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001胶体金免疫层析法快速检测鼠疫耶尔森菌F1抗体

001胶体金免疫层析法快速检测鼠疫耶尔森菌F1抗体
001胶体金免疫层析法快速检测鼠疫耶尔森菌F1抗体

胶体金免疫层析试纸条在临床诊断中的 研究进展

Hans Journal of Nanotechnology纳米技术, 2019, 9(2), 55-59 Published Online May 2019 in Hans. https://www.wendangku.net/doc/da8840542.html,/journal/nat https://https://www.wendangku.net/doc/da8840542.html,/10.12677/nat.2019.92006 Colloidal Gold Immunochromatography Strip Technique and Its Application in Clinical Diagnosis Ping Meng Laboratory of Nephrology, Huadu District People’s Hospital of Guangzhou, Huadu Hospital of Southern Medical University, Guangzhou Guangdong Received: Apr. 9th, 2019; accepted: Apr. 23rd, 2019; published: May 6th, 2019 Abstract Colloidal gold immunochromatography strip (CGIS) is a new immunoassay technique in clinic. It combines the visualization of colloidal gold technique and the specificity of immunochromatography. It has been extensively applied in clinic, laboratory and family with its excellent features at present. It has good prospects for development especially in infectious diseases and autoimmune diseases. This paper will introduce and summarize the development of CGIS technique in the disease diagno-sis. Research and development of CGIS will be in the direction of more sensitive specificity and mul-tiplexed detection in the future. Keywords Colloidal, Colloidal Gold Immunochromatography Strip, Disease Diagnosis 胶体金免疫层析试纸条在临床诊断中的 研究进展 孟萍 南方医科大学附属花都医院,广州市花都区人民医院肾病实验室,广东广州 收稿日期:2019年4月9日;录用日期:2019年4月23日;发布日期:2019年5月6日 摘要 胶体金免疫层析试纸条技术(colloidal gold immunochromatography strip, CGIS)作为近年来临床上兴

1双抗体夹心法

1.双抗体夹心法 双抗体夹心法,属于非竞争结合测定。它是检测抗原最常用的ELISA,适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原,而不能用于小分子半抗原的检测。 其基本工作原理是:利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合,形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的,因此复合物的形成量与待测抗原的含量成正比(在方法可检测范围内)。测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD值),即可确定待测抗原含量。若固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个不同的抗原决定簇结合,则属于双位点夹心法。若采用固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子结合,则是双抗原夹心法。 操作步骤: ⑴将特异性抗体包被固相载体McAb。孵育一定时间,使形成固相抗体,洗涤除去未结合的抗体和杂质。 ⑵加待检标本,孵育,使标本中的抗原与固相载体上的抗体充分反应,形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。 ⑶加酶标抗体,孵育,使形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体夹心复合物。洗涤除去未结合酶标抗体。 ⑷加底物显色。固相上的酶催化底物产生有色产物,通过比色,测标本中抗原的量。 现多采用针对单一抗原决定簇特异性的单克隆抗体做固相化和酶标抗体,则受检样品和酶标抗体可一次性加入,简化流程,缩短反应时间。若标本中待测抗原浓度过高,抗原可分别与酶标抗体和固相抗体结合而不形成上述夹心复合物(类似于免疫沉淀反应中抗原过剩时的后带现象),使最终结果低于实际含量(钩状效应),甚至出现假阴性现象。因此对此类标本应适当稀释后再测定。另外,当血清中存在类风湿因子(RF)时,类风湿因子(RF)可充当抗原,而形成固相抗体-类风湿因子-酶标抗体夹心复合物,从而出现假阳性结果。 2.间接法 此法是测定抗体最常用的方法,属非竞争结合试验。其原理是将抗原连接到固相载体上,样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物,再用酶标二抗(针对受检抗体的抗体,如羊抗人IgG抗体)与固相免疫复合物中的抗体结合,形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物,测定加底物后的显色程度,确定待测抗体含量。 操作步骤 ⑴将已知抗原包被固相载体,形成固相抗原。洗涤除去未结合的抗原及杂质。 ⑵封闭:用高浓度无关蛋白封闭,阻止待检血清中非特异IgG吸附固相。 ⑶加待检血清,孵育,使固相抗原和待检抗体充分结合,洗涤除去未结合的非特异抗体及其他血清成分。 ⑷加酶标抗体或酶标SPA,孵育,形成固相抗原-待检抗体-酶标抗抗体(或酶标SPA)复合物。 ⑸加底物显色。 间接法由于采用的酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子(如抗人IgG),因此该法只需要换固相抗原,即可用一种酶标二抗检测各种与抗原相应的抗体,具有更广泛的通用性。

