HIV跨膜蛋白gp41和gp36原核表达及抗原性研究_袁作为

文章编号:1000-5404(2010)21-2281-05

论著

H I V 跨膜蛋白g p 41和g p 36原核表达及抗原性研究

袁作为1

,帅光泽2

,张　君1

,胡接力1

,郑　建1

(400016重庆,重庆医科大学感染性疾病分子生物学教育部重点实验室1;610106成都,成都大学校医院内科2)

[摘要]　目的　构建H I V 跨膜蛋白g p 41和g p 36原核表达载体,诱导表达H I V 抗原,为H I V 快速诊断和蛋白疫苗研

究提供材料基础。方法　用P C R 方法对H I V -1包膜蛋白g p 41和H I V -2包膜蛋白g p 36基因序列进行全长、截短扩增,分别或以融合表达方式克隆入原核表达载体p Q E 30、p E T 32a (+)及p G S T -M O L U C ,重组质粒经异丙基硫代半乳糖苷(i s o p r o -p y l -β-D -t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e ,I P T G )诱导表达,并经N i -N A T 或谷胱甘肽-S e p h a r o s e -4B 层析柱亲和纯化H I V 跨膜糖蛋白抗原,对获得的纯化抗原进行We s t e r nb l o t 检测,利用H I V 抗原制备E L I S A 检测试剂盒,并分析H I V 临床样本。结果　成功构建了H I V 包膜蛋白的原核表达载体,利用亲和层析纯化得到了纯度较高的H I V 包膜蛋白;We s t e r n b l o t 分析结果证实表达纯化的H I V 跨膜蛋白g p 41(a a .538～718)、g p 36(a a .533～764)以及g p 41-g p 36均能和H I V 阳性血清反应;E L I S A 试剂盒检测临床样本显示,特异性达95%以上,灵敏度达100%。结论　获得了有生物学活性的H I V 截短包膜蛋白,并可用于H I V 快速检测试剂盒的研发。 [关键词]　H I V -1包膜蛋白g p 41;H I V -2包膜蛋白g p 36;重组;抗原性 [中图法分类号]　R 373.9;R 392-33;R 392.11

[文献标志码]　A

[基金项目]　国家自然科学基金(30872419)

[通信作者]　郑　建,电话:(023)68486780,E -m a i l :j i a n 0102@h o t m a i l .c o m

E x p r e s s i o no f H I V t r a n s -m e m b r a n ep r o t e i ng p 41a n dp r o n u c l e u s g p 36a n dt h e i r a n t i g e n i c i t y

Y u a n Z u o w e i 1,S h u a i G u a n g z e 2,Z h a n g J u n 1,H u J i e l i 1,Z h e n g J i a n 1

(1K e y L a b o r a t o r y o f M o l e c u l a r B i o l o g y L a b o r a t o r y o f I n f e c t i o u s

D i s e a s e s o f M i n i s t r y o f

E d u c a t i o n ,C h o n g q i n g M e d i c a l U n i v e r s i t y ,C h o n g q i n g ,40016;2D e p a r t m e n t o f I n t e r n a l M e d i c i n e ,H e a l t hC e n t e r o f C h e n g d u U n i v e r s i t y ,C h e n g d u ,S i c h u a n P r o v i n c e ,610106,C h i n a )

[A b s t r a c t ]　O b j e c t i v e T o c o n s t r u c t t h er e c o m b i n a n t p l a s m i d s w i t hH I V -1g p 41a n dH I V -2g p 36

g e n e s a n d i n d u c e t h e e x p r e s s i o n o f H I V a n t i g e n s f o r t h e r a p i dd i a g n o s i s o f H I V a n dd e v e l o p m e n t o f p r o t e i n v a c c i n e .M e t h o d s F u l l -l e n g t hg e n e s a n d /o r f r a g m e n t g e n e s e n c o d i n gH I V -1t r a n s -m e m b r a n ep r o t e i ng p 41a n d H I V -2t r a n s -m e m b r a n e p r o t e i n g p 36w e r e a m p l i f i e d b y P C R .T a r g e t g e n e s w e r e i n s e r t e d i n t o t h e e x p r e s s i o n v e c t o r s p Q E 30,p E T 32a (+)a n dp G S T -M O L U C ,r e s p e c t i v e l y .R e c o m b i n a n t v e c t o r s w e r et r a n s f o r m e di n t o

E .c o l i B L 21a n d i n d u c e d b y I P T G .E x p r e s s e d f u s i o n p r o t e i n s w e r e p u r i f i e d b y N i 2+

-a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y o r G S T -a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y .A n t i g e n i c i t y o f p u r i f i e dp r o t e i n s w a s i d e n t i f i e db y W e s t e r nb l o t t i n ga n dE L I S A w e r e p r e p a r e d u s i n g t h e p u r i f i e d p r o t e i n s .H I V s a m p l e s w e r e a n a l y z e d .R e s u l t s T h ep r o n u c l e u s v e c t o r o f H I Vt r a n s -m e m b r a n ep r o t e i nw a s s u c c e s s f u l l yc o n s t r u c t e d .H I V t r a n s -m e m b r a n ep r o t e i nw i t har a t h e r h i g h

p u r i t y w a s o b t a i n e d b y N i 2+

-a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y o r G S T -a f f i n i t y c h r o m a t o g r a p h y .W e s t e r n b l o t t i n g s h o w e d t h a t t h e e x p r e s s e d p r o d u c t s i n c l u d i n g g p 41(a a .538-718),g p 36(a a .533-764)a n d g p 41-g p 36r e a c t e dt o

p o s i t i v e H I Vi n s e r u m .H I V -1+o r H I V -w e r e d e t e c t e d w i t h E L I S Ai n H I Vs a m p l e s w i t h a s e n s i t i v i t y o f 100%

a n d a s p e c i f i c i t y o f o v e r 95%.C o n c l u s i o n T h e

b i o l o g i

c a l a c t i v i t y o f H I Vt r u n c a t i o n c r o s s m e m b r a n e p r o t e i n s c a n b e u s e

d i n r

e s e a r c h a n d d e v e l o p m e n t o

f H I Vr a p i d d i a

g n o s i s k i t s . [K e y w o r d s ]　H I V -1e n v e l o p e p r o t e i n g p 41;H I V -2e n v e l o p e p r o t e i n g p 36;r e c o m b i n a n t ;a n t i g e n i c i t y

S u p p o r t e db yt h eN a t i o n a l N a t u r a l S c i e n c eF o u n d a t i o no f C h i n a(30872419).C o r r e s p o n d i n ga u t h o r :Z h e n gJ i a n ,T e l :86-23-68486780,E -m a i l :j i a n 0102@h o t m a i l .c o m

艾滋病是由人类免疫缺陷病毒(h u m a n i m m u n o d e -f i c i e n c y v i r u s ,H I V )感染所致的获得性免疫缺陷综合

征(a c q u i r e di m m u n o d e f i c i e n c y s y n d r o m e ,A I D S )。目前

全球约3500万感染者,其中我国约有80万,疫情开始由高危人群向普通人群大面积扩散,进入快速增长

期,防治工作非常艰巨[1]

。H I V 疫苗是控制艾滋病传播的有效手段,但是迄今为止没有一种有效的疫苗应

2281

第32卷第21期2010年11月15日 第　三　军　医　大　学　学　报A C T A A C A D E M I A E M E D I C I N A E M I L I T A R I S T E R T I A E

V o l .32,N o .21

N o v .15　2010

DOI :10.16016/j .1000-5404.2010.21.004

用于临床。因此对于艾滋病的早期诊断就显得尤为重

要,特异灵敏的诊断能够让患者尽早治疗,同时也避免

H I V 的进一步传播[2]

。而H I V 诊断试剂盒的开发,首先是要获得纯度较高的特异性H I V 抗原。H I V 包膜蛋白g p 41和g p 36暴露于H I V 表面,是诱导机体产生抗体的优势表位,因此是H I V 抗体检测的首选靶标,

同时也是蛋白疫苗研制的抗原表位[3,4]

。本研究尝试对H I V -1g p 41和H I V -2g p 36蛋白的全长和截短进行原核表达,为H I V 快速诊断试剂盒研制以及蛋白多肽疫苗开发提供材料基础。1　材料与方法1.1　材料

