兴凯湖翘嘴鲌 H FABP 基因的克隆及组织表达分析
第30卷第2期大连海洋大学学报Vol.30No.2 2015年4月JOURNAL OF DALIAN OCEAN UNIVERSITY Apr.2015
DOI:10.3969/J.ISSN.2095-1388.2015.02.002文章编号:2095-1388(2015)02-0120-05兴凯湖翘嘴鲌H-FABP基因的克隆及组织表达分析
韩英1二2,陈晓婷1二2,王琨3,张红1二2
(1.东北农业大学动物科学技术学院,黑龙江哈尔滨150030;2.淡水鱼类育种国家地方联合工程实验室,黑龙江哈尔滨
150030;3.哈尔滨商业大学,黑龙江哈尔滨150028)
摘要:为研究H-FABP基因在兴凯湖野生和养殖翘嘴鲌Culter alburnus各相同组织中表达的差异,根据
GenBank中已知鲤科鱼类的H-FABP基因序列进行引物设计,采用RT-PCR和RACE方法克隆出兴凯湖翘嘴
鲌心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)的全CDS区序列(402bp)二3′UTR区序列(242bp)和5′UTR区序列
(134bp)共778bp的cDNA序列三将其提交到GenBank中,获得基因登陆号为KJ629286,通过Blast比对
发现,兴凯湖翘嘴鲌H-FABP基因的CDS区与鲤Cyprinus carpio和齐口裂腹鱼Schizothorax prenanti的同源性
高达91%;氨基酸同源性比对显示,兴凯湖翘嘴鲌H-FABP氨基酸序列与虹鳟Oncorhynchus mykiss的同源性
为76%,与斑马鱼Danio rerio的同源性为85%;分析野生翘嘴鲌7个组织(鳃二心脏二肠二肝胰脏二肌
肉二肾脏二脾脏)以及养殖翘嘴鲌除心脏之外的6个相同组织H-FABP基因的表达情况,结果显示,
H-FABP基因在野生组和养殖组肝胰脏中表达量均为最高,与其他组织的表达量有显著性差异(P<0.05),
H-FABP基因在野生组和养殖组各相同组织中的表达量无显著性差异(P>0.05)三研究表明,兴凯湖翘嘴
鲌H-FABP基因序列高度保守,与鲤形目鱼类的同源性更高三
关键词:翘嘴鲌;兴凯湖;心型脂肪酸结合蛋白;基因克隆;组织表达
中图分类号:Q78 文献标志码:A
肌内脂肪(IMF)含量是反映鱼类肉质品质的重要指标,脂肪酸结合蛋白(fatty acid-binding protein,FABP)基因作为影响肌内脂肪含量的候选基因之一,在脂肪酸转运和脂类代谢中起着重要的作用,已引起学者的广泛关注三目前,已从哺乳动物二禽类二鱼类和昆虫等生物细胞液中分离出多种类型的FABPs,如脂肪型脂肪酸结合蛋白(A-FABP)二脑型脂肪酸结合蛋白(B-FABP)二表皮型脂肪酸结合蛋白(E-FABP)二心型脂肪酸结合蛋白(H-FABP)二小肠型脂肪酸结合蛋白(I-FABP)二回肠型脂肪酸结合蛋白(IL-LBP)二肝胰脏型脂肪酸结合蛋白(L-FABP)二髓磷脂型脂肪酸结合蛋白(M-FABP)和睾丸型脂肪酸结合蛋白(T-FABP)[1]三其中,L-FABP能同时结合长链脂肪酸,而IL-LBP对脂肪酸没有亲和力,I-FABP在与配基发生结合的过程中其构象与其他类型的FABP构象不同三近年来,对B-FABP和E-FABP 的研究较多,人类B-FABP氨基酸序列与其H-FABP氨基酸序列具有67%的同源性,而人类E-FABP氨基酸序列与其H-FABP氨基酸序列则有48%的同源性[2]三
在畜禽类FABPs基因家族中,对H-FABP的研究比较广泛,多集中在多态性方面,而有关鱼类H-FABP基因及其表达的研究报道尚少三Ando 等[3]克隆了虹鳟Oncorhynchus mykiss H-FABP基因,与鼠心型脂肪酸结合蛋白的同源性为75%三Liu 等[4]描述了斑马鱼Danio rerio H-FABP基因结构,并将该基因定位在连锁群上三Jordal等[5]测定了饲料脂肪酸对大西洋鲑Salmo salar H-FABP基因的影响,并分析了该基因在大西洋鲑不同生长阶段的表达情况三林亚秋等[6]克隆了齐口裂腹鱼Schizotho?rax prenanti和鲤Cyprinus carpio H-FABP基因序列,并测定了该基因在各个组织中的表达量三覃川杰等[7]克隆了瓦氏黄颡鱼Pelteobagrus vachelli H-FABP基因cDNA序列,定量PCR反应分析表明,腹腔脂肪组织是心型脂肪酸结合蛋白表达的主要场所三俞菊华等[8]对建鲤H-FABP基因分离及其多态性与增重的相关性进行了分析,检测了其中
收稿日期:2014-06-20
基金项目:黑龙江省博士后启动基金资助项目(LRB10-633(SN));黑龙江省自然科学基金资助项目(C200934) 作者简介:韩英(1963 ),女,教授,博士生导师三E-mail:hanying_606@https://www.wendangku.net/doc/d27893029.html,
3个SNP位点的基因型,并筛选出与增重相关的分子标记三在GenBank中已经收录了鲤二斑马鱼二齐口裂腹鱼二虹鳟二罗非鱼Oreochromis niloticus二大西洋鲑二底鳉Fundulus heteroclitus二银鳕鱼Ano?plopoma fimbria等鱼类的H-FABP基因cDNA序列三兴凯湖翘嘴鲌Culter alburnus体色银白二肉质细嫩二味道鲜美,是中国重要的名贵经济鱼类,也是古时历代进京贡品和高级宴席佳肴,具有极高的经济价值,是中国四大名淡水鱼之一三迄今为止,尚无其肉质性状与基因调控的相关报道三本研究中,以野生和养殖兴凯湖翘嘴鲌为试验材料,利用PCR技术和RACE法克隆H-FABP基因,进行序列分析二比对,并应用RT-PCR技术分析该基因在不同组织中的表达规律,探索兴凯湖翘嘴鲌肌内脂肪含量的调控机制,为进一步研究鱼类的肉质奠定基础,同时为其分子遗传育种提供参考依据三
1 材料与方法
1.1 材料
试验用野生翘嘴鲌采自黑龙江省兴凯湖,养殖翘嘴鲌采自黑龙江农垦振达兴凯湖大白鱼研究所养殖基地,体质量为(142.1±6.3)g,野生组和养殖组翘嘴鲌样本均为5尾,每组设3个重复三感受态细胞二DNA Taq酶二dNTP二Buffer二DNA Marker等试剂,均购自北京全式金生物技术有限公司三RNA提取试剂盒二cDNA第一链合成试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒,均购自海基生物科技有限公司三3′-Full RACE Core Set2.0试剂盒二5′-Full RACE试剂盒二PMD18-T Vector试剂盒和荧光定量试剂盒,均购自宝生物工程(大连)有限公司三
1.2 方法
1.2.1 样品的制备 使用无RNA酶处理的手术刀和剪刀进行解剖,采集鲜活鱼体的肝胰脏二心脏二脾脏二肠二肌肉二肾脏和腮,迅速置于液氮中,于超低温冰箱(-80℃)中保存备用三
1.2.2 H-FABP基因cDNA的克隆 提取翘嘴鲌心脏组织RNA,使用紫外分光光度计以及琼脂糖凝胶电泳检测RNA三OD260nm/OD280nm值在1.8~2.0之间,而且凝胶成像显示分别在28S二18S二5S 三处有条带三用3μg总RNA进行反转录,反应程序:30℃下反应5min,42℃下反应30min,95℃下反应5min,共循环30次,4℃下保存三
