时间分辨荧光技术

时间分辨荧光技术

时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是一种非同位素免疫分析技术，它用镧系元素标记抗原或抗体，根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。

（一）TRFIA分析原理

在生物流体和血清中的许多复合物和蛋白本身就可以发荧光，因此使用传统的发色团进而进行荧光检测的灵敏度就会严重下降。大部分背景荧光信号是短时存在的，因此将长衰减寿命的标记物与时间分辨荧光技术相结合，就可以使瞬时荧光干扰减到最小化。

时间分辨荧光分析法（TRFIA）实际上是在荧光分析（FIA）的基础上发展起来的，它是一种特殊的荧光分析。荧光分析利用了荧光的波长与其激发波长的巨大差异克服了普通紫外-可见分光分析法中杂色光的影响，同时，荧光分析与普通分光不同，光电接受器与激发光不在同一直线上，激发光不能直接到达光电接受器，从而大幅度地提高了光学分析的灵敏度。但是，当进行超微量分析的时候，激发光的杂散光的影响就显得严重了。因此，解决激发光的杂散光的影响成了提高灵敏度的瓶颈。

解决杂散光影响的最好方法当然是测量时没有激发光的存在。但普通的荧光标志物荧光寿命非常短，激发光消失，荧光也消失。不过有非常少的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）的荧光寿命较长，可达1～2ms，能够满足测量要求，因此而产生了时间分辨荧光分析法，即使用长效荧光标记物，在关闭激发光后再测定荧光强度的分析方法医学教|育网搜集整理。

平时常用的稀土金属主要是Eu（铕）和Tb（铽），Eu荧光寿命1ms，在水中不稳定，但加入增强剂后可以克服；Tb荧光寿命1.6ms，水中稳定，但其荧光波长短、散射严重、能量大易使组分分解，因此从测量方法学上看Tb很好，但不适合用于生物分析，故Eu最为常用。

（二）时间分辨信号原理

普通物质荧光光谱分为激发光谱和发射光谱，在选择荧光物质作为标记物时，必须考虑激发光谱和发射光谱之间的波长差，即Stakes位移的大小。如果Stakes位移小，激发光谱和发射光谱常有重叠，相互干扰，影响检测结果的准确性。镧系元素的荧光光谱有较大的Stakes位移，最大可达290nm，激发光谱和发射光谱间不会相互重叠，加上其发射的光谱信号峰很窄，荧光寿命长，铕的荧光寿命可达730us，检测中只要在每个激发光脉冲过后采用延缓测量时间的方式，待短寿命的背景荧光衰变消失后，再打开取样门仪器记录长寿命铕鳌合物发射的特异性荧光，可以避免本底荧光干扰，提高检测的精密度。

TRFIA的测量仪器是时间分辨荧光计，由三大部分组成：光源：脉冲光源：氙灯（每秒闪烁1000次）；小型N2激光器；输出脉冲波长：337nm荧光信号获取系统；数据处理系统医学教|育网搜集整理。

（三）解离增强原理

解离增强镧系元素荧光免疫分析（DELFIA）是时间分辨荧光免疫分析中的一种。它用具有双功能基团结构的螯合剂，使其一端与铕（Eu）连接，另一端与抗体／抗原分子上的自由氨基连接，形成EU标记的抗体／抗原，经过免疫反应之后生成免疫复合物。由于这种复合物在水中的荧光强度非常弱，因此加入一种增强剂，使Eu3+从复合物上解离下来，自由Eu3+同增强剂中的另一种螫合剂螯合形成一种胶态分子团，这种分子团在紫外光的激发下能发出很强的荧光，信号增强了百万倍。因为这种分析方法使用了解离增强步骤，因此称为解离增强镧系元素荧光免疫分析。这是目前在时间分辨荧光免疫分析中应用最多的一种分析系统。

（四）TR-FIA应用

1.激素：甲状腺激素、甾体类激素。

2.病毒性肝炎标志物。

3.肿瘤相关抗原医学教|育网搜集整理。

4.药物。

5.多肽类。

（五）TRFIA技术为临床检测带来的先进性：

时间分辨技术的原理

时间分辨技术的原理目前最先进的免疫检测技术： 1、时间分辨原理： 用三价稀土离子及其鳌合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标记蛋白质、多胎、激素、抗体、核酸探针或生物流行性细胞，当反应体系发生后，用时间分辨仪器测定最后产物中荧光强度。根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析之目的。 2、时间分辨原子标记物的特点： ●发射光和激发光有较大的STOKES位移——高特异性 ●长寿命荧光，降低其他物质的荧光干扰——高灵敏度 ●半衰期长达几十万年，试剂受干扰小——高稳定性 原子标记与大分子标记物的对比 3、波长分辨： ●标记离子的荧光激发光波长范围较宽，发射光光谱范围较窄，是类线光谱， 有利于降低本底荧光强度，提高分辨率。 ●激发与发射光之间有一个较大的STOKES位移，有利于排除非特异荧光的 干扰，增强测量的特异性。

4、时间分辨： ●标记离子螯合物产生的荧光强度高，寿命长，有利于消除样品及环境中荧 光物质对检测结果的影响。 ●每一秒名检测样品1000次，取其中不受干扰的400次的均值作为测定值， 有利于提高检测的准确性。 时间分辨技术取代酶免、放免是免疫检测技术发展的必然趋势！ RIA（放免） ●放射性（125I），对环境和身体的危害，已经为重视环保的国家逐步取消， 如整个欧洲仅尚存几个放免试验室。 ●125I半衰期短，导致试剂的有效期短，需每次定标，造成很大的浪费。 ●由于标记物（125I）的不断变化，带来药盒批间、批内较大的变异，标准 曲线无法保存备用。 ELESA（酶免） ●灵敏度、重复性不及放免，易造成漏检和假阳性。 ●酶的纯度和反应过程容易受环境因素影响，导致稳定性、重复性不好。 与其它技术的相对优势： （1）、是现有的免疫检测方法中灵敏度最高的 （2）、是现有的免疫检测方法中稳定性最好的 （3）、多标记检测是目前所有免疫检测技术中独一无二的 TRF技术与电化学发光的比较

