3T3-L1细胞诱导

一、诱导液配制

1、4,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液（IBMX）配制。分子量222，几乎不溶于水，现配现用，0.22um 过滤除菌。100×母液（50mmol/L）：11.5mg IBMX+940ul超纯水+60ul 1mol/L KOH。

2、胰岛素溶液配制。比较难溶，-20℃保存1个月，使用PH 2~3的稀盐酸溶液助溶，0.22um过滤除菌。100×母液（1mg/ml）：10mg INS+10ml 0.01mol/L HCL。

3、地塞米松溶液配制。分子量516.41，0.22um过滤除菌，-20℃保存1个月。使用无水乙醇溶解，1000×母液（1mmol/L）。

二、3T3-LI细胞系的培养、诱导

、1、按常规贴壁细胞培养法培养于含l0% NCS DMEM高糖培养基中，37℃、体积分数为5％CO

2

饱和湿度条件下培养，2d换液一次。

2、3T3-Ll细胞系的诱导：细胞生长状态良好时实验。细胞传代分瓶，每一瓶中的细胞数约为1×105，每48h换液。当细胞接触抑制2d后，加入诱导剂 (10%胎牛血清FBS的高糖DMEM培养液（含10ug/ml胰岛素，1umol/L地塞米松，0.5mmol/L IBMX），培养2d。然后换为10%胎牛血清的高糖DMEM培养液（含10ug/ml的胰岛

素），培养2d。改为10%的胎牛血清的DMEM培养液，每2d换液一直到诱导成为成熟的脂肪细胞(细胞体积增大，细胞中出现串状的脂肪滴)，占总体积的90%。

三、注意事项

1、待细胞接触抑制后2d加入诱导剂。太早，细胞没有退出生长周期。太迟，细胞诱导后容易漂浮。

2、3T3细胞株20代以后分化困难，最好挑选5代左右开始诱导分化。将细胞冻存起来，使用时再复苏。

3、大约需要8~10天，可以诱导分化成功。之后换液处理需要轻缓，以免损失细胞。

4、诱导前后使用油红O染色鉴定。证明是成熟脂肪细胞，而不是空泡样变性。方法：油红O 是一种可以特异地和细胞内三酰甘油结合的红色染料，与未分化细胞和细胞外脂质不结合。吸弃培养板里的分化培养基；1×PBS冲洗细胞2次或3次；加入10%的甲醛磷酸盐缓冲液4 mL/孔，室温固定1 h；吸弃固定液；加入油红O溶液，室温染色3 h；吸弃染色剂；无菌三蒸水冲洗2次，洗去未着色染料；显微镜下观察，照相。

C3H1OT12细胞向神经元诱导分化的方法研究

C3H1O T1 2细胞向神经元诱导分化的方法研究 邓均　艾国平　王军平　徐辉　邹仲敏　闫国和 董世武　郝磊　冉新泽　粟永萍 【摘　要】 目的　探讨体外诱导间充质干细胞(m esenchym al stem cells,M SC s)系C3H1O T1 2细胞分化为神经元细胞的方法。　方法　取3月龄SD大鼠1只,体重200g,进行神经元细胞的原代培养及诱导上清液的收集,用细胞免疫组织化学方法进行鉴定。将C3H1O T1 2细胞进行培养,分别用Β巯基乙醇(A组)和神经元原代细胞上清液(B组)作为诱导剂,对C3H1O T1 2细胞进行诱导分化;对照组(C组)不加诱导剂进行培养。采用细胞免疫组织化学方法对分化的细胞进行鉴定。　结果　细胞免疫化学检测原代培养细胞为神经元,表达特异标志物:神经丝蛋白(neu rofilam en t p ro tein, N F)和神经元特异性烯醇化酶(neu ron specific eno lase,N SE)。A组C3H1O T1 2细胞经Β巯基乙醇诱导2h即表达N F和N SE,5h表达强度增强。B组C3H1O T1 2细胞经原代神经元培养上清液诱导,1d有N F和N SE表达,但表达强度比A 组弱。各组N SE表达阳性率和强度均高于N F。　结论　化学分子和微环境体液因素均可诱导M SC s向神经元细胞分化;为M SC s通过神经分化参与脑创伤的修复提供了理论依据。 【关键词】 间充质干细胞 分化 神经元细胞 诱导 中图分类号:Q813111　R329.2 文献标识码:A EXPER I M ENTAL INVESTIGATI ON ON CHARACTER ISTI CSOF C3H1OT1 2CELL IND UCED D IFFERENTI ATI ON INT O NEUR ON-L IKE CELL S D EN G J un,A I Guop ing,W A N G J unp ing,et a l.Institu te of Co m bined Inju ry,Colleg e of P reven tive M ed icine,T h ird M ilita ry M ed ica l U n iversity,Chong qing,400038,P.R.Ch ina.E2m a il:dj t mm u@to m. co m Corresp ond ing au thor:SU Y ongp ing,E2m a il:suyp2003@y ahoo.co https://www.wendangku.net/doc/df9930207.html, 【Abstract】 Objective　To exp lo re the m ethod that can induce the m esenchym al stem cells(M SC s)to differen tiate in to the neu ron2like cells in v itro.M ethods　T he neu ron2like cells w ere iso lated from an SD rat(age, 3mon th s;w eigh t,200g).T hey underw en t a p ri m ary cu ltu re;the induced liqu id supernatan t w as co llected,and w as iden tified by the cell i m m unoh istochem istry.T he C3H1O T1 2cells w ere cu ltu red,as an M SC s model,and they w ere induced in to differen tiati on byΒ2m ercap toethano l(Group A)and by the liqu id supernatan t of the neu ron2like p ri m ary cells(Group B),respectively.T he cells w ere cu ltu red w ithou t any inducti on w ere u sed as a con tro l(Group C). I mm unoh istochem istry w as u sed to iden tify the type of the cells.Results　T he resu lt of the i m m unochem istry show ed that the cells undergo ing the p ri m ary cu ltu re exp ressed the neu rofilam en t p ro tein(N F)and the neu ron specific eno lase (N SE),and they w ere neu ron2like cells.Β2m ercap toethano l cou ld induce the C3H1O T1 2cells to exp ress N F and N SE at2h,and the exp ressi on in ten sity increased at5h.T he liqu id supernatan t of the p ri m arily2cu ltu red neu ron2like cells cou ld induce the C3H1O T1 2cells to exp ress N F and N SE at1d,bu t the exp ressi on in ten sity induced by the liqu id supernatan t w as w eaker than that induced byΒ2m ercap toethano l.T he po sitivity rate and the in ten sity exp ressi on of N SE w ere h igher than tho se of N F.Conclusion　M SC s can differen tiate in to the neu ron2like cells byΒ2m ercap toethano l and the m icroenvironm en t humo ral facto r,w h ich can pave the w ay fo r a fu rther study of the differen tiati on of M SC s and the effect of the differen tiati on on the b rain traum a repair. 【Key words】 M esenchym al stem cells D ifferen tiati on N eu ron2like cells Induce Founda tion ite m:N ati onal Basic Science R esearch and D evelopm en t Gran ts(2005CB522605) 近年来,干细胞由于其多向分化潜能成为研究热点,也成为细胞工程、再生医学研究中的主要选择细 基金项目:国家重点基础研究发展计划(973)资助项目(2005CB522605) 作者单位:第三军医大学军事预防医学院复合伤研究所(重庆, 400038) 通讯作者:粟永萍,教授,博士导师,研究方向:干细胞参与创伤修复的机制研究,E2m ail:suyp2003@https://www.wendangku.net/doc/df9930207.html, 胞[1,2]。神经干细胞的发现为中枢神经细胞变性疾病和中枢神经系统损伤的移植治疗提供了有效的移植物,但由于目前很难获得足够的神经干细胞,因此寻找一种新的移植细胞来源,对神经科学领域基础与应用研究的发展至关重要[3,4]。研究证实,间充质干细胞(m esenchym al stem cells,M SC s)具有可塑性,可跨胚层分化,诱导分化为外胚层的神经元细胞[5,6]。而且M SC s易获取,易生长,有较强的增殖能力,可成为神