参考已发表的鲤H-FABP基因序列(登录号: JQ342672.1),使用Primer5.0软件设计上下游引物H1;采用兴凯湖翘嘴鲌心脏组织的总RNA为模板并扩增出部分cDNA序列,根据其H-FABP基因部分CDS区序列设计RACE法扩增3′端和5′端所需的2对引物H3′和H5′(表1),从而扩增出兴凯湖翘嘴鲌的H-FABP基因全cDNA序列三用10g/L 琼脂糖凝胶电泳检测扩增产物,回收目的条带三将回收产物与PMD-18T载体连接,转化后筛选出阳性克隆,在NCBI上比对测序后的序列同源性三
表1 克隆H-FABP基因的引物
Tab.1 Primers for cloning of H-FABP gene
引物primer序列sequence(5′-3′)
H1-F CCAAGCCTACAACCATCAT
H1-R ATTGACATCTCGGACCAG
H3′in CCGTCAGCACTTTCAAAAGCACAG
H3′out AGTATGACCAAGCCTACAACC
H5′in ACTTTACGGTCATCTGCAGTGGTCT
H5′out GTCCCATTTCTGAACATGAACC 1.2.3 H-FABP基因表达量的检测 从心脏二肝胰脏二脾脏二肾脏二肠二鳃二肌肉各组织中提取总RNA,进行反转录三使用Primer5.0软件设计FQ-PCR引物(表2),采用FQ-PCR法检测H-FABP 基因在各组织中的相对表达量三PCR反应程序: 95℃下预变性15s;95℃下变性5s,60℃下退火34s,共进行40个循环;60℃下延伸1min三
表2 FQ-PCR引物
Tab.2 Primers of FQ-PCR
基因
gene序列(5′-3′)
sequence(5′-3′)产物大小/bp
product size H-FABP-F TTTGTTGGCACATGGAACTT
H-FABP-R TGATGGTTGTAGGCTTGGTC
100β-actin-F ACTTCGAGCAGGAGA
β-actin-R ACAGTGTTGGCATACAG
150 1.3 数据处理
应用NCBI上的Blast程序,比对克隆出的序列与其他物种的同源性三使用DNAMAN软件拼接克隆出的cDNA序列三使用Mega4.0软件进行碱基组成和变异分析并采用Neighbor-joining(NJ)法构建系统发育树三使用SPSS17.0统计软件对表达量进行显著性检验三
2 结果与分析
2.1 翘嘴鲌H-FABP基因cDNA克隆及序列分析
采用RT-PCR和RACE法克隆并测序得到了翘嘴鲌H-FABP基因共778bp的cDNA序列(图
121
第2期韩英,等:兴凯湖翘嘴鲌H-FABP基因的克隆及组织表达分析
1)三该基因5′端非翻译区长134bp,3′非翻译区长242bp,起始密码子为ATG,终止密码子为TAA, PolyA加尾信号为AATAAA三完整的开放阅读框由402bp组成,编码133个氨基酸三将其提交到GenBank,获得基因登陆号为KJ629286三
注:起始密码子和终止密码子用方框标出
Note:Initiation codon and termination codon are marked in a box
图1 兴凯湖翘嘴鲌H-FABP基因全cDNA序列
Fig.1 Complete sequence of cDNA of H-FABP gene in culter Culter alburnus in Xingkai Lake
将所得氨基酸序列提交至NCBI,通过Blast比对氨基酸同源性,结果表明,兴凯湖翘嘴鲌H-FABP氨基酸序列与齐口裂腹鱼二鲤同源性均为91%,与斑马鱼同源性为85%,与长鳍真鮰Ictalu?rus functatus同源性为83%,与大西洋鲑二虹鳟二银鳕鱼二底鳉等鱼类同源性为75%,与人Homo sapiens二猪Sus scrofa二牛Bos taurus二鸡Gallus gal?lus二大鼠Rattus norvegicus二小鼠Mus musculus等哺乳动物和禽类的同源性为75%左右三兴凯湖翘嘴鲌H-FABP氨基酸数目与鲤二斑马鱼二长鳍真鮰二大西洋鲑二虹鳟相同,均编码133个氨基酸,但比底鳉(编码132个氨基酸)多1个氨基酸,比银鳕鱼(编码134个氨基酸)少1个氨基酸三使用ClustalW在线比对,结果显示:仅在FABP胞质脂肪酸结合蛋白信号区其与齐口裂腹鱼和鲤有一个丝氨酸(S)突变成苏氨酸(T)的差异;与长鳍真鮰有一个从天冬氨酸(D)突变为谷氨酸(E)的差异;与斑马鱼有2个氨基酸突变的差异,分别为丙氨酸(A)到甘氨酸(G)的突变和天冬氨酸
(D)到谷氨酸(E)的突变三
2.2 翘嘴鲌H-FABP氨基酸序列的系统进化分析
将兴凯湖翘嘴鲌H-FABP氨基酸序列与鲤二齐口裂腹鱼二斑马鱼二虹鳟二长鳍真鮰二银鳕鱼二大西洋鲑二底鳉二人二牛二猪二鸡二大鼠二小鼠的H-FABP氨基酸序列使用ClustalX1.83软件进行多重比较分析,使用Mega4.0程序中的Maxinum Parsimony和Neighbor-joining算法,设Bootstrap为1000,构建遗传进化树,结果如图2所示三从图2可见,兴凯湖翘嘴鲌首先与斑马鱼二齐口裂腹鱼和鲤聚在一起,然后与长鳍真鮰聚在一起,再与虹鳟和大西洋鲑聚在一起,最后与底鳉和银鳕鱼聚在一起,与其他鱼类二鸟类和哺乳类差异较大,分布在两个分支上
三
图2 翘嘴鲌H-FABP氨基酸序列的遗传进化树Fig.2 Phylogenetic tree of amino acid sequences in H-FABP in culter Culter alburnus
2.3 H-FABP基因的组织表达
从图3可见:H-FABP基因在翘嘴鲌野生组和
221大连海洋大学学报 第30卷
养殖组肝胰脏中表达量均为最高,与其他组织的表达量有显著性差异(P<0.05);但野生组和养殖组各相同组织中的表达量均无显著性差异(P>
0.05)三
注:标有不同小写字母者表示组间有显著性差异(P<0.05),标有相同小写字母者表示组间无显著性差异(P>0.05) Note:The means with different letters are significant differences at the0.05probability level,and the means with the same letters are not significant differences
图3 翘嘴鲌H-FABP基因在各组织中的相对表达量Fig.3 Relative expression of H-FABP gene in tissues of culter Culter alburnus
3 讨论
克隆新基因时,常选择亲缘关系相近物种的氨基酸序列保守区设计引物三经克隆二测序与比对分析,兴凯湖翘嘴鲌H-FABP基因全CDS区序列共402bp,编码一个终止密码子和133个氨基酸三本试验中,将克隆得到的H-FABP氨基酸序列与其他物种H-FABP的同源性进行比较,结果显示,兴凯湖翘嘴鲌H-FABP氨基酸序列与同属鲤形目的鲤和齐口裂腹鱼同源性高达91%,与非同目的斑马鱼同源性亦高达91%,与长鳍真鮰同源性达83%,与大西洋鲑二虹鳟二银鳕鱼二底鳉等鱼类同源性均在75%左右,与人二牛二小鼠二大鼠二猪二鸡等哺乳动物和禽类的同源性均为75%左右,由此可验证所得序列即为兴凯湖翘嘴鲌的H-FABP序列三兴凯湖翘嘴鲌H-FABP氨基酸数目与鲤二斑马鱼二长鳍真鮰二大西洋鲑二虹鳟相同,均编码133个氨基酸;但比银鳕鱼(编码134个氨基酸)少1个氨基酸,比底鳉(编码132个氨基酸)多1个氨基酸三该序列具有高度保守性,这对于保持H-FABP的基本功能具有重要意义三