双抗体夹心法

1. 双抗体夹心法双抗体夹心法,属于非竞争结合测定.它是检测抗原最常用的ELISA, 适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇的多价抗原,而不能用于小分子半抗原的检测. 其基本工作原理是:利用连接于固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合,形成固相抗体-抗原-酶标抗体免疫复合物.由于反应系统中固相抗体和酶标抗体的量相对于待测抗原是过量的,因此复合物的形成量 与待测抗原的含量成正比(在方法可检测范围内). 测定复合物中的酶作用于加入的底物后生成的有色物质量(OD 值),即可确定待测抗原含量. 若固相载体上的抗体和酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个不同的抗原决定簇结合,则属于双位点夹心法.若采用固相载体上的抗原和酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子结合,则是双抗原夹心法. 操作步骤: ⑴将特异性抗体包被固相载体McAb. 孵育一定时间,使形成固相抗体,洗涤除去未结合的抗体和杂质. ⑵加待检标本,孵育,使标本中的抗原与固相载体上的抗体充分反应,形成固相抗原抗 体复合物.洗涤除去其他未结合物质. ⑶加酶标抗体,孵育,使形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体夹心复合物.洗涤除去未结合酶标抗体. ⑷加底物显色.固相上的酶催化底物产生有色产物,通过比色,测标本中抗原的量. 现多采用针对单一抗原决定簇特异性的单克隆抗体做固相化和酶标抗体,则受检样 品和酶标抗体可一次性加入,简化流程,缩短反应时间.若标本中待测抗原浓度过高,抗原可分别与酶标抗体和固相抗体结合而不形成上述夹心复合物(类似于免疫沉淀反应中抗原过剩时的后带现象),使最终结果低于实际含量(钩状效应),甚至出现假阴性现象.因此对此类标本应适当稀释后再测定.另外,当血清中存在类风湿因子(RF)时,类 风湿因子(RF)可充当抗原而形成固相抗体-类风湿因子-酶标抗体夹心复合物,从而出现假阳性结果. 2. 间接法此法是测定抗体最常用的方法,属非竞争结合试验.其原理是将抗原连接到固相载体上,样品中待测抗体与之结合成固相抗原-受检抗体复合物,再用酶标二抗(针对受检 抗体的抗体,如羊抗人IgG 抗体)与固相免疫复合物中的抗体结合,形成固相抗原-受检抗体-酶标二抗复合物,测定加底物后的显色程度,确定待测抗体含量. 操作步骤 ⑴将已知抗原包被固相载体,形成固相抗原.洗涤除去未结合的抗原及杂质. ⑵封闭:用高浓度无关蛋白封闭,阻止待检血清中非特异IgG吸附固相. ⑶加待检血清,孵育,使固相抗原和待检抗体充分结合,洗涤除去未结合的非特异抗体及其他血清成分. ⑷加酶标抗体或酶标SPA,孵育,形成固相抗原彳寺检抗体-酶标抗抗体(或酶标SPA复合物. ⑸加底物显色. 间接法由于采用的酶标二抗是针对一类免疫球蛋白分子(如抗人IgG),因此该法只需要换固相抗原,即可用一种酶标二抗检测各种与抗原相应的抗体,具有更广泛的通用性. 3. 竞争法

1双抗体夹心法

1。双抗体夹心法 双抗体夹心法,属于非竞争结合测定、它就是检测抗原最常用得ELISA,适用于检测分子中具有至少两个抗原决定簇得多价抗原,而不能用于小分子半抗原得检测。 其基本工作原理就是:利用连接于固相载体上得抗体与酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个抗原决定簇结合,形成固相抗体—抗原-酶标抗体免疫复合物。由于反应系统中固相抗体与酶标抗体得量相对于待测抗原就是过量得,因此复合物得形成量与待测抗原得含量成正比(在方法可检测范围内)、测定复合物中得酶作用于加入得底物后生成得有色物质量(OD值),即可确定待测抗原含量、若固相载体上得抗体与酶标抗体分别与样品中被检测抗原分子上两个不同得抗原决定簇结合,则属于双位点夹心法。若采用固相载体上得抗原与酶标抗原分别与样品中被检测抗体分子结合,则就是双抗原夹心法、 操作步骤: ⑴将特异性抗体包被固相载体McAb。孵育一定时间,使形成固相抗体,洗涤除去未结合得抗体与杂质。 ⑵加待检标本,孵育,使标本中得抗原与固相载体上得抗体充分反应,形成固相抗原抗体复合物、洗涤除去其她未结合物质。 ⑶加酶标抗体,孵育,使形成固相抗体-待测抗原-酶标抗体夹心复合物。洗涤除去未结合酶标抗体。 ⑷加底物显色。固相上得酶催化底物产生有色产物,通过比色,测标本中抗原得量、 现多采用针对单一抗原决定簇特异性得单克隆抗体做固相化与酶标抗体,则受检样品与酶标抗体可一次性加入,简化流程,缩短反应时间、若标本中待测抗原浓度过高,抗原可分别与酶标抗体与固相抗体结合而不形成上述夹心复合物(类似于免疫沉淀反应中抗原过剩时得后带现象),使最终结果低于实际含量(钩状效应),甚至出现假阴性现象。因此对此类标本应适当稀释后再测定。另外,当血清中存在类风湿因子(RF)时,类风湿因子(RF)可充当抗原,而形成固相抗体—类风湿因子-酶标抗体夹心复合物,从而出现假阳性结果、 2。间接法 此法就是测定抗体最常用得方法,属非竞争结合试验、其原理就是将抗原连接到固相载体上,样品中待测抗体与之结合成固相抗原—受检抗体复合物,再用酶标二抗(针对受检抗体得抗体,如羊抗人IgG抗体)与固相免疫复合物中得抗体结合,形成固相抗原-受检抗体—酶标二抗复合物,测定加底物后得显色程度,确定待测抗体含量。 操作步骤 ⑴将已知抗原包被固相载体,形成固相抗原。洗涤除去未结合得抗原及杂质。 ⑵封闭:用高浓度无关蛋白封闭,阻止待检血清中非特异IgG吸附固相。 ⑶加待检血清,孵育,使固相抗原与待检抗体充分结合,洗涤除去未结合得非特异抗体及其她血清成分。 ⑷加酶标抗体或酶标SPA,孵育,形成固相抗原-待检抗体-酶标抗抗体(或酶标SPA)复合物。 ⑸加底物显色、 间接法由于采用得酶标二抗就是针对一类免疫球蛋白分子(如抗人IgG),因此该法只需要换固相抗原,即可用一种酶标二抗检测各种与抗原相应得抗体,具有更广泛得通用性。 3、竞争法 竞争法ELISA可用于抗原与半抗原得定量测定,也可对抗体进行检测。其方法与特点