时间分辨荧光免疫分析仪特点及性能

时间分辨荧光免疫分析仪特点及性能 时间分辨荧光免疫分析仪采用现代光学、机械、计算机等先进技术，通过标记离子螯合物产生的特异性荧光寿命长、强度高，消除本底干扰荧光；利用激发光波谱宽、荧光发射波谱窄，增强荧光强度，提高分辨率的原理，对临床免疫血样进行定量分析，为临床血样提供灵敏、准确、可靠的数据。 概述 时间分辨荧光免疫法所用的标记物是镧系元素螯合物，利用这类荧光物质荧光寿命长等特点，通过波长和时间两种分辨技术，有效排除了非特异本底荧光的干扰。 特点 1、灵敏度高； 2、标记物制备简单； 3、稳定性好； 4、标准曲线线性范围宽； 5、操作方便。 技术性能 电源：210～240V，50～60Hz；外型尺寸：550mm×600mm×270mm；重量：25 kg；灵敏度：10-13 mol/L；线性度：10-12～10-8 mol/L；快速测试：1秒/样；高稳定性：< ±1 %；工作制：连续运行；安全分类：I类；防电击程度：B型；熔断器：Φ5×20 5A。 应用领域 主要用于对人的血液和其它体液中的各种免疫检测项目进行定量分析，它可以适用与传染病检查、内分泌科检查、细胞学检查、肿瘤科检查等。随着检验医学的发展，对微量、超微量的测定会越来越多，同时RIA的污染问题会越来越被重视，因此，时间分辨荧光分析法具有越来越大的应用空间。 产品特性产品参数 产品特点： 1) 采用进口光源、光学镜片及光电倍增管，保证检测结果的稳定性及可靠性； 2) 测试速度快，1秒／样本； 3) 标本灵活，适合任意份标本量； 4) 全中文软件，操作界面简便； 5) 是国内首家研发出成功，填补国内空白，并获得国家科技进步二等奖。 技术参数： 1) 测定原理：时间分辨 2) 激发光源：进口氙灯 3) 灵敏度: 10 -17 mol／孔（Eu 3+） 4) 线性范围：10 -13 mol／孔～10 -17 mol／孔 5) 高稳定性：＜5 % 6) 电源：AC 198～242V 50～60Hz 7) 外型尺寸：710mm×520mm×320mm

化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点

化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点 概念 化学发光免疫分析(chemiluminescenceimmunoassay,CLIA),是将具有高灵敏度的化学发光测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、半抗原、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、荧光免疫分析和时间分辨荧光免疫分析之后发展起来的一项最新免疫测定技术。 时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是以镧系元素标记抗原或抗体，并与时间分辨测定技术结合而建立起来的一种新型非放射性微量免疫分析技术，它根据镧系元素螯合物的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。 原理 化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和化学发光分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个激发态的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的基态时, 同时发射出光子(hM) , 利用发光信号测量仪器测 量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。鲁米诺(1umino1)、异鲁米诺(isolumino1)及其衍生物、吖啶酯(acIidinim ester)衍生物、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkaline phosphatase，ALP)是目前CLIA中使用最多的四类标记物。 时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）基本原理 用三价稀土离子及其鳌合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标 记蛋白质、激素、抗原、抗体、核酸探针等物质，当免疫反应体系发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点，用时间分辨荧光分析仪测定免疫反应最后产物中荧光强度。根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析之目的。 应用 化学发光免疫分析技术（CLIA） 各种激素、病毒抗原抗体、肿瘤标志物、感染性疾病、心脏标志物、治疗药物检测等各种抗原、抗体和半抗原 时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）应用广泛 1.多肽类：蛋白质、激素（甲状腺激素、甾体类激素）。 2.病原体抗原/抗体 3.病毒性肝炎标志物 4.肿瘤相关抗原 5.药物 6.核酸 优缺点

HTRF技术原理和应用介绍

Cisbio-HTRF?技术原理和应用简介 HTRF?（均相时间分辨荧光，Homogeneous Time-Resolved Fluorescence ）是一种用来检测纯液相体系中待测物的技术。该技术基于荧光共振能量转移（FRET，Fluorescence Resonance Energy Transfer）和时间分辨荧光（TRF, Time-Resolved Fluorescence)）两大技术，开通的一款高通量药物筛选利器。 荧光共振能量转移（FRET） 利用两种荧光基团的能量转移，这两种荧光基团分别称为能量供体（Donor）和能量受体（Acceptor）。Donor被外来光源激发（例如氙灯或激光），如果它与Acceptor比较接近，可以将能量共振转移到在Acceptor上，使其受到激发，发出特定波长的发射光。 将Donor和Acceptor分别与相互作用的两个生物分子结合，生物分子的结合可以将Donor和Acceptor拉到足够近的距离，产生能量转移，由于Acceptor的发射光来自能量转移，所以实验中不需要将未结合与已结合的分子分开，即不需要洗涤步骤。 时间分辨荧光（TRF） TRF利用稀土元素中镧系元素的独特性质，它们与普通荧光的主要区别是荧光的持续时间不同。普通荧光的半衰期为纳秒级。镧系元素的半衰期为毫秒级，有6个数量级的差别。所以，在检测室，TRF有一个时间延迟---50us，经过这个时间延迟，普通荧光的信号几乎为零，所以，TRF 的背景非常低，反映样品实际情况。 HTRF?的能量受体（技术创新点） HTRF?的能量供体是铕(Eu)和钛(Tb)的穴状化合物。在这个穴状化合物里，Eu和Tb被永久地嵌合在一个笼子里，结构非常稳定，这个结构由教授发明的，并由此在1987年获得了诺贝尔奖。 HTRF?的能量受体 HTRF?的能量受体也有二种，XL665和d2.它们的光学性质相同，分子量不同，前者分子量为10KD，实际上就是别藻蓝蛋白（APC）。我们将APC的亚基偶联在一起，使其不能解离，提高了稳定性，后者分子量为1KD，在某些实验中有独特的优势。 HTRF?的操作步骤 HTRF?操作步骤非常简单，只需要将实验所需试剂加进去，然后孵育，检测即可。

