大鼠海马神经元MR于穹窿切断后表达变化的研究

大鼠海马神经元MR于穹窿切断后表达变化的研究1

张彦慧1，韩芳2，石玉秀2,*

1海南医学院组织学与胚胎学教研室, 海南海口（571000）

2中国医科大学基础医学院组织学与胚胎学教研室，辽宁沈阳（110001）

摘要：目的建立大鼠穹窿切断模型研究海马神经元核受体－盐皮质激素受体（Mineralocorticoid Receptor, MR）表达的变化。方法建立大鼠穹窿切断模型，于穹窿切断术后0、4、7、10天取材；同时取材假手术组（非穹窿切断术）、正常组作为对照，应用免疫组化、Western Blotting方法分别进行各组海马神经元MR表达变化的观察及定量检测。结果穹窿切断7天后，免疫组化和Western Blotting结果显示海马神经元MR表达下调，10天下调更为显著。结论穹窿切断后，海马MR表达下调，提示海马对HPA轴的抑制作用可能在穹窿切断后减弱。

关键词：穹窿切断术；MR；海马；神经元

下丘脑－垂体－肾上腺（hypothalamic-pituitary-adrenal, HPA）轴作为神经内分泌网络的枢纽在维持机体内环境平衡、调节机体衰老过程中起着重要的作用，海马是HPA轴功能调节的重要组成部分，其对HPA轴的负反馈调节作用主要是通过海马内的核受体－盐皮质激素受体（Mineralocorticoid Receptor, MR）、糖皮质激素受体（Glucocorticoid Receptor, GR）介导的，其中MR参与基础水平HPA轴的负反馈调节[1]。一些研究表明：海马对HPA轴的负反馈调节作用可能是由于海马媒介穹窿对下丘脑室旁核产生了抑制作用[2,3]。本实验建立大鼠穹窿切断模型，应用免疫组化、Western Blotting检测了大鼠穹窿切断后海马MR的表达变化，为进一步揭示海马负反馈调节HPA轴的机制提供实验依据。

1. 材料和方法

1.1 实验动物及分组

成年健康雄性Wistar大鼠90只，体重200－220g，中国医科大学实验动物中心提供，实验室条件饲养，随机分为9组，即穹窿切断0天、4天、7天、10天组、相应假手术组和正常组。每组10只，分别用于免疫组化和Western Blotting各半。

1.2 动物模型的建立

将大鼠用戊巴比妥将其麻醉后，固定于江湾IC型脑立体定位仪，常规消毒、剪毛，正中切开头皮，暴露出颅骨，于前囟后1.5mm，中线外左右1.0mm处，用电动开颅器凿开颅骨，切开硬脑膜，用自制的双刃刀先置于上述部位的脑表面，（相当于穹窿部位），续降刀6mm，切断穹窿，降刀时间约1分钟，假手术组降刀2mm，（未切穹窿），刀在脑中均停留5分钟[3]。清洁颅面，缝合头皮，常规饲养，抗菌素控制感染。

1.3 取材

各组Wistar大鼠依次乙醚麻醉，用2％戊巴比妥腹腔内注射强化麻醉，打开胸腔，施心脏灌流，生理盐水快速冲洗血道，4％的多聚甲醛灌流固定，取出大脑，于同种固定液中续固定3小时，浸于Holt′s液（40％蔗糖，0.1mPBS配制）中2－3天至沉下。

1本课题得到教育部博士点基金〔2005〕216号（20050159011）和辽宁省教育厅科技攻关项目 [A类] [2005] 153号[05 L491]的资助。

*石玉秀，通讯作者。

1.4 免疫组化SABC 法染色

从Holt ′s 液中取出脑，用恒冷箱切片机（型号Leica ）制作冰冻切片，厚14μm ，

3%H2O2-甲醇20min 以阻断内源性过氧化物酶、0.03% Triton X-100浸泡10min ，5％BSA 封闭20min 后，滴加兔抗鼠MR 抗体（Doctor Fan H 友情馈赠，工作浓度为1:200），阴性对照组加0.01M PB S 代替一抗，4℃冰箱孵育过夜,滴加生物素化羊抗兔IgG37℃、20min ， 滴加SABC37℃、20min ，以上各步间用0.01M PBS 漂洗, DAB 显色,常规脱水,透明,中性树胶封片.光学显微镜（OLYMPUS, BX60, Japan ）下观察，摄片。

1.5 Western Blotting

取新鲜海马组织经匀浆、超声粉碎后高速低温离心，11000rmp/min ，取上清；每例标本提取蛋白50μg ，7.5％SDS －PAGE 变性凝胶电泳，浓缩胶80v 、30min ，分离胶120v ，90min ；转印，40v 、95 min 和100v 、120 min ；TBS 浸泡10 min ，5%脱脂奶粉封闭60 min ，TTBS 中洗2次×5 min ；,兔抗鼠MR 一抗(Doctor Fan H 友情馈赠，工作浓度1:500）中孵育4℃过夜；HRP 标记羊抗兔IgG （工作浓度1:1500）孵育2h ，TTBS 洗2次×5 min ，TBS 洗1次×10 min ，DAB 法显色10 min, DH2O 漂洗，扫描PVDF 膜进行定量检测。

1.6 图像分析及统计学分析

采用Motic Images Advanced 3.2图像分析系统，在海马CA1区内测每高倍（10×40倍）视野内MR 的光密度值，每张切片选2-3个视野，计算各组平均光密度（IOD ）。所得数据用SPSS13.0软件处理，采用方差分析进行两两比较，以 P<0.05为有统计学意义。Western Blotting 结果进行图像扫描后分析各条带的灰度值。

2. 结 果

2.1 MR 免疫组化反应染色结果

MR 免疫反应阳性产物呈棕褐色表达，主要位于海马CA1、CA2、CA3区的锥体细胞层和齿状回的颗粒细胞层神经元的细胞质和细胞核内。

正常组及假手术组：海马CA1区，棕褐色MR 表达阳性的锥体细胞数目较多，细胞排列较整齐，有突起，有的细胞可见核仁。穹窿切断组：0、4天组海马CA1区MR 免疫反应阳性细胞数目、染色与假手术组相比，无明显差异，（p ＞0.05）。穹窿切断7天、10天组海马CA1区免疫阳性细胞数较正常组、假手术组明显减少，染色浅，（p ＜0.05）而且穹窿切断10天组较穹窿切断7天组免疫反应阳性细胞少，染色更浅，表达减弱（p ＜0.05）。（见表1和图1－6）