赵旭庭等[9]研究表明,H-FABP基因在鸭的脑和肾中有微量表达,在小肠二脂肪二腺胃二肌胃二骨骼肌和肺组织中均有中度表达,在心脏组织中表达量最高,在卵巢二脾和肝中不表达三在对鱼类H-FABP基因的研究中,Liu等[4]研究表明,H-FABP基因在斑马鱼卵巢和肝中表达最丰富,在心二脑二精巢二皮肤二肌肉二肠中均有不同程度的表达;林亚秋等[6]研究发现,H-FABP基因在齐口裂腹鱼和鲤肝胰脏中表达量最高,且表达量显著高于其他组织,在鲤各组织中表达量由高到低依次为心脏二脾二肾二脑二鳃二脂肪二肌肉,在齐口裂腹鱼各组织中表达量由高到低依次为心脏二脑二鳃二肾二肌肉二脂肪二脾三本研究中,对兴凯湖翘嘴鲌各组织的H-FABP基因mRNA相对表达量进行比较后发现,该基因在肝胰脏中的表达量显著高于其他组织,在肌肉二心脏二脾和肠中均有中度表达,在鳃和肾中仅有微量表达三动物的肝脏二脂肪组织和小肠是合成脂肪的主要场所,以肝脏的合成能力最强三已有研究表明,兴凯湖翘嘴鲌二鲤和齐口裂腹鱼H-FABP基因在肝胰脏组织中表达量均高于其他组织,说明其表达具有肝胰脏特异性三
H-FABP具有促进细胞内脂肪酸转运的功能,与长链脂肪酸的亲和力很强,其具有转运长链脂肪酸以及调节脂肪酸代谢平衡之功能[4,10],可将脂肪酸运送到胞内脂肪及磷脂合成部位三研究表明, H-FABP基因与新疆细毛羊的IMF含量无相关性,与20~90日龄哈萨克羊的IMF含量呈显著正相关[11];李文娟等[12]研究发现,H-FABP基因与矮脚鸡的IMF含量无相关性,与北京油鸡和白莱航鸡的IMF含量呈显著负相关;林亚秋等[6]测定了3种规格鲤和齐口裂腹鱼在不同饲养条件下相同繁殖周期内的IMF含量,并对H-FABP基因的表达量进行相关分析后发现,齐口裂腹鱼H-FABP基因表达量与IMF含量呈显著正相关,而鲤该基因表达量与IMF含量呈显著负相关,造成这种差异的原因,可能是由于两种鱼的脂肪转运与贮存分子调控机制以及生长环境不同三笔者在前期的研究中,对3龄二4龄二5龄兴凯湖野生和养殖翘嘴鲌的IMF 和脂肪酸含量进行了分析,结果表明,在野生组中检测到18种脂肪酸,其中肌肉饱和脂肪酸二多不饱和脂肪酸二二十二碳六烯酸和二十碳五烯酸的总量显著高于养殖组(P<0.05),随着年龄的增长,野生组肌肉脂肪含量显著低于养殖组[13-14]三本研究结果显示,H-FABP基因在野生组和养殖组各相同组织中的表达量无显著性差异三因此,H-FABP 基因表达量与IMF的相关性具有物种差异性三鱼类脂肪代谢由多种基因共同协调作用,H-FABP作为肉质脂肪性状的候选基因之一,其对IMF含量的影响仍有待于进一步研究三
H-FABP作为影响肉质嫩度的主效基因,其多
321
第2期韩英,等:兴凯湖翘嘴鲌H-FABP基因的克隆及组织表达分析
态性及分子标记尚需进一步研究三这对于了解鱼类肉质形成的分子机制,实现优质性状的早期选择,加快良种尤其是优良肉质鱼类的选择育种,具有重要的意义三
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Cloning and expression of H-FABP gene in tissues of
culter Culter alburnus in Xingkai Lake
HAN Ying1,2,CHEN Xiao-ting1,2,WANG Kun3,ZHANG Hong1,2
(1.Animal Science and Technology College,Northeast Agricultural University,Harbin150030,China;2.Country Location United Engineering Labo?ratory of Freshwater Fish Breeding,Harbin150030,China;3.Harbin University of Commerce,Harbin150028,China) Abstract:The778bp cDNA sequence including whole CDS sequence(402bp),whole3′UTR sequence(242 bp)and partial5′UTR sequence(134bp)of heart type fatty acid binding protein(H-FABP)in culter Culter al?burnus was cloned by RT-PCR and RACE technology to evaluate difference between the amount of expression of H-FABP gene in wild and farmed culter in Xingkai Lake,according to the H-FABP gene sequences of members in Cyprinidae known in Genbank with accession number of KC782835.The Blast showed that there was91%homolo?gy in H-FABP gene CDS area between culter and common carp Cyprinus carpio and prenant’s schizothoracin Schizo?thorax prenanti.The comparison of amino acid homology revealed that the H-FABP gene of the culter showed76% homology with rainbow trout Oncorhynchus mykiss and85%homology with zebrafish Danio rerio.The expression of H-FABP gene in7tissues(gill,heart,intestine,hepatopancreas,muscle,kidney,spleen)of wild Culter albur?nus and in6tissues except heart of cultured culter indicated that the maximal mRNA expression of H-FABP gene was observed in hepatopancreas of wild and cultured culter,with significantly different from other tissues(P< 0.05).In the same tissue,however,there was no significant difference in mRNA expression level of H-FABP gene in wild and cultured culter(P>0.05).It is concluded that the conservative H-FABP gene in culter had high homology with that in members in Cyprinidae.