天然药物活性筛选考卷

2012级硕士研究生期末考题 (1)请列举5种转基因动物可用于老年痴呆药物研究，并简要说明它们的特征和应用范围（5分） i APP转基因小鼠： 病理特征：APP水平是正常鼠的6倍，Ab增高10-14倍，出现淀粉样血管病变，脂质氧化损伤，超氧化物歧化酶增加。行为学特征：9-10月龄小数空间辨识能力受损。 应用范围：APP 转基因鼠可用于抗老年痴呆中药的药效评价、活性筛选以及作用机制的研究。 ii APOE小鼠 特征：该模型的转基因小鼠动脉壁损伤严重,内皮细胞出现受损、变质、脱落,细胞内连接不紧密。内皮下间隙增宽,内弹力膜破坏和消失；中膜平滑肌结构破坏,合成型平滑肌较多。 应用范围：可用于模拟小鼠老化过程中动脉粥样硬化进程，以及药物等因素对动脉粥样硬化进程的影响。 iii 神经组织特异表达CTF1转基因小鼠 特征：转入的CTF1基因在脑组织的表达水平均高于同龄对照小鼠，CTF1转基因小鼠大小脑组织基本结构形态与正常小鼠对照没有异常。 应用范围：用于研究CTF1生物学功能与老年痴呆等疾病发病机制的关系。 iv 快速老化SAM-P小鼠 特征：老化迅速，且其海马甲醛含量随老龄化进程而增加。 应用范围：研究内源性甲醛异常蓄积与记忆衰退关系，研究大鼠老化机制等。 PS1-GFP小鼠 特征：高表达早老蛋白PS1 应用范围：研究早老蛋白的结构和功能，了解其导致老年化的机制。 (2)请比较细胞活性检测的几种方法的异同，包括MTT法、Hoechst 染色法、细胞排染实验、细胞克隆形成实验，包括实验目的、原理、方法、优缺点等（10分） ①MTT法 实验目的：在肿瘤增值实验中，根据活细胞功能强弱，推测出活细胞相对数目

时间分辨荧光分析技术

1.1 时间分辨荧光分析技术 时间分辨荧光生化分析技术是基于稀土荧光配合物特殊的荧光性质而建立起来的，自1978年提出以来[1]，已广泛的应用于免疫分析、核酸测定、荧光显微镜成像、细胞识别、单细胞原位测定、生物芯片等生化领域，并发展出了相应的时间分辨荧光免疫测定法、时间分辨荧光DNA 杂交测定法、时间分辨荧光显微镜成像测定法、时间分辨荧光细胞活性测定法及时间分辨荧光生物芯片测定法等分支。 本节主要对稀土荧光配合物的发光机理、荧光性质，时间分辨荧光测定的原理，时间分辨荧光免疫分析技术，时间分辨荧光显微镜成像技术的研究进展等加以介绍。 1.1.1 稀土荧光配合物的发光机理及荧光性质 稀土元素指的是元素周期表中IIIB 族的镧系元素以及钪和钇，共17种元素。其中镧系元素的外层电子结构为4f 0-145d 0-106s 1-2，由于5s 和5p 电子对4f 电子的屏蔽作用，导致这些金属及其离子的性质十分相似。图1.1给出了四种三价稀土离子的基态及激发态电子能级图[2]。 1020 152530355 E N E R G Y ,103c m -1 6 H 5/2 G 5/2 6 H 15/2 7 F 0 F 2D 0 5D 1 7F 6 F 5 4 5D 3 13/2 4 9/2 Sm 3+ Eu 3+ Tb 3+ Dy 3+ H 9/2 图1.1 部分三价稀土离子的电子能级图 Fig. 1.1 Electronic energy levels of certain lanthanide(III) ions 大部分稀土离子本身是不具有荧光性质的，只有Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+的水溶液在紫外光或可见光的激发下能够发出微弱的荧光。当Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+与某些有机配位体形成配合物时其荧光强度会显著增强，这种发光是基于配合物内由配位体到中心稀土离子的能量转移所产生的[3-8]。以铕(III)配合物为

时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay)操作

时间分辨荧光免疫分析法(Time-resolved fluoroimmunoassay)是在荧光分析的基础上发展起来的一种特殊的荧光分析。它利用具有长效荧光的稀土金属（Eu、Tb、Sm、Dy）作标记物，充分利用激发光与发射光之间的降移与发射光较长的半寿期，在激发光后延时测量发射光的强度。从而所测的荧光不受激发光和被检物中的非特异荧光干扰，提高了检测的特异性与灵敏度。在激发光后延时400微秒，测量400微秒，间歇200微秒后进入下一个测量周期，每一个周期为1000微秒。对每一个样品实施1秒钟的测量，意味着完成了1000个周期的测量，测量精确度极高。 （一）Auto DELFIA自动时间分辨荧光免疫分析仪开/关程序 1 开机 1.1 依次打开样品处理器电源，微孔板处理器电源，打印机电源。 1.2 打开计算机显示器。 1.3 启动计算机。 1.4 运行系统软件：Auto DELFIA与Multicalc系统软件在Windows启动后自动运行。Auto DELFIA workstation软件用于控制Auto DELFIA的运行，MultiCalc的主要功能是与主机通讯，对测试结果进行评估和对质控及其他数据处理（可通过双击屏幕上图标不运行）。在MultiCalc Auto DELFIA环境下，只有键盘有效，鼠标无效。 2 开机后准备 1.1 清洗液准备 1.1.1 微孔板处理器洗液（250ml浓缩液＋600ml去离子水混合），每做一块板至少1升用量，洗液在密闭条件可保存2周时间。 1.1.2 准备样品处理器洗液（50ml浓缩液＋5000ml去离子水混合），每做一块板至少需要800ml洗液，洗液在密闭条件下可保存1周时间。 1.2 样品处理器准备 1.2.1 在Wash bottle（清洗液瓶）、Rinse bottle (冲洗液瓶)分别注入足够用量的清洗液和去离子水，倒空废液瓶。拧紧各瓶盖，确保废液瓶管路向下。 1.2.2 如样品需要稀释，放入稀释杯和稀释液。系统安装时已调好有71ml和190ml两种规格的稀释杯，若使用71ml的稀释杯，从最右端开始放置，如有预处理样品，则不能使用190ml 的稀释杯。不能使用多个稀释杯。 1.3 微孔板处理器准备。