胶体金法各种方法法原理

双 抗体夹心 法原理 以FABP 为例(检测抗原) 阳性反应 Y1=F14A (标记了胶体金) Y2=F104B (固定在NC 膜上即T 线) Y3=羊抗鼠IgG (固定在NC 膜上即C 线) 此方法较常用,主要用于较大分子量的蛋白(抗原)的检测。要求两株抗体针对一个抗原的不同位点才可以。也有个别的检测项目是双抗原夹心检测抗体的,原理类似。 竞争法原理 以吗啡为例(检测抗原) 样品(血清)含FABP 蛋白 金标记F14A 抗体 金-F14A-FABP 金-F14A-FABP-F14A 金-F14A-羊抗鼠IgG 金-F14A-FABP 羊抗鼠IgG 显示红色 显示红色 金标记F14A 抗体 不显色 显示红色 金-F14A-羊抗鼠IgG 阴性反应 阳性反应

阳性反应 Y1=胶体金标记的吗啡单抗 Y2=吗啡-BSA 偶联物 Y3=羊抗鼠 此方法主要用于小分子抗原(毒品、农药、肽链等)的检测。由于抗原分子量小不能直接固定于NC 膜上,常常用化学方法把小分子偶联到BSA 等大分子物质上再固定于NC 膜上。此结果与双抗原夹心法相反,阴性CT 两条都是红线,阳性只有C 线一条红线。 间接法原理 以HIV 为例(检测抗体) 金-吗啡抗体-吗啡 吗啡-BSA 金标记吗啡抗体 显示红色 不显色 金-吗啡抗体-吗啡 羊抗鼠 样品(尿液)含吗啡 显示红色 显示红色 金标记吗啡抗体 金-吗啡抗体-羊抗鼠 阴性尿液抗体-吗 显示红色 显示红色 阴性反应 阳性反应

此方法主要用于血清中抗体检测,纯化或者重组的抗原固定于NC 膜上,标记多为蛋白A(ProteinA 或叫SPA ,抗体Fc 端结合而与其它蛋白质不结合)。此方法要求胶体金过量,一般来说样品再加入前需要稀释或者加极少量后再加缓冲液。 斑点免疫渗滤法使用就是间接法。 显示红色 不显色

胶体金法的定义和分类

胶体金是一种常用的标记技术,是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术,有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能例用到。 1971年Faulk 和Taytor将胶体金引入免疫化学,此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法,在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法(immunochromatogra-phy)和快速免疫金渗滤法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA),用于检测 HBsAg、HCG 和抗双链DNA抗体等,具有简单、快速、准确和无污染等优点。 免疫胶体金技术的基本原理: 胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如白磷、抗坏血酸、枸橼酸钠、鞣酸等作用下,可聚合成一定大小的金颗粒,并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态,形成带负电的疏水胶溶液,由于静电作用而成为稳定的胶体状态,故称胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷,可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合,由于这种结合是静电结合,所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外,还可以与许多其它生物大分子结合,如SPA、PHA、ConA 等。根据胶体金的一些物理性状,如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应,加上结合物的免疫和生物学特性,因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。 胶体金标记,实质上是蛋白质等高分子被吸附到胶体金颗粒表面的包被过程。吸附机理可能是胶体金颗粒表面负电荷,与蛋白质的正电荷基团因静电吸附而形成牢固结合。用还原法可以方便地从氯金酸制备各种不同粒径、也就是不同颜色的胶体金颗粒。这种球形的粒子对蛋白质有很强的吸附功能,可以与葡萄球菌A蛋白、免疫球蛋白、毒素、糖蛋白、酶、抗生素、激素、牛血清白蛋白多肽缀合物等非共价结合,因而在基础研究和临床实验中成为非常有用的工具。 免疫金标记技术(Immunogold labelling techique) 主要利用了金颗粒具有高电子密度的特性,在金标蛋白结合处,在显微镜下可见黑褐色颗粒,当这些标记物在相应的配体处大量聚集时,肉眼可见红色或粉红色斑点,因而用于定性或半定量的快速免疫检测方法中,这一反应也可以通过银颗粒的沉积被放大,称之为免疫金银染色。

双抗体夹心ELISA法检测CEA

双抗体夹心ELISA法检测CEA 一、实验目的 1. 阐述酶联免疫吸附测定(ELISA)的原理,列举ELISA类型 2. 完成ELISA的基本操作 3. 学会分析实验结果 4. 能根据需要设计相应的ELISA实验流程 二、实验原理 酶联免疫吸附测定(Enzyme-linked immunosorbent assay 简称ELISA)是以免疫学反应为基础,将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。 ELISA 类型:直接法(一步法);间接法(间接ELISA、双抗体/原夹心法,竞争性ELISA、BAS-ELISA)。 1. 已知的抗原或抗体结合到特定的固相载体表面(聚苯乙烯微量反应板,利用蛋白和聚苯乙烯表面间的疏水性部分相互吸附),并保持其免疫学活性。 将抗原或抗体固定在固相载体表面的过程称为包被(coating)。蛋白质与聚苯乙烯固相载体是通过物理吸附结合的,靠的是蛋白质分子结构上的疏水基团与固相载体表面的疏水基团间的作用。这种物理吸附是非特异性的,受蛋白质的分子量、等电点、浓度等的影响。大分子蛋白质较小分子蛋白质通常含有更多的疏水基团,故更易吸附到固相载体表面。 包被用抗原分为——天然抗原、重组抗原和合成多肽抗原三大类。 合成多肽抗原是抗原决定簇的氨基酸序列人工合成的多肽片段。一般只含有一个抗原决定簇,纯度高,特异性也高,但由于分子量太小,往往难于直接吸附于固相上。借助于偶联物与固相载体的吸附,间接地结合到固相载体表面。 2. 抗原抗体的特异性结合:可用于以已知抗原检测未知抗体或以已知抗体检测未知抗原。本实验采用以已知抗体检测未知抗原。 3. 抗原或抗体可通过共价键与酶连接形成酶结合物,而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性。结合在固相载体上的酶量与标本中待测抗原或抗体的量成正比。 (制备结合物时所用纯度较高的IgG,以免在与酶联结时其他杂蛋白的干扰。最好用层析纯化的抗体,这样全部酶结合物均具有特异的免疫活性,可以在高稀释度进行反应,实验结果本底浅淡。抗原必须是高纯度的。) 4. 酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,因此,可以按底物显色的程度显示试验结果,还可通过ELISA检测仪进行定量测定,这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来,使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。 常用于ELISA法的酶有辣根过氧化物酶(HRP),碱性磷酸酯酶等,其中尤以辣根过氧化物酶为多。由于酶催化的是氧化还原反应,在呈色后须立刻测定(30min内),否则空气中的氧化作用使颜色加深,无法准确地定量。 ELISA法中所用的酶要求纯度高,催化反应的转化率高,转一性强,性质稳定,继续保留它的活性部位和催化能力。 HRP的色原底物: OPD(邻苯二胺)被认为是HRP最为敏感的色原底物之一,其在HRP的作用下,由过氧化氢(H202) 氧化而聚合成2,2’—二氨基偶氮苯(DAB)。缺点:实际工作中,用强酸尤其