干细胞诱导分化具体步骤及注意事项

干细胞诱导分化具体步骤及注意事项 一、技术简介 干细胞诱导分化是诱导干细胞定向分化，使之成为成熟的功能细胞，是目前干细胞研究的关键环节。干细胞是一种未充分分化，具有自我复制能力的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。如：骨髓间充质干细胞是位于骨髓基质中的一类中胚层来源的未分化细胞，在体内外均发现有极强的增殖能力，具有很强的自我更新和多向分化潜能。在一定诱导条件下，可以分化为成骨细胞、成软骨细胞和成肌细胞等，还可以分化为巨噬细胞、脂肪细胞、内皮细胞和成纤维细胞等骨髓基质细胞，具有发育为骨、软骨、脂肪、肌肉、真皮及骨髓基质等中胚层组织的潜能。 在体胚胎分化过程中，组织发生和身体构造的形成具有时空顺序性和相互诱导性。在个体发育过程中，细胞分化是程序控制的有序有规律过程，程序的运行结果表现为不同发育阶段、不同组织部位的细胞表现出不同的形态、不同的生长方式和不同的生理功能。从分子水平上来看，这一结果取决于细胞在基因表达上的时空差异，这种基因表达差异除由细胞内在发育程序决定外，还受细胞外环境影响和调控，且有时这种外部控制条件或环境对形成特定细胞有着决定性作用。干细胞体外定向诱导分化的原理，就是选择适当的诱导剂和诱导模式，通过诱导物与细胞表面受体结合或使细胞发生轻度可逆性损伤等，使被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化，然后将这些定向分化的细胞进行分离和培养传代，从而得到人们所需要的细胞类型。 二、实验流程 1. 干细胞的分离、原代和传代培养。 2. 定向诱导干细胞分化。 3. 成长曲线测定。 4. 诱导分化后细胞鉴定。 5. 结果统计分析。