一种均相时间分辨荧光免疫分析中间体、螯合剂及制备方法

59潘晓春：微波消解–石墨炉原子吸收光谱法测定空气中碲 滤膜样品进行前处理，再以5 g／L氯化钯溶液为基体改进剂，石墨炉原子吸收光谱法测定空气中碲的含量。该方法操作简便、快速，测定结果准确、可靠，精密度好且检出限低，能满足环境空气和工业废气中碲的测定。 参考文献 ［1］　徐伯洪.工作场所有害物质监测方法［M］.北京：中国人民公安大学出版社，2003: 129–130. ［2］　王建滨，耿勇超.石墨炉原子吸收光谱法测定工业废气中的锡［J］.环境科技，2007，20(2): 74–75. ［3］　杨丽君，贾树松，郭维静.空气中碲的微波消解–氢化物发生原子荧光测定法［J］.环境与健康杂志，2008，25(2): 121–125.［4］　张遴，丁润明，陈欣，等.石墨炉原子吸收光谱法测定玻璃器皿浸出的锑量［J］.理化检验：化学分册，2009，45(1): 11–13. ［5］　张峰.微波消解石墨炉原子吸收法测定工业废气中铍及其化合物［J］.干旱环境监测，2014，28(1): 1–3. ［6］　国家环保总局.空气和废气监测分析方法指南［M］.4版.北京：中国环境科学出版社，2004: 421–426. ［7］　郑玉玲，于建军.工作场所空气中总粉尘浓度测定结果不确定度 分析［J］.职业与健康，2010(6): 143–146. ［8］　邹晓春，吴礼康，陈小燕，等.工作场所空气中碲及其化合物石墨炉原子吸收光谱法研究［J］.中国职业医学，2003，30(5): 11–12.［9］　王瑞.微波消解–石墨炉原子吸收光谱法测定环境空气中的镉［J］.环境与发展，2014(Z1): 116–118. ［10］　顾文奎，徐国和，赵凤仙，等.工作场所空气中锰的微波消解–石墨炉原子吸收测定法［J］.环境与健康杂志，2013，30(7): 27–33. ［11］　赵彦龙，梁永津，刘胜玉，等.石墨炉原子吸收法测定高盐样品中铅基体改进剂的研究［J］.广州环境科学，2013，28(1): 67–71. ［12］　韦必帽，黄坚锋.两种基体改进剂在石墨炉原子吸收光谱法测定土壤重金属镉中的研究［J］.绿色科技，2017(2): 26–27.［13］　中国环境监测总站.环境水质监测质量保证手册［M］ . 2版.北京：化学工业出版社. 2010: 87–88. ［14］　易馨.低品位碲矿生物浸出液中碲的形态分析及氧化性碲的生物还原研究［D］.成都：成都理工大学，2016 ［15］　刘桂芳，邢大荣.浅谈工作场所空气中有毒物质测定标准检验方法中存在的问题［J］.中国卫生检验杂志，2014，24(1): 48–49. 一种均相时间分辨荧光免疫分析中间体、 螯合剂及制备方法 申请公布号：CN107266472A　申请公布日：2017.10.20 申请人：叶水盛 摘要　本发明提供了一种均相时间分辨荧光免疫分析中间体、螯合剂及制备方法，属于荧光免疫分析、有机合成技术领域。该结构利用含氮杂冠醚具有良好的水溶性，且能与联吡啶经过取代反应形成穴状化合物，所述的穴状结构的化合物既能吸收激发光并传递能量给Eu3+，又能对Eu3+有较强的螯合作用；既可增加螯合剂的稳定性和抗干扰性，又可提高螯合剂的水溶性；本发明还提供了一种时间分辨荧光免疫分析螯合剂及其制备方法，螯合剂的激发光谱波长范围较宽为200~380 nm，最大的激发光波长为363 nm，有效地扩展了其激发范围，并且获得了在不同溶剂中的荧光光谱和荧光寿命。 基于结晶紫酰肼的亚硝酸盐含量测定 申请公布号：CN107266351A　申请公布日：2017.10.20 申请人：成都理工大学 摘要　本发明涉及一种分段式吸附磁珠方法、存储设备及核酸提取仪器，特征部分在于：根据试剂量设置至少两个停顿点；控制磁珠吸附装置动作，使磁珠吸附装置上的磁棒套在每个所述停顿点停顿，进行磁珠吸附；设置停顿点，磁棒套在每个停顿点做适当停顿，为分段吸磁方式，确保磁珠的充分吸收，有利于提高核酸的提取效率。本发明具有的有益效果：在支撑架上设置收纳用的容纳腔，使用方便，且简洁。同时，支撑架采用钢制材料，钢材具有很好的延展性和可塑性，制造方便，可根据消费者需求由钢材弯曲而形成的几个半封闭容纳腔，用以收纳杂志或者书籍等物品。 高密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法 申请公布号：CN107267594A　申请公布日：2017.10.20 申请人：协和梅迪克斯株式会社 摘要　本发明涉及高密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法。本发明提供能够简便且准确地进行测定的高密度脂蛋白(HDL)中的胆固醇的测定方法。一种样本中的高密度脂蛋白中的胆固醇的测定方法，其特征在于，使样本与(1)胆固醇酯水解酶和胆固醇氧化酶、或(2)胆固醇酯水解酶、氧化型辅酶和胆固醇脱氢酶在含有选自由特定结构的吡啶鎓盐和特定结构的季铵盐组成的组中的至少一种物质以及聚阴离子的水性介质中反应而生成过氧化氢或还原型辅酶，测定生成的过氧化氢或还原型辅酶。 一种无规型高分子表面活性剂制备方法 申请公布号：CN107151286A　申请公布日：2017.09.12 申请人：江苏有容催化技术研究所有限公司 摘要　本发明公开了一种无规型高分子表面活性剂的制备方法,以丙烯酰胺亲油性乙希基阴离子単体为共聚単体,通过自由基溶液共聚合制得阴高子丙烯酸酯类高分子表面活性剂。本制备方法得到的高分子表面活性剂不仅可作乳液聚合的乳化剂,还可用来乳化松香、石油树酯等。本发明可通过调节单体种类、各单体用量及多种单体的配比,制备具有不同表面活性的系类阴离子丙烯酸酯类高分子表面活性剂。本方法具有单体选择和组成范围变化广、制备过程简单等特点,其在实际工业中易于应用和推广。

化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点

化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点 Newly compiled on November 23, 2020