表1 海马CA1区MR 免疫反应平均光密度值（IOD ）（X ——

±s ）

Table 1 The IOD value of immunoreaction of MR in the hippocampal area CA1

时间

（time ）

正常组 （normal ） 假手术组 (sham operation) 穹窿切断组 (fornix transection) 4d

7d 0.305±0.016 0.309±0.021 0.295±0.016 0.294±0.026 0.298±0.025 0.256±0.010▲

0.205±0.017﹡

与相应假手术组比较（compared with corresponding sham operation ）P ＜0.05, P ＜0.05

与穹窿切断10天组比较（compared with fornix transection 10 day ）▲P ＜0.05

2.2 Western Blotting 结果

Western Blotting 检测发现海马MR 的表达在穹窿切断7天、10天组较假手术组下调，且MR 在10天组较7天组表达量少（p ＜0.05），0、4天组与假手术组相比无明显差异（p ＞0.05）（见表2和图7）

图7海马MR Western Blotting 结果

Fig.7 Western Blotting results of MR in the hippocampus

Western Blotting 结果显示在110KD 处出现特异性蛋白条带。MC 为正常组、MS0、MS4、MS7、MS10分别为假手术0、4、7、10天组、MF0、MF4、MF7、MF10分别为穹窿切断0、4、7、10天组。

表2 海马 MR Western Blotting 的灰度值（X ——

±s ）

Table 2 The gray scale of the Western Blotting of MR in the hippocampus

时间

（time ）

正常组 （normal ） 假手术组 (sham operation) 穹窿切断组 (fornix transection) 4d

7d

10d 121.58±7.06 118.45±9.65 119.45±8.07 121.56±8.55 118.69±7.89 113.91±6.62 115.23±8.46 78.95±6.79▲ 50.84±5.75﹡

与正常组、相应假手术组比较（compared with normal group and corresponding sham operation ）▲P ＜0.05, ?P

＜0.05

与穹窿切断10天组比较（compared with fornix transection 10 day ）▲P ＜0.05

3. 讨 论

MR 属于核受体超家族的成员，核受体是能与特异性激素结合的蛋白，主要是一类配基依赖性转录调节因子，通过基因表达，诱导或者抑制细胞的增殖、分化和死忙，导致多种生物效应。游离的糖皮质激素通过弥散进入细胞内,迅速与胞浆内MR 结合，此时受体被活化，激素受体复合物转移到核内与DNA 结合后，影响基因的表达，诱导或抑制mRNA 的转录，从而产生相应的生理效应。MR 在中枢的表达比较集中,主要局限在海马、外侧隔核、杏仁核、嗅核、穹窿下器官、脉络丛等区域,并以海马最为丰富[4]。

研究表明兴奋海马引起实验大鼠和人的HPA 轴活性降低，而损害海马则使大鼠和灵长类动物在应激反应时的糖皮质类固醇激素分泌增加，并使室旁核小细胞神经元表达CRH 和

AVP的mRNA增加[1]，这表明海马对HPA轴的活动有抑制作用。并且这种抑制作用是通

过海马的MR和GR介导的，由于MR对糖皮质激素的亲和力比GR的高，故在HPA轴激

活初期或基础水平。糖皮质激素首先与海马的MR结合，基础条件下，MR几乎全部被占据，然而大约有70%以上的GR 没有被占据，当应激诱导的皮质酮的释放增多时，主要是与GR

结合[5]。因此，静息条件下，糖皮质激素与海马中的MR结合参与基础水平的HPA轴负反

馈调节;应激条件下，高水平的应激激素与海马中的GR结合，抑制HPA轴的过度反应或使

应激状态的HPA轴功能恢复到基础水平。有研究表明，MR的激活对加强GR调节HPA轴

的功能也起到非常重要的作用[6]。

从海马到室旁核没有直接的神经投射，间接的路径都要经过穹窿，现有研究报道穹窿切

断也可以影响室旁核的CRH和AVP的水平[7]，由此引发我们推断海马对室旁核的抑制作

用可能通过穹窿纤维介导。本实验建立了大鼠穹窿切断的模型，采用免疫组织化学和Western Blotting方法研究了穹窿切断后海马神经元MR的表达变化。实验结果表明穹窿切断7天后，MR的表达下调，这可能是由于穹窿切断后，海马投射到室旁核的神经纤维的间接路径被切断，导致海马对HPA轴的抑制作用被解除，使HPA轴处于亢奋状态。HPA轴兴奋，下丘

脑室旁核的小细胞神经元分泌多种促进促肾上腺皮质激素（adrenocorticotrophic hormone，ACTH）分泌的激素，其中最重要的是CRH和AVP，CRH和AVP刺激垂体分泌ACTH，

后者经血液循环到达肾上腺，刺激肾上腺皮质合成和分泌肾上腺皮质激素[8]。有实验证明，糖皮质激素水平过高时对MR有负调节作用[9]，这种由配体诱发的受体向下调节可能是细

胞的一种自我保护机制，可以降低靶细胞对激素的反应性，防止因激素的持续作用对细胞造

成损伤。所以MR的下调可能是糖皮质激素升高对其产生负调节作用的结果。

随着增龄，衰老大鼠体内MR的含量降低，可以增加基础水平HPA轴的活性，延长应

激诱导的ACTH的释放，引起静息状态下HPA轴的昼夜节律发生紊乱[10]。

参考文献

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3.De Kloet ER,Vreugdenhil E,Oitzl MS,et al. Brain corticosteroid receptor balance in health and disease[J]. Endocr Rev, 1998 Jun;19(3):269-301.

4.Herman JP, Cullinan WE. Neurocircuitry of stress: central control of the hypothalamo-pituitary-adrenocortical axis. Trends Neurosci,1997；20:78-84

5.Herman JP, Schafer MK，Young EA, et al. Evidence of hippocampal regulation of neuroendocrine neurons of the hypothalamo-pituitary-adrenocorticoid axis. J. neurosci. 1989 Sep; 9(9):3072-3082.

6.Robert L. Spencer, Paul J. Kim, Brian A. Kalman and Michael A. Cole Evidence for Mineralocorticoid Receptor Facilitation of Glucocorticoid Receptor-Dependent Regulation of Hypothalamic-Pituitary-Adrenal Axis Activity Endocrinology. 1998, 139(6) :2718-2726

7.刘虹，韩芳，石玉秀 . 穹窿切断对大鼠下丘脑CRH表达的影响. 中国组织化学与细胞化学杂志, 2006,15(6):669－673

8.张彦慧，韩芳，石玉秀 . 穹窿切断后海马神经元GR表达变化的研究. 中国组织化学与细胞化学杂志, 2006,15(6):581－585

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10.Boyer P. Do anxiety and depression have a common pathophysiological mechanism? Acta. Psychiatr Scand, 2000;102:24-29

EXPRESSION OF MINERALOCORTICOID RECEPTORS IN THE HIPPOCAMPAL NEURONS BY

FORNIX TRANSECTION

Zhang Yanhui, Han fang, Shi Yuxiu

1 Department of Histology and Embryology, Hainan Medical College, haikou (571000)

2Department of Histology and Embryology, basic medical college, China Medical University,