牙髓干细胞向神经细胞方向的诱导分化实验

万方数据

万方数据

华西口腔医学杂志第篮卷第４期２００７年８月 ———— 一一里型！１１些地婴坐堂皇！型些！臣！！！堑盟型些ｇ：！婴！：塑！： 物经琼脂糖凝胶电泳分折，可见一条约３８０ｂｐ大小 的扩增产物条带，与ＧＦＡＰ预期片段大小基本一致。 内参对照ＧＡＰＤＨ也可见９００ｂｐ的清晰条带（图４）。 ２．２免疫细胞化学染色１＋Ｍａ妇２：Ｇ８Ａ９和诱导细胞，３：ｃＦＡ’耳口束诱导细胞４： 诱导细胞抗黑∑世氍ｅ鲞掣肌岬：、”冒：Ｉ鬻翟：詈：黧鬻：…。，。。呈 ３），对照组这两种抗体染色均呈阴性。一 阳性表选 囤２坤经诱导４ｄ盾牙髓干细胞抗ＧＦＡＰ的阳性表远ＡＢｃ×２００ ，培２ｈ椰ｖｅ８叩哪ｌ…ｍ曲ｔｌｂｏｄ）∞ｃＦＡＰ缸ｄｅⅡｋｌＦＬＩｌｐｓｔ…ｅⅡｓⅡｅａｔｅｄ诵ｔｈＩ）叫口ｌｊｎｄｕｃｂｖｅｒｒ?刚ｉｕｍＲⅡ４ｄＨＹｓ ＡＢＣＨ２００ 幽３砷经诱导４ｄ后，牙髓Ｔ细胞抗Ｎ虬的｜５Ｈ性表述ＡＢｃ×２００ Ｆ咱３Ｐｏｇｉｄ…砷…ｍ们【ｈａ埘ｂｏｄｙｔ０ＮｓＥ０ｆｄｅｎ词ｐＵ如“Ｌｅ…ｄｋｈ即Ｌ出ｗＪⅡＩＪ?ｅｍ“１ｎｄｌｍｄ…ｌ。出Ｉｌｒｔ＿ｈ４ｄａｖｓ ＡＢＣ×Ⅻ ２＿３１ｗ—Ｐｃｌ｛检测 咀未诱导细胞为对照，诱导细胞的ＲＴ—ＰｃＲ产３讨论 成体干细胞的横向分化潜能或称为可塑性是指其不仅能分化为来源组织的各种细胞类型，而且具有分化为其他胚层来源的成熟细胞的潜能Ｈ。自从１９９７年有关成体干细胞可塑性的系列研究＝ｌ挂道后，可塑性研究引起生命科学领域的极大关注，对干细胞的研究产生重要影响。而这其中研究最多、可塑性最强的是骨髓基质干细胞（ｂｏｎｃｍｃｓｅｎｃｈｙｍａｌｓｔｅｍｃｅｌｌｓ－ＢＭｓｃｓ），可以诱导分化为骨髂肌细胞、心肌细胞、内皮细胞、肝细胞、胆管上皮细胞、肺上皮细胞、肠上皮细胞、皮肤上皮细胞、神经细胞、脂肪细胞等，其中最引八注目的是其神经方向的分化潜能。 Ｅｄｉｔｉｓ等”研究表明小胶质细胞、星形胶质细胞是来源于骨髓的一种前体细胞。而Ｂｒａｚｅｌｔｏｎ等‘啦过绿色荧光蛋白基因转染示踪研究发现，在脑内微环境下，ＢＭｓｃｓ能分化为神经元样细胞、星形胶质样细胞，除表达相应神经细胞表型特点外，尚有神经元样功能。而在体外，削ＤＭｓＯ、ＢＨＡ、Ｂ—ＭＥ等作为主要诱导剂，可诱导成年大鼠和人的ＢＭＳＣｓ分化为神经元和神经胶质细胞，诱导后细胞在形态上出现类似于神经元样突起，表达ＮｓＥ、ｎｅｓｔｉｎ等神经细胞特异性标志㈣。此外，表皮生长｜盘｜子或脑源性神经生长因子与维甲酸或胎鼠的中脑、纹状体的悬液也可体外诱导ＢＭｓｃｓ分化为幼稚的神经兀和神经胶 质细胞口。可见体外不同培养条件下都可诱导ＢＭｓｃｓ　万方数据

癌的分化诱导治疗和分化诱导剂

癌的分化诱导治疗和分化诱导剂 作者：闫晓光(A1435)综述周训银1 吴军正2审校一般认为，癌细胞的分化程度较正常低，主要有以下几种观点：⑴癌细胞来源于未能完全分化的正常干细胞的异常分化；⑵癌细胞是已完全分化的正常细胞的反分化形成的；⑶癌变是细胞发育的阻抑，即细胞在早期分化阶段被致癌物转化为低分化、高增殖的癌细胞；而在细胞接近于分化完成时，被致癌物转化为高度分化的、低增殖的癌细胞。不管癌细胞是来自成熟细胞的反分化，或来自未成熟细胞的异常分化，还是阻抑正常细胞的分化，都可以看作是一种细胞分化的疾病，目前已经有许多把恶性细胞再分化成高分化不(或低)增殖正常细胞的例子：⑴Mckinell等人将蛙肾肿瘤细胞核注入受精的去核卵，结果发现肿瘤细胞核改变了基因的表达，经过正常分化，成长为正常的蝌蚪，及至成年蛙，都没有一点恶性肿瘤的迹象。⑵Mintz由含特异标志的小黑鼠分离畸胎瘤细胞，直接注入另一种含不同基因标志的小白鼠胚胎，然后将胚胎移植到假孕的寄养母鼠的子宫内，结果胚胎长成了正常鼠。从上面的实验中可以得出下面的启示：⑴至少有部分癌是由于基因的表达及功能改变所致，而基因的结构并未改变。如果癌都是由于基因的永久性突变，那么畸胎瘤就不可能再分化为正常细胞。⑵如果癌细胞可以向正常逆转，就有可能设计出一种治疗癌瘤的药物，促使癌细胞再分化成正常细胞。很多生成因子或化学物质在体内或体外可促进癌细胞分化而降低肿瘤恶性程度的事实，为发展抗癌治疗开辟了一条新途径──分化诱导治疗[1]。 1 分化诱导疗法特点 肿瘤细胞分化诱导疗法的基本特点为不杀伤肿瘤细胞，而诱导肿瘤细胞分化为正常或接近正常细胞，即在一些化学制剂的作用下，有的肿瘤细胞出现类似正常细胞的表型，有的恢复了正常细胞的某些功能，这些制剂被称为分化诱导剂，运用分化诱导剂促进体内肿瘤细胞分化来治疗癌症，被称为分化诱导疗法。目前国内外文献资料对癌细胞分化的叫法有所不同，如：逆转、表型逆转、逆向转化、正常化、脱癌、去恶性及去恶化等，总之，均表达出肿瘤细胞向正常细胞方向发展。分化诱导疗法的提出，打破了50年代曾流行的“一旦成了癌细胞，便永远是癌细胞”的观点，癌细胞的分化诱导疗法，作为肿瘤治疗的一条新途径，近年