化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点 概念 化学发光免疫分析(chemiluminescence immunoassay,),是将具有高灵敏度的测定技术与高特异性的免疫反应相结合，用于各种抗原、、抗体、激素、酶、脂肪酸、维生素和药物等的检测分析技术。是继放免分析、酶免分析、和之后发展起来的一项最新免疫测定技术。 时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）是以标记抗原或抗体，并与时间分辨测定技术结合而建立起来的一种新型非放射性微量免疫分析技术，它根据镧系元素的发光特点，用时间分辨技术测量荧光，同时检测波长和时间两个参数进行信号分辨，可有效地排除非特异荧光的干扰，极大地提高了分析灵敏度。 原理 化学发光免疫分析包含两个部分, 即免疫反应系统和分析系统。化学发光分析系统是利用化学发光物质经催化剂的催化和氧化剂的氧化, 形成一个的中间体, 当这种激发态中间体回到稳定的时, 同时发射出光子(hM) , 利用发光信号测量仪器测量光量子产额。免疫反应系统是将发光物质(在反应剂激发下生成激发态中间体) 直接标记在抗原(化学发光免疫分析) 或抗体(免疫化学发光分析) 上, 或酶作用于发光底物。鲁米诺 (1umino1)、异鲁米诺(isolumino1)及其衍生物、吖啶酯(acIidinimester)衍生物、辣根过氧化物酶(horseradishperoxidase，HRP)和碱性磷酸酶(alkalinephosphatase，ALP)是目前CLIA中使用最多的四类标记物。 时间分辨荧光免疫测定（TRFIA）基本原理 用三价稀土离子及其鳌合剂作为示踪物，代替荧光物质、同位素或酶，标 记蛋白质、激素、抗原、抗体、核酸探针等物质，当免疫反应体系发生后，根据稀土离子螯合物的荧光光谱的特点，用时间分辨荧光分析仪测定免疫反应最后产物中荧光强度。根据荧光强度或相对荧光强度比值，来判断反应体系中分析物的浓度，达到定量分析之目的。 应用 （CLIA）

均相时间分辨荧光

Bagnols-sur-Cèze法国-2009年11月5日-Cisbio Bioassays (https://www.wendangku.net/doc/d811868539.html,)公司是IBA旗下的子公司，也是药物研究和药物筛选领域HTRF (均相时间分辨荧光)技术的发明者。今天Cisbio公司宣布，其在中国和韩国已建立了自己的销售团队，以便进一步开发亚洲市场。本土销售团队将能让Cisbio为这两个迅速增长的生物制药市场的客户提供GPCR和激酶研究的HTRF平台、生物标志物检测以及其他相关的服务。 Cisbio Bioassays公司所销售的基于HTRF技术的产品包括：IP1, cAMP, Cellul’erk 以及Tag-lite?细胞表面受体平台。这些业务将会通过IBA集团旗下的IBA中国分公司(https://www.wendangku.net/doc/d811868539.html,)来操作。为了在亚洲市场拓展应用于癌症诊断和治疗方面的放射药物产品、仪器和方法, IBA集团于2007年建立了IBA中国公司。韩国的销售业务则由位于首尔的代理商JCBio公司(www.jcbio.co.kr)负责。JCBio公司专注于为制药和生物技术实验室提供相关商品。 “在过去的10年里，我们一直致力于在欧洲、北美和亚洲建立本土化的团队，针对特定市场并拓展我们在当地的业务。” Cisbio Bioassays 市场部主管Fran?ois Degorce说道，“我们的目标是成为一个客户至上的服务性公司，并让业务遍及全球。我们在中国和韩国的团队将帮助我们促进与该两个重要市场的客户的关系。” 作为2009年度 Frost & Sullivan北美技术创新奖项的获得者，Cisbio Bioassays凭借着其专利技术HTRF领先于均相荧光方法领域。HTRF是一种很灵敏且稳定的技术，主要应用于药物研发的高通量筛选阶段。除了基于HTRF的一些产品外，Cisbio还能提供一系列的定制服务，其包括：为客户特定的实验蛋白，抗体或化合物等进行标记，为客户设计和研发实验方法，以及为客户提供HTRF 技术培训。Cisbio Bioassays总部在法国，同时在Bedford, Massachusetts(美国)也有基地；在日本和印度则通过独家代理来销售商品。 HTRF 技术介绍 HTRF(均相时间分辨荧光)是用来检测均相体系中待测物的一种最常用的方法，是用来研究药物靶标的理想的平台。这种技术结合了荧光共振能量转移(FRET) 和时间分辨技术(TR)。在TR-FRET 实验中，当供体和受体相离很近时，在供体和受体之间会有荧光共振能量转移而产生信号。采用双波长检测能够显著减小缓冲液和培养基的干扰，最终的信号跟产物形成的量成比例。 HTRF技术被广泛应用于基于细胞实验和生化实验的药物研发的不同阶段，从实验开发，lead 到hit，高通量筛选（HTS），到临床前研究。这是一种很灵敏且稳定的技术，可以使用384和1536孔板。自从10年前HTRF技术进入药物研发领域以来，研究者采用该技术加快了很多基于抗体的研究，包括GPCR（配体结合，受体二聚化，cAMP 和IP-1 的检测，以及磷酸化ERK的定量）, 激酶，细胞因子和生物标志物，生物过程（抗体和蛋白生产），以及蛋白和蛋白，蛋白和多肽，蛋白和DNA/RNA相互作用的实验。HTRF技术也可以取代大部分ELISA，因为HTRF具有同等的检测 https://www.wendangku.net/doc/d811868539.html,第 17 页，共 26 页下一页 返回

化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点

化学发光免疫技术与时间分辨技术的异同点概念 优缺点

优点 化学发光免疫分析法（CLIA） ?单个样本检测速度快，适合做急诊； ?灵敏度较高； ?自动化程度高； 时间分辨荧光免疫技术（TRFIA） ?发射光和激发光有较大的STOKES位移——高特异性 ?长寿命荧光，降低其他物质的荧光干扰——高灵敏度 ?半衰期长达几十万年，试剂受干扰小——高稳定性 ?荧光寿命长，易于自动化 ?重复性好 ?标准曲线范围宽 ?结果可靠 与其它技术的相对优势： （1）、是现有的免疫检测方法中灵敏度最高的 （2）、是现有的免疫检测方法中稳定性最好的 （3）、多标记检测是目前所有免疫检测技术中独一无二的缺点 化学发光免疫分析法（CLIA） ?发光过程短 ?本底较高 ?仪器故障率较高 ?试剂稳定性差 ?检测精度不高 试剂价格高 时间分辨荧光免疫测定（TRFIA） ?测量方式复杂 ?仪器成本及维护费用高 ?环境及样品中同元素可导致本底干扰等 类型原理及试剂发光类型 化学发光免疫分析（CLIA）用化学发光物质直接标 记抗原或抗体组成 吖啶酯 （acrydinum esters） 时间分辨免疫荧光分析（TRFIA）* 是用三价稀土离子及其 螯合剂作为示踪物 铕（ Eu3+ ）、铽（ Te3+ ） 及钐（ Sm3+ ）、镝 （ De3+ ） 化学发光与时间分辨荧光方法学比较 化学发光时间分辨荧光发光效率1% 95%