1.1.1　质粒和菌株 H I V 全基因组质粒p H I V 1、p H I V 2,宿主大肠杆菌J M 109、B L 21、S G 13009,表达载体p Q E 30、p E T 32a (+)及p G S T -M O L U C 为本室保存。1.1.2　主要试剂 D N A 聚合酶p r i m e s t a r (T A K A R A ),质粒提取试剂盒(P r o m e g a ),限制性内切酶(P r o m e g a ),T 4D N A 连接酶(P r o m e g a ),胶回收试剂盒(Q i a g e n ),I P T G (S i g m a ),H R P 标记羊抗人I g G 购自B i o s 生物技术公司,H I VE L I S A 检测试剂盒购自上海科华生物技术有限公司。

1.1.3　临床样本 H I V -1、H I V -2阳性血清样本及阴性血清样本由四川省疾病预防控制中心提供。

1.2　方法

1.2.1　目的基因扩增 根据N C B I 提供的H I V -1(B 亚型)

和H I V -2的基因序列,分别设计针对不同原核表达载体p Q E 30、p E T 32a (+)及p G S T -M O L U C 的g p 41和g p 36的全长和截短表达P C R 引物。以p H I V -1为模板,引物P 1、P 2扩增全长g p 41(1023b p ),引物P 5、P 6扩增g p 41(a a .538～718、555b p );以p H I V -2为模板,引物P 3、P 4扩增全长g p 36(1032b p ),引物P 7、P 8扩增g p 36(a a .533～764、705b p );用引物P 5、P 10从g p 41(a a .538～718、555b p )上扩增得到3′端带甘氨酸L i n k e r 的P C R 产物,用引物P 9、P 8从g p 36(a a .533～764、705b p )上扩增得到5′端带甘氨酸L i n k e r 的P C R 产物,二者以1∶1摩尔比加入经重

叠延伸P C R 后得到融合截短序列g p 41-g p 36(1248b p )。上述P C R 产物低熔点胶回收。P C R 引物及退火条件见表1。1.2.2　目的基因克隆 载体p Q E 30、p E T 32a (+)、p G S T -M O L U C 及P C R 产物经相应的限制性内切酶双酶切;纯化后的酶切载体与相应的酶切P C R 产物经T 4连接酶连接并转化大肠杆菌J M 109。重组质粒经酶切、测序鉴定。鉴定正确的重组质粒转化相应的表达菌B L 21(D E 3)(以p E T 32a (+)或p G S T -M O L U C 为载体的重组质粒)或S G 13009(以p Q E 30为载体的重组质粒)。1.2.3　重组蛋白的诱导表达 单个菌落接种于含相应抗生素的L B 培养液[以p E T 32a (+)或p G S T -M O L U C 为载体的重组质粒接种于含100m g /m l 氨苄青霉素的培养基;以p Q E 30为载体的重组质粒接种于含100m g /m l 氨苄青霉素和50m g /m l 卡拉霉素的培养基]。30℃摇床振摇过夜培养,待A 600≈0.6时加入终浓度为1m m o l /L 的I P T G 和0.1m m o l /LM g C l 2,15℃诱导约18h ,离心收集菌体,加入蛋白上样缓冲液,煮沸5m i n 后离心取上清S D S -P A G E 检测重组蛋白的表达。1.2.4　重组蛋白的W e s t e r n -b l o t 检测 表达产物经120g /L S D S -P A G E 电泳并转移至硝酸纤维素膜上,以1∶100比例分别稀释H I V -1阳性血清和H I V -2阳性血清并室温下孵育2h ,1∶5000稀释H R P 标记的抗人I g G 为二抗并室温孵育1h 。用二氨基联苯胺(D A B )显色分析表达产物的抗原性。1.2.5　重组蛋白的大量表达和纯化 大量诱导表达重组蛋白,离心收集细菌。对用p Q E 30和p E T 32a (+)载体表达含6×H i s 标签的融合蛋白用N i -N A T 层析柱亲和纯化:裂解缓冲液重悬菌体沉淀,超声破菌,14000×g (4℃)离心20m i n ,上清加入N i -N A T 层析柱,用洗涤液(20m m o l /Li m i d a z o l e )洗去杂蛋白至D (280)<0.1,洗脱液(250m m o l /Li m i d a z o l e )洗脱结合蛋白至D (280)<0.1。对用p G S T -M O L U C 载体表达含G S T 标签的融合蛋白用谷胱甘肽-S e p h a r o s e -4B 层析柱亲和纯化:超声破菌后的蛋白上清加入谷胱甘肽-S e p h a r o s e -4B 层析柱,P B S 洗去杂蛋

白后,洗脱液(10m m o l /L 还原型谷胱甘肽)洗脱吸附在柱上的融合蛋白。S D S -P A G E 测定各洗脱管的纯度和浓度。收集2种融合蛋白的洗脱液,用D E A E 离子交换柱第2次纯化融合蛋白。2次洗脱蛋白通过S D S -P A G E 测定目的蛋白浓度和纯度后决定洗脱蛋白的收集,并风干浓缩。B r a d f o r d 法测定纯化蛋白量。

表1　P C R 引物设计及退火条件

酶切位点扩增基因选用载体引物序列

退火温度(℃)

载体

引物g p 41

V 1、V 2、V 3

P 1B a m H ⅠB g l Ⅱ5′-A T G A G A T C T G C A G T G G G A A T A G G A G C -358

P 2

S a l ⅠS a l Ⅰ5′-A T G G T C G A C T T C C A A G C C C T G T C T T A -3′g p 36V 1、V 2、V 3P 3B a m H ⅠB g l Ⅱ5′-A T G A G A T C T G T G A G G A A C A A A A G A G G T G -3′58P 4S a l ⅠS a l Ⅰ5′-A T G G T C G A C T C T T G G A A C T G C G A G T A T -3′g p 41-T V 2、V 3P 5B a m H ⅠB g l Ⅱ5′-A T G A G A T C T A C G G T A C A G G C C A G A C A A T -3′

55P 6S a l ⅠS a l Ⅰ5′-G G C G T C G A C T G T T C G A A T G A T C T G A A A C G A T A A T G G T G A A -3′g p 36-T V 2、V 3P 7S a c ⅠS a c Ⅰ5′-G C C G A G C T C A T C A T T C G A A C A A C G C T G T C A G C C C A G T -3′55P 8S a l ⅠS a l Ⅰ5′-A T G G T C G A C G A G G C G A G T C A G T A G G -3′g p 41-g p 36

V 2、V 3

P 5B a m H Ⅰ

B g l Ⅱ

5′-A T G A G A T C T A C G G T A C A G G C C A G A C A A T -352P 105′-A T C A T T C G A A C A -3P 95′-T G T T C G A A T G A T -3′

52P 8

S a l Ⅰ

S a l Ⅰ

5′-A T G G T C G A C G A G G C G A G T C A G T A G G -3

g p 41-T 、g p 36-T 分别为g p 41(a a .538～718)、g p 36(a a .533～764);V 1、V 2、V 3分别为载体p E T 32a (+)、p Q E 30、p G S T -M O L U C 。斜体字划线碱基为限制性内切酶酶切位点;加粗碱基为甘氨酸l i n k e r

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第32卷第21期2010年11月15日 第　三　军　医　大　学　学　报A C T A A C A D E M I A E M E D I C I N A E M I L I T A R I S T E R T I A E

V o l .32,N o .21

N o v .15　2010

1.2.6　H I V 1/H I V 2E L I S A 检测试剂盒的制备 定量后的纯化蛋白用碳酸盐缓冲液(4.3g /LN a H C O 3,5.3g /LN a 2C O 3,p H 9.4)稀释成5μg /m l 包被酶标板,4℃孵育过夜。用含0.5%T w e e n -20的P B S 洗涤酶标板4次,加入200μl 封闭缓冲液(1%B S A 的P B S )室温封闭2h 。洗涤4次后吹干并置于4℃保存。

1.2.7　临床样本的E L I S A 检测 在包被的酶标板中加入患者血清,37℃孵2h ,洗涤缓冲液洗板4次,加入1∶5000稀释

的抗人二抗37℃孵0.5h ,充分洗板4次,四甲基联苯胺(T M B )显色,于波长450n m 测定吸光度值[D (450)]。

2　结果

2.1　重组表达质粒的构建

分别以H I V -1和H I V -2全基因组质粒为模板,扩增g p 41和g p 36全长﹑截短及融合基因片段。P C R 以及重叠延伸P C R 产物经琼脂糖凝胶电泳可见清晰条带,与预期片段大小相符。P C R 产物与相应的酶切载体连接转化,构建的重组质粒经双酶切鉴定(图1),其中p G S T -g p 36(a a .533～764)、p Q E -g p 36(a a .533～764)经S a c Ⅰ、S a l Ⅰ双酶切,在约700b p 左右位置可见酶切小片段。其他重组质粒用B a m H Ⅰ、S a l Ⅰ双酶切,由于载体的酶切位点B a m H Ⅰ与P C R 产物的酶切位点B g l Ⅱ为同粘酶,载体与P C R 产物连接后两种酶切位点消失,所以当用B a m H Ⅰ、S a l Ⅰ双酶切重组质粒时,不能酶切出小片段,而大片段的大小为载体大小加上插入片段大小。酶切与测序结果表明,重组质粒大小和读码框正确无误