Key words:Culter alburnus;Xingkai Lake;heart type fatty acid binding protein(H-FABP);gene cloning;tis?sues expression
421大连海洋大学学报 第30卷
【高中生物】功能基因的克隆及生物信息学分析
（生物科技行业）功能基因的克隆及生物信息学分析
功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structuralgenomics）转向功能基因组学(functionalgenomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多
控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。 1.2同源序列克隆目的基因 首先根据已知的基因序列设计PCR引物，在已知材料中扩增到该片段，并经克隆测序验证，利用放射性同位素标记或其他非同位素标记该PCR片段作为探针，与待研究材料的cDNA文库杂交，就可以获得该基因cDNA克隆，利用克隆进一步筛选基因组文库，挑选阳性克隆，亚克隆并测序，从中就可以筛选到该基因的完整序列。 1.3结合连锁和连锁不平衡的分析方法 结合连锁和连锁不平衡的分析方法是未知基因克隆研究领域发展的新方向[6]。(Linkagedisequilibrium,LD)。与连锁分析不同,连锁不平衡分析可以利用自然群体中历史发生的重组事件。历史上发生的重组使连锁的标记渐渐分布到不同的同源染色体上,这样就只有相隔很近的标记才能不被重组掉,从而形成大小不同的单倍型片段(Haplotypeblock)。这样经过很多世代的重组,只有相隔很近的基因,才能仍处在相同的原始单倍型片段上,基因间的连锁不平衡才能依然存在。所以基于连锁不平衡分析,可以实现目的基因的精细定位。林木大多为自由授粉的异交物种,所以连锁不平衡程度很低,林木基因组中的LD可能会仅局限于非常小的区域,这就为目的基因的精细定位提供了可能,结合SNP检测技术,科学家甚至可以将效应位点直接与单个的核苷酸突变关联起来,进行数量性状寡核苷酸
红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析 开题报告 于凯
毕业设计/论文 开题报告 课题名称红豆杉中MYB家族基因克隆及表达分析类别毕业论文 系别城市建设学院 专业班生物工程0701班 姓名于凯 评分 指导教师 华中科技大学武昌分校
华中科技大学武昌分校学生毕业论文开题报告
癌活性，对于治疗卵巢癌、乳腺癌等疗效突出。但是由于含量少、提取困难等诸多因素，高纯度紫杉醇价格昂贵，每公斤200万元人民币左右。因此，近年来国内外许研究人员、实验室和公司一直试图通过生物合成、化学合成、微生物提取、组织和细胞培养、寻找类似物等途径来解决紫杉醇的药源短缺问题。 研究紫杉醇的生物合成，尤其一些限速反应步骤机理的阐明对于人为定向的提高合成效率，克隆重组形成关键酶基因从而提高紫杉醇的产量意义重大。从理论上来说这是一个好方法，但是紫杉醇的合成途径非常复杂，涉及到多种酶以及很多分支途径，单纯依靠转化一、两种限速酶基因，只能保证转入的限速酶表达量提高，使之不再是限速因素，但其它阶段对于最终产量的限制依然存在，而且同时转入多种基因的可行性非常低，这种方法的缺陷很明显。 若采用化学合成，如从红豆杉植物中分离得到的巴卡亭Ⅲ经过四步化学过程可合成紫杉醇，为合成紫杉醇提供了新途径[5]。但化学合成从实质意义上说还没有取得彻底的突破，目前还不具备应用价值。 如果从共生真菌中直接提取紫杉醇，能够利用真菌生长速度快的优势，但目前分离的菌株无论从种类还是数量上都远不够工业化的要求，而且还存在很多不确定因素[1]。生产紫杉醇的微生物大多是与红豆杉共生的真菌，其紫杉醇含量极微，并且这些真菌的培养和大规模发酵困难，菌株衰退也是一个难题。 另外，红豆杉愈伤组织和细胞培养生产紫杉醇是研究的热点之一，是工厂化大规模生产紫杉醇的重要手段之一。但运用植物组织、细胞培养技术生产紫杉醇仍处在实验室阶段，如何获得高含量、产紫杉醇稳定的愈伤组织一直都是组织培养、细胞培养生产紫杉醇的关键。 1.1.3关于MYB基因 ①MYB基因 目前，在几乎所有的真核生物中都发现了与禽类逆转录病毒癌基因和细胞原癌基因c-MYB相似的基因，它们的编码产物在结构和功能上具有高度保守的DNA结合域，是一类转录因子[6]。在植物中首先从玉米中克隆了含有MYB结构域的转录因子C1基因，之后在植物中发现的MYB相关基因的数量迅速增加[7]。
基因的克隆、表达载体构建与功能验证
基因的克隆、表达载体构建及功能验证（一般性方法） 一、基因克隆 ★事前三问 a.克隆这个基因干什么？它有什么功能？ b.这个基因在哪种材料中扩增？ c.材料需要怎么处理？ ◎实验前准备工作 a.设计引物，准备材料， b.购置试剂：Taq酶、反转录试剂盒、凝胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒、连接试 剂盒 c.实验试剂及用具：枪头、离心管、培养皿、滤纸灭菌；Amp+ 、Kan+等抗生素准 备 ※基本流程 提取和纯化RNA—cDNA第一条链合成—PCR—凝胶电泳—胶回收—连接—转化—涂平板—挑单菌落—摇菌—提质粒—测序 1.总RNA的提取、纯化及cDNA第一链合成 1.1叶片、根总RNA的提取 Trizol是一种高效的总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解植物细胞，抑制细胞释放出的核酸酶，所提取的RNA完整性好且纯度高，以利于下一步的实验。 1）实验前准备 预先配制0.1%的DEPC水（ddH2O中含0.1%DEPC，V/V，37 ℃过夜处理12 h），高温灭菌后，用DEPC水配制75%乙醇，研钵、量筒、试剂瓶等需200℃灭菌至少4 h，所用枪头和枪盒均去RNA酶处理(直接购买)。 2)Trizol 法（小麦）叶片或根的总RNA实验步骤如下： （1）提前在1.5 ml离心管中加入1 mlTrizol，然后将200 mg样品液氮中研磨成白色粉末，
移入管内，用力摇15 s，在15-30℃温育5 min，使核酸蛋白复合物完全分离。 （2）4℃，12000g离心10min，取上清，离心得到的沉淀中包括细胞外膜、多糖、高分子量DNA，上清中含有RNA。 （3）吸取上清液加0.2 ml氯仿，盖好盖，用力摇15 s，15～30 ℃温育2～3 min。（4）在≤12000g，4℃离心10 min，样品分为三层：底层为黄色有机相，上层为无色水相和一个中间层，RNA主要在水相中，水相体积约为所用TRIzol试剂的60%。 （5）将上层水相转移到新的1.5 ml离心管中，加2倍体积的无水乙醇沉淀RNA，室温静止30 min。 （6）在≤12000g，4℃离心10 min，离心前看不出RNA沉淀，离心后在管侧和管底出现胶状沉淀。 （7）用≥1 ml的75%乙醇洗RNA，涡旋振荡样品，在≤7500g，4℃离心5 min，弃上清。（8）室温放置干燥或真空抽干RNA沉淀，大约晾5-10分钟，加无RNase的水100μl用枪头吸几次，55～60℃温育10 min使RNA溶解。 （9）配制以下体系： 10×DNase buffer 5 μl DNase I （RNase-free）（40 μg/μl） 1 μl RNasin Inhibitor（40 μg/μl） 1 μl Total RNA 70 μg 加去RNase水至总体积为50 μl （10）37 ℃水浴1h，加DEPC处理的水至总体积为100 μl，加入等体积氯仿抽提一次。（11）取上清，加入10 μl的3 mol/L NaAC溶液，200 μl的无水乙醇，-80 ℃沉淀30 min。 （12）2～8 ℃，12000g离心10 min，弃清液，干燥后取50μl无RNase的水溶解RNA。3）RNA的质量及纯度检测 （1）电泳检测取2ul RNA 与1 ul 10×Loading buffer上样缓冲液混合均匀在1% 的琼脂糖凝胶上电泳，在紫外灯下观察RNA 条带并记录实验结果。 （2）分光光度计RNA纯度检测 取1ul RNA液，以DEPC水为空白对照，测定A260/ A280 比值，估测RNA质 量。 4）cDNA第一条链的合成 按照以下体系将提取的总RNA反转录成第一链cDNA： 1）在Eppendorf管中配制下列混合液：