胚胎干细胞体外诱导分化综述

胚胎干细胞体外诱导分化综述 摘要：由于胚胎干细胞具有自我更新、高度增值和多向分化的潜能，因此，自20世纪90年代开始，对胚胎干细胞的研究成为生物学领域和医药工程领域研究的一个焦点。本文从胚胎干细胞的分离、体外诱导胚胎干细胞的原理和定向分化的机制、胚胎干细胞体外诱导的方法、定向分化的细胞、应用前景和研究存在的问题对胚胎干细胞进行综述。 关键词：胚胎干细胞；体外培养；诱导分化；应用 干细胞是一种具有多分化潜能和自我更新功能的早期未分化细胞。在特定条件下，它可以 分化成不同的功能细胞，形成多种组织和器官，它包括胚胎干细胞和成体干细胞。前者指早期胚胎的多能干细胞，后者是存在于胎儿和成体不同的组织内的多潜能干细胞这些细胞具有自我复制能力，并产生不同种类的具有特定表型和功能的成熟细胞的能力，能够维持机体功能的稳定，发挥生理性的细胞更新和修复组织损伤作用[4,9,10]。 胚胎干细胞（embryonic stem cell,ESC)是从着床前胚胎内内细胞团(inner cell mass,ICM)或原始生殖细胞经体外分化抑制培养分离的一种全能性细胞[1]。它能在体外长期不断自我更新,并保持多向分化潜能,可以分化为内、中、外三个胚层的几乎所有类型细胞。自1981年Evans和Kauffman[2,8]用不同的方法首次成功分离得到小鼠胚胎干细胞以来,小鼠胚胎干细胞成为近20年来人们用来研究发育分化、基因表达调控、基因治疗等最理想的模型，并且有大量研究表明小鼠胚胎干细胞可以在体外被诱导分化为绝大多数类型的成体细胞.1998年Thomson等首次成功分离并建立人胚胎干细胞系。自此，人胚胎干细胞不但提供了一个研究人类自身发育分化的良好机会,而且如果人胚胎干细胞能像小鼠胚胎干细胞一样可以在体外诱导形成各种成体细胞,那么利用这些诱导分化形成的成熟细胞将有可能进行细胞和组织替代治疗, 包括糖尿病、帕金森病、早老性痴呆、心血管疾病和肿瘤等多种目前临床上难以治愈的疾病。 1 胚胎干细胞的分离 自Thomson成功分离并建立人胚胎干细胞系后，多年以来，人们研究出很多胚胎干细胞的 分离方法，在这里主要介绍三种： 1.1 分离自胚胎内细胞团 内细胞团又称胚细胞（embryoblast）,是一团于哺乳动物初期胚胎中的一个细胞团块。从早期胚胎内细胞团（inner cell mass,ICM）分离是获得胚胎干细胞的主要途径。由于不同动物的胚胎发育存在差异，因此应注意取材时间。可通过免疫外科手术法、机械剥离法、组织培 养法等方法除去胚胎滋养层细胞获得囊胚内细胞团（ICM）细胞进行体外分化抑制培养。 1.2分离自原始生殖细胞

牙髓干细胞向神经细胞方向的诱导分化实验

牙髓干细胞向神经细胞方向的诱导分化实验 贺慧霞;金岩;史俊南;罗玉庆;周艳妮;彭智;许玉和 【期刊名称】《华西口腔医学杂志》 【年(卷),期】2007(025)004 【摘要】目的探讨克隆化培养分离的人牙髓干细胞是否具有向神经细胞方向分化的潜能,并确定其诱导条件.方法克隆化培养的人牙髓干细胞预诱导24 h,然后换含一定浓度二甲基亚砜(DMSO)、丁羟基茴香醚(BHA)、forskolin、β-巯基乙醇(β-ME)和氢化可的松(hydrocortisone)的联合诱导液连续诱导4 d,对诱导细胞进行形态学观察,神经胶质酸性蛋白(GFAP)、非特异性酯酶(NSE)免疫组化染色和GFAP mRNA RT-PCR检测.同时,以未诱导细胞为对照.结果诱导12 h 时细胞形态开始改变,24 h时分化为较为典型的神经细胞样细胞,继续诱导分化细胞数量增多;诱导细胞表达神经元细胞特异性标志NSE和GFAP蛋白;RT-PCR 检测诱导细胞表达GFAP mRNA,而未诱导细胞均无上述改变和表达.结论人牙髓干细胞在一定的诱导条件下可横向分化为神经元样细胞. 【总页数】4页(331-334) 【关键词】牙髓干细胞;诱导;分化 【作者】贺慧霞;金岩;史俊南;罗玉庆;周艳妮;彭智;许玉和 【作者单位】第四军医大学口腔医院病理科,组织工程中心,陕西,西安,710032;武警甘肃总队医院,口腔科,甘肃,兰州,730050;第四军医大学口腔医院病理科,组织工程中心,陕西,西安,710032;第四军医大学口腔医院,牙体牙髓科,陕西,西安,710032;兰州军区临潼疗养院三区,门诊部,陕西,西安,710600;武警甘肃总队医院,口腔科,甘肃,兰州,730050;武警甘肃总队医院,口腔科,甘肃,兰州,730050;武

诱导分化成熟脂肪细胞方案

Sigma的试剂：IBMX（Sigma I-7018) Dexamethasone (Sigma D-4902) Insulin (Bovine; Sigma I-5500) gibco血清：小牛血清(GibcoBRL-Cat#16170-078/Lot #1060198) 胎牛血清(GibcoBRL-Cat# 10437-028/Lot # 1026566) 培养基DMEM;（GibcoBRL-Cat# 11965-084） MEM Sodium Pyruvate (100mM; GibcoBRL Cat#11360-070) Pen/Strep/Glutamine (100x P/S/G; GibcoBRL Cat#10378-016) 一: 本次3T3-L1细胞共一25cm3培养瓶消化后传代分为2个10cm培养皿，3天后每个10cm皿分别传代3个10cm皿。共6个10cm皿，将其中5个皿细胞冻存于-80°，将一个10cm皿中3t3-l1细胞分别接种于一个6孔板一个12孔板其中4孔和2个10cm皿，待2个10cm皿中细胞铺满90%后消化冻存于-80。 二：6孔板和12孔板4孔即将用于分化。两者均在细胞铺满90%左右接触抑制2d开始加诱导剂，诱导方案严格按照之前计划的施行，诱导剂①培养2d后换为诱导剂②培养2d，后换诱导剂③培养，以后每48h换液，均采用诱导剂③，8天左右即可看到脂滴，此次整个诱导过程共用14天，出脂滴后继续48h换液，目的主要是获得更多的脂肪细胞。 三：3t3-l1诱导分化过程整体较为顺利，之前考虑到的诸如细胞可能贴壁不牢，易漂浮的情况基本未出现（漂浮很少），诱导剂配置过程中由于剂量极低，担心的浓度不准问题，后证明对分化影响不是很大。 一、诱导液配制 1、4,3-异丁基-1-甲基黄嘌呤溶液（IBMX）配制。分子量222，几乎不溶于水，现配现用，过滤除菌。100×母液（50mmol/L）：IBMX+940ul超纯水+60ul 1mol/L KOH。每毫升培养基加10ul IBMX.