。

1:λ-E c o T 14I d i g e s t D N A 标准;2:p G S T -(g p 41-g p 36);3:p Q E -(g p 41-g p 36);4:p G S T -g p 36(a a .533～764);5:p Q E -g p 36(a a .533～764);6:p G S T -g p 41(a a .538～718);7:p Q E -g p 41(a a .538～718);8:p G S T -g p 36;9:p Q E -g p 36;10:p E T -g p 36;11:p G S T -g p 41;12:p Q E -g p 41;13:p E T -g p 41

图1　酶切产物琼脂糖凝胶电泳分析

2.2　重组蛋白的诱导表达和纯化

经过降低诱导温度,改变诱导剂浓度等优化诱导表达条件,S D S -P A G E 显示,g p 41(a a .538～718)、g p 36(a a .533～764)以及g p 41-g p 36在p Q E 30和p G S T -M O L U C 载体中均有表达,分子量与期望值相符(图2)。融合蛋白经亲和柱纯化后,纯度均在80%以上(图3)。全长g p 41、全长g p 36在p Q E 30中没有表达,而在p E T 32a (+)和p G S T -M O L U C 中有微量表达,优化诱导条件很难提高其表达水平,亲和层析纯化重组蛋白其纯度不足10%,浓度不足0.1m g /m l ,不适合做E L I S A 检测的包被抗原(数据未给出)。免疫印迹结果表明,除G S T -g p 41-g p 36外,表达的重组蛋白g p 41(a a .538～718)、g p 36(a a .533～764)、g p 41-

g p 36及G S T -g p 41(a a 538～718)、G S T -g p 36(a a 533～764别与H I V -1和H I V -2阳性血清发生特异性反应,融合蛋白具有很好的抗原性(图4)。

M :蛋白标准;1:g p 41-g p 36;2:G S T -g p 36(533～764);3:G S T -g p 41-g p 36;4:g p 41(a a .538～718);5:G S T -g p 41(a a .538～718);6:g p 36(a a .533～764)

图2　重组蛋白诱导表达产物S D S -P A G E 分析

M :蛋白标准;1:g p 36(a a .533～764);2:g p 41-g p 36;3:G S T -g p 36(a a .533～764);4:G S T -g p 41-g p 36;5:g p 41(a a .538～718);6:G S T -g p 41(a a .538～718)

图3　重组纯化蛋白S D S -P A G E 分析

A :以H I V -1阳性血清作为一抗;

B :以H I V -2阳性血清作为一抗1:G S T -g p 41-g p 36;2:g p 41-g p 36;3:G S T -g p 41(a a .538～718);4:g p 41(a a .538～718);5:g p 36(a a .533～764);6:G S T -g p 36(a a .533～764)

图4　纯化蛋白We s t e r nb l o t 分析

2.3　H I V -1/H I V -2E L I S A 检测试剂盒的应用

以We s t e r nb l o t 检测具有免疫学活性的重组蛋白包被

E L I S A 酶标板,制备H I V -1和H I V -2E L I S A 检测试剂盒。用制备的检测试剂盒分别检测36份H I V -1阳性血清、12份H I V -2阳性血清以及109份阴性血清,分析检测试剂盒的特异性和灵敏性。融合蛋白g p 41(a a .538～718)、g p 41-g p 36及G S T -g p 41(a a .538～718)对H I V -1的检测灵敏性为100%,特异性分别为98.17%,97.25%和95.41%。融合蛋白g p 36(a a .533～764)、g p 41-g p 36及G S T -g p 36(a a .533～764)对H I V -2的检测灵敏性为100%,特异性分别为97.25%,97.25%和96.33%(表2、3)。

表2　H I V -1阳性和阴性血清样本E L I S A 检测结果

H I V -1+血清

H I V -血清灵敏度特异度g p 41(a a .538～718)36/36107/109100%98.17%G S T -g p 41(a a .538～718)

36/36104/109100%95.41%g p 41-g p 36

36/36

106/109

100%

97.25%

表3　H I V -2阳性和阴性血清样本E L I S A 检测结果

H I V -2+血清

H I V -血清

灵敏度特异度G p 36(a a .533～764)12/12106/109100%97.25%G S T -g p 36(a a .533～764)

12/12105/109100%96.33%2283

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3　讨论

H I V检测方法有多种,如核酸检测、P24抗原检测、抗体检测等。抗体检测是利用H I V特异性抗原来检测血清中针对H I V的特异性抗体,该方法广泛应用于H I V初筛诊断。与抗体检测相比核酸检测操作复杂,易出现假阳性或假阴性结果,而主要应用于临床H I V治疗疗效评价。P24抗原检测虽然能够早期诊断H I V,但是P24量较少,使其阳性率通常较低,采用解离免疫复合物法或浓缩P24抗原可提高敏感性,但这也增加了检测成本[5,6]。因此H I V抗体检测是H I V筛查的主要手段,在H I V的防控中发挥着重要作用。

基于H I V抗体检测方法的建立,首要的是获得具有免疫学活性的蛋白抗原。H I V-1包膜蛋白g p41由外膜蛋白前体(g p160)裂解产生,免疫原性强,H I V感染者能针对其产生特异抗体,且在体内长期存在,检出率高,g p41N-末端部分(a a.584～616)抗原决定簇与H I V-1患者血清中抗体有较宽的反应性[7];H I V-2包膜蛋白g p36由H I V-2外膜蛋白(g p140)裂解产生,其N端(a a.581～605)序列高度保守,H I V感染者血清中有针对这个区域的特异抗体[8]。因此包含有这些保守区的全长或截短抗原肽可作为开发H I V诊断试剂盒的靶蛋白。

我们可以通过化学合成或利用基因工程克隆表达来获得抗原肽,考虑到化学合成价格昂贵且不可再生,所以选择利用构建原核表达载体诱导表达的方法来获得大量的抗原。不同的表达载体由于其启动子、融合标签等成分不同,其表达能力及表达水平差异很大;同时融合蛋白的大小和结构的差异也会对表达的重组融合蛋白的构象产生很大的影响,进而影响融合蛋白的抗原性及生物学功能[9]。在本实验中,为获得高表达水平和高抗原性的重组蛋白,我们同时选用3种不同的表达载体分别表达全长和截短的目的蛋白。载体p Q E30以T5为启动子,其启动能力明显低于T7启动子,因此在表达大小适中的截短g p41和g p36片段时,相对于载体p G S T-M O L U C而言,其表达水平明显降低;对片段较长的全长g p41和g p36则完全没有表达。融合标签G S T虽然能增加重组蛋白的溶解性,但随着融合片段的增大,其表达水平也下降,故同为g p41-g p36的串联片段,在载体p Q E30的表达量明显高于p G S T-M O L U C;同时由于融合标签G S T相对较大,融合后的重组蛋白可能会由于G S T的空间位阻作用遮蔽g p41和g p36的抗原决定簇位点,导致抗原性的缺失,从而使免疫印迹无反应。在g p41和g p36的截短表达中,不同融合标签对抗原的抗原性也起着重要的影响,h i s 标签由于其分子量太小,几乎不影响重组蛋白的高级结构,对重组蛋白的生物学活性影响甚微,在E L I S A检测时其特异性最高(g p41为98.17%,g p36为97.25%)。由此可知,选择不同的表达载体对获得高表达和高生物学活性的重组蛋白具有至关重要的影响,甚至直接导致实验的成功或者失败;而不同载体对不同蛋白的表达情况往往是未知的。同时选择多种表达载体表达目的蛋白是获得高效表达重组蛋白的重要策略。