Shenyang (110001)

Abstract

Objective To investigate the expression of mineralocorticoid receptor which is one of neuclear receptors in the hippocampal neurons by fornix transection. Methods The fornix was transected to set animal model，drawing the materials from the experimental rats after fornix transection on day 0，4，7，10, and from the rats with (non-fornix transection)as well as normal group simultaneously as comparison. Immunohistochemical method and Western Blotting were respectively used for observation and quantitative detection of the changes of MR expression in the hippocampal neurons in each MRoup. Results The expression of MR down regulates after fornix transection on day 7, down regulation obviously on day 10. Conclusion Fornix transection can relieve the inhibition of hippocampus to HPA axis with the expression of MR in the hippocampus occurring down regulation. Keywords: Fornix transection; MR; hippocampus; Neuron

图版说明

图1 正常组海马MR免疫反应阳性细胞. ×40

图2 正常组海马CA1区MR免疫反应阳性细胞. ×400

图3 穹窿切断组（0天）海马CA1区MR免疫反应阳性细胞. ×400

图4 穹窿切断组（4天）海马CA1区MR免疫反应阳性细胞. ×400

图5 穹窿切断组（7天）海马CA1区MR免疫反应阳性细胞. ×400

图6 穹窿切断组（10天）海马CA1区MR免疫反应阳性细胞. ×400

EXPLANATION OF FIGURES

Fig. 1 Immunoreaction of MR in rat hippocampal of Normal group. ×400

Fig. 2 Immunoreaction of MR in rat hippocampal area CA1 of Normal group. ×400

Fig. 3 Immunoreaction of MR in rat hippocampal area CA1 of fornix transection group（0d）. ×400 Fig. 4 Immunoreaction of MR in rat hippocampal area CA1 of fornix transection group（4d）. ×400 Fig. 5 Immunoreaction of MR in rat hippocampal area CA1 of fornix transection group（7d）. ×400 Fig. 6 Immunoreaction of MR in rat hippocampal area CA1 of fornix transection group（10d）.

×400

原代海马神经元细胞培养

原代海马神经元细胞培养 溶液的配制： (1) 4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100ml pH=7.4的0.01mol/l PBS中，混匀过滤， 室温保存。 (2)磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol?l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO4?12H2O，1.7g；KCl， 0.1g；NaCl，4.0g，双蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。用0.2μm滤膜过滤，4℃保存。 (3) 1%蛋白酶的配制：用磷酸缓冲液（pH=7.2～7.4）配制成浓度为1%的胰蛋白酶母液 冻存。使用时，用解剖液稀释至0.25%。 (4) 培养皿涂被多聚赖氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。将上述多聚赖氨酸 放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。 (5) 解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP04?7H20，0.18g； KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加双蒸水1000ml，调pH=7.0～7.4，过滤，4℃保存。 (6) 种植液：DMEM 79%，胎牛血清，10%；马血清，10%；谷氨酰胺培养液1%。 (7) 饲养液：Neurobasal培养基，97%；谷氨酰胺培养液，1%；B-27，2%。 (8) 阿糖胞苷：用双蒸水配制成浓度为l mg?ml-1的母液储存。用0.2μm滤膜过滤，-20℃ 储存。使用时，取6μl母液加入2ml培养液中，终浓度为3μg?ml-1。（根据实验情况调整浓度） 大鼠原代海马神经元细胞的培养 (1) 新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其放入盛有解 剖液的培养皿中。 (2) 在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿中。在分离出全 部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数小块，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培养皿中，将培养皿放入9%CO2、37℃消化20min。 (3) 将培养皿中的海马碎片移入离心管中，去除含胰蛋白酶的液体并用种植液将海马碎 片冲洗2～3遍，终止酶的消化作用。

免疫组化常用标记物[参照材料]

免疫组化常用标记物 免疫组化常用标记物 一、常用标志物 1. CD15(LeuM1)---（阳性部位：细胞膜）。是一种由半乳糖、岩藻糖和N-乙酰葡萄糖组成的碳水化合物抗原，又称半抗原χ，是粒/单核细胞相关抗原。免疫组织化学表达：成熟粒细胞、激活的淋巴细胞（主要是T淋巴细胞）、R-S细胞、大多数腺癌等。 2. 癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）(CD66e)---（阳性部位：细胞膜/浆）。癌胚抗原是表达于胎儿上皮细胞的一种糖蛋白，分子量为180kDa。存于某些恶性肿瘤组织尤其是内胚层来源发肿瘤中，大多数胃肠道（包括胰腺）和肺腺癌均有表达，少量成人上皮细胞和良性肿瘤亦可表达。CEA主要用于标记上皮性肿瘤，尤其是腺上皮来源的腺癌。 3.嗜铬素A（chromogranin A，CgA）---（阳性部位：细胞浆）。嗜铬素是位于神经分泌颗粒内的酸性糖蛋白家族，是一组可溶性酸性蛋白，分子量为76～1 20 kDa，分布广泛。含量最丰富的是嗜铬素A，另两个是嗜铬素B和嗜铬素C。几乎所有的神经内分泌肿瘤中均可检测到嗜铬素。嗜铬素A不仅存在于神经内分泌细胞的分泌颗粒中，也广泛分布于所有含有颗粒的内分泌细胞和神经内分泌细胞来源的肿瘤细胞。此抗体可以识别嗜铬素A抗原羧基末端的片段，而不与氨基末端的片段反应，主要用于标记神经内分泌细胞及其来源的肿瘤。对小细胞癌进行抗原修复可提高检测的敏感性。 4.细胞角蛋白（cytokeratin pan，广谱CK）--- AE1/ AE3（阳性部位：细胞浆）。此抗体可以识别绝大部分酸性细胞角蛋白（Ⅰ型/低分子量）和碱性细胞角蛋白（Ⅱ型/高分子量）。用于标记上皮及上皮来源的肿瘤，特别是对鉴别和判断转移性肿瘤是否为上皮源性具有一定的意义。 5.细胞角蛋白5/6（cytokeratin 5/6，CK5/6）---（阳性部位：细胞浆）。在正常组织中，鳞状上皮和导管上皮的基底细胞以及部分的鳞状上皮生发层细胞、肌上皮细胞和间皮细胞阳性，腺上皮细胞阴性。因此，可用于鳞癌和腺癌、间皮瘤和腺癌的鉴别诊断。支气管上皮基底细胞、间皮；鳞癌、大细胞癌、移行细胞癌、间皮瘤阳性。大多数腺癌为阴性。 6. 细胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）---（阳性部位：细胞浆）。CK7是分子量为54 kDa的一种碱性细胞角蛋白，存在于大多数正常组织的腺上皮和移行上皮细胞中，一般非上皮来源的细胞无表达。在卵巢、乳腺和肺的腺癌呈阳性反应，而胃肠道的腺癌阴性。 7. 细胞角蛋白20（cytokeratin 20，CK20）---（阳性部位：细胞浆）。CK20（46kDa）存在于正常的胃肠道上皮、移行上皮、Merkel细胞及其来源的肿瘤，而乳腺癌、肺癌和神经内分泌肿瘤不表达。CK7positive CK7 negative CK20 positive uninformative colorectum CK20 negative lunguninformative 8. 细胞角蛋白（高分子量）（cytokeratin，HMW）---（阳性部位：细胞浆）。高分子量细胞角蛋白抗体（34βE12）可以识别68kDa、58kDa、56.5kDa和50kD a的细胞角蛋白。