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx 班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR 的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA 全长, 共987 bp ,其中编码区723 bp ,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa ,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP 家族典型的UspA 结构域,但无典 型的A TP 结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR 分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中 均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸 (ABA )、茉莉酸甲酯(MeJA )等非生物胁迫下表达量有明显 变化,推测PwUSP2可能参与青杄对逆境胁迫的响应。 材料与方法 青杄植 物材料 实验结果 通过RACE-PCR 方法获得PwUSP2基因的末端序列,与EST 序列拼接后获得完整的cDNA 序列全长。PwUSP2基因cDNA 序列全长共987 bp , 编码区共723 bp , 共编码240个氨基酸。 在85 bp 处为起始密码子ATG , 805 bp 处为终止密码子TGA , 968 bp 处为Poly(A)20尾巴。 青杄PwUSP2 全长cDNA 的获得 生物信息 学分析 组织特异 性表达 胁迫 处理 PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h 表达量达到最高,在42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整体下降趋势。 PwUSP2在ABA 胁迫下表达量出现下降, 与42℃热激胁迫模式相似,而在MeJA 胁迫下,PwUSP2基因受到诱导, 表达量显著上调。 ABA 和MeJA 胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl 胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降,同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl 和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs 基因被克隆和分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析
青杄PwUSP2基因的克隆和表达分析 周xx,xx班级 摘要 广泛逆境胁迫蛋白(USPs)参与碳缺乏、缺氧、干旱和高盐 等多种非生物胁迫, 但在植物中的研究尚不深入。本文通 过RACE-PCR的方法获得青杄PwUSP2基因的cDNA全长, 共987 bp,其中编码区723 bp,共编码240个氨基酸。利用 生物信息学工具对其理化性质、二级结构和三级结构进行 分析,结果显示,该蛋白理论分子质量为26.84 kDa,理论等 电点为4.61,有丝氨酸和苏氨酸结合位点,为非跨膜的亲水 蛋白。PwUSP2具有USP家族典型的UspA结构域,但无典 型的A TP结合位点G-2X-G-9X-G[S/T]。RT-qPCR分析表明, PwUSP2在青杄花粉、果实、种子、成熟叶、幼叶、成茎中均有表达,在果实中表达量较高。同时,PwUSP2在脱落酸(ABA)、茉莉酸甲酯(MeJA)等非生物胁迫下表达量有明显 EST 968 bp处为Poly(A)20尾巴。 PwUSP2全cDNA的核苷酸序列及推导的氨基酸序列PwUSP2在不同非生物胁迫下的表达模式不同。PwUSP2 受4℃低温诱导,表达量上调,且在12 h表达量达到最高,在 42℃热激胁迫下, PwUSP2呈现不同的表达模式,表达量呈整 体下降趋势。 ABA和MeJA胁迫下PwUSP2的表达分析 在NaCl胁迫下, PwUSP2基因的表达量先上升后下降, 同时PwUSP2基因的表达受干旱胁迫诱导上调。 温度胁迫下PwUSP2的表达分析 NaCl和干旱胁迫下PwUSP2的表达分析 讨论 目前,在细菌和植物中,只有少数USPs基因被克隆和 分离,且部分参与了多种逆境胁迫。PwUSP2是广泛逆境胁 迫蛋白,本研究结果显示其在多种逆境胁迫下存在表达差 异,对不同胁迫的反应时间也存在差别,暗示其可能广泛参 与多种逆境胁迫响应。PwUSP2在抗逆过程中的具体功能, 以及参与的信号转导路径和调控机制仍有待于研究。 林学院第五届学生学术论坛
功能基因的克隆及生物信息学分析
功能基因的克隆及其生物信息学分析 摘要：随着多种生物全基因组序列的获得，基因组研究正从结构基因组学（structural genomics）转向功能基因组学(functional genomics)的整体研究。功能基因组学利用结构基因组学研究获得的大量数据与信息评价基因功能(包括生化功能、细胞功能、发育功能、适应功能等)，其主要手段结合了高通量的大规模的实验方法、统计和计算机分析技术[1]，它代表了基因分析的新阶段，已成为21世纪国际生命科学研究的前沿。功能基因组学是利用基因组测序获得的信息和产物，发展和应用新的实验手段，通过在基因组或系统水平上全面分析基因的功能，使生物学研究从对单一基因或蛋白的研究转向多个基因或蛋白同时进行系统的研究，是在基因组静态的组成序列基础上转入对基因组动态的生物学功能学研究[2]。如何研究功能基因，也成为我们面临的一个课题，本文就克隆和生物信息学分析在研究功能基因方面的应用做一个简要的阐述。 关键词：功能基因、克隆、生物信息学分析。 1.功能基因的克隆 1.1 图位克隆方法 图位克隆又称定位克隆，它是根据目标基因在染色体上确切位置，寻找与其紧密连锁的分子标记，筛选BCA克隆，通过染色体步移法逐步逼近目的基因区域，根据测序结果或用BAC、YAC克隆筛选cDNA表达文库寻找候选基因，得到候选基因后再确定目标基因。优点是无需掌握基因产物的任何信息，从突变体开始，逐步找到基因，最后证实该基因就是造成突变的原因。通过图位克隆许多控制质量性状的单基因得以克隆，最近也有报道某些控制数量性状的主效基因（控制蕃茄果实大小的基因克隆[3]、控制水稻成熟后稻谷脱落基因克隆[4]以及小麦VRN2 基因克隆[5]等）也通过图位克隆法获得。
绿色荧光蛋白基因克隆及表达结果分析
3 结果与分析 3.1质粒提取 用醋酸铵法提取pET-28a 和pEGFP-N3质粒后，进行琼脂糖电泳检测质粒是否提取成功。得到电泳结果，如图一所示，3、4号泳道有明显清晰的条带说明pEGFP-N3提取成功。1、2泳道同样有明显清晰的条带，说明pET-28a 提取成功。 3.2 双酶切 用BamH1和Not1分别对pEGFP-N3和pET-28a 双酶切。1、2号泳道为pEGFP-N3的酶切结果，如图二所示，电泳会得到两条带，说明pEGFP-N3酶切成功。4号泳道为pET-28a 的酶切产物的电泳有明显条带，证明酶切成功。 3.3 抗性筛选 通过氯化钙法制备DH5α感受态细胞，用热激发将pET-28a-GFP 转入DH5α感 图 1 pET-28a 和pEGFP-N3质粒提取电泳图 1、2泳道为pET-28a 电泳结果 3、4号泳道为pEGFP-N3电泳结果 图 2 BamH1、Not1双酶切 pEGFP-N3和pET-28a 1、2号泳道为pEGFP-N3酶切产物 3号泳道为pEGFP-N3原始质粒 4号泳道为pET-28a 酶切产物 5号用泳道为pET-28a 原使质粒
受态细胞。转化重组质粒后涂平板，进行重组质粒的抗性筛选。因为28a中含有 抗卡那基因，所以筛选后可以得到含28a的重组质粒。从图中可以看出1号平板 长出较多菌落，说明DH5α感受态细胞存活。2号平板无菌落生长，说明DH5α中 不含抗卡那基因。3号板生长出较少菌落，证明卡那有活性。4号板无菌落生长。 失败原因其一可能是在倒了第一个平板加入卡那后，由于倒平板速度太慢，导致 培养基凝固，影响了卡那的浓度和活性。其二可能是在转化过程中，离心后，弃 上清的过程中，将沉淀和上清混在了一起，影响了溶液的浓度。 图3重组质粒转化DH5α感受态细胞 1号图为不含卡那的阴性对照 2号图为含卡那的阴性对照 3号图为含卡那的自提pET-28a的阳性对照 4号图为含卡那的连接产物结果 3.4PCR鉴定 经PCR扩增后，进行琼脂糖凝胶电泳检测是否扩增成功，得到电泳结果如图 四所示，结果表明，1、2泳道的条带约为700bp，说明成功扩增出含有GFP的基 因。DNA电泳检验扩增片段,选出能够得到700bp左右片段的阳性克隆。 图4阳性重组菌的PCR鉴定 1、2号泳道为重组质粒转化结果