重复检测不可重复可无数次重复 本底噪声干扰大零本底 灵敏级数10 -15 10 -18 标记物大分子化合物原子 标记位点1个/抗体可达20个/抗体 标准曲线稳定2~4周稳定达一年以上 多标记无有，最多可达四个标记科研开发无有 化学发光免疫技术原理图 时间分辨免疫技术原理图

时间分辨荧光免疫分析的原理

一、前言 近百年来，“特效试剂”一直是分析化学家追求的目标。所谓“特效试剂”，就是指的是只与一种待测物质反应的试剂。事实上，目前使用的所谓的“铜试剂”、“铁试剂”、“硝酸试剂”等等，都是“盛名之下，其实难副”的。20世纪40-50年代追求合成特效试剂的狂热，早已降温。正在分析化学家心灰意冷之际，人们从免疫学与生物化学的成就看到了这一理想的曙光：免疫系统简直就是天然存在的一部特异性试剂的合成机器。抗原与抗体之间的免疫反应具有高度的特异性，这种识别的专一性超过酶对底物的识别水平，抗原-抗体复合物的稳定常数一般为109，有些高达1010-1015，具有很高的稳定性。免疫反应的特点使得免疫分析已成为一个跨学科的新型分析技术，广泛应用于临床体液分析、药物分析、环境分析、食品分析和生物化学研究，尤其在毒品的鉴定、吸毒人员的认定和疾病的诊断方面，发挥了重要作用。 时间分辨荧光免疫分析技术（TRFIA）是自80年代以来新发展起来的一种新型分析技术，与其它免疫分析技术相比，有其独特的优点。它克服了放射性免疫分析法（RIA）中放射性同位素带来的污染问题；克服了酶免疫分析法（EIA）中酶不稳定的缺点；而且，由于TRFIA法能够很好的消除背景荧光的干扰，使其灵敏度比普通荧光法（FIA）高出几个数量级。正是由于TRFIA的独特优点，使得它成为免疫分析中最有发展潜力的一种分析方法。 二、时间分辨荧光免疫分析的原理 时间分辨荧光免疫分析的原理就是使用三价稀土离子（如Eu3+、Tb3+、Sm3+、Dy3+）作为示踪物，通过这些稀土离子与具有双功能结构的螯合剂以及抗原形成稀土离子-螯合剂-抗原螯合物。当标记抗原、待测抗原共同竞争抗体，形成免疫复合物，由于免疫复合物中抗原抗体结合部分就含有稀土离子，当采取一些办法将结合部分与游离部分分开后，利用时间分辨荧光分析仪，即可测定复合物中的稀土离子发射的荧光强度，从而确定待测抗原的量。 正常情况下，免疫复合物中的稀土离子自身荧光信号很微弱，若加入一种酸性增强液，稀土离子从免疫复合物中解离出来，和增强液中的β-二酮体、三正辛基氧化膦、Triton X-100等成分形成一种微囊。后者被激发光激发后，则稀土离子可以发出长寿命的极强的荧光信号，使原来微弱的荧光信号增强将近100万倍。 采用时间分辨技术测量荧光，采用了门控技术，它是使背景荧光信号降低到零以后，再测定长寿命标记物的荧光。 三、时间分辨荧光分析的测量方法 （1）解离增强测量法 解离增强测量法是解离增强稀土离子荧光方法，简称DELFIA法。通过双功能基团把Eu3+或Sm3+螯合到抗原、抗体或SA上，免疫反应后，部分标记物结合到固相载体上，未结合的标记物被洗掉。最后用低pH值的增强液，把Eu3+或Sm3+

HTRF技术原理和应用介绍

Cisbio-HTRF?技术原理与应用简介 HTRF?(均相时间分辨荧光,Homogeneous Time-Resolved Fluorescence )就是一种用来检测纯液相体系中待测物的技术。该技术基于荧光共振能量转移(FRET,Fluorescence Resonance Energy Transfer)与时间分辨荧光(TRF, Time-Resolved Fluorescence))两大技术,开通的一款高通量药物筛选利器。 荧光共振能量转移(FRET) 利用两种荧光基团的能量转移,这两种荧光基团分别称为能量供体(Donor)与能量受体(Acceptor)。Donor被外来光源激发(例如氙灯或激光),如果它与Acceptor比较接近,可以将能量共振转移到在Acceptor上,使其受到激发,发出特定波长的发射光。 将Donor与Acceptor分别与相互作用的两个生物分子结合,生物分子的结合可以将Donor与Acceptor拉到足够近的距离,产生能量转移,由于Acceptor的发射光来自能量转移,所以实验中不需要将未结合与已结合的分子分开,即不需要洗涤步骤。 时间分辨荧光(TRF) TRF利用稀土元素中镧系元素的独特性质,它们与普通荧光的主要区别就是荧光的持续时间不同。普通荧光的半衰期为纳秒级。镧系元素的半衰期为毫秒级,有6个数量级的差别。所以,在检测室,TRF有一个时间延迟---50us,经过这个时间延迟,普通荧光的信号几乎为零,所以,TRF的背景非常低,反映样品实际情况。

HTRF?的能量受体(技术创新点) HTRF?的能量供体就是铕(Eu)与钛(Tb)的穴状化合物。在这个穴状化合物里,Eu与Tb被永久地嵌合在一个笼子里,结构非常稳定,这个结构由J、M、Lehn’s教授发明的,并由此在1987年获得了诺贝尔奖。 HTRF?的能量受体 HTRF?的能量受体也有二种,XL665与d2、它们的光学性质相同,分子量不同,前者分子量为10KD,实际上就就是别藻蓝蛋白(APC)。我们将APC的亚基偶联在一起,使其不能解离,提高了稳定性,后者分子量为1KD,在某些实验中有独特的优势。 HTRF?的操作步骤 HTRF?操作步骤非常简单,只需要将实验所需试剂加进去,然后孵育,检测即可。 HTRF?实验数据分析 HTRF?采用了比值法来处理数据,可以去除溶液通透率、细胞大小、细胞数量不同引起的误差。