本研究尝试对H I V-1g p41和H I V-2g p36蛋白的全长和截短进行原核表达,其中g p41和g p36全长的原核表达没有成功,还可能和全长包膜蛋白含有较多疏水氨基酸以及表达产物对宿主菌的毒性有关。包涵体形式表达的重组蛋白往往会由于蛋白的错误折叠导致立体构象的改变,进而造成生物学活性的丢失。而包涵体复性一直是分子生物学界的难题,包涵体复性率通常很低,一般不超过20%;同时不同的蛋白具有不同的结构和功能,其复性过程也各不相同,存在明显的差异和不同难易程度。为避免重组蛋白包涵体表达,本实验不仅通过选择能增加可溶性表达的融合表达载体p E T32a(+)和p G S T-M O L U C,并通过大幅降低诱导表达温度,严格控制诱导表达细菌密度,加入一些辅助因子等手段,使得原本以包涵体形式表达的重组蛋白重新以溶解形式表达在菌体裂解上清中(数据未给出),最终成功表达纯化了g p41(a a.538～718)、g p36(a a.533～764)以及g p41-g p36截短蛋白,W e s t e r n b l o t检测显示所表达的抗原均具有很好的抗原性,能够和H I V阳性血清发生反应。E L I S A检测试剂盒对36份H I V-1阳性血清、12份H I V-2阳性血清以及109份阴性血清分析结果显示灵敏性为100%,特异性大于95%,这说明所表达的抗原肽可以应用于胶体金试纸条以及酶联免疫检测试剂盒的开发,但其特异性还有待提高。纯化过后的蛋白仍然含有一定量的杂蛋白,这可能降低检测的特异性,我们可以进一步优化纯化条件获得更纯的抗原肽,同时可以利用其他特异抗原与现有抗原肽联用,以此来提高检测的特异性。

H I V-1与H I V-2包膜蛋白间只有40%的同源序列,因此单一的包膜蛋白不能同时检测出H I V-1和H I V-2感染。本研究中利用重叠延伸P C R通过甘氨酸L i n k e r将H I V-1包膜蛋白g p41和H I V-2包膜蛋白g p36连接而得融合蛋白g p41-g p36,这一融合蛋白能够同时检测H I V-1和H I V-2感染,这增加了H I V检测的适用范围,同时可以提高检出率,降低漏诊率。

g p41-g p36同时包括了H I V-1和H I V-2包膜蛋白,且这

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一包膜蛋白区序列高度保守,能诱导机体产生广谱中和抗体[10,11]

,对H I V 联合蛋白多肽疫苗的开发有一定的意义。参考文献:

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c o m b i n a n t -

d

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f o rs e r o d i a

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[11]F o r s e l l MN ,S c h i e f W R ,Wy a t t RT .I m m u n o g e n i c i t y o f H I V -1e n v e -l o p e g l y c o p r o t e i no l i g o m e r s [J ].C u r r O p i nH I V A I D S ,2009,4(5):380-387.

(收稿:2010-06-12;修回:2010-07-06)

(编辑　王　红)

文章编号:1000-5404(2010)21-2285-01

个案与短篇

中耳灌注地塞米松治疗120例主观性耳鸣

闫海燕,李丽萍,兰立国 (

064400河北迁安,河北省迁安市人民医院五官科) [关键词]　中耳灌注;地塞米松;主观性耳鸣 [中图法分类号]　R 764.45 [文献标志码]　B [通信作者]　闫海燕,E -m a i l :y a n h a i y a n 111@y a h o o .c n

主观性耳鸣是指在周围环境中无相应声源和电(磁)刺激源情况下,患者自觉耳内或颅内有声音的一种主观感觉。耳鸣给患者带来很大痛苦和烦恼。耳鸣的治疗方法很多,但疗效都不确定。近年来我们采用中耳灌注地塞米松加常规口服药物治疗主观性耳鸣患者,并与常规口服药物治疗患者进行对照观察,现报告如下。

1　资料与方法1.1　一般资料

选取2007年1月至2009年12月门诊主观性耳鸣患者共计120例152耳,经过全身检查,耳部检查、纯音测听、声导抗、A B R 、C T 检查,排除耳部器质性病变(耵聍栓塞、中耳炎、咽鼓管堵塞、耳硬化症、听神经瘤)及严重全身疾病(高血压、糖尿病、贫血、肾病、精神病)。分为治疗组和对照组。治疗组:41例56耳,男性24例32耳,女性17例24耳。年龄18～65岁,

平均38.5岁,伴听力下降30耳,不伴听力下降26耳。首诊20耳,复诊36耳。病史7d 至5年,平均55d 。对照组:79例96耳,男性36例42耳,女性43例54耳。年龄19～64岁,平均36.7岁,伴听力下降49耳,不伴听力下降47耳。首诊61耳,复诊35耳。病史5d 至5年,平均47d 。2组临床资料差异无统计学意义(P>0.05)。

1.2　方法

对照组:采用常规口服药物治疗。长春胺缓释胶囊30m g ,2次/d ;培他啶片4m g ,3次/d ;维生素B 110m g ,3次/d ;维生素B 12

0.5m g ,3次/d 治疗。 治疗组:采用中耳灌注地塞米松加常规口服药物治疗。患者取坐位,75%乙醇消毒耳廓及外耳道,7号长针经鼓膜紧张部前下象限注入地塞米松5m g (郑州市卓峰制药有限公司,5m g /m l ),迅速仰卧30m i n ,期间避免打喷嚏及吞咽动作。每周1次,共3次,共用地塞米松15m g 。同时口服常规药物治疗(同对照组)。

2组患者均治疗20d 后,据临床症状判断疗效。疗效分级标准:王洪田等[1]制定的《耳鸣的诊断和治疗指南建议案》。

(下转2299页)

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(完整版)临床免疫学检验知识点.doc

临床免疫学检验 1、免疫：是机体识别和排斥抗原性异物的一种生理功能 2、免疫防御（对外）；免疫自稳（防自身免疫病）；免疫监视（防肿瘤）。 3、中枢免疫器官：骨髓、胸腺；外周免疫器官：淋巴结、脾脏（最大）、黏膜相关淋巴组织 4、 B 细胞：通过识别膜免疫球蛋白来结合抗原，介导体液免疫；B细胞受体=BCR=mIg 表面标志：膜免疫球蛋白（SmIg）、 Fc 受体、补体受体、EB 病毒受体和小鼠红细胞受体。 成熟 B 细胞： CD19、CD20、 CD21、 CD22 （成熟 B 细胞的 mIg 主要为 mIgM和 mIgD）同时检测 CD5分子，可分为 B1 细胞和 B2 细胞。 B 细胞功能检测方法：溶血空斑形成试验（体液免疫功能）。 5、T 细胞：介导细胞免疫。共同表面标志是 CD3（多链糖蛋白）；辅助 T 细胞的标志是 CD4；杀伤 T 细胞的标志是 CD8； T 细胞受体 =TCR。 T 细胞和 NK细胞的共同表面标志是CD2（绵羊红细胞受体）； CD3＋ CD4＋CD8－ =辅助性T细胞（Th） CD3＋ CD4－CD8＋ =细胞毒性T 细胞（ Tc 或 CTL）（ T 细胞介导的细胞毒试验） CD4＋ CD25＋ =调节性T细胞（Tr或Treg） T 细胞功能检测：植物血凝素（ PHA）刀豆素（ CONA）刺激 T 细胞增殖。增殖试验有：形态 法、核素法。 T 细胞亚群的分离：亲和板结合分离法，磁性微球分离法，荧光激活细胞分离仪分离法 *E 花环试验是通过检测SRBC受体而对T 细胞进行计数的一种试验； 6、 NK细胞：具有细胞介导的细胞毒作用。直接杀伤靶细胞（肿瘤细胞和病毒感染的细胞） 表面标志： CD16（ ADCC）、 CD56。 测定人 NK细胞活性的靶细胞多用K562 细胞株，而测定小鼠胞株。NK细胞活性则常采 用 YAC-1 细 7、吞噬细胞包括：单核 - 吞噬细胞系统（MPS，表面标志外周血中的单核细胞和组织内的巨噬细胞）和中性粒细胞。CD14，包括骨髓内的前单核细胞、（表达 MHCⅡ类分子） 8、人成熟树突状细胞（DC）（专职抗原呈递功能）：表面标志为CD1a、CD11c和CD83。 9、免疫球蛋白可分为分泌型（ sIg ，主要存在于体液中，具有抗体功能）及膜型（ mIg，作为抗原受体表达于 B 细胞表面，称为膜表面免疫球蛋白） 10、免疫球蛋白按含量多少排序：IgG＞IgA＞IgM＞IgD＞IgE五类（按重链恒定区抗原性（CH）排序） 免疫球蛋白含量测定：单向环状免疫扩散法、免疫比浊法。 11、免疫球蛋白的同种型抗原决定簇位于恒定区（CH、CL） 12、抗体由浆细胞产生。抗体分子上VH和 VL（高变区）是抗原结合部位。