氟西汀对海马神经元生长的影响

氟西汀对海马神经元生长的影响 各位读友大家好，此文档由网络收集而来，欢迎您下载，谢谢 【关键词】氟西汀;细胞培养;海马神经元;大鼠 氟西汀是5-羟色胺（5-HT）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除有抗抑郁作用外，尚可治疗其他中枢神经系统疾病。有研究表明，氟西汀对海马的神经保护作用是其发挥抗抑郁效应的机制之一［1］。关于氟西汀对体外培养的海马神经元生长的影响未见报道，本研究初步探讨了氟西汀对原代培养的海马神经元生长的影响。 1材料与方法 新生大鼠海马神经元的分离和培养 技术方法在参考文献［2］基础上加以改进。取出生24h内的新生SD大鼠（东南大学医学院动物实验中心提供），无菌分离出双侧海马，用显微剪剪碎，

D-Hank#39;s液清洗2或3次，将剪碎的海马组织转移至离心管中，加入等量%的胰酶（美国Sigma公司），37℃消化30min，中间振摇1或2次，加入10%的DMEM/F12（美国Gibco公司）5ml，轻轻吹打15次，然后1000r·min-1离心5min，制成单细胞悬液，置于CO2培养箱（德国Heraeus公司产品）中，差速贴壁30min，去除成纤维细胞，吸取未贴壁的细胞，并用200目的不锈钢滤网过滤，收集过滤后的单细胞悬液于培养皿中，然后至离心管中，取一滴单细胞悬液进行计数，并用DMEM/F12将细胞密度调到1×106ml-1，然后接种于200μg·ml-1多聚赖氨酸（美国Sigma公司）包被的6孔培养板中，转移至培养箱内培养，4h后换为无血清培养基，即含2%B27的Neurobasl培养基（美国Gibco公司），以后每3天半量换液1次。使用培养6d的神经元进行染色鉴定。 大鼠海马神经元的鉴定 烯醇化酶（NSE）免疫细胞化学染

干细胞在治疗运动神经元病中的应用研究进展

干细胞在治疗运动神经元病中的应用研究进展 陈　博※(综述),王丹丹(审校) (协和干细胞基因工程有限公司,天津巿脐带血干细胞库,天津300384) 中图分类号:R338 文献标识码:A 文章编号:100622084(2010)0821147202 摘要:运动神经元病病因至今不明,目前尚无有效药物。成体干细胞因为具有自我复制和多项分化潜能等特点,其移植治疗运动神经元病也成为研究热点。成体干细胞包括脐血源性神经干细胞、自体神经干细胞、自体骨髓间充质干细胞、脐带间充质干细胞。各种细胞在取材、临床应用、治疗效果方面都有优缺点。国内外对运动神经元病的治疗研究较少,细胞的选择尚需探索。 关键词:运动神经元病;骨髓间充质干细胞;脐带间充质干细胞 A Rev i ew on Research Progress of Appli ca ti on of Ste m Cells to Trea ti n g D isea ses i n M otor Neu2 ron D isea se　CHEN B o,WAN G D an2dan.(U nion S te m Cell&Gene Engineering L i m ited Co m pany, Tianjin Cord B lood B ank,Tianjin300384,China) Abstract:The cause ofMot orNeur on D isease(MND,mot or neur on disease)re mains unknown,and s o far,there are not effective drugs.Due t o its capability t o differentiate int o multi p le cell types as well as self2renew continuously,ste m cell,es pecially Somatic ste m cell′s researching on treat m ent of the MND with trans p lanting has als o become int o a hot s pot in medical arena.Somatic ste m cells include neural ste m cells,mesechy mal stem cell and human umbilical cord mesenchy mal ste m cells.Vari ous cells has its res pective advantage in s ource,clinical app licati on and treat m ent.There is less research on MND treat m ent,s o it′s i m portant t o choose the most suitable measure ments. Key words:Mot or neur on disease;Bone mesenchy mal ste m cell;Human umbilical cord mesen2 chy mal ste m cells 运动神经元病(mot or neur on disease,MND)是以 选择性侵犯脊髓前角细胞、脑干运动神经元、大脑皮 质锥体细胞和锥体束为主的一组慢性进行性变性疾 病,病因及发病机制复杂,目前尚无有效药物。临床 表现分为肌萎缩侧索硬化、进行性脊肌萎缩症、进行 性延髓麻痹、原发性侧索硬化。干细胞移植为神经 系统疾病的治疗提供了一种新的手段。干细胞按其 起源分为胚胎干细胞和成体干细胞。由于伦理性、 取材困难及致瘤性等原因,胚胎干细胞的研究与使 用受到了限制[1]。目前多数研究中的干细胞为神经 干细胞(neural ste m cells,NSC)和间充质干细胞 (mesenchy mal ste m cells,MSCs),现就这两种干细胞 在治疗MND的应用予以介绍。 1　脐血源性神经干细胞移植 国内有研究报道,脐带血体外培养分化为神经 干细胞,对33例因创伤性脊髓损伤和硬膜外血肿造 成的急性压迫性损害患者进行神经干细胞移植,植 术后7～10d,33例患者损伤的脊髓功能均有改善, 神经干细胞移植后2周至16个月随访资料显示,33 例患者的脊髓功能呈继续改善的趋势[2]。也有研究 者将脐带血间充质干细胞进行分离、培养以及诱导 其向NSC分化,并应用于MND患者的治疗。通过对 11例MND患者治疗前后场致离子显微镜检查评分 及总T细胞进行流式细胞检测发现:脐带血间充质 干细胞来源的神经干细胞移植治疗短期内通过一定 的免疫调节作用,可以改善MND患者的临床症状和 日常生活能力[3]。2　自体神经干细胞移植 国外有研究者将鼠嗅鞘细胞和鼠间充质干细胞移植入肌萎缩侧索硬化动物模型,进行疗效比较。结果显示,两种细胞移植都具有良好的安全性,其中嗅鞘细胞组与对照组临床差异不明显,而MSCs组(雌性)比对照组存活时间明显延长[4]。多发性硬化症(multi p lescler osis,MS)是一种中枢神经系统多部位脱髓鞘改变的自身免疫性疾病,急性期免疫反应导致的轴突损伤 以及慢性期的脱髓鞘导致患者的神经功能缺失。免疫调节治疗和免疫抑制治疗是目前治疗MS的主要方法,但仅对部分患者有效。因此,NSC移植有可能成为治疗MS的另一种方法。研究显示,将NSC或者少突胶质细胞前体细胞移植到MS模型大鼠脑内后,在脱髓鞘部位可见到髓鞘再生[5,6]。恰当的移植途径以及病变部位的免疫微环境,对髓鞘再生的抑制作用是NSC移植治疗MS的关键。 3　自体骨髓M SC s移植治疗M N D 骨髓间充质干细胞是一类存在于骨髓网状间质内的非造血干细胞,具有分化成各种间叶组织细胞的潜能,在一定条件下可自我复制并能分化成多种细胞,其中包括神经细胞和神经胶质细胞,同时骨髓干细胞还能分泌多种神经营养因子,对神经细胞的修复产生促进作用。神经干细胞在临床上较难获得且在伦理学上存在一定的问题,而骨髓基质干细胞可以作为同种同体来源细胞,较易获得且不存在伦理问题;作为移植供体细胞骨髓基质干细胞和神经干细胞同样具有以下特性:①可以在体外迅速扩增。 ②无或低免疫原性。③能够在宿主脑内长期存活并与宿主神经元整合形成突触联系。④可以稳定的分化并长期表达外生性基因,例如酪氨酸羟化酶。此外,骨髓基质干细胞对神经于细胞还有着明确的促存活和分化的能力[7]。骨髓基质干细胞较神经干细胞更具临床优势,有可能作为自体细胞应用于组织工程和作为良好的移植细胞应用于替代治疗[8]。 在治疗MND的基础研究方面。主要使用人