免疫胶体金技术常见影响因素分析

免疫胶体金技术常见影响因素分析 自胶体金作为特殊标记物进行研究以来,建立的各种免疫胶体金技术以其特异性强、灵敏度高、操作简捷等特点,在医学、农牧业、环境及食品检测等领域被广泛应用。免疫胶体金技术的反应过程是一个由金颗粒、抗原与抗体动态结合的反应过程,在这个过程中每个环节的好坏都直接影响试验的成败。而试验过程中每个环节又受到很多因素的影响和制约,下面将影响免疫胶体金技术的因素作一分析,为成功制备胶体金检测产品提供参考。 1耗材的选择 1.1不同型号膜的筛选。硝酸纤维素膜的型号在试验中至关重要,作为反应载体影响到整个试验的成败。不同的生产厂家生产硝酸纤维素膜时使用的聚合物和表面活性剂的来源、类型和数量均大不相同,对生产出的膜的性能产生较大影响——膜的孔径和分布结构不同。膜孔径减小,膜的实际可用表面积递增,膜结合蛋白的量也递增;膜孔径越小,层析速度也越慢,金标复合物通过T线的时间就越长,反应也就越充分;因此膜孔径越小灵敏度越高,但是同时也减慢了跑板速度,增加了非特异性结合的机会,也就是假阳性越高。用于金标免疫快速试验的膜多为硝酸纤维素膜或硝酸纤维素/醋酸纤维素混合膜,不同的包被蛋白对膜有特定要求,试验者应根据蛋白质的性质选择适合孔径大小和分布结构的膜,找到合适的平衡点,使胶体金的标记物在膜上的流动速率为最佳。 1.2结合垫的选择。结合垫位于层析系统的中间,一般要求结合垫的网格均一且非特异性吸附低,能很好地负载胶体金标记物和待检测样品,而不被吸附;玻璃纤维素膜具备以上优点,同时具有一定的硬度,为试验中常用。 1.3样品垫及吸水纸的选择。样品垫和吸水纸位于胶体金免疫层析系统的两端,对于胶体金层析系统功能的实现起着举足轻重的作用。试验中应根据试纸条检测样品的性质选择合适的样品垫和吸水纸,保证样品在样品垫形成的通道中快速地流动而不被非特异性地吸附或者改变样品的性质。如检测样品为血清,则可选择网格较疏松的玻璃纤维素膜即可;如果检测样品为毒素,则可选择质量好的吸水纸和样品垫。吸水纸则要有很好的蓄水能力,保证样品中所用的液体都经过膜的反应区而被样品垫吸收和蓄积。 2关于胶体金的制备 制备颗粒均匀、分散度好的胶体金在金标免疫快速试验中非常关键,如果金颗粒直径的变异范围太大就会影响到试验的稳定性和重复性,如果金颗粒的形状不规则或粒径不均一,使得胶体金标记物容易解离和沉淀而产生金标扩散不完全、反应区底色过深和假阳性现象;而且胶体金质量不好,胶体

最新ELISA双抗体夹心法

ELISA双抗体夹心法 点击次数:320 作者:百奥迈科发表于:2009-03-13 16:18转载请注明来自丁香园 1、原理 ELISA 的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。受检标本与固相载体表面的抗原或抗体起反应。用洗涤的方法使固相载体上形成的抗原抗体复合物与液体中的其他物质分开。加入酶标记的抗原或抗体,通过反应也结合在固相载体上。加入酶反应的底物后,底物被酶催化成为有色产物,产物的量与标本中受检物质的量直接相关,根据呈色的深浅进行定性或定量分析。酶的催化效率很高,间接地放大了免疫反应的结果,使测定方法达到很高的敏感度。 2、特点 某些分泌型蛋白,用siRNA 干扰后可以用ELISA 进行检测。 3、ELISA 实验流程示图(以双抗体夹心法为例) 4、试剂与耗材 (1)包被缓冲液(pH 9.6 0.05 M 碳酸盐缓冲液): (2)洗涤缓冲液(pH 7.4,0.15 M PBS):

(3)稀释液: (4)终止液(2 M H2SO4): (5)底物缓冲液(pH 5.0): (6)四甲基联苯胺(TMB)使用液: (7)2,2’-连氮基-双-3-乙基-苯丙噻唑啉磺胺(ABTS)使用液:

(8)抗原、抗体和酶标记抗体:按说明书处理。 (9)标准品:用稀释液稀释成梯度浓度溶液。 (10)96 孔聚苯乙烯塑料板(酶标板)。 2、实验步骤(双抗体夹心法): (1)包被:用包被缓冲液将抗体稀释至蛋白质含量为1-10 μg/mL。在酶标板反应孔中加0.1 mL,4℃过夜。次日,弃去孔内溶液,用洗涤缓冲液洗板3 次,每次3 min。 (2)加样:加一定浓度稀释的待检样品(同时做空白对照,阴性对照孔及阳性对照)0.1 mL 于上述已包被的反应孔中,置湿盒中,37℃, 1 hr。用洗涤缓冲液洗板3 次,每次3 min。 (3)加酶标抗体:于各反应孔中,加入新鲜稀释的酶标抗体(经滴定后的稀释度)0.1ml。 37℃,0.5 - 1 hr,用洗涤缓冲液洗板3 次,每次3 min。 (4)加底物液显色:于各反应孔中加入现配的TMB 底物溶液0.1 mL,37 ℃,10 - 30min。 (5)终止反应:于各反应孔中加入终止液0.05 mL。 (6)结果判定:将酶标板在酶标仪上,于450 nm (若ABTS 显色,读410 nm),读数,输出到Excel 中。 (7)以标准品浓度为横坐标,吸光度为纵坐标,生成标准曲线和直线回归方程式,根据公式计算未知样品的浓度,并记录。

免疫胶体金技术(Immune colloidal gold technique)

(2)试剂配制必须保持严格的纯净,所有试剂都必须使用双馏水或三馏水并去离子后配制,或者在临用前将配好的试剂经超滤或微孔滤膜(0.45μm)过滤,以除去其中的聚合物和其它可能混入的杂质。 (3)配制胶体金溶液的pH以中性(pH7.2)较好。 (4)氯金酸的质量要求上乘,杂质少。最好是进口的。 (5)氯金酸配成1%水溶液在4℃可保持数月稳定,由于氯金酸易潮解,因此在配制时,最好将整个小包装一次性溶解。 (三)胶体金标记蛋白的制备 胶体金对蛋白的吸附主要取决于pH值,在接近蛋白质的等电点或偏碱的条件下,二者容易形成牢固的结合物。如果胶体金的pH值低于蛋白质的等电点时,则会聚集而失去结合能力。除此以外胶体金颗粒的大小、离子强度、蛋白质的分子量等都影响胶体金与蛋白质的结合。 1、待标记蛋白溶液的制备将待标记蛋白预先对0.005Mol/L pH7.0 NaCl溶液中4℃透析过夜,以除去多余的盐离子,然后100 000g4℃离心1h,去除聚合物。 2、待标胶体金溶液的准备以0.1Mol/L K2CO3或0.1Mol/L HCl调胶体金液的pH值。标记IgG时,调至9.0;标记McAb时,调至8.2;标记亲和层析抗体时,调至7.6;标记SPA 时,调至5.9~6.2;标记ConA时,调至8.0;标记亲和素时,调至9~10。 由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板,因此,在调节pH时,采用精密pH试纸测定为宜。 3、胶体金与标记蛋白用量之比的确定 (1)根据待标记蛋白的要求,将胶体金调好pH之后,分装10管,每管1ml。 (2)将标记蛋白(以IgG为例)以0.005Mol/L pH9.0硼酸盐缓冲液做系列稀释为 5μg/ml~50μg/ml,分别取1ml,加入上列金胶溶液中,混匀。对照管只加1ml稀释液。 (3)5min后,在上述各管中加入0.1ml 10%NaCl溶液,混匀后静置2h,观察结果。 (4)结果观察,对照管(未加蛋白质)和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管,均呈现出由红变蓝的聚沉现象;而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量,即为该标记蛋白质的最低用量,在实际工作中,可适当增加10%~20%。 4、胶体金与蛋白质(IgG)的结合将胶体金和IgG溶液分别以0.1Mol/L K2CO3调pH至9.0,电磁搅拌IgG溶液,加入胶体金溶液,继续搅拌10min,加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。常用稳定剂是5%胎牛血清(BSA)和1%聚乙二醇(分子量20KD)。加入的量:5%BSA使溶液终浓度为1%;1%聚乙二醇加至总溶液的1/10。 5、胶体金标记蛋白的纯化 (1)超速离心法:根据胶体金颗粒的大小,标记蛋白的种类及稳定剂的不同选用不同的离心速度和离心时间。 用BSA做稳定剂的胶体金—羊抗兔IgG结合物可先低速离心(20nm金胶粒用1 200r/min,5nm金胶粒用1 800r/min)20min,弃去凝聚的沉淀。然后将5nm胶体金结合物用6 000g,4℃离心1h;20nm~40nm胶体金结合物,14 000g,4℃离心1h。仔细吸出上清,沉淀物用含1%BSA的PB液(含0.02%NaN3),将沉淀重悬为原体积的1/10,4℃保存。如在结合物内加50%甘油可贮存于-18℃保存一年以上。 为了得到颗粒均一的免疫金试剂,可将上述初步纯化的结合物再进一步用10%~30%蔗糖或甘油进行密度梯度离心,分带收集不同梯度的胶体金与蛋白的结合物。