抗原抗体的最佳反应

第一节抗原抗体反应的原理 抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原决定簇（表位）与抗体超变区的沟槽分子表面的结构互性与亲合性而结合的。 一、抗原抗体的结合力 抗原抗体间结合为非共价键结合，有四种分子间引力参与。 （1）静电引力：是抗原抗体分子带有相反电荷的氨基和羧基基团之间相互吸引的力。又称为库伦引力。这种引力的大小与两电荷间的距离的平方成反比。两个电荷距离越近，静电引力越强。 （2）范德华引力：是抗原与抗体两个大分子外层轨道上电子之间相互作用时，因两者电子云中的偶极摆动而产生吸引力。能促使抗原抗体相互结合，这种引力的能量小于静电引力。 （3）氢键结合力：是抗体上亲水基团与相应抗原彼此接近时，相互间可形成氢键，使抗原抗体相互结合。氢键结合力较范德华引力强。 （4）疏水作用力：是抗原表位与抗体超变区靠近时，相互间正、负极性消失，亲水层也立即失去，排斥了两者之间的水分子，使抗原抗体进一步相互吸引，促进其结合。疏水作用力是这些力中最强的，对维系抗原抗体结合作用最大。 二、抗原抗体的亲合性和亲合力 亲合性是指抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原表位之间相互适应而存在的引力，它是抗原抗体之间固有的结合力，可用平衡常数K来表示：K=K1/K2，K值越大，亲合性越高；亲合性越高，与抗原结合越牢。 抗体的亲合力是指抗体结合部位与抗原表位之间结合的强度，与抗体结合价直接相关，即所谓多价优势，如IgG为两价，亲合力为单价的103倍，IgM为5～10价，亲合力为单价的107倍。由于抗原抗体的结合反应是可逆的，若抗体的亲合力高，与抗原分子结合牢固，不易解离；反之即容易解离。 二、亲水胶体转化为疏水胶体 大多数抗原为蛋白质，抗体是球蛋白，它们溶解在水中皆为胶体溶液，不会发生自然沉淀。这种亲水胶体的形成机制是因蛋白质含有大量的氨基和羧基残基，在溶液中这些残基带有电荷，由于静电作用，在蛋白质分子周围出现了带相反电荷的电子云并形成了水化层，由于电荷的相斥，就避免了蛋白质分子间靠拢、凝集和沉淀。当抗原抗体结合后，使水化层表面电荷减少或消失，水化层变薄，电子云也消失，蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体。再加入电解质，如NaCl，则进一步使疏水胶体物相互靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。

抗原抗体结合的影响因素

转载某理工大学讲义，如果有更新的研究文章更好，呵呵 第一节抗原抗体反应的原理抗原与抗体能够特异性结合是基于抗原决定簇(表 位 )与抗体超变区的 沟槽分子表面的结构互性与亲合性而结合的。 一、抗原抗体的结合力抗原抗体间结合为非共价键结合，有四种分子间引力参与。 (1)静电引力：是抗原抗体分子带有相反电荷的氨基和羧基基团之间相互吸引的力。又称为库伦引力。这种引力的大小与两电荷间的距离的平方成反比。两个电荷距离越近，静电引力越强。 (2)范登华引力：是抗原与抗体两个大分子外层轨道上电子之间相互作用时，因两者电子云中的偶极摆动而产生吸引力。能促使抗原抗体相互结合，这种引力的能量小于静电引力。 (3)氢键结合力：是抗体上亲水基团与相应抗原彼此接近时，相互间可形成氢键，使抗原抗体相互结合。氢键结合力较范登华引力强。 (4)疏水作用力：是抗原表位与抗体超变区靠近时，相互间正、负极性消失，亲水层也立即失去，排斥了两者之间的水分子，使抗原抗体进一步相互吸引，促进其结合。疏水作用力是这些力中最强的，对维系抗原抗体结合作用最大。 二、抗原抗体的亲合性和亲合力亲合性是指抗体分子上一个抗原结合点与对应的抗原表位之间相互适应而存在的引力，它是抗原抗体之间固有的结合力，可用平衡常数 K 来表示： K=K1/K2 ，K 值越大，亲合性越高；亲合性越高，与抗原结合越牢。抗体的亲合力是指抗体结合部位与抗原表位之间结合的强度，与抗体结合价直接相关，即所谓多价优势，如 IgG 为两价，亲合力为单价的103倍，IgM为5?10价，亲合力为单价的 107倍。由于抗原抗体的结合反应是可逆的，若抗体的亲合力高，与抗原分子结合牢固，不易解离；反之即容易解离。 三、亲水胶体转化为疏水胶体大多数抗原为蛋白质，抗体是球蛋白，它们溶解在水中皆为胶体溶液，不会发生自然沉淀。这种亲水胶体的形成机制是因蛋白质含有大量的氨基和羧基残基，在溶液中这些残基带有电荷，由于静电作用，在蛋白质分子周围出现了带相反电荷的电子云并形成了水化层，由于电荷的相斥，就避免了蛋白质分子间靠拢、凝集和沉淀。当抗原抗体结合后，使水化层表面电荷减少或消失，水化层变薄，电子云也消失，蛋白质由亲水胶体转化为疏水胶体。再加入电解质，如NaCI，则进一步使疏水胶体物相互 靠拢，形成可见的抗原抗体复合物。 第二节抗原抗体反应的特点 一、特异性抗原抗体的特异性是指抗原分子上的抗原决定簇和抗体分子超变区结合的特异性，由两者之间查问结构互补决定的。抗体分子VH 区和 VL 区上 各自具有的三个高变区共同组成抗原结合部位，该部位形成一个与抗原决定簇互补的槽沟，决定了抗体的特异性。因此，在抗原抗体反应的免疫学实验中，可以用已知的抗原或抗体来检测相应的抗体或抗原。但较大分子的蛋白质常含有多种抗原表位。如果两种不同的抗原分子上有相同的抗原表位，或抗原、抗体间构型部分相同，皆可出现交叉反应。 二、比例性比例性是指抗原抗体特异性结合时，生成结合物的量与反应物浓度的关系，只有当二者浓度比例适当时，才出现可见的反应。因此在进行抗原抗体试验时，抗原抗体反应比例最合适的范围，称为抗原抗体反应的等价带。当抗体过量时，称为前带，抗原过量时，称为后带。

第四章免疫球蛋白

第四章免疫球蛋白 抗体（antibody，Ab）是介导体液免疫的重要效应分子，是B细胞接受抗原刺激后增殖分化为浆细胞所产生的糖蛋白，主要存在于血清等体液中，通过与相应抗原特异性地结合，发挥体液免疫功能。早在十九世纪后期，von Behring和Kitasato就发现白喉或破伤风毒素免疫动物后可产生具有中和毒素作用的物质，称之为抗毒素（antitoxin），随后引入抗体一词来泛指抗毒素类物质。1937年Tiselius和Kabat用电泳方法将血清蛋白分为白蛋白以及α1、α2、β和γ球蛋白等组分，并发现抗体活性主要存在于γ区，故相当长一段时间内，抗体又被称为γ球蛋白（丙种球蛋白）（图4-1）。1968年和1972年世界卫生组织和国际免疫学会联合会的专门委员会先后决定，将具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统一命名为免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig）。免疫球蛋白可分为分泌型（secreted Ig，sIg）和膜型（membrane Ig, mIg）。前者主要存在于血液及组织液中，具有抗体的各种功能；后者构成B细胞膜上的抗原受体。 第一节免疫球蛋白的结构 一、免疫球蛋白的基本结构 X射线晶体衍射结构分析发现，免疫球蛋白由四肽链分子组成，各肽链间有数量不等的链间二硫键。在结构上Ig可分为三个大小大致相同的片段，其中两

个大小完全一致的片段位于分子的上方，通过一易弯曲的区域与主干连接，形成一“Y”字型结构（图4－2），组成Ig单体，是免疫球蛋白分子的基本单位。 （一）重链和轻链 任何一类天然免疫球蛋白分子均含有四条多肽链，其中，分子量较大的称为重链(heavy chain，H)，而分子量较小的为轻链(light chain，L)。同一天然Ig分子中的两条H链和两条L链的氨基酸组成完全相同。 1．重链分子量约为50~75kD，由450~550个氨基酸残基组成。各类免疫球蛋白重链恒定区的氨基酸组成和排列顺序不尽相同，因而其抗原性也不同。据此，可将免疫球蛋白重链分为五类（class）或五个同种型（isotype），即μ链、δ链、 链、α链和ε链，其相应的Ig分别为IgM、IgD、IgG、IgA和IgE。不同类的重链具有不同的特征，如链内二硫键的数目和位置、连接寡糖的数量、结构域的数目以及铰链区的长度等均不完全相同。即使是同一类Ig重链其铰链区氨基酸组成和二硫键的数目、位置也不同，据此又可将同一类Ig分为不同的亚类（subclass）。如人IgG可分为IgG1~IgG4；IgA可分为IgA1和IgA2。IgM、IgD