神经元轴突标志物

神经元轴突标志物

Tau: Neuro n Type of MAP; helps main tai n structure of the axon 神经元树突标志物Drebrin、MAP SAP102 微管相关蛋白Microtubule-associated protein-2(MAP-2) : Neuron Den drite-specific MAP;prote in found specifically in den dritic branching of neuron 是组成神经元细胞骨架的重要组成成分，包括：MAP5 MAP1.2和MAP1 三种不同类型。在神经系统发育、形成和再生过程的不同时期扮演着重要的角色。其中MAP5为早期微观相关蛋白，在胚胎期和新生动物大脑中有较高表达，并随大脑的逐渐成熟而退化，对神经元突起的生长具有重要的引导作用。MAP2包括三种亚型：MAP2a MAP2I和MAP2c其中MAP21和MAP2(出现较早。随着年龄的增长MAP2被组织蛋白酶D所降解，在不同类型的神经元中表达量存在差异。 神经元早期标志物Tubulin、b-4 tubulin : Neuron Important structural protein for neuron; identifies differentiated neuron Nervous System微管蛋白为球形分子,分为两种类型:a 微管蛋白(a-tubulin) 和B微管蛋白(B -tubulin), 这两种微管蛋白具有相似 的三维结构，能够紧密地结合成二聚体，作为微管组装的亚基，能够聚合并且参与细胞分裂。a和B微管蛋白各有一个GTP结合位点，位于a亚基上的GTP结合位点，是不可逆的结合位点，结合上去的GTP不能被水解，也不能被GDP替换。位于B亚基上的GTP结合位点结合GTP后能够被水解成GDP所以这个位点又称为可交换的位点(exchangeable site,E 位点)-III Tubulin 又名tubulin B -4，是原始神经上皮中所表达的最早的神经元标志物之一。其作为神经元特有标志物，被广泛应用于神经生物学研究。 Noggin: Neuron A neuron-specific gene expressed during the development of n euro ns Neurosphere Embryoid body (E ⑨： ES Cluster of primitive n eural cells in culture of differentiating ES cells; indicates presence of early neurons and glia 星型胶质细胞标志物Astrocyte 、S-100、Microglia Markers Glial fibrillary acidic protein (GFAP) : Astrocyte Protein specifically produced by astrocyte 属于三型中间丝蛋白家族成员，在星型胶质细胞中大量特异性表达。在外周神经系统中的卫星细胞和部分雪旺氏细胞中也有少量表达。神经干细胞也会频繁并大量的表达GFAP因此，GFAP抗体经常被作为星型胶质 细胞的标志物用于神经生物学研究。另外，对于一些来源于星型胶质细胞的脑源性肿瘤，GFAP的表达量也较高。最近研究表明：在位于肝脏的枯否细胞、镜上皮细胞、唾液腺肿瘤细胞和红细胞中亦有GFAP的表达。

胎鼠海马神经元培养及其鉴定

［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究 工作. 昆明医学院学报2011，（5）：17～19Journal of Kunming Medical University CN 53-1049/R 胎鼠海马神经元培养及其鉴定 李玉1），王波1），但齐琴2 ） （1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所，云南昆 明650031 ）［摘要］目的建立胎鼠海马神经元体外培养方法，观察细胞生长情况，免疫组织化学染色鉴定神经元特 异性．方法取胎鼠海马，分裂获得细胞悬液，接种于24孔板，经2h 差速帖壁去除成纤维细胞，将细胞液转移并继续培养，以获娶纯度较高的海马神经元．培养第5、11、15天观察细胞和突起生长情况，用NeuN 抗体以免疫组化SP 二步法染色鉴立神经细胞．结果培养头3d ．细胞生长缓慢，5d 时细胞开始生长，可见突起， 11d 时突起连成网状．经Neun 染色培养细胞呈阳性反应，证明是神经元．结论 本方法获取生长良好，纯度 较高的海马神经元． ［关键词］胎鼠；海马神经元；Neun ；培养 ［中图分类号］Q831.1+1［文献标识码］A ［文章编号］1003－4706（2011）05－0017－03 I dent ificat ion and Cult ur e of Hippocampus Neur ons in Fet al Rat s LI Yu 1），WANG Bo 1），DAN Qi －qin 2 ） （1）Deat.of Neurosurgery ；2）Institute of Neuroscience ，Kunming Medical University ， Kunming Yunnan 650031，China ） ［Abstract ］Objective To establish the protocol for culturing hippocampus neurons in vitro and explore the neuronal growth character istics ．Methods Tissues from hippocampus of fatal rats were harvested ，then digested into cell suspension by using 0.125%trypsin ．After planted into wells for 2hours ，cell suspension was transferred into next well for continuing incubation ．The cell growth was observed at day 5，11and 15．Neurons specific Enolase （NSE ）antibody ，recognized specifically NSE antigen in cultured cells ，was used to identify neurons by SP-two-step staining method ．Results After incubated for 2hours ，transferred suspensions in wells showed some pure neurons ，which is identified by NSE staining ．However ，they grew slowly during 1～3days ，then grew well from 5th day ，with gradual increasing the neuritis outgrowth ．Conclusion Purified neurons with neurite outgrowth states can be acquired by this method. ［Key words ］Fetal rats ；Hippocampus neurons ；NSE staining ；Culture 海马神经元细胞培养是研究神经细胞生物学特性和外源干扰因素作用（细胞因子）的有效细胞模型，其在神经生物学，发育生物学体外实验研究中已被广泛应用[1-3]．然而，要获得纯度较高， 生长状态较好的海马神经元也不是一件易事．本实验长期从事海马神经细胞生物特性及其应用研究，故需建立该细胞模型．鉴于胚胎来源的细胞 生长状态较成年动物来源者好[4，5] ．本实验建立大