复旦大学免疫实验ELISA双抗体夹心法检测抗原

ELISA双抗体夹心法检测抗原 实验时间:实验地点:实验人: 1实验目的 1.阐述ELISA(酶联免疫吸附测定)的原理,列举ELISA类型 2.完成ELISA的基本操作 3.学会分析实验结果 4.能根据需要设计相应的ELISAS实验流程 2实验原理 ELISA:是以免疫学反应为基础,将抗原、抗体的特异性反应与酶对底物的高效催化作用相结合起来的一种敏感性很高的实验技术。 ELISA双抗体夹心法常用于检测抗原。将已知道抗体吸附于固相载体上,加入待检含相应抗原的标本使之结合反应。然后洗涤,再加入酶标抗体和底物进行测定。但该方法只适用于检测多价大分子抗原,不适合检测小分子半抗原。 结合在固相载体表面的抗原或抗体仍保持其免疫学活性,酶标记的抗原或抗体既保留其免疫学活性,又保留酶的活性。通过加入与酶反应的底物后显色,根据颜色的深浅可以判断样品中物质的含量,进行定性或定量的分析,可以间接放大免疫反应结果。所以说ELISA的基础是抗原或抗体的固相化及抗原或抗体的酶标记。 酶结合物与相应抗原或抗体结合后,可根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在,而且颜色反应的深浅是与标本中相应抗原或抗体的量成正比例的,因此,可以按底物显色的程度显示试验结果,还可通过ELISA检测仪进行定量测定,这样就将酶化学反应的敏感性和抗原抗体反应的特异性结合起来,使ELISA方法成为一种既特异又敏感的检测方法。 3实验材料 1.酶标反应板(包被有抗CEA抗体) 2.CEA标准品(0ng/ml,5ng/ml,10ng/ml,20ng/ml,40ng/ml,80ng/ml) 3.样品1和样品2 4.酶标抗体(酶结合物) 5.底物液A和底物液B(显色剂A和B) 6.终止液 7.洗涤液

人绒毛膜促性腺激素(HCG)检测试纸(胶体金免疫层析法)产品技术要求jinwofu

人绒毛膜促性腺激素(HCG)检测试纸(胶体金免疫层析法) 适用范围:用于体外定性检测人尿液中人绒毛膜促性腺激素(HCG)的含量。1.1 产品型号/规格:笔型/卡型/条型。完整最小包装规格1人份。 1.2 主要组成成分:本品系由包被有抗HCG单克隆抗体及抗鼠IgG的固相硝酸纤维膜和 胶体金标记的抗HCG单克隆抗体包被的玻璃纤维膜、样本垫及吸水纸组成。2.1 物理性状 2.1.1 外观:检测HCG试纸应整洁完整、无毛刺、无破损、无污染;材料附着牢固。 2.1.2 宽度:检测HCG试纸的宽度应≥2.5mm。 2.1.3 移行速度:液体移动速度应不低于10 mm/min。 2.2 最低检测限 用HCG国家标准品进行检测,应不高于25 mIU/ml。 2.3 特异性: 2.3.1 阴性特异性:分别用含500 mIU/ml人促黄体生成素(hLH)、1000 mIU/ml 人卵泡刺激素(hFSH)和1000 μIU/ml人促甲状腺素(hTSH)的0 mIU/ml人绒毛促性腺激素(HCG)液进行检测,结果应均为阴性。 2.3.2 阳性特异性:分别用含500 mIU/ml hLH、1000 mIU/ml hFSH 和1000 μIU/ml hTSH的25 mIU/ml HCG液中进行检测,结果应均为阳性。 2.4 重复性 取同一批号的HCG试纸10支,以浓度为25 mIU/ml的HCG液测定,反应结果一致,显色度均一。

2.5 批间差 取3个批号的HCG试纸,对重复性进行检测,3个批号HCG试纸的检测结果都应符合2.4项的要求。 2.6 稳定性 试剂盒4~30℃避光保存,有效期为24个月,对到效期后的试剂盒,分别检测2.1~2.4项,结果应符合各项的要求。

ELISA双抗体夹心法—检测HBs

E L I S A双抗体夹心法—检 测H B s The latest revision on November 22, 2020

ELISA(双抗体夹心法)—检测HBsAg 摘要: 以已知抗体(抗HBs)包被载体,然后将含有抗原的待检标本加入,共同孵育后,抗原结合于包被抗体上,再加入酶标记特异抗体(酶标抗HBs),酶标抗体连接到抗原上,最后加入底物溶液,根据颜色反应来判定抗原含量。【材料】HBsAg试剂盒,本试剂盒含: 1、包被抗-HBs反应条 1瓶 2、酶结合物 1瓶 3、HBsAg阳性对照 1瓶 4、HBsAg阴性对照 1瓶 5、洗涤液:用前每瓶作1:20稀释 1瓶 6、显色剂( 相关专题 以已知抗体(抗HBs)包被,然后将含有的待检标本加入,共同孵育后,结合于包被抗体上,再加入酶标记特异抗体(酶标抗HBs),酶标抗体连接到抗原上,最后加入底物溶液,根据颜色反应来判定抗原含量。 【材料】HBsAg试剂盒,本试剂盒含: 1、包被抗-HBs反应条 1瓶

2、酶结合物 1瓶 3、HBsAg阳性对照 1瓶 4、HBsAg阴性对照 1瓶 5、洗涤液:用前每瓶作1:20稀释 1瓶 6、显色剂(TMB)A 1瓶 7、显色剂(TMB)B 1瓶 8、终止液 1瓶 【方法】 1、加入待测标本每孔,并设HBsAg阳性对照2孔,HBsAg阴性对照2孔,空白对照1孔,然后加入酶结合物每孔1滴、空白对照孔不加),充分混匀后置37℃孵育30分钟。 2、洗板:弃去反应条孔内液体、拍干、用洗涤液注满每孔,弃去拍干,反复五次后拍干。 3、显色剂:先加显色剂A每孔1滴,然后再加显色剂B每孔1滴,混匀,37℃孵育10分钟。 4、每孔加终止液1滴,混匀。 【结果】