骨髓基质干细胞诱导分化为神经细胞的研究进展

骨髓基质干细胞诱导分化为神经细胞的研究进展骨髓基质干细胞具有取材简单、增殖速度快、培养过程中始终保持多向分 化的潜能等特点，已经成为干细胞研究领域的热点，是最好的组织工程种子细胞之一，还可以诱导分化为神经细胞。本文对骨髓基质干细胞诱导分化为神经细胞的研究进展作一综述。 [Abstract] Bone marrow stromal cells has derived simple，fast growth，the training process remains much to differentiate and other characteristics，has been become the hot spot in the study of stem cells，is one of the best seed cells of tissue engineering.It can also differentiate into neural cells.The article reviewes the progress of induction of bone marrow stromal cells to neural cells and its mechanisms. [Key words] Bone marrow stromal cells；Neural cells；Bone marrow 骨髓基质干细胞（bone marrow stromal cells，BMSCs）位于骨髓中，是具有自我复制和多向分化潜能的非造血干细胞[1]。由于BMSCs具有取材容易、培养简单、增殖能力强、可以传代并且不改变生物学特性以及没有伦理学及免疫排斥等优点而备受瞩目[2-3]，BMSCs为治疗中枢神经系统疾病的一种理想供体细胞[4-6]。本文将BMSCs诱导分化为神经细胞的研究现状作一综述。 1 BMSCs定向分化为神经细胞的研究现状 1.1 体内定向分化 大量研究表明，BMSCs在体内可以分化为神经细胞。有学者将来源于人的BMSCs注入小鼠纹状体内，5～72 d后发现，在脑组织切片上有供体细胞存在，同时无明显炎症反应和排斥反应[7]。Mezey等[8]进行了雄性和雌性小鼠BMSCs 移植实验，将雄性小鼠的BMSCs植入雌性小鼠体内，一段时间后进行检测发现有携带Y染色体的神经细胞出现在雌性小鼠体内，提示雄性小鼠的BMSCs在雌性小鼠的体内分化成神经细胞。Guillermo等[9]将BrdU标记的大鼠BMSCs注入胎龄为15 d的大鼠胚胎的侧脑室内，在胎龄18、20 d时检测发现移植的细胞形成细胞团，2个月时检测仍有少量的移植细胞存活，表明BMSCs可以在脑的微环境中分化为神经细胞并存活较长时间。Chen等[10]将BMSCs应用于脑外伤动物，发现其能分化为神经细胞，并对神经功能的恢复有明显的促进作用。上述实验表明，BMSCs在体内可以迁移、存活、在相应部位的微环境影响下可分化为神经细胞，并能发挥一定的神经修复功能。 1.2 体外定向分化 能在体外分化为有较完整功能的神经细胞，是BMSCs作为神经细胞移植的来源细胞应用于临床的基础，很多学者在如何诱导BMSCs分化为神经细胞方面做了大量有益的探索，取得了较大进展，截止目前，诱导方法大致可归纳为以下

胚胎干细胞的定向诱导分化及应用前景

龙源期刊网 https://www.wendangku.net/doc/df9930207.html, 胚胎干细胞的定向诱导分化及应用前景 作者：王士珍李雪甫陈培 来源：《科技视界》2012年第23期 【摘要】胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES细胞)主要来自于胚胎发育早期囊胚中内细胞群(inner cell mass, ICM), 具有无限增殖、自我更新和多向分化的特性。理论上可以诱导分化为机体中200多种细胞，可作为细胞移植、组织替代, 甚至器官克隆的细胞供体，为将来治疗人类诸多难治性疾病提供细胞来源。本文简述了胚胎干细胞的诱导分化方法、定向分化的一些细胞种类以及应用前景。 【关键词】胚胎干细胞；诱导；分化 ES细胞是由囊胚的内细胞群或胎儿的原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)经体外抑制分化培养而获得的一种具有多向分化潜能的细胞。英国剑桥大学的Evans等[1]于1981年首次建立了小鼠胚胎干细胞系。Thomson等[2]于1998年利用临床上体外受精的胚胎，采用免疫法分离出内细胞群，首次成功分离出人胚胎干细胞系。同年，Sham blott等[2]以STO作为饲养层首次建立了人胚胎生殖细胞(hEGC)系。一般情况下，可将胚胎干细胞和胚胎生殖细胞统称 为胚胎干细胞。饲养层或白血病抑制因子（LIF）是ES细胞体外培养过程中保持未分化状态的必要条件。当培养条件有轻微改变时，例如在培养液中添加某些诱导分化因子（维甲酸RA、DMSO等），ES细胞就会发生分化；另外，如果把脱离饲养层的ES细胞进行悬浮培养，会发育成大小不一的拟胚体（embryoid boby, EB）,然后可诱导EB向不同类型细胞分化。至今，已从ES细胞诱导分化出心肌细胞、骨细胞、软骨细胞、肝细胞、造血细胞、脂肪细胞、胰岛素细胞、神经细胞、内皮细胞等。这些诱导后的细胞有望为器官移植、损伤器官的修复提供原材料，具有十分广阔的临床应用前景。所以，近年来有关胚胎干细胞的定向分化研究已成为全世界研究的热点。 1诱导ES细胞定向分化的方法 目前，通常针对人们设想要得到的终末靶细胞，而采用不同的诱导分化方法，使ES细胞最终定向分化为目的细胞。最常用的诱导方法一般包括以下四种：化学试剂诱导法、细胞因子诱导法、共培养诱导法以及转基因诱导法等。 1.1化学试剂诱导法 维甲酸（retinoic acid，RA）是体内维生素A的代谢中间产物，主要影响骨的生长和促进上皮细胞增生、分化、角质溶解等代谢作用。Schuldiner等[3]用一定浓度的RA（10-6M）诱导人ES细胞向神经细胞分化。实验证实：产生的神经细胞比未用RA处理的对照组增加了22%。目前，RA诱导ES细胞分化为神经细胞的机制还没有完全弄清楚。一般认为RA进入细胞后，最先与细胞质中维甲酸结合蛋白 (cellular RA binding protein，CRABP)形成复合物，然