抗体的结构与功能

免疫球蛋白的结构与功能 一、免疫球蛋白分子的基本结构 Porter等对血清IgG抗体的研究证明，Ig分子的基本结构是由四肽链组成的。即由二条相同的分子量较小的肽链称为轻链和二条相同的分子量较大的肽链称为重链组成的。轻链与重链是由二硫键连接形成一个四肽链分子称为Ig分子的单体，是构成免疫球蛋白分子的基本结构。Ig单体中四条肽链两端游离的氨基或羧基的方向是一致的，分别命名为氨基端（N 端）和羧基端（C端）。 （一）轻链和重链 由于骨髓瘤蛋白（M蛋白）是均一性球蛋白分子，并证明本周蛋白（BJ）是Ig分子的L链，很容易从患者血液和尿液中分离纯化这种蛋白，并可对来自不同患者的标本进行比较分析，从而为Ig分子氨基酸序列分析提供了良好的材料。 1．轻链（light chain,L）轻链大约由214个氨基酸残基组成，通常不含碳水化合物，分子量约为24kD。每条轻链含有两个由链内二硫键内二硫所组成的环肽。L链共有两型：kappa(κ)与lambda(λ)，同一个天然Ig分子上L链的型总是相同的。正常人血清中的κ：λ约为2：1。 2．重链（heavy chain,H链）重链大小约为轻链的2倍，含450～550个氨基酸残基，分子量约为55或75kD。每条H链含有4～5个链内二硫键所组成的环肽。不同的H链由于氨基酸组成的排列顺序、二硫键的数目和们置、含的种类和数量不同，其抗原性也不相同，根据H链抗原性的差异可将其分为5类：μ链、γ链、α链、δ链和ε链，不同H链与L 链（κ或λ链）组成完整Ig的分子分别称之为IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。γ、α和δ链上含有4个肽，μ和ε链含有5个环肽。 （二）可变区和恒定区 通过对不同骨髓蛋白或本周蛋白H链或L链的氨基酸序列比较分析，发现其氨基端（N-末端）氨基酸序列变化很大，称此区为可变区（V），而羧基末端（C-末端）则相对稳定，变化很小，称此区为恒定区。 1．可变区（variable region,V区）位于L链靠近N端的1/2（约含108～111个氨基酸残基）和H链靠近N端的1/5或1/4（约含118个氨基酸残基）。每个V区中均有一个由链内二硫键连接形成的肽环，每个肽环约含67～75个氨基酸残基。V区氨基酸的组成和排列随抗体结合抗原的特异性不同有较大的变异。由于V区中氨基酸的种类为排列顺序千变万化，故可形成许多种具有不同结合抗原特异性的抗体。 L链和H链的V区分别称为VL和VH。在VL和VH中某些局部区域的氨基酸组成和排列顺序具有更高的变休程度，这些区域称为高变区（hypervariable region,HVR）。在V区中非HVR部位的氨基酸组面和排列相对比较保守，称为骨架区（fuamework rugion）。VL 中的高变区有三个，通常分别位于第24～34、50～65、95～102位氨基酸。VL和VH的这三个HVR分别称为HVR1、HVR2和HVR3。经X线结晶衍射的研究分析证明，高变区确实为抗体与抗原结合的位置，因而称为决定簇互补区（complementarity-determining regi-on,CDR）。VL和VH的HVR1、HVR2和HVR3又可分别称为CDR1、CDR2和CDR3，一般的CDR3具有更高的高变程度。高变区也是Ig分子独特型决定簇（idiotypic determinants）主要存在的部位。在大多数情况下H链在与抗原结合中起更重要的作用。 2．恒定区（constant region,C区）位于L链靠近C端的1/2（约含105个氨基酸残基）和H 链靠近C端的3/4区域或4/5区域（约从119位氨基酸至C末端）。H链每个功能区约含110多个氨基酸残基，含有一个由二锍键连接的50～60个氨基酸残基组成的肽环。这个区域氨

抗体的结构与功能

来源：医学全在线更新：2007-12-3 医学论坛 该文章转载自医学全在线：https://www.wendangku.net/doc/d49481301.html,/edu/200712/18959.shtml 免疫球蛋白的结构与功能 一、免疫球蛋白分子的基本结构 Porter等对血清IgG抗体的研究证明，Ig分子的基本结构是由四肽链组成的。即由二条相同的分子量较小的肽链称为轻链和二条相同的分子量较大的肽链称为重链组成的。轻链与重链是由二硫键连接形成一个四肽链分子称为Ig分子的单体，是构成免疫球蛋白分子的基本结构。Ig单体中四条肽链两端游离的氨基或羧基的方向是一致的，分别命名为氨基端（N 端）和羧基端（C端）。 图2-3 免疫球蛋白分子的基本结构示意图 （一）轻链和重链 由于骨髓瘤蛋白（M蛋白）是均一性球蛋白分子，并证明本周蛋白（BJ）是Ig分子的L链，很容易从患者血液和尿液中分离纯化这种蛋白，并可对来自不同患者的标本进行比较分析，从而为Ig分子氨基酸序列分析提供了良好的材料。 1．轻链（light chain,L）轻链大约由214个氨基酸残基组成，通常不含碳水化合物，分子量约为24kD。每条轻链含有两个由链内二硫键内二硫所组成的环肽。L链共有两型：

kappa(κ)与lambda(λ)，同一个天然Ig分子上L链的型总是相同的。正常人血清中的κ：λ约为2：1。 2．重链（heavy chain,H链）重链大小约为轻链的2倍，含450～550个氨基酸残基，分子量约为55或75kD。每条H链含有4～5个链内二硫键所组成的环肽。不同的H链由于氨基酸组成的排列顺序、二硫键的数目和们置、含的种类和数量不同，其抗原性也不相同，根据H链抗原性的差异可将其分为5类：μ链、γ链、α链、δ链和ε链，不同H链与L 链（κ或λ链）组成完整Ig的分子分别称之为IgM、IgG、IgA、IgD和IgE。γ、α和δ链上含有4个肽，μ和ε链含有5个环肽。 （二）可变区和恒定区 通过对不同骨髓蛋白或本周蛋白H链或L链的氨基酸序列比较分析，发现其氨基端（N-末端）氨基酸序列变化很大，称此区为可变区（V），而羧基末端（C-末端）则相对稳定，变化很小，称此区为恒定区。 1．可变区（variable region,V区）位于L链靠近N端的1/2（约含108～111个氨基酸残基）和H链靠近N端的1/5或1/4（约含118个氨基酸残基）。每个V区中均有一个由链内二硫键连接形成的肽环，每个肽环约含67～75个氨基酸残基。V区氨基酸的组成和排列随抗体结合抗原的特异性不同有较大的变异。由于V区中氨基酸的种类为排列顺序千变万化，故可形成许多种具有不同结合抗原特异性的抗体。 L链和H链的V区分别称为VL和VH。在VL和VH中某些局部区域的氨基酸组成和排列顺序具有更高的变休程度，这些区域称为高变区（hypervariable region,HVR）。在V区中非HVR部位的氨基酸组面和排列相对比较保守，称为骨架区（fuamework rugion）。VL 中的高变区有三个，通常分别位于第24～34、50～65、95～102位氨基酸。VL和VH的这三个HVR分别称为HVR1、HVR2和HVR3。经X线结晶衍射的研究分析证明，高变区确实为抗体与抗原结合的位置，因而称为决定簇互补区（complementarity-determining regi-on,CDR）。VL和VH的HVR1、HVR2和HVR3又可分别称为CDR1、CDR2和CDR3，一般的CDR3具有更高的高变程度。高变区也是Ig分子独特型决定簇（idiotypic determinants）主要存在的部位。在大多数情况下H链在与抗原结合中起更重要的作用。