几种胶体金技术详解

胶体金免疫分析技术详解 随着免疫分析日益广泛应用于以临床为主以及非临床领域的诊断工业,免疫分析正在向两个方向发展:一类为全自动化的免疫分析;另一类为以硝酸纤维膜为载体的快速免疫分析。前者需要价格昂贵的全自动仪器及与仪器严格配套的各种试剂盒,目前只能在医疗及检测中心应用,虽也能较快速给出结果,但仍需一定时间,不适合远离医疗及检测中心的地区,更不能用于“患者床旁检验”和普查的需要,在酶免疫分析的基础上,主要以硝酸纤维素膜为载体的快速诊断方法迅速和广泛地发展起来。这类方法目前在文献及市场上的命名还很不统一。它实际上属于快速斑点免疫结合分析,主要有以下两种方法:斑点免疫渗滤分析DIFA和斑点免疫层析分析DICA。本篇主要介绍以金作为标志物的胶体金免疫分析技术。 金标记免疫分析技术也称免疫胶体金技术,是于1971年建立的一种信号显示技术。此技术最初用于免疫电镜检查,由胶体金颗粒标记抗原或抗体,与组织或细胞中相应的抗体或抗原相结合,在电子显微镜的检查时可起特异的示踪作用。此后,此技术与银染技术相结合建立的免疫金银染色法,使抗原抗体特异反应信号可在光学显微镜下观察。近10多年来,利用硝酸纤维素膜(NC)等为固相载体,以胶体金标记的抗原或抗体与特异配体的反应在膜上进行,建立了快速的金标记免疫渗滤技术和金标记免疫层析技术,并在传染病、心血管病、风湿病、自身免疫病的免疫学检测中广泛应用。 胶体金是指金微小粒子(0-100nm)分散在另一种物质中所形成的体系,通常指金以微小粒子分散在溶液中所形成的金溶胶,用此金溶胶标记蛋白质(抗原、抗体或SPA、SPG),胶体金颗粒具有高电子密度的特性,故在金标蛋白的抗原抗体结合处,显微镜下可见黑褐色颗粒;当这些标记物在相应的标记处大量聚集时,可在载体膜上呈现红色或粉红色斑点,从而用于抗原或抗体物质的半定量或定性。 与ELISA不同之处便是反应时间大大缩短,仅需要数分钟就完成了ELISA需数小时才能显示的结果。因为在GIFA和GICA中,高浓度的抗体集中固定在纤维素的微孔中,待测抗原在渗滤或层析时,流经微孔与固定的高浓度抗体紧密接触,很快完成免疫结合反应。这就是以膜为基础的胶体金快速免疫结合分析中的免疫浓缩作用。在ELISA中,待测抗原要在液相中经过扩散作用,逐渐与吸附在固相表面的抗体结合。同时,标记抗体也需要同样的扩散结合过程形成抗体-抗原-标记抗体复合物,故需时间较长。故此技术做到了名副其实的POCT。 原理: 将氯金酸(HAuCl4)用还原法制成一定直径的金溶胶颗粒(胶体金),标记金黄色葡萄球菌A

ELISA(双抗体夹心法)—检测HBsAg

ELISA(双抗体夹心法)—检测HBsAg 摘要: 以已知抗体(抗HBs)包被载体,然后将含有抗原的待检标本加入,共同孵育后,抗原结合于包被抗体上,再加入酶标记特异抗体(酶标抗HBs),酶标抗体连接到抗原上,最后加入底物溶液,根据颜色反应来判定抗原含量。【材料】HBsAg试剂盒,本试剂盒含: 1、包被抗-HBs反应条 1瓶 2、酶结合物 1瓶 3、HBsAg阳性对照 1瓶 4、HBsAg阴性对照 1瓶 5、洗涤液:用前每瓶作1:20稀释 1瓶 6、显色剂( 找产品,上生物帮>> >> 相关专题 ELISA免疫实验技术 以已知抗体(抗HBs)包被载体,然后将含有抗原的待检标本加入,共同孵育后,抗原结合于包被抗体上,再加入酶标记特异抗体(酶标抗HBs),酶标抗体连接到抗原上,最后加入底物溶液,根据颜色反应来判定抗原含量。 【材料】HBsAg试剂盒,本试剂盒含: 1、包被抗-HBs反应条 1瓶

2、酶结合物 1瓶 3、HBsAg阳性对照 1瓶 4、HBsAg阴性对照 1瓶 5、洗涤液:用前每瓶作1:20稀释 1瓶 6、显色剂(TMB)A 1瓶 7、显色剂(TMB)B 1瓶 8、终止液 1瓶 【方法】 1、加入待测标本每孔0.05ml,并设HBsAg阳性对照2孔,HBsAg阴性对照2孔,空白对照1孔,然后加入酶结合物每孔1滴(0.05ml、空白对照孔不加),充分混匀后置37℃孵育30分钟。 2、洗板:弃去反应条孔内液体、拍干、用洗涤液注满每孔,弃去拍干,反复五次后拍干。 3、显色剂:先加显色剂A每孔1滴(0.05ml),然后再加显色剂B每孔1滴(0.05ml),混匀,37℃孵育10分钟。 4、每孔加终止液1滴(0.05ml),混匀。 【结果】