(SOP)时间分辨荧光免疫分析实验操作指南

时间分辨荧光免疫分析实验操作指南以及注意事项

第一节时间分辨反应过程图 TRFIA的操作要点 优质的试剂，良好的仪器和正确的操作是保证TRFIA检测结果准确可靠的必要条件。 下面列出TRFIA各个操作步骤的注意要点，严格遵照规定操作. 1、样本的采取和保存 TRFIA测定的样本一般为血清。不能使用含抗凝剂EDTA和柠檬酸的样本，因为二者可以螯合铕，使测定值降低。血清样本可按常规方法采集,溶血和脂血样本可能会影响测值。 样品在2℃-8℃可以保存3-5天，如果需要长期保存，请－20℃保存，避免反复冻融。冻结血清融解后，蛋白质局部浓缩，分布不均，宜轻缓充分混匀，避免气泡，可上下颠倒混和。不要把样本保存在室温，室温放置48小时可能会导致结果不稳定。 2、试剂的准备 整个实验过程应尽量在干净无尘的环境下进行 实验前应检查试剂盒的出厂日期以确定试剂盒是否过期，一般自产品检验合格出厂日期起有效期为一年。 按试剂盒说明书的要求准备实验中需用的试剂。TRFIA中用的去离子水，包括用于洗涤的，应为新鲜的和高质量的去离子水。从冰箱中取出的试验用试剂应待其温度与室温平衡后使用。试剂盒中本次试验不需用的部分应及时放回冰箱保存。 试剂盒中的标准品或铕标试剂若是冻干的状态，第一次开盒做实验在加去

离子水溶解标准品或铕标后，请不要立刻开始使用，静置10分钟左右待其溶解完全后再开始。 板条若未能一次用完，剩余板条用塑料袋（内有干燥剂）封口后密封保存。 TRFIA受反应温度的不恒定、操作误差以及铕标记物的稳定性等因素的影响，不同日期的荧光值会有所波动，因此在定量测定中，每批测试均须用一系列不同浓度的参考标准品在相同的条件下制作标准曲线。 3、加样 在TRFIA中一般有3次加样步骤，即加样本，加铕标记物，加增强液。加样时应将所加物加在微孔板的底部，避免加在孔壁上部，不可溅出，不可产生气泡。 加样本一般用微量加样器，按规定的量加入板孔中。加不同的样本应更换吸嘴，以免发生交叉污染。加铕标记和增强液时可用定量多道加液器，使加液过程迅速完成。 连续加样器使用时要连续流畅，并不是加样越慢越好！ 加样时检测吸嘴是否堵塞，加量是否足够，注意吸头之间是有差异的。 加样品时把样品按12个一排排好，做时每加样一个，就把它前移一排，这样不容易出错。 注意按操作步骤计算试剂的量是否充足，特别是使用全自动仪器时！ 使用干净的一次性容器配制铕标记物。铕标记物的污染是造成实验本底增高的首要原因。注意铕标记物的瓶盖不要与标准品瓶盖混用；所有接触过铕标记物的用品使用完毕应该丢弃，不能重复使用。注意铕标记物原液和工作不要污染实验台面、加样枪及试剂盒中的其他组份。 4、孵育 在TRFIA中一般有一次或两次抗原抗体反应，即加样本和铕标记物后。抗原抗体反应的完成需要有一定的温度和时间，这一保温过程称为孵育，或者温育。 目前TRFIA常用模式在微孔板中进行，属固相免疫测定，抗原、抗体的结合只在固相表面上发生。以抗体包被的夹心法为例，加入板孔中的样本，其中的抗原并不是都有均等的和固相抗体结合的机会，只有最贴近孔壁的一层溶液中的抗原直接与抗体接触。这是一个逐步平衡的过程，因此需经扩散才能达到反应的