胚胎干细胞体外定向诱导分化的研究进展

胚胎干细胞体外定向诱导分化的研究进展 （姓名：李翔单位：宁夏师范学院化学与化学工程学院11级科学教育班） 摘要：胚胎干细胞是从早期胚胎内细胞团分离培养出来的具有发育全能性或多能性的干细胞,具有多向分化潜能和自我更新的特性。胚胎干细胞可以定向诱导分化生产组织和细胞,可为细胞移植提供无免疫原性的材料,为难以治愈的疾病的细胞移植治疗提供可能。本文介绍了胚胎干细胞的诱导分化方法和应用。 关键词：胚胎干细胞;定向诱导分化;分化潜能;自我更新 胚胎干细胞(embryonic stem cell,ES细胞)是从早期胚胎(桑椹胚、囊胚)或原始生殖细胞(primordial germ cell,PGCS)分离出来的能在体外永久培养的、具有多方向分化潜能和种系嵌合能力的细胞系。ES细胞具有多向分化潜能,可分化形成外胚层、中胚层和内胚层细胞的谱系干细胞,再成长为不同的神经、造血、肌肉,骨骼等各种细胞基于其特性,目前普遍认为,ES细胞对体外研究动物和人胚胎的发生发育,基因表达调控,药物的筛选和致畸实验及作为组织细胞移植治疗,克隆治疗和基因治疗的细胞源及产生克隆和转基因动物等领域将产生重要的影响。1998年,T homson和Gearhart2个研究组分别从人ICM和PGCS建立了人类ES细胞系,在国际上引起了轰动。Science杂志将人类ES细胞研究成果评为1999年世界十大科技进展之首,美国《时代》周刊将其列为20世纪末世界十大科技成就之首,并认为ES细胞和人类基因组将同时成为新世纪最具发展和应用前景的领域,由此掀起了ES细胞研究的高潮。 1体外诱导ES细胞的原理 在体胚胎分化过程中，组织发生和身体构造的形成具有时空顺序性和相互诱导性。在个体发育过程中，细胞分化是程序控制的有序有规律过程，程序的运行结果表现为不同发育阶段、不同组织部位的细胞表现出不同的形态、不同的生长方式和不同的生理功能。从分子水平上来看，这一结果取决于细胞在基因表达上的时空差异。这种基因表达差异除由细胞内在发育程序决定外，还受细胞外环境影响和调控，且有时这种外部控制条件或环境对形成特定细胞有着决定性作用。ES细胞体外定向诱导分化的原理，就是选择适当的诱导剂和诱导模式，通过诱导物与细胞表面受体结合或使细胞发生轻度可逆性损伤等，使被诱导细胞按预定的细胞类型方向分化[2]，然后将这些定向分化的细胞进行分离和培养传代，从而得到人们所需要的细胞类型。 2体外诱导ES细胞的方法 体外诱导ES细胞的常用方法是将ES细胞进行悬浮培养或悬滴培养，使其形成类胚体(Embry-oid Bodies,EBs)，该结构的分化过程与体内胚胎的早期发育过程相似。首先将EBs消化成单细胞，然后再贴壁培养，并于不同的培养阶段添加不同种类和不同浓度的化学物质、条件培养基或细胞因子等诱导条件，直接促进ES细胞定向分化为某种特殊类型的细胞；或通过改变培养条件对某些类型的细胞分化起抑制作用，从而高效诱导目的细胞的分化。改变细胞的培养条件使ES细胞进行定向分化的基本策略有三种：一是向培养基中添加生长因子和化学诱导剂等；二是将ES细胞与其它细胞一起进行培养；三是将细胞接种在适当的底物上，以促使细胞中某些特定基因的表达上调或下降，从而引发细胞沿着某一特定谱系进行分化。体外诱导胚胎干细胞的物质有化学试剂诱导法、细胞因