双抗体夹心法之钩状效应

钩状效应是指在双抗体夹心法测抗原的一步法ELISA中,测定显色随着待测标本中抗原浓度的增加而升高至一定程度后,测定吸光度即随抗原浓度的增加而开始下降直到不显色,而出现假阴性结果。 抗原抗体最适比例 在恒定量的抗体中加入递增量的抗原形成抗体复合物(沉淀)的量见图1。曲线的高峰部分是抗原抗体比例最合适的范围,称为等价带(zone of equivalence)。在等价带前后分别为抗体过剩带和抗原过剩带。如果抗原或抗体极度过剩,则无沉淀物形成,在免疫测定中称为带现象(zone phenomenon)。抗体过量称为前带(prezone),抗原地过量称为后带(postzone)。在用免疫学方法测定抗原时,应使反应系统中有足够的抗体量,否则测得的量会小于实际含量,甚至出现假阴性。 图1沉淀反应中沉淀量与抗原抗体的比例关系 (RF)的双抗体夹心法测抗原 双抗体夹心法是检测抗原最常用的方法,操作步骤如下: 1)将特异性抗体与固相载体联结,形成固相抗体。洗涤除去未结合的抗体及杂质。 2)加受检标本,保温反应。标本中的抗原与固相抗体结合,形成固相抗原抗体复合物。洗涤除去其他未结合物质。 3)加酶标抗体,保温反应。固相免疫复合物上的抗原与酶标抗体结合。彻底洗涤未结合的酶标抗体。此时固相载体上带有的酶量与标本中受检抗原的量相关。 4)加底物显色。固相上的酶催化底物成为有色产物。通过比色,测知标本中抗原的量。 在临床检验中,此法适用于检验各种蛋白质等大分子抗原,例如HBsAg、HBeAg、AFP、hCG等。只要获得针对受检抗原的特异性抗体,就可用于包被固相载体和制备酶结合物而建立此法。 如抗体的来源为抗血清,包被和酶标用的抗体最好分别取自不同种属的动物。如应用单克隆抗体,一般选择两个针对抗原上不同决定簇的单抗,分别用于包被固相载体和制备酶结合物。这种双位点夹心法具有很高的特异性,而且可以将受检标本和酶标抗体一起保温反应,作一步法检测。 在一步法测定中,当标本中受检抗原的含量很高时,过量抗原分别和固相抗体及酶标抗体结合,而不再形成"夹心复合物"。类同于沉淀反应中抗原过剩的后带现象,此时反应后显色的吸光值(位于抗原过剩带上)与标准曲线(位于抗体过剩带上)某一抗原浓度的吸光值相同,如按常法测读,所得结果将低于实际的含量,这种现象被称为钩状效应(hook effect),

简明免疫胶体金技术流程

胶体金标记技术 胶体金是一种常用的标记技术,有其独特的优点。近年已在各种生物学研究中广泛使用。在临床使用的免疫印迹技术几乎都使用其标记。同时在流式、电镜、免疫、分子生物学以至生物芯片中都可能利用到。 1971年Faulk 和Taytor将胶体金引人免疫化学,此后免疫胶体金技术作为一种新的免疫学方法,在生物医学各领域得到了日益广泛的应用。目前在医学检验中的应用主要是免疫层析法(immunochromatogra-phy)和快速免疫金渗滤法(Dot-immuogold filtration assay DIGFA),用于检测 HBsAg、HCG 和抗双链DNA抗体等,具有简单、快速、准确和无污染等优点。 (一)基本原理 免疫胶体金技术是以胶体金作为示踪标志物应用于抗原抗体的一种新型的免疫标记技术。胶体金是由氯金酸(HAuCl4)在还原剂如柠檬酸钠、鞣酸、抗坏血酸、白磷、硼氢化钠等作用下,聚合成为特定大小的金颗粒,并由于静电作用成为一种稳定的胶体状态,称为胶体金。胶体金在弱碱环境下带负电荷,可与蛋白质分子的正电荷基团形成牢固的结合,由于这种结合是静电结合,所以不影响蛋白质的生物特性。 胶体金除了与蛋白质结合以外,还可以与许多其它生物大分子结合,如SPA、PHA、ConA等。根据胶体金的一些物理性状,如高电子密度、颗粒大小、形状及颜色反应,加上结合物的免疫和生物学特性,因而使胶体金广泛地应用于免疫学、组织学、病理学和细胞生物学等领域。 (二)胶体金的制备 胶体金的制备一般采用还原法,根据不同的还原剂可以制备大小不同的胶体金颗粒。常用来制备胶体金颗粒的方法如下: 1.枸橼酸三钠还原法 (1)10nm胶体金粒的制备:取0.01%HAuCl4水溶液100ml,加入1%枸橼酸三钠水溶液3ml,加热煮沸30min,冷却至4℃,溶液呈红色。 (2)15nm胶体金颗粒的制备:取0.01%HAuCl4水溶液100ml,加入1%枸橼酸三钠水溶液2ml,加热煮沸15min~30min,直至颜色变红。冷却后加入0.1Mol/L K2CO30.5ml,混匀即可。 (3)15nm、18nm~20nm、30nm或50nm胶体金颗粒的制备:取0.01%HAuCl4水溶液100ml,加热煮沸。根据需要迅速加入1%枸橼酸三钠水溶液4ml、2.5ml、1ml或0.75ml,继续煮沸约5min,出现橙红色。这样制成的胶体金颗粒则分别为15nm、18~20nm、30nm和50nm。 金溶胶颗粒的直径和制备时加入的柠檬酸三钠量是密切相关的,保持其他条件恒定,仅改变加入的柠檬酸三钠量,可制得不同颜色的金溶胶,也就是不同粒径的金溶胶,见表1。 2.鞣酸-枸橼酸钠还原法 用此混合还原剂可以得到比较满意的金溶胶 A液:1%HAuCl4水溶液1ml加入79ml双馏水中混匀。 B液:1%枸橼酸三钠4ml,1%鞣酸0.7ml,0.1Mol/L K2CO3液0.2ml,混合,加入双馏水至20ml。

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