一个快速响应干旱的F-box基因的克隆和表达分析
作物学报 ACTA AGRONOMICA SINICA 2014， 40（6）： 1027-1034 http：//https://www.wendangku.net/doc/d27893029.html,/ ISSN 0496-3490； CODEN TSHPA9 E-mail： xbzw@https://www.wendangku.net/doc/d27893029.html, 本研究由辽宁省科技厅农业攻关项目（2011208001）资助。 * 通讯作者（Corresponding author）： 李文利， E-mail： biolwl@https://www.wendangku.net/doc/d27893029.html, 第一作者联系方式： E-mail： yh4018@https://www.wendangku.net/doc/d27893029.html, Received（收稿日期）： 2013-09-26； Accepted（接受日期）： 2014-01-12； Published online（网络出版日期）： 2014-03-24. URL： http：//https://www.wendangku.net/doc/d27893029.html,/kcms/detail/11.1809.S.20140324.1336.013.html DOI： 10.3724/SP.J.1006.2014.01027 一个快速响应干旱的F-box 基因的克隆和表达分析 尹 恒 余琴鸯 安利佳 李文利* 大连理工大学生命科学与技术学院， 辽宁大连 116024 摘 要： F-box 是Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型泛素连接酶E3的重要组成部分， 在泛素化介导的蛋白质降解中选择性识别靶蛋白。本文从谷子苗期干旱胁迫条件下构建的转录组文库中克隆了与耐旱早期响应相关的F-box 基因， 命名为SiFBX （GenBank 登录号为KC252635.1）。该基因全长510 bp， 编码170个氨基酸。蛋白质结构预测表明， 该蛋白含有丰富的精氨酸、亮氨酸、丝氨酸， 缺少跨膜结构域及信号肽序列。系统进化分析表明， 该基因与已报道的EID1和FBW4亲缘关系较近。在该基因上游1.9 kb 序列处， 预测到启动子的核心序列及与多种逆境胁迫相关的调控序列。荧光定量PCR 分析表明， 该基因分别在正常干旱、PEG 和ABA 诱导下， 表达量出现显著变化。 关键词： 谷子； 干旱响应； F-box； gRT-PCR Cloning and Expression Analysis of an F-box Gene （SiFBX ） Rapidly Respon-sive to Drought Stress YIN Heng， YU Qin-Yang， AN Li-Jia， and LI Wen-Li * School of Life Science & Biotechnology， Dalian University of Technology， Dalian 116024， China Abstract： F-box proteins， components of the Skp1-Cullin1-F-box （SCF） protein E3 ubiquitin ligase complex， serve as the variable component responsible for substrate recognition and recruitment in SCF-mediated proteolysis. The anti-drought relative gene of SiFBX （GenBank accession number KC252635.1） which belongs to the F-box super family was cloned from foxtail millet （Se-taria italic ）. The full-length cDNA of SiFBX was 510 bp， which encoded 170 amino acid residues. Protein analysis and structure predication showed that it has a higher proportion of arginine （R）， leucine （L）， and serine （S） and a lack of trans-membrane do-mains and signal peptide. Phylogenetic analysis demonstrated that SiFBX has similarity with EID1 and FBW4. Many abiotic stress-related cis -acting elements and transcription factors were discovered in the 1.9 kb upstream region of SiFBX . The results of real-time PCR showed that there were remarkable changes in the expectation level of SiFBX for the treatments with PEG ， wa-ter-withholding， and ABA. Keywords： Setaria italica ； Drought response； F-box protein； qRT-PCR 研究表明， 泛素化蛋白连接酶E3对植物生长发育和逆境胁迫响应等过程中的关键步骤具有重要的调控作用[1]， Skp1-Cullin1-F-box （SCF）型蛋白复合物是E3中研究最深入的一类。F-box 蛋白也是真核细胞中一大类蛋白质家族， 包含了一个35～60个氨基酸组成的F-box 结构域， 在SCF 型E3介导的蛋白降解中， 起着靶蛋白识别和稳定SCF 复合物的作用。F-box 蛋白结构域的N-端部分与SKP 结合， 通过其C-端部分与靶蛋白结合发挥作用。在F-box 蛋白结 构域的下游， 常常伴随一些重要的次级元件， 如LRR （leucine-rich repeat）、WD repeat 、亮氨酸拉链结构等[2]。 Shinozaki 等[3]首先在拟南芥基因组序列中发现了近700个编码F-box 蛋白的基因， 占基因组编码总蛋白的3%左右。Jain 等[4]也在水稻基因组中发现了687个F-box 蛋白， 根据F-box 蛋白C 端的不同将其分为10大类亚家族。对功能已知的F-box 蛋白深入研究表明， F-box 蛋白几乎参与所有的植物生长发
基因克隆和表达