抗体选择题

1. 关于轻链的叙述，哪项是错误的 (A) A、Ig根据V L抗原特异性不同分为两个型 B、Ig的轻链均相同 C、轻链有两型 D、同一个天然Ig分子上两条轻链的型总是相同的 E、人血清中各类Ig所含κ链和λ链的比例约为2:1 2. 免疫球蛋白的结构是由 (D) A、二条相同的重链组成 B、二条多肽链组成 C、以J链连接的一条轻链和一条重链组成 D、二硫键连接的二条相同重链和二条相同轻链组成 E、二硫键连接的一条重链和一条轻连组成 3. 将免疫球蛋白分为两型的根据是 (A) A、轻连恒定区抗原性不同 B、重链恒定区抗原性不同 C、重链可变区抗原性不同 D、轻链可变区抗原性不同 E、超（高）变区抗原性不同 4. 抗体与抗原决定簇互补结合的部位是 (C) A、V H B、C L、C H C、V H、V L中的CDR（HVR） D、V L中的CDR E、Fc段 5. 抗原和抗体特异结合的部位在 (B) A、V H B、V L和V H C、C L和C H D、Fc段 E、C H 6. IgG与FcR结合的功能区是 (D) A、C H2 B、C H1 C、铰链区 D、C H3 E、V H、V L 7. IgG (C) A、在胚胎期即可合成 B、有CH4功能区 C、能通过胎盘 D、B细胞表面抗原识别受体属此类 E、天然血型抗体属此类 8 .铰链区位于 (A)

A、C H1与C H2之间 B、V H与C H1之间 C、C H2与C H3之间 D、C H3与C H4之间 E、V H与C H之间 9. 关于Ig分泌片的特性哪项是错误的? (E) A、以非共价键方式连接两个Ig分子单体 B、由上皮细胞合成和分泌 C、分泌片的功能是保护IgA及介导IgA的转运 D、分泌片与IgA的形成无密切关系 E、主要存在于血清中 10. 人类个体发育过程中，最早合成的免疫球蛋白是 (C) A、IgA B、IgG C、IgM D、IgD E、IgE 11. 免疫球蛋白产生的顺序是 (B) A、IgA-IgG-IgM B、IgM-IgG-IgA C、IgG-IgM-IgA D、IgM-IgA-IgG E、IgA-IgM-IgG 12 .与抗原结合后活化补体能力最强的Ig分子是 (D) A、IgD B、IgG C、IgA D、IgM E、IgE 13. IgG分子中与补体结合的部位存在于 (A) A、C H2 B、C H1 C、C H3 D、C H4 E、V H 14. 能激活补体又能与SPA结合的Ig是 (C) A、IgD B、IgA C、IgG D、IgM E、IgE 15. 合成分泌抗体的细胞是 (A) A、浆细胞

4第四章 免疫球蛋白

第三章免疫球蛋白（immunoglobulin，Ig） 1.免疫球蛋白Ig：具有抗体活性或化学结构与抗体相似的球蛋白统称为免疫球蛋白。分为分泌型免疫球蛋白sIg、膜型免疫球蛋白mIg 2.抗体（antibody，Ab） ①概念：B细胞在抗原的刺激下分化为浆细胞，产生具有与相应抗原发生特异性结合反应的免疫球蛋白，称为抗体。 ②存在部位：血清、其他体液或外分泌液中。将抗体介导的免疫称为体液免疫。将含有抗体的血清称为抗血清或免疫血清。 ③电泳区带：抗体活性大部分在γ区带，故抗体曾有γ球蛋白（或丙种球蛋白）之称。 第一节免疫球蛋白的分子结构 一、免疫球蛋白的基本结构：由二硫键相连的四条对称的多肽链构成的单体。形成一“Y”字形结构。重链、轻链 四肽链结构：所有Ig的基本单位都是四条肽链的对称结构。两条重链（H）和两条轻链（L）。每条重链和轻链分为氨基端和羧基端。 （一）重链与轻链（天然的Ig单体结构中，两条重链同类，两条轻链同型。） 1.重链（heavy chain，H链）450～550个氨基酸残基，分子量约55～75kD。根据Ig重链恒定区的分子结构和抗原特异性的不同，Ig可分为五类：即IgG、IgM、IgA、IgD、IgE，相应H链为γ、μ、α、δ及ε链。 2. 轻链 轻链为重链的1/2，约由214个氨基酸组成。根据轻链的不同，分为κ、λ两型。正常人血清Ig的κ:λ=2 :1 （二）可变区和恒定区 1.可变区（variable region，V区） 近N端的1/2 L链和1/4（或1/5）H链，氨基酸的组成及序列变化较大，而得名。 ⑴超变区（hypervariable region，HVR）：V区内变化最为剧烈的特定部位。L链3个，H链3个。因其在空间结构上可与抗原决定簇形成精密的互补，故又称互补性决定区（complementarity determing region，CDR）。 不同Ig分子在超变区结构上各自具有独特的氨基酸排序和构型特点，也称为Ig分子的独特型或独特型决定簇。 超变区、互补性决定区和独特型决定簇指的是Ig分子中的同一结构部位，只是从不同的角度阐述而已。（IgV区的结构特点、功能、该区的抗原性） ⑵骨架区（framework region，FR） Ig分子V区超变区之外的部位，其氨基酸组成及排列相对保守。 作用：主要是稳定CDR的空间构型，以利Ig的CDR与抗原表位精细的特异性结合。 2.恒定区（constant region，C区） 近C端的1/2 L链及3/4（或4/5）H链。氨基酸组成在同一物种的同一类Ig中相对稳定。 （三）其他结构 1.J链（jioning chain，J链）由浆细胞合成。 主要作用：在H链的羧基端将Ig单体连接成双体或多聚体，起稳定多聚体结构及参与体内运转的作用。 2.分泌片（secretory piece，SP）由粘膜上皮细胞合成，以非共价形式结合IgA二聚体，使其成为分泌型IgA（SIgA）。 作用：保护SIgA抵抗外分泌液中蛋白酶的降解作用,介导SIgA向粘膜上皮外主动转运，发挥粘膜免疫效应。 二、免疫球蛋白的功能区（结构域） 约由110个氨基酸组成。由链内二硫键连接并经β-片层折叠形成的具有特定功能的球形结构域，称为Ig的功能区或结构域。（一）功能区的名称 （二）L链：VL、CL ；H链：VH、CH1、CH2、CH3、CH4（IgM和IgE有） 功能区IgG、IgA、IgD的重链有4个球形结构，分别为VH、CH1、CH2和CH3；IgM和IgE有5个球形结构，即多一个CH4。VH和VL是结合抗原的部位；CH1为遗传标志所在；CH2是补体结合位点；CH3与细胞表面Fc受体结合.。

免疫学检验试题(附答案)

免疫学检验试题（一） 1. 免疫监视功能低下时易发生（）。 A．自身免疫病 B．超敏反应 C．肿瘤 D．免疫缺陷病 E．移植排斥反应 答案C 解析免疫系统的功能之一是对自身偶尔产生的有癌变倾向的细胞进行清除，此即免疫监视功能，免疫监视功能低下时易发生肿瘤。 （ 2. 免疫自稳功能异常可发生（）。 A．病毒持续感染 B．肿瘤 C．超敏反应 D．自身免疫病 E．免疫缺陷病 答案D 解析免疫系统的功能之一是对自身衰老的组织细胞进行清除，此即免疫自稳功能，免疫自稳功能异常可发生自身免疫病。

— 3. 既具有抗原加工提呈作用又具有杀菌作用的细胞是（）。A．树突状细胞 B．巨噬细胞 C．中性粒细胞 D．B细胞 E．T细胞 答案B 解析树突状细胞、巨噬细胞和B细胞都有抗原加工提呈作用，但只有巨噬细胞兼有吞噬杀菌作用。 4. 免疫应答过程不包括（）。 A．T细胞在胸腺内分化成熟 ： B．B细胞对抗原的特异性识别 C．巨噬细胞对抗原的处理和提呈 D．T细胞和B细胞的活化、增殖和分化 E．效应细胞和效应分子的产生和作用 答案A 解析免疫应答过程指免疫系统针对抗原的反应过程，不包括免疫细胞的发育过程。

5. 关于外周免疫器官的叙述，不正确的是（）。 A．包括淋巴结、脾和黏膜相关淋巴组织 B．发生发育的时间晚于中枢免疫器官 — C．是免疫应答发生的场所 D．是免疫细胞发生和成熟的场所 E．是所有淋巴细胞定居的场所 答案D 解析免疫细胞发生和成熟的场所在中枢免疫器官，故D项不正确。 5. 在正常血清中，含量最高的补体成分是（）。 A．C1 B．C3 、 C．C4 D．C5 E．C4Bp 答案B 解析在正常血清中含量最高的补体成分是C3。 7. 细胞因子不包括（）。 A．单核因子