海马神经元细胞免疫荧光检验

海马神经元细胞免疫荧光检验 神经元鉴定： 一、烯醇化酶鉴定： 培养细胞用100%乙醇固定---10min---PBS漂洗5min×3次---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS 漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min 以减少排特异背景颜色------加第一抗体特异烯醇化酶（chemicon，1:1000），4℃冰箱孵育18~24小时---PBS漂洗5min×3次---加入2步法：PV9000试剂Ⅰ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---PV9000试剂Ⅱ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---DAB显示红棕色；70%，80%，90%，100%I，100%II 梯度酒精透水；二甲苯Ⅰ，Ⅱ透明2次，每次30min---中性树胶灯片---镜下观察。 二、β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulinⅢ）荧光显示： 培养细胞用预冷PBS液轻柔漂洗3次，4%多聚甲醛固定，1h，4℃---吸去多余甲醛---PBS漂洗5min×3次---0.25%triton，室温，15min---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min以减少排特异背景颜色------弃血清，加入β-tubulinⅢ抗体（1:100稀释），4℃，过夜---PBS漂洗5min×3次---滴加FITC 标记的山羊抗小鼠lgG（体积比1:200稀释），37℃，1h---DAPI复染10min---抗荧光猝灭封片液封片---荧光显微镜观察---选择10个视野，统计学处理。

运动神经元病疾病研究报告

运动神经元病疾病研究报告 疾病别名：运动神经元疾病 所属部位：全身 就诊科室：神经内科 病症体征：肌肉萎缩，肌束震颤，瘫痪，腱反射亢进，吞咽困难 疾病介绍： 什么是运动神经元病？运动神经元病为一组原因不明，选择性地损害脊髓前角，脑干运动神经核，以缓慢进展行的神经系统变性性疾病，临床表现为肢体 的上，下运动神经元瘫痪共存，而不累及感觉系统，植物神经，小脑功能为特 征 症状体征： 运动神经元病有什么症状？运动神经元病起病缓慢，病程也可呈亚急性，症 状依受损部位而定。由于运动神经元疾病选择性侵犯脊髓前角细胞、脑于颅神 经运动核以及大脑运动皮质锥体细胞、锥体束，因此若病变以下级运动神经元 为主，称为进行性脊髓性肌萎缩症；若病变以上级运动神经元为主，称为原发 性侧索硬化；若上、下级运动神经元损害同时存在，则称为肌萎缩侧索硬化； 若病变以延髓运动神经核变性为主者，则称为进行性延髓麻痹。临床以进行性 脊肌萎缩症、肌萎缩侧索硬化最常见。 运动神经元病有什么症状？运动神经元病最早症状多见于手部分，患者感手 指运动无力、僵硬、笨拙，手部肌肉逐渐萎缩，可见肌束震颤。四肢远端呈进 行性肌萎缩，约半数以上病例早期呈一侧上肢手部大小鱼际肌萎缩，以后扩展 到前臂肌，甚至胸大肌，背部肌肉亦可萎缩，小腿部肌肉也可萎缩，肌肉萎缩 肢体无力，肌张力高(牵拉感觉)，肌束颤动，行动困难、呼吸和吞咽障碍等症状。如早期病变性双侧锥体束，则可先出现双下肢痉挛性截瘫。 化验检查： 运动神经元病的检查可以通过以下四种方法： 1、脑脊液检查基本正常。 2、肌电图检查可见自发电位，神经传导速度正常。 3、肌肉活检可见神经源性肌萎缩。 4、头、颈MRI可正常。

成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定

昆明医学院学报2011，（6）：29～32 CN53-1049/R Journal of Kunming Medical University 成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定 李玉1），但齐琴2），习杨彦彬2） （1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所， 云南昆明650031） ［摘要］目的观察体外培养成年小鼠海马神经细胞生长情况及其形态学变化．方法获取成年海马组织，制成细胞悬液，接种于培养板，分别于1，3，7，10，13，15d观察细胞生长情况，用神经元特异烯醇化酶抗体经免疫组织化学染色技术鉴定神经元．结果成年海马神经元接种后1～3d，有较多的杂质和部分细胞漂浮，贴壁细胞较少量．每隔3d半量换液后，杂质不断减少，但第1周细胞生长缓慢，第7～10d才见细胞生长良好．培养15d后，大部分细胞出现有明显的颗粒等早期退化征象．免疫组化染色证实培养细胞呈现神经元特异烯醇化酶染色阳性染色，免疫阳性产物主要分布于细胞质；证明是神经元．结论体外培养成年海马神经元早期生长缓慢，7～10d才显示良好的生长状态，2周左右细胞则开始退变．提示10d以前的细胞是供体外研究用的理想细胞． ［关键词］大鼠；神经细胞；海马；细胞培养；免疫组化 ［中图分类号］Q813.1+1［文献标识码］A［文章编号］1003－4706（2011）06－0029－04 Cult ur e and Ident ificat ion of Hippocampus Neur ons in Adult Rat s LI Yu1），DAN Qi－qin1），XIYANG Yan－bin2） （1）Dept.of Neurosurgery，The1st Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming Yunnan 650032；2）Institute of Neuroscience，Kunming Medical University，Kunming Yunnan650031，China） ［Abstract］Objective To observe the morphology and characteristics of hippocampus neurons in adult rats in vitro．Method The hippocampus tissues from adult rats were collected，then digested into cell suspension by using0.125%trypsin．Cell suspension was planted into wells and observed at day1，3，7，10，13，and15 after incubation．Neurons specific Enolase（NSE）antibody，recognized specifically NSE antigen in cultured cells，was used to identify neurons by SP-two-step staining method．Results During1-3days，the extensive bodies of floating cells and tissue blocks were seen，but a few cells attached to the bottom of well．The growth of attached cells was also extensively slow，specifically within1week，while it began to grow quickly after7days，and maintained till15days．Amazingly，cells exhibited aging character with more particles in cytoplasm after15 days．NSE staining showed that cultured cells were positive staining by neuronal specific enalose antibody．Conclusion Adult hippocampus neurons grow slowly during the first week，but they are better from7day to15，then begin to degenerate after15days in vitro．This suggests that neurons from hippocampus of adult rats cultured in10days could be better for related neurobiological studies. ［Key words］Adult rats；Hippocampus neurons；NSE staining；Culture ［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究工作.