Cloning and expression of peroxisomal Ascorbate Peroxidase gene from wheat Yaping Chen,Huazhong Wang,Xiue Wang,Aizhong Cao&Peidu Chen* State Key Laboratory of Crop Genetics and Germplasm Enhancement,Nanjing Agricultural University, Nanjing210095,People’s Republic of China;*Author for correspondence(Phone:+86-25-84396026;E-mail: pdchen@https://www.wendangku.net/doc/d27893029.html,) Accepted24October2005 Key words:peroxisomal ascorbate peroxidase,powdery mildew,SSH,wheat Abstract A full-length cDNA encoding wheat peroxisomal ascorbate peroxidase(pAPX)was cloned by Suppression Subtractive Hybridization(SSH)and in silico approach.The cDNA was1027bp in length and contained a complete ORF of876bp,which encodes a protein of292amino acid residues.Its deduced amino acids sequence had84%identity with that of pAPX from barley.The gene was designated as Ta-pAPX.The Ta-pAPX homologous genes were mapped on wheat chromosome7A and7D using Chinese Spring nulli-tetrasomic lines analysis.Northern analysis indicated that,after inoculation by Erysiphe graminis Dc.f.sp. tritici,the expression of Ta-pAPX gene in Yangmai5was enhanced,but its expression in wheat-Haynaldia villosa6VS/6AL translocation lines changed a little.The results implied that Ta-pAPX may be related to susceptibility of wheat to powdery mildew.The complete coding sequence of Ta-pAPX was cloned into an expression vector pET32(a+)and a protein with the same deduced molecular weight(MW)was expressed in E.coli BL21(DE3),which showed ascorbate peroxidase activity. Abbreviations:APX–ascorbate peroxidase;ESTs–expressed sequence tags;IPTG–isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside;MW–molecular weight;ORF–open reading frame;pAPX–peroxisomal ascorbate peroxidase;SSH–Suppression Subtractive Hybridization. Introduction Ascorbate peroxidase(APX),found in higher plants,cyanobacteria,and algae[1],is the key enzyme in degradation hydrogen peroxide.So far, at least?ve APX isoforms have been identi?ed in plants:cytosolic isoforms,mitochondria isoforms, peroxisomal/glyoxysomal isoform and two chlo-roplastie isoforms,one in stroma and the other associated with the thylakoid membranes,all of which catalyze the reaction: 2ascorbate peroxidasetH2O2! 2monodehydroascorbatet2H2O APXs activity increased in response to a num-ber of stress conditions,such as drought[2],salt [3],high temperature[4]and pathogen infection [5].Relationship between di?erent stress condi-tions and changes of APX activity were observed. Powdery mildew caused by E.graminis DC.f.sp.tritici is one of the most serious diseases of common wheat in China and many other countries.The Triticum aestivum(‘‘Yangmai5’’)–Haynaldia villosa6VS/6AL translocation line carrying powdery mildew resistance gene Pm:21 confers e?ective resistance to all current powdery mildew races.To investigate the mechanism of Molecular Biology Reports(2006)33:207–213 DOI10.1007/s11033-005-4536-1óSpringer2006
第五章基因克隆技术
第五章基因克隆技术 基因克隆技术是分子生物学的核心技术，其目的是获得某一基因或DNA片段的大量拷贝，用于深入分析基因的结构与功能，并可达到人为改造细胞以及物种遗传性状的目的。基因克隆的一项关键技术是DNA重组技术，它利用酶学方法将不同来源的DNA分子进行体外特异性切割，重新拼接组装成一个新的杂合DNA分子。在此基础上将杂合DNA分子转入一定宿主细胞中进行扩增，形成大量的子代分子，此过程称基因克隆。有目的地通过基因克隆技术，人为操作改造基因，改变生物遗传性状的系列过程总称为基因工程。 基因克隆的一般程序为： 一、获取目的基因 目的基因就是需要研究的特定基因或DNA片段。获取目的基因的主要方法： 1、用限制性内切酶酶解染色体DNA，构建基因组文库，再从基因组文库中筛选目的基因。该法的优点是获得的目的基因的组织结构与天然基因完全相同，在结构基因中也含有内含子序列，但是也正因为这一点构成了该法最大缺点，即含有内含子的基因在原核细胞中不能表达。原因是原核细胞不能识别并剪切插入顺序(内含子)，因而也不能表达出正确的基因产物。 2、分离纯化细胞中的mRNA，以mRNA为模板，在反转录酶作用下生成cDNA第一链，再以cDNA第一链为模板在DNA聚合酶作用下生成双链cDNA,构建cDNA文库，从中筛选所需的目的基因。此法仅用于筛选为蛋白质编码的结构基因。因成熟的mRNA分子中已经切除了内含子序列，具有完整的阅读框架，可在原核细胞中正确表达。 3、人工体外合成基因：由于当前人工体外合成DNA的长度有限，此法仅用于制备小分子生物活性多肽基因和小分子量蛋白基因。在基因较大情况下，常需先合成多个DNA片段，然后拼接成完整的基因，此法还要求目的基因的全部碱基顺序已被阐明。 4、PCR法扩增基因：PCR(聚合酶链式反应)技术的出现和发展，为目的基因的寻找提供了有力技术工具。用PCR法可选择性扩增基因组中所要研究的个别基因或DNA片段，或用反向PCR技术，先将特定mRNA反转录为cDNA第一链，然后再进行扩增。用PCR法筛选基因，需要对目的基因的DNA序列至少有部分了解。 二、选择适当的载体 按上述方法制备的目的基因如果没有合适的载体协助，很难进入受体细胞，即使能进入，往往也不能进行复制和表达，因为这些外源性DNA一般不带有复制调控系统。为了保证目的基因或外源DNA片段能在细胞内克隆，必须将它们与适当的载体连接。理想的载体应该是：(1)分子量较小，能在细胞内自主复制的环状或线状DNA分子；(2)具有特异的限制性酶切位点，便于外源DNA片段的插入，且有明显的遗传筛选标志，如抗药性或插入失活等，以利于阳性克隆的筛选；(4)具有生物安全性。常用的克隆载体可分为三类，即质粒、噬菌体及病毒。由于天然载体用于基因克隆存在许多缺点，现用载体实际上是在天然载体基础上进行改造而成。 1、质粒载体质粒是细菌染色体外小型环状DNA复制子，质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。质粒载体具有如下特点：分子相对较小(3~10kb)；含松弛型复制子因而在