时间分辨荧光免疫分析方法的光谱研究

第24卷,第5期 光谱学与光谱分析Vol 124,No 15,pp5962599 2004年5月 Spectroscopy and S pectral Analysis May ,2004　 时间分辨荧光免疫分析方法的光谱研究 郭周义,田　振,贾雅丽 华南师范大学激光生命科学研究所,广东广州　510631 摘　要　时间分辨荧光免疫分析法是用三价稀土离子及其螯合剂作为示踪物,标记蛋白质、激素、抗体、核 酸探针或生物活性细胞,待反应体系(如:抗原抗体免疫反应、生物素亲合反应、核酸探针杂交反应、靶细胞与效应细胞的杀伤反应等)发生后,用时间分辨荧光技术测定反应体系中分析物的浓度,达到定量分析的目的。它之所以能够继放射性同位素标记、酶标记、化学发光、电化学发光后成为一种更新、更灵敏的检测方法,主要取决于它所用标记物三价稀土离子螯合物独一无二的物理及化学性质。主要报导了对使用的长寿 命荧光团Eu 3+ 螯合物的光谱研究结果,时间分辨技术及荧光增强技术的原理。实验表明:选择336～337nm 的激发波长,有利于Eu 3+ 的配位二酮体的激发及能量转移。 主题词　免疫分析;荧光增强技术;时间分辨光谱技术;Eu 3+螯合物中图分类号:O657132 文献标识码:A 文章编号:100020593(2004)0520596204 　收稿日期:2003203226,修订日期:2003206228 　基金项目:广东省科技攻关重点项目(2002C60113);广州市天河区科技计划项目(2002XGP06);广东省自然科学基金项目(No 1015012, No.031518);教育部科学技术研究重点项目(No 102113)资助 　作者简介:郭周义,1965年生,华南师范大学激光生命科学研究所教授,博士生导师 引　言 最近几年发展起来的时间分辨荧光免疫分析方法(TR 2 FIA )是超微量免疫检定法的一大突破。由于使用了时间分辨光谱技术和荧光增强技术,使荧光免疫分析的灵敏度得到了极大提高。1983年Petterson [1]和Eskola [2]首先将时间分辨荧光光谱技术应用于免疫分析的研究中。目前,TRFIA 的最低检出值已达10-19mol ?well -1,远远超过酶标记免疫分析法(EIA )的10-9mol ?well -1,放射免疫分析法(RIA )的10-15mol ?well -1和发光免疫分析法(L IA )的10-15mol ?L -1。 稀土离子是金属离子,若用来直接标记抗原、抗体,标记率很低,一般使用含有双功能基团的螯合剂,形成稀土离子2螯合剂2抗原(或抗体)的螯合物。稀土离子的荧光,不仅与自身的能级结构有关,而且与螯合剂的性质有关。螯合物不同,稀土离子的激发光和发射光也会有所不同。 1　稀土离子的吸收光谱 镧系离子的电子排布为 1s 2 2s 22p 63s 23p 63d 104s 24p 64d 104f n 5s 25p 6(n =0～14),其主要价态有二价、三价和四价。三价态是特征氧化态,其 基组态是4f n (n =0～14),下一个激发态是4f n -15d [3]。 稀土离子吸收光谱[4]的产生可归因于三种情况。111　f —f 跃迁光谱 指f n 组态内,不同J 能级间跃迁所产生的光谱。它的特点是: (1)发光弱。这主要是因为f —f 跃迁是宇称选择规则禁 阻的。虽然在溶液和固态化合物中,由于配体场微扰,也能 观察到相应的光谱,但相对于d —d 跃迁来说,也是相当弱的。 (2)类线性的光谱。谱带的尖锐原因是处于内层的4f 电子受到5s 2,5p 6电子的屏蔽,受环境的影响较小。 (3)谱带的范围较广。在近紫外,可见区和近红外区内 都能得到稀土离子(Ⅲ )的光谱。112　f —d 跃迁光谱 4f n 向4f n -15d 的跃迁是组态间的跃迁。这种跃迁是宇称选择规则允许的,因而4f —5d 的跃迁是较强的;三价离子的吸收带一般在紫外区出现;由于5d 能级易受周围离子的配体场影响,相对于f —f 跃迁来说,谱带变宽。113　电荷跃迁光谱 稀土离子的电荷跃迁光谱,是指配体向金属发生电荷跃迁而产生的光谱,是电荷密度从配体的分子轨道向金属离子轨道进行重新分配的结果。镧系络合物能否出现电荷跃迁带取决于配体和金属离子的氧化还原性。一般在易氧化的配体 和易还原为低价离子(Sm 3+,Eu 3+ ,Te 3+,Yb 3+和Ce 4+)的络合物光谱中易见到电荷跃迁带。谱带的特点是有较强的强度和较宽的宽度。

常见发光免疫分析技术的比较

常见发光免疫分析技术的比较 免疫学技术的迅速发展对精度的要求越来越高，一般的酶免检测技术已逐渐无法适应这种形势的需要。现今发展的主流已不再是用放射性同位素标记的测定方法(避免污染环境及对人体损害)，而是转向于能在任何地方操作的快速均相和固相测定，最终趋向于能够枪测到皮克或10负18 摩尔级的、非同位素的、自动或半自动的实验室测定技术，发光免疫分析技术顺应了这一潮流，开创了免疫诊断的新纪元。 发光免疫分析是一种灵敏度高、特异性强、检测快速及无放射危害的分析技术。70年代末以来得到了迅速发展，目前在国际上已经实现商品化和产业化的发光免疫分析产品，基本上可以分为：化学发光、时间分辨荧光(也称时间延迟光致发光)、电化学发光(也称场致发光和电致发光)几种。 1、化学发光 化学发光是指在化学反应过程中发出可见光的现象。通常是指有些化合物不经紫外光或可见光照射，通过吸收化学能(主要为氧化还原反应)，从基态激发至激发态。退激时通过跃迁(或将激发能转移至受体分子上)，释放能量产生光子，以光形式放出能量从而导致的发光现象。其主要特点为消耗发光剂。同时量子效率相对较低。 1.1 按化学反应类型分类：可分为酶促化学发光和非酶促化学发光两类。其中酶促化学发光主要包括辣根过氧化物酶(HRP)系统、碱性磷酸酶 (ALP)系统、黄嘌呤氧化酶系统等。酶促发光的共同特点为发光过程中作为标记物的酶基本不被消耗，而反应体系中发光剂充分过最，因此发光信号强而稳定，且发光时间较长。因此可采用速率法测量，故检测方式简单、成本较低。酶促反应的主要缺点为工作曲线可能随时间漂移，而且低端斜率容易呈非线性下移。而非酶促化学发光包括吖啶酯系统、草酸酯系统、三价铁一鲁米诺系统等。非酶促发光的共同特点为发光过程中标记物被消耗，同时作为标记物的发光剂是发光反应的瓶颈，即含量总是相对不足，因此发光信号持续时间较短；如果直接在免疫反应杯中启动发光反应，由于发光剂被很快消耗，故只能进行一次性测量。所以重复性较差。为降低检测成本并实现重复测量，目前普遍采用原位进样加流动池的时间积分测量方式。因此仪器成本及维护费用较高，而且反复使用的流动池可能导致交叉污染；并目冲洗或进样中产生的气泡也会干扰测定；同时繁琐冗长的冲洗过程也会成为提高检测效率的瓶颈。另外，使用磁性或非磁性微粒时，强烈的散射吸收作用也会降低灵敏度。 1.2 按发光持续时间分类：可分为闪光和辉光两类，闪光型发光时间在数秒内，如吖啶酯系统。其检测方式一般采用原位进样和时间积分法测量，即在检测器部位加装进样器，并保证加入发光剂和检测2个过程同步进行；同时以整个发光信号峰的面积为发光强度。而辉光型发光时间在数分钟至数十分钟以上，如HRP一鲁米诺系统、ALP—AMPPD系统、黄嘌呤氧化酶-鲁米诺系统等。其信号检测无需原位进样，一般以速率法测量，即在发光信号相对稳定的区域任意点测量单位时间的发光强度。 测量化学发光反应的光强度，求得某些化学物质和生物物质的含量，尤其与免疫学方法结合以后形成的化学发光免疫测定法(CLIA)，其既具有发光检测的高度灵敏性，又具有免疫分析的高度特异性，检测快速，试剂无放射危害，检测限达10负15 mol／L。