大脑地解剖结构和功能——布鲁德曼分区

大脑的解剖结构和功能——布罗德曼分区系统 布罗德曼分区是一个根据细胞结构将大脑皮层划分为一系列解剖区域的系统。神经解剖学中所谓细胞结构（Cytoarchitecture），是指在染色的脑组织中观察到的神经元的组织方式。 布罗德曼分区1909年由德国神经科医生科比尼安·布洛德曼（Korbinian Brodmann）提出。根据皮质细胞的类型及纤维的疏密把大脑皮质分为52个区，并用数字给予表示。Brodmann Area 1, BA1 Brodmann Area 2, BA2 Brodmann Area 3, BA3 位置：位于中央后回 (postcentral gyrus) 和前顶叶区。 功能：分别为体感皮层内侧、末尾和前端区,BA1、BA2、BA3共同组成体感皮层； 具备基本体感功能（first somatic sensory area）接受对侧肢体的感觉传入。Brodmann Area 4, BA4 位置：位于中央前回(precentral gyrus)，中央沟(central sulcus)的内侧面 功能：初级运动皮层（first somatic motor area)，包含“运动小人”（motor homunculus ）。 控制行为运动，与BA6 （前）和BA3 、BA2 、BA1、（后）相连，同时与丘脑腹外侧核相连。 体感小人（Somatosensory Homunculus ） 传入体感信息较多的身体区域获得的皮层代表区域较大。比如手部在初级体感皮层中的代表区域比背部的大。体感皮质定位可用“体感小人”（Somatosensory homunculus）来表示。 Brodmann Area 5, BA5 位置：位于顶叶前梨状皮质区（梨状皮质piriform cortex为下边缘皮质的组成部分）。功能：与BA7形成体感联合皮层。 Brodmann Area 7, BA7 位置：位于顶叶皮质顶部，体感皮层后方，视觉皮层（visual area)上方。 功能：将视觉和运动信息联合起来；与BA5形成体感联合皮层；视觉-运动协调功能。 Sensory Areas---------Somatosensory Association Area 位置：位于初级躯体感觉皮层后方（BA5、BA7）

免疫组化常用标记物

免疫组化常用标记物 一、常用标志物 1. CD15(LeuM1)---（阳性部位：细胞膜）。是一种由半乳糖、岩藻糖和N-乙酰葡萄糖组成的碳水化合物抗原，又称半抗原χ，是粒/单核细胞相关抗原。免疫组织化学表达：成熟粒细胞、激活的淋巴细胞（主要是T淋巴细胞）、R-S细胞、大多数腺癌等。 2. 癌胚抗原（carcinoembryonic antigen，CEA）(CD66e)---（阳性部位：细胞膜/浆）。癌胚抗原是表达于胎儿上皮细胞的一种糖蛋白，分子量为180kDa。存于某些恶性肿瘤组织尤其是内胚层来源发肿瘤中，大多数胃肠道（包括胰腺）和肺腺癌均有表达，少量成人上皮细胞和良性肿瘤亦可表达。CEA主要用于标记上皮性肿瘤，尤其是腺上皮来源的腺癌。 3.嗜铬素A（chromogranin A，CgA）---（阳性部位：细胞浆）。嗜铬素是位于神经分泌颗粒内的酸性糖蛋白家族，是一组可溶性酸性蛋白，分子量为76～120 kDa，分布广泛。含量最丰富的是嗜铬素A，另两个是嗜铬素B和嗜铬素C。几乎所有的神经内分泌肿瘤中均可检测到嗜铬素。嗜铬素A不仅存在于神经内分泌细胞的分泌颗粒中，也广泛分布于所有含有颗粒的内分泌细胞和神经内分泌细胞来源的肿瘤细胞。此抗体可以识别嗜铬素A抗原羧基末端的片段，而不与氨基末端的片段反应，主要用于标记神经内分泌细胞及其来源的肿瘤。对小细胞癌进行抗原修复可提高检测的敏感性。 4.细胞角蛋白（cytokeratin pan，广谱 CK）--- AE1/ AE3（阳性部位：细胞浆）。此抗体可以识别绝大部分酸性细胞角蛋白（Ⅰ型/低分子量）和碱性细胞角蛋白（Ⅱ型/高分子量）。用于标记上皮及上皮来源的肿瘤，特别是对鉴别和判断转移性肿瘤是否为上皮源性具有一定的意义。 5.细胞角蛋白5/6（cytokeratin 5/6，CK5/6）---（阳性部位：细胞浆）。在正常组织中，鳞状上皮和导管上皮的基底细胞以及部分的鳞状上皮生发层细胞、肌上皮细胞和间皮细胞阳性，腺上皮细胞阴性。因此，可用于鳞癌和腺癌、间皮瘤和腺癌的鉴别诊断。支气管上皮基底细胞、间皮；鳞癌、大细胞癌、移行细胞癌、间皮瘤阳性。大多数腺癌为阴性。 6. 细胞角蛋白7（cytokeratin 7，CK7）---（阳性部位：细胞浆）。CK7是分子量为54 kDa的一种碱性细胞角蛋白，存在于大多数正常组织的腺上皮和移行上皮细胞中，一般非上皮来源的细胞无表达。在卵巢、乳腺和肺的腺癌呈阳性反应，而胃肠道的腺癌阴性。 7. 细胞角蛋白20（cytokeratin 20，CK20）---（阳性部位：细胞浆）。CK20（46kDa）存在于正常的胃肠道上皮、移行上皮、Merkel细胞及其来源的肿瘤，而乳腺癌、肺癌和神经内分泌肿瘤不表达。 CK7 positive CK7 negative CK20 positive uninformative colorectum CK20 negative lung uninformative 8. 细胞角蛋白（高分子量）（cytokeratin，HMW）---（阳性部位：细胞浆）。高分子量细胞角蛋白抗体（34βE12）可以识别68kDa、58kDa、56.5kDa和50kDa的细胞角蛋白。 9.上皮膜抗原（epithelial membrane antigen，EMA）(MUC1)---（阳性部位：细胞浆）。上皮膜抗原是一种高分子量（400 kDa）跨膜糖蛋白，广泛分布于各种上皮细胞及其来源的肿瘤。癌细胞过表达MUC1与肿瘤侵袭有关，有意义的免疫反应性为膜阳性，如为纯粹的胞浆着色则为假阳性。此抗体可以用于标记上皮及上皮源性肿瘤，EMA阳性表达的肿瘤包括大多数的癌、间皮瘤、滑膜肉瘤和上皮样肉瘤等，淋巴瘤、黑色素瘤和软组织肿瘤阴性表达。 10.HBME1---（阳性部位：细胞膜）。该抗体与间皮细胞表面的抗原反应，染色方式呈现一种特殊的“厚膜”方式，在鉴别间皮瘤与腺癌时有一定的参考价值：间皮瘤为厚膜型，腺癌为薄膜型或胞浆着色。 11.突触素（synaptophysin，Syn）---（阳性部位：细胞浆）。突触素是分子量为38kDa的糖蛋白，主要存在于神经元突触前囊泡膜，是神经性和上皮性神经内分泌肿瘤的特异性标志之一，用于标记神经内分泌肿瘤。 12.甲状腺转录因子1（thyroid transcription factor-1，TTF-1）---（阳性部位：细胞核）。TTF-1表达于甲状腺腺上皮和肺的上皮细胞中。大多数肺的小细胞癌、腺癌、少部分大细胞癌、大多数非典型神经内分泌肿瘤免疫组化结果显示TTF-1阳性，而肺鳞癌及绝大多数典型类癌TTF-1阴性。