胚胎干细胞的定向诱导分化及应用前景

胚胎干细胞的定向诱导分化及应用前景 【摘要】胚胎干细胞（embryonic stem cell, ES细胞)主要来自于胚胎发育早期囊胚中内细胞群(inner cell mass, ICM), 具有无限增殖、自我更新和多向分化的特性。理论上可以诱导分化为机体中200多种细胞，可作为细胞移植、组织替代, 甚至器官克隆的细胞供体，为将来治疗人类诸多难治性疾病提供细胞来源。本文简述了胚胎干细胞的诱导分化方法、定向分化的一些细胞种类以及应用前景。 【关键词】胚胎干细胞；诱导；分化 ES细胞是由囊胚的内细胞群或胎儿的原始生殖细胞(Primordial germ cells，PGCs)经体外抑制分化培养而获得的一种具有多向分化潜能的细胞。英国剑桥大学的Evans等[1]于1981年首次建立了小鼠胚胎干细胞系。Thomson等[2]于1998年利用临床上体外受精的胚胎，采用免疫法分离出内细胞群，首次成功分离出人胚胎干细胞系。同年，Sham blott等[2]以STO作为饲养层首次建立了人胚胎生殖细胞(hEGC)系。一般情况下，可将胚胎干细胞和胚胎生殖细胞统称为胚胎干细胞。饲养层或白血病抑制因子（LIF）是ES细胞体外培养过程中保持未分化状态的必要条件。当培养条件有轻微改变时，例如在培养液中添加某些诱导分化因子（维甲酸RA、DMSO等），ES细胞就会发生分化；另外，如果把脱离饲养层的ES细胞进行悬浮培养，会发育成大小不一的拟胚体（embryoid boby, EB）,然后可诱导EB向不同类型细胞分化。至今，已从ES细胞诱导分化出心肌细胞、骨细胞、软骨细胞、肝细胞、造血细胞、脂肪细胞、胰岛素细胞、神经细胞、内皮细胞等。这些诱导后的细胞有望为器官移植、损伤器官的修复提供原材料，具有十分广阔的临床应用前景。所以，近年来有关胚胎干细胞的定向分化研究已成为全世界研究的热点。 1诱导ES细胞定向分化的方法 目前，通常针对人们设想要得到的终末靶细胞，而采用不同的诱导分化方法，使ES细胞最终定向分化为目的细胞。最常用的诱导方法一般包括以下四种：化学试剂诱导法、细胞因子诱导法、共培养诱导法以及转基因诱导法等。 1.1化学试剂诱导法 维甲酸（retinoic acid，RA）是体内维生素A的代谢中间产物，主要影响骨的生长和促进上皮细胞增生、分化、角质溶解等代谢作用。Schuldiner等[3]用一定浓度的RA（10-6M）诱导人ES细胞向神经细胞分化。实验证实：产生的神经细胞比未用RA处理的对照组增加了22%。目前，RA诱导ES细胞分化为神经细胞的机制还没有完全弄清楚。一般认为RA进入细胞后，最先与细胞质中维甲酸结合蛋白(cellular RA binding protein，CRABP)形成复合物，然后复合物进入细胞核内，与染色质上的受体结合，从而调控一系列基因的表达，使细胞的表型发生转变。二甲基亚砜（DMSO）是一种含硫的有机化合物，不仅能用于细胞的常规冻存，而且还是一种常用的细胞分化诱导剂，能够诱导ES细胞分化为骨骼肌细胞、心肌细胞等，其作用机制主要是影响c-myc基因表达，降低细胞的内源性聚腺苷二磷酸核苷表达水平。也有研究证明，DMSO能使细胞内储存的钙释放出来，而细胞内钙离子浓度升高在诱导细胞分化中可能起着重要作用。除了RA、DMSO外，还有β-磷酸甘油、维生素C(VC)、地塞米松、维生素K3(VK3)以及2，5-羟基维生素D3等化学试剂，也能诱导ES细胞定向分化为特定类型细

干细胞向生殖细胞诱导分化的调控机理及应用性研究

一、研究内容 本项目将以胚胎干细胞及诱导多能干细胞（iPS）为技术平台，研究哺乳动物干细胞向生殖细胞分化以及生殖细胞减数分裂的调控网络和机理，并建立研究生殖细胞分化所需的生物技术平台及多种细胞及小鼠模型，从而提高干细胞向生殖细胞诱导分化的效率，为大型经济动物优质培育奠定基础。 （1）利用蛋白质组学，BiFC组学, 信息学研究平台，建立以PGC关键调控元为中心的信号调控网络，筛选控制PGC基因表达的关键因子，并阐述端粒蛋白以及端粒酶在干细胞向PGC诱导分化过程中的作用机理。同时利用表观遗传学研究技术，分析PGC诱导过程中组蛋白修饰的动态过程和不同修饰与PGC发育之间的相互关系。探讨以上关键信号调控网络、关键因子在诱导牛干细胞向生殖细胞分化过程中的调控机理。 (2) 利用基因组学、蛋白质组学研究技术，系统地分析精原干细胞和胚胎干细胞的特异性差异。阐明雄性生殖细胞中诱导减数分裂的分子机制，建立干细胞体外诱导分化雄性生殖细胞的理论体系，并分析体外生成生殖细胞的生物学功能。 (3)以人及小鼠胚胎干细胞体外分化系统为模型，优化PGC特化的条件，并通过转基因及基因敲除的方法，探索关键转录因子及信号网络在PGC形成过程中的功能及调控机理。 (4)建立较为完善的牛ES细胞体外培养体系，探讨牛干细胞自我更新和分化途径。通过转基因技术、选择合适的生长因子、转录因子和培养体系诱导牛ES细胞分化为雄性生殖细胞，并建立相应的技术平台。

二、预期目标 总体目标 本项目以研究诱导分化技术、蛋白调控网络、减数分裂机理及农业经济动物培育为主线，紧密围绕以上3个拟解决的关键科学问题。在建立的多种技术平台的基础上，确立以PGC关键调控元为中心的信号调控网络，筛选控制PGC 基因表达的关键因子。系统地分析精原干细胞与胚胎干细胞之间特异性差异，阐明雄性生殖细胞中诱导减数分裂的分子机制。同时，建立体外诱导培养功能性生殖细胞的技术体系，以小鼠为主要研究对象，尝试应用干细胞诱导产生的生殖细胞来培育优化动物，最终确立我国在这一极富竞争性的前沿探索领域的领先地位。 五年预期目标 1，发展基于干细胞学和生殖细胞学研究的一整套方法和综合技术平台。 2，建立以PGC关键调控元为中心的较为完整的信号调控网络，筛选出控制PGC 基因表达的几个关键因子。 3，明确端粒蛋白以及端粒酶在干细胞向PGC诱导过程中的作用机理，并揭示组蛋白修饰的动态过程和不同修饰与PGC发育之间的相互关系。 4，明确精原干细胞和胚胎干细胞之间的基因表达差异，确定3-6个差异表达基因。5，阐明雄性生殖细胞中诱导减数分裂的分子机制。 6，建立一整套诱导PGC生成的培养体系。 7，建立1-3个体外培养生长状况良好、表达干细胞标记的牛ES细胞系，初步阐明牛干细胞自我更新和分化的可能途径。 8，力争建立牛ES细胞体外诱导分化形成功能性配子（精子、卵子）的技术体