gfp基因的克隆与表达
基因工程实验设计 题目：绿色荧光蛋白基因(gfp)的克隆及表达 专业：生工1001 ：会淼 2013年3月13 实验目的：研究绿色荧光蛋白（Greed Fluorescent Protein，GFP）基因的基因克隆及在大肠杆菌中的表达。 实验方法; 通过分别将DH-5α (pEGFP-N3)和DH-5α(pET-28a)提取质粒、酶切并连接形成重组质粒pET-28a-GFP，将重组质粒导入E.coli DH-5α感受态细胞中进行转化,通过限制性核酸切酶Not I与Bam H1和PCR对所建质粒进行分析鉴定后, 通过转化的方法把含绿色荧光蛋白（GFP）外源基因转入大肠杆菌体BL-21进行表达，再用IPTG诱导GFP基因表达，如果可以看到显现绿色，判断GFP基因在大肠杆菌中成功表达。 1.材料与方法： 1.1.1 实验材料 克隆菌E.coli DH-5a、表达菌BL-21为本实验室收藏菌种，质粒 pET-28a 和 pEGFP-N3，引物，限制性切酶 Bam H1、 Not Ⅰ 1.1.2 仪器设备 Eppendof离心机、电泳仪、电子天平、台式离心机、控温磁力搅拌器、调温电热套pH计、冰箱、台式冷冻恒温振荡器、紫外灯、生物洁净工作台、电热恒温水温箱、琼脂糖凝胶电泳电泳装置、凝胶成像分析系统、酒精灯、培养皿、、移液枪、枪头、接种环、酒精棉球、灭菌枪头、平板封口膜、离心管 1.1.3 试剂及溶液 分装后于121 ℃高压灭菌20 min。（LB固体培养基是在液体LB中加琼脂粉至1 %）； 溶液Ⅰ 50 mL 葡萄糖50 mmol/L Tris-Cl (pH 8.0) 25 mmol/L EDTA (pH 8.0) 10 mmol/L 121℃高压灭菌 15 min后置于0~4℃贮存； 溶液Ⅱ 100 mL NaOH 0.2 mol/L
目的基因的克隆与及表达
分子生物学大实验—目的基因的克隆与及 表达 第一节基因操作概述 (2) 一、聚合酶链式反应(PCR) (2) 二、质粒概述 (4) 三、凝胶电泳 (5) 四、大肠杆菌感受态细胞的制备和转化 (6) 五、重组质粒的连接 (7) 六、限制性内切酶消化 (7) 七、SDS-PAGE蛋白质电泳 (7) 第二节材料、设备及试剂 (7) 一、材料 (8) 二、设备 (8) 三、试剂： (9) 第三节操作步骤 (10) 一、目的基因的获得： (10) 二、pET-21bT（pET-21bR、pET-21b）载体的获得： (11) 三、pET-21b等与目的片段的连接作用 (12) 四、转化大肠杆菌DH5α进行阳性克隆子筛选与鉴定
(13) 五、转化转化大肠杆菌BL21plyst，摇菌进行SDS-PAGE 电泳。 (14) 六、融合蛋白的毒力测定 (16) 第四节本实验的实验报告 (16)
第一节基因操作概述 一、聚合酶链式反应(PCR) PCR(Polymerase Chain Reaction，聚合酶链反应)是一种选择性体外扩增DNA或RNA的方法。它包括三个基本步骤：(1)变性(Denature)：目的双链DNA片段在94℃下解链；(2)退火(Anneal)：两种寡核苷酸引物在适当温度(50℃左右)下与模板上的目的序列通过氢键配对；(3)延伸(Extension)：在Taq DNA聚合酶合成DNA的最适温度下，以目的DNA为模板进行合成。由这三个基本步骤组成一轮循环，理论上每一轮循环将使目的DNA扩增一倍，这些经合成产生的DNA又可作为下一轮循环的模板，所以经25～35轮循环就可使DNA 扩增达106倍。 （一）、PCR反应中的主要成份 1、引物：PCR反应产物的特异性由一对上下游引物所决定。引物的好坏往往是PCR成败的关键。引物设计和选择目的DNA序列区域时可遵循下列原则：(1)引物长度约为16～30bp，太短会降低退火温度影响引物与模板配对，从而使非特异性增高。太长则比较浪费，且难以合成。(2)引物中
L_乳酸脱氢酶基因克隆及功能分析
20卷5期2004年9月生 物 工 程 学 报Chinese Jou rnal o f Biotechnology Vol.20 No.5 September 2004 收稿日期:2004_03_08,修回日期:2004_05_31。 *通讯作者。 Tel:86_22_23505967;Fax:86_22_23505967;E_mail:meor@https://www.wendangku.net/doc/d27893029.html, L_乳酸脱氢酶基因克隆及功能分析 李 剑 唐 梁凤来 张心平 刘如林 * (南开大学生命科学学院,天津 300071) 摘 要 构建了一株产D,L_乳酸的乳杆菌(Lactobacillus sp.)MD_1的基因文库。利用乳酸脱氢酶和丙酮酸裂解酶缺陷的Escherichia coli FMJ144作为宿主,通过互补筛选分离克隆到乳酸脱氢酶基因(ldh L )。核酸序列分析表明,该基因以ATG 为起始密码子编码316个氨基酸残基组成的蛋白质,预测的分子量为33 84kD;5 端存在典型的启动子结构,3 端的终止子是不依赖于 因子的转录终止子。ldh L 编码的蛋白质有3个保守区域,其中Gly13~Asp50保守区域是NADH 的结合位点,Asp73~Ile100和Asn123~Arg154保守区是酶的活性部位。该ldhL 和其他乳杆菌的ldhL 基因和编码的氨基酸序列相似性较低,核苷酸序列相似性最高仅为64 1%,氨基酸序列相似性最高仅为68 9%,是新的L_乳酸脱氢酶基因。 关键词 乳杆菌(Lactobacillus sp.)MD_1,L_乳酸脱氢酶基因,互补筛选,功能分析中图分类号 Q93 文献标识码 A 文章编号1000 3061(2004)05 0725 05 乳酸在食品、医药、化工、环保等领域有广泛的用途。L_乳酸的生产及其聚合物作为可降解塑料和医用材料的研究日益深入。D_乳酸的聚合物可以用于药物的缓释技术和可降解环保农药的前体物。因此,高光学纯度的D_乳酸或L_乳酸均具有广阔的应用前景[1] 。 乳酸脱氢酶(LDH )是以NAD H 为辅酶,将丙酮酸经过生化反应生成乳酸,因此LDH 是乳酸菌合成乳酸的关键酶。产D,L_乳酸的乳杆菌中存在L 和D 两种依赖NADH 的LDH,分别催化丙酮酸生成L_乳酸和D_乳酸。作者筛选到一株产DL_乳酸的乳杆菌(Lactobacillus sp.)MD_1,能在48 含200g L 葡萄糖的发酵液中快速生长并生产乳酸,72h 产量可达 140g L 以上。如果使乳杆菌的D_乳酸脱氢酶基因(ldhD )缺失,则只生产高光学纯度的L_乳酸(理论上光学纯度可达到100%),同时可以大幅提高L_乳酸产量。反之,如果使L_乳酸脱氢酶基因(ldhL )缺 失,则生产高光学纯度的D_乳酸。 本文报道了Lactobacillus sp.MD_1菌株的ldhL 序列,同时对ldhL 及编码的蛋白质的一级结构进行了初步分析。 1 材料与方法 1 1 菌株与质粒 本文所用的菌株和质粒见表1。质粒pJDC9、菌株E .coli FMJ144由Jean Delcour 教授惠赠。 表1 菌株和质粒 Table 1 Bacterial strains and plasmids used in this study Strain or plas mi d Characteri stic(s) Source or reference Lactobacillus .s p.MD_1 Wild_type s train this study E .coli FMJ144 ldh pfl ::Cam r t rpR his _29(Am )pro _2ary _427deo B arc ts x IN (rrnD _rrnE )lacY 2 TG1suoE hsd 5thi (lac _proAB ) F (traD 36)ProAB +lac I q lacZ M 15 3Plas mid pJDC9Em r ;l dhZ 4 pLZD3083 Em r ;pJ DC9wi th a 3 11Bam H fragment from s train MD_1 this study Em r ,Ap r and Cm r indicate resistance to erythro myci n,ampicillin,and chl oramphenicol,respectivel y