海马结构及图

海马结构,希望有所帮助 海马结构(hippocampal formation，HF)属于脑的边缘系统(1imbic system)中的重要结构，与学习、记忆、认知功能有关，尤其是短期记忆与空间记忆。海马皮质从海马沟至侧脑室下角依次为分子层、锥体层和多形层。齿状回也分三层：分子层、颗粒细胞层和多形层。依据细胞形态、不同皮质区的发育差异以及纤维排列的不同，将海马分为4个区，即CAl、CA2、CA3、CA4区。海马结构是大脑边缘系统的重要组成部分．在进化上是大脑的古皮质，位于大脑内侧面颞叶的内侧深部，左右对称。一般认为海马结构由海马或称Ammon角、齿状回、下托及海马伞组成，结构比较复杂。在功能和纤维联系上，不仅与嗅觉有关，更与内脏活动．情绪反应和性活动有密切关系。细胞学研究表明，海马头部主要是由CAI区折叠而成，而CAI区对缺氧等损伤最为敏感，也被称为易损区，因此海马头部也是最易发生病变的部位。 海马结构由海马(hippoeampus)、齿状回(dentate gyrls)、下托(subiculum)和围绕胼胝体的海马残体(hippoeampal rudimerit)组成，其中海马为体积最大最主要的部分。 大脑海马（hippocampus）是位于脑颞叶内的一个部位的名称，人有两个海马，分别位于左右脑半球. 它是组成大脑边缘系统的一部分，担当着关于记忆以及空间定位的作用. 名字来源于这个部位的弯曲形状貌似海马(希腊语hippocampus). 在阿兹海默病中,海马是首先受到损伤的区域; 表现症状为记忆力衰退以及方向知觉的丧失。大脑缺氧(缺氧症)以及脑炎等也可导致海马损伤 . 在动物解剖中, 海马属于脑的演化过程中最古老的一部分。来源于旧皮质的海马在灵长类以及海洋生物中的鲸类中尤为明显。虽然如此, 与进化树上相对年轻的大脑皮层相比灵长类动物尤其是

海 马 神 经 元 培 养

海马神经元培养 （1）材料 ①孕鼠：海马：孕18d，皮层或纹状体：孕16d ②Neurobasal medium (Gibco-BRL, cat. no. 21103) L-Glutamine (Gibco-BRL, cat. no. 25030) 谷氨酰胺 Glutamic acid (Sigma, cat. no. G-1626) 谷氨酸 B27 (Gibco-BRL, cat. no. 17504) ③Poly-D-lysine (mol wt 30,000—70,000) (Sigma, cat. no. P-7280)多聚赖氨酸 ④Hank’s balanced salt solution (HBSS) (Gibco-BRL, cat. no. 14025) ⑤HBSS without Ca2+, Mg2+ (Gibco-BRL, cat. no. 14175) ⑥trypsin 胰酶 ⑦NaHCO 3 ⑧Na pyruvate (Gibco-BRL, cat. no. 11840)丙酮酸钠 ⑨Trypan blue, 0.4% 台盘蓝 ⑩巴氏吸管，前端用火抛光 刻度吸管 离心管 闪烁瓶 玻璃培养皿：小：3套 大：2套 冰袋、纱布 手术器械、筛网 培养瓶或培养板

（2）步骤 ①准备 a．配制试剂 i) Poly-D-lysine（需保存在聚苯乙烯容器中，不能保存在玻璃、聚碳酸酯或聚丙烯容器中） 配制硼酸缓冲液（pH8.4） A液（硼砂溶液）：1.907g硼砂溶于100ml纯水（0.05M），0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 B液（硼酸溶液）：1.237g硼砂溶于100ml纯水（0.2M）0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 4.5mlA液+ 5.5mlB液 5mg P-D-L溶于10ml硼酸缓冲液中，配制成0.5mg/ml贮存液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存使用时用硼酸缓冲液稀释10倍。 ii)HBSS without Ca2+, Mg2+（D-Hank’s溶液）配制 不含钙、镁的HBSS粉剂：4.75g溶于400ml纯水 NaHCO3：0.175g加入溶液 1M NaOH 调节pH至7.2-7.4 纯水定容至500ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 iii）1M NaOH溶液配制 NAOH：4g 溶于100ml纯水 iv）0.125%胰酶+0.02%EDTA D-Hank’s溶液10ml EDTA 20mg 溶解后 D-Hank’s溶液80ml 胰酶125mg 溶解后 1M NaOH溶液调节pH至7.2 D-Hank’s溶液定容至100ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 v）D-Hank’s溶液配制（0.035% NaHCO3，1mM Na pyrurate，10mM HEPES，pH7.4） 不含钙、镁的HBSS粉剂： 2.375g溶于200ml纯水 NaHCO3：0.088g加入溶液 HEPES：0.596g加入溶液 Na pyrurate（100mM）： 2.5ml加入溶液 1M NaOH 调节pH至7.4 纯水定容至250ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 vi）Hank’s溶液配制（0.035% NaHCO3，1mM Na pyrurate，10mM HEPES，pH7.4） 含钙、镁的HBSS粉剂： 2.45g溶于200ml纯水 NaHCO3：0.088g加入溶液 HEPES：0.596g加入溶液 Na pyrurate（100mM）： 2.5ml加入溶液