第二十四章免疫诊断

第二十二章免疫学检测技术的基本原理一、单选题 1．下列免疫学测定方法敏感性最高的是： A．沉淀反应 B．凝集反应 C．ELISA D．放射免疫测定 E．补体结合试验 2．反向间接凝集试验是检测标本中哪种成分？ A．抗体 B．补体 C．抗原 D．抗原抗体复合物 E．以上均不是 3．用免疫荧光技术间接法检测组织中的抗原，应将荧光素标记：A．抗原 B．相应抗体 C．抗免疫球蛋白抗体 D．抗原抗体复合物 E．抗C3抗体 4．用ELISA双抗体夹心法检测抗原A时，固相载体的包被物是：A．酶标抗A抗体 B．未标记的抗A抗体 C．酶标抗原A D．未标记的抗球蛋白抗体 E．酶标抗球蛋白抗体 5．用免疫荧光技术直接法检测病原微生物时，荧光素应标记在：A．微生物上 B．抗人Ig抗体上 C．抗原抗体复合物上 D．抗微生物抗体上 E．抗C3抗体上 6．目前使用最广泛的荧光素为： A．FITC B．RB200 C．TRIT-C D．镧系螯合物 E．伊文思蓝 7 有关金标准的概念正确的是： A．只用于评估一种试验的特异性 B．只用于评估一种试验的敏感性 C．假设检测结果100%可靠 D．是除特异性和敏感性外的另一种评估方式 E．只确定阴性结果的可靠性 8. T细胞能形成E花环是因为其细胞膜上具有： A.CD2 B. CD3 C. CD4 D.CD8 E. CD28 9.E花环试验可用于：

A.T细胞功能测定 B. T细胞的分离 C. B细胞功能测定 D. CD4+T细胞计数 E. CD8+T细胞计数 10.用小鼠抗人CD3单克隆抗体，检测T细胞，其结果代表的是： A. T细胞总数 B. T H细胞数 C.T S细胞数 D.CD4+细胞数 E. CD8+细胞数 11.下列哪项指标可以评价AIDS患者的细胞免疫功能？ A．CD2+/CD3+细胞比值 B.CD3+/CD4+细胞比值 C.CD3+/CD8+细胞比值 D.CD4+/CD8+细胞比值 E.CD2+/CD4+细胞比值 12. 外周血E花环阳性细胞总数代表的是： A. CD4+T细胞数 B. CD8+T细胞数 C.B细胞数 D.NK细胞数 E.T细胞总数 13.人T淋巴细胞转化试验最常用的刺激因子是： A.PHA B.ConA C.PMN D.LPS E.特异性抗原 14．溶血空斑试验检测的是哪类细胞的功能？ A.T细胞 B.巨噬细胞 C.NK细胞 D.B细胞 https://www.wendangku.net/doc/d49481301.html,K细胞 15.常用的检测细胞毒效应的方法是： A．31P掺入法 B．125I释放法 C．51Cr释放法 D．形态学检测法 E．移动抑制试验 16.评价病人T细胞功能的试验是： A.血清免疫球蛋白的测定 B.溶血空斑试验 C.淋巴细胞转化试验 D.膜表面免疫球蛋白测定 E.E花环试验 17.检测中性粒细胞吞噬功能的方法是： A.四唑氮蓝还原试验 B. 过氧化物酶测定法 C.溶血空斑试验

第十七章临床常用免疫学检查

第十七章临床常用免疫学检查 一选择题 （一）A型题 1.补体溶血活性增高见于（） A.急性扁桃腺炎 B.链球菌感染后肾小球肾炎 C.系统红斑狼疮 D.自身免疫性溶血性贫血 E.类风湿性关节炎 2.巨球蛋白血症主要为哪一种免疫球蛋白异常增高（） A.IgG B.IgA C.IgM D.IgD E.IgE 3.血中含量最多的补体是（） A.C1 B.C2 C.C3 D.C4 E.C9 4.除原发性肝癌外，下列哪种疾病最易引起AFP 增高（） A.生殖腺胚胎癌 B.肾脏胚胎癌 C.多囊肝 D.慢性肝炎 E.肝硬化 5.免疫应答中出现最早的抗体是（） A.IgG B.IgA C.IgM D.IgD E.IgE 6.抗核抗体阳性可见于（） A.多发性骨髓瘤 B.甲型肝炎 C.系统性红斑狼疮 D.甲状腺肿大 E.急性肾盂肾炎 7.主要用于检测患者血中伤寒沙门菌抗原的试验是（） A.肥达（Widal）反应 B.酶联免疫吸附试验 C.胶乳凝集试验 D.循环免疫复合物（CIC）测定

E.C反应蛋白（CRP）测定 8.抗线粒体抗体测定结果呈强阳性可见于（） A.急性肝炎 B.慢性活动性肝炎 C.原发性胆汁性肝硬化 D.肝外胆管阻塞 E.原发性肝癌 9.抗双股DNA抗体阳性主要用于诊断哪种疾病（） A.系统性红斑狼疮 B.皮肌炎 C.类风湿关节炎 D.慢性肝炎 E.干燥综合症 10.男性，45岁。进行性右上腹痛2个月，食欲减退，巩膜黄染，肝肋下2.0cm，质中等，未触及结节，肝放射性核素检查示有大小不等地斑块状放射性缺损区，边缘不整齐。AFP560/L，HbsAg（+），最可能的诊断是（） A.乙型肝炎 B.阿米巴肝脓肿 C.肝硬化 D.原发性肝癌 E.肝脓肿 11.E玫瑰花环形成试验中E花环增高不见于（） A甲状腺功能亢进 B.甲状腺炎 C.恶性肿瘤 D.重症肌无力 F.慢性活动性肝炎 12.关于癌胚抗原哪种说法不正确（） A.是一种胎儿性蛋白 B.是一种肿瘤标志物 C.其测定有助于肝癌的早期诊断 D.其测定可鉴别原发性与转移性肝癌 E.最初发现于成人结肠癌组织中 13.下列有关甲胎蛋白检查的临床意义，哪项不正确（） A.动态观察有助于诊断早期原发性肝癌 B.对判断肝炎的病情、疗效有价值 C.对重症肝炎的愈后有价值 D.生殖腺胚胎癌时可增高 E.阴性结果可排除原发性肝癌 14.以下有关类风湿因子（RF）的描述，哪一项是错误的（） A.RF为一种抗自身变性IgG的抗体 B.主要用于风湿性疾病的疗效观察 C.SLE可呈阳性 D.少数老年人可呈阳性

第一节抗原抗体反应

免疫学检测 抗原抗体反应(antigen-antibody reaction)是指抗原与相应抗体所发生的特异性结合反应。 抗原抗体反应的特点 （一）特异性抗原抗体的结合本质是抗原决定簇与抗体超变区的结合。抗原决定簇与抗体超变区在一级结构和空间构型上呈互补关系，所以它们的结合具有高度特异性。抗原抗体结合力的大小，常用亲和力（affinity）或亲合力（avidity）来表示，前者指抗体分子上一个抗原结合部位与相应的抗原决定基之间的结合强度，后者指一个抗体分子与整个抗原之间的结合强度。抗原与抗体的结合为非共价的可逆结合，它们空间构象的互补程度不同，结合力强弱也不同，互补程度越高，亲和力越高。 （二）可逆性抗原抗体结合反应不是化学反应，而是非共价键的结合。4种分子间引力参与了抗原抗体间的结合，分别是静电引力、范德华力、氢键结合力和疏水作用。抗体和抗原之间的亲和力源自抗体超变区和抗原决定簇在空间构型上的互补性。抗原和抗体分子均是极性分子，反应温度、酸碱度和离子浓度对它们的极性有重要影响，从而影响着两者的空间构型和亲和力。抗原抗体结合反应是可逆反应。正向反应产物是抗原抗体复合物，复合物解离则是逆向反应。（三）抗原和抗体的浓度及合适比例 抗原和抗体的浓度及合适比例是可见现象能否出现的关键。当比例不合适时，少量的小分子抗原抗体复合物停留在反应的第一阶段，不能进一步交联和聚集，故不出现肉眼可见的现象。一般用电解质溶液来调整抗原和抗体的浓度，使两者的比例合适。 （四）抗原抗体反应的阶段性 抗原抗体反应的过程可分为两个阶段。第一阶段是抗原抗体发生特异性结合，此阶段的抗原抗体复合物量很少，分子小，肉眼看不见。当抗原抗体比例合适并且具备一定的环境因素(如电解质、pH、温度、补体)时，抗原抗体复合物进一步交联和聚集，反应也进入第二阶段，即可见反应阶段。第二阶段的抗原抗体复合物可以出现凝集、沉淀等肉眼可见的现象，还可激活补体，引发溶菌、溶血