干细胞的诱导分化方法及各类诱导试剂的配置

干细胞诱导分化的方法及各类诱导试剂的配置 YAO Xiang 由于易分离获得、免疫原性低且具有多向诱导分化潜能，骨髓基质干细胞（Bone marrow stroma stem cells，MSCs）成为了组织工程与再生医学中理想的种子细胞。正是由于上述原因，骨髓基质干细胞成为了很多研究者关注并使用的模型细胞。本文将着重于骨髓基质干细胞的成骨诱导分化、成软骨诱导分化和成脂诱导分化三个方向加以介绍，相关内容有利于实验研究者快速而有效地配制上述各类诱导分化试剂，进而极大缩短前期探索实验和文献搜索整合所耗费的大量时间。本文主要内容涵盖： 1.成骨诱导分化中诱导液的添加方案（包含换液周期及诱导试剂浓度） 2.成骨诱导分化中各类诱导试剂的产品信息及母液配置方案 3.成脂诱导分化中诱导液的添加方案（包含换液周期及诱导试剂浓度） 4.成脂诱导分化中各类诱导试剂的产品信息及母液配置方案 5.成骨与成脂共诱导液的添加方案（包含换液周期及诱导试剂浓度） 6.成骨与成脂共诱导试剂的产品信息及母液配置方案 7.成软骨诱导分化中诱导液的添加方案（包含换液周期及诱导试剂浓 度） 8.成软骨诱导分化中各类诱导试剂的产品信息及母液配置方案 注：下述诱导方案经多次实验验证是行之有效的，笔者利用相关方案参与发表的部分参考文献如下： 1. Yao X, Peng R, Ding JD*. Cell-material interactions revealed via material techniques of surface patterning. Advanced Materials, 2013;25:5257-86. (材料领域TOP期刊) 2. Yao X, Hu YW, Cao B, Peng R, Ding JD*. Effects of surface molecular chirality on adhesion and differentiation of stem cells. Biomaterials, 2013;34:9001-9. (生物材料领域TOP期刊) 3. Yao X, Peng R, Ding JD*. Effects of aspect ratios of stem cells on lineage commitments with and without induction media. Biomaterials, 2013;34:930-9. 4. Peng R, Yao X, Cao B, Tang J, Ding JD*. The effect of culture conditions on the adipogenic and osteogenic inductions of mesenchymal stem cells on micropatterned surfaces. Biomaterials, 2012;33:6008-19. (IF:8.39)

干细胞定向分化

影响胚胎干细胞定向分化的因子包括转录因子、细 胞因子以及化学诱导剂的体外诱导，同时也包括通过共 培养和表观遗传修饰进行的诱导[27]。这其中对于细胞因子领域研究较多。最新研究表明，Jumonji能够通过调节Polycomb抑制复合物2(PRC2)的功能，从而维持胚胎干细 胞自我更新和分化间的平衡，一旦Jumonji缺失，便会抑 制胚胎干细胞的分化[28,29]。而对于PRC对胚胎干细胞分化的调节机制，研究人员发现PRC复合体的重要成分Ezh2是 通过抑制Ink4A-Ink4B位点，从而调节细胞的分化率[30]。此外，还有研究发现，Chd1基因能够通过控制核染色质 的开放从而调节胚胎干细胞的分化[31]。美国、加拿大和英国的科研 人员在2008年发现了一种“干细胞自我维持稳态”，这 种理论与现行的主流观点相反，认为胚胎干细胞的增殖 和多能性并不依赖于外界刺激，而是自身固有一套自我 更新和分化的程序[32] 目前，大部分关于胚胎干细胞的研究均以小鼠作为 研究对象，因此，对于胚胎干细胞定向分化的研究所得 到的有效诱导因子大部分是针对小鼠的。然而，研究发现，用于诱导小鼠胚胎干细胞定向分化的因子对于诱导 人类胚胎干细胞向特定细胞的分化并不是都有效，比如 在人类胚胎干细胞中，苯丙酸诺龙(activin-A)和转化生长

因子(transforming growth factor，TGF)只能诱导中胚层的 形成，视黄酸(retinoic acid，RA)、表皮生长因子(epidermal growth factor，EGF)、骨形成蛋白4(bone morphogenetic protein，BMP-4)和碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor，bFGF)促使细胞向外胚层和中胚 层分化，然而神经生长因子(nerve growth factor，NGF)和肝细胞生长因子(hepatocyte growth factor，HGF)促使人类 ESC向三个胚层的细胞分化，BMP-4还能诱导人类ESC发 育为滋养层的细胞[33] 间充质干细胞最初是从骨髓中分离获得，随着研究 的不断深入，目前从脂肪组织、骨外膜、滑膜、骨骼 肌、表皮、血液、骨小梁、人脐带、肺、牙髓、牙周膜 等组织中均能够分离获得间充质干细胞。骨髓间充质干 细胞具备易于分离、培养、扩增和纯化，多次传代扩增 后仍具有干细胞特性，不存在免疫排斥，体外基因转染 率高并能稳定高效表达外源基因等优点，因此骨髓间充 质干细胞成为近年干细胞研究的热点。 自从2001年首次成功分离脂肪来源间充质干细胞以 来，由于其不仅与骨髓间充质干细胞的生物学特性相