多靶点pCRISPR载体
CRISPR-derived genome editing technology
A pYLCRISPR/Cas9-MT(II) vector system for targeting m μl tiple
gene sites of dicot plants
华南农业大学 刘耀光实验室
1. CRISPR-Cas9核酸酶切靶序列原理图示：
2 相关载体图谱
2.1 CRISPR —gRNA vector ：
注：用载体骨架隔开U6启动子和gRNA 区，可以避免没有被BsaI 切断的空载分子被PCR 扩增，见后面说明
5’ NNNNNNNNNNNN GNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
Target Site
NGG PAM
NNNNNNNNNNNN-3’3’ NNNNNNNNNNNN
NCC NNNNNNNNNNNN-5’NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
5’-G/A
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN GUUUUAGAGCUAG
A A
CGAUA
GAA
AACUAUUGCCUGAUCGGAAUAAAAUU Cas9 nuclease
Cleavage site
genome sequence
gRNA RuvC-like domain HNH domain
CUUGAAAAAGUGGCACCGA G
CGUGGCU UUUUU-3’
Bsa I 酶切方式:
ggtctc NNNNNNN-33-ccagag NNNNNNN
PAtU6=Arabidopsis U6 promoter
（基于pEasy-Blunt 载体）
gagacc NNNNNN------------NNNNN ggtctc Transcription
Bsa I
Bsa I
pEasy-Blunt 载体骨架
2.2 CRISPR 双元载体 (双子叶植物用，也可用于单子叶植物，但pYLCRISPR/Cas9-MT(I)更合适单子叶植物)
3. 基因组靶位点选择和双链接头设计
3.1 靶位点选择
（1）在目标区如果能够找到NGG 上游第20碱基是A （用U3启动子）或G(用U6启动子）的序列（ (U3或U6启动子转录起始碱基），优先选为靶序列
合成接头的形式（U3启动子右上，U6a 启动子右下） 注意：接头的2个粘性末端不互补
(2) 如果在NGG 上游第20碱基不是A 或G ，可选20碱基为靶序列（Kabin Xie and Yinong Yang ， 2013， Molecular Plant)
合成接头的形式（U6a 启动子）
为了提高突变效率，对一个目的基因设计多个靶点。建议在ORF 5’区和中部区域各设计1个靶点，使之任何1个靶点的突变都可以产生功能缺失，或2个靶点之间的序列被敲除。
5-NNNNNNNNN A NNNNNNNNNNNNNNNNNNN NGG 靶位点
G 4碱基酶切位点，有利于检测打靶效果
5-ggc A NNNNNNNNNNNNNNNNNNN -3’
3-NNNNNNNNNNNNNNNNNNN CAAA-5’
19nt
正向接头引物
反向互补接头引物
5-gcc G NNNNNNNNNNNNNNNNNNN -3’
3-NNNNNNNNNNNNNNNNNNN CAAA-5’
19nt
5-gcc G NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN -3
3-NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN CAAA-5
20nt
5-NNNNNNNNN NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN NGG NNNNNNNNN-3
PAM
20nt
Not I
Bsa I Bsa 5’-ct GCCG a GAGACC ccdB GGTCTC A GTTT TA-3’
B1
BL’大肠杆菌致死基因
几个靶位点设计例：
左图：切点在起始密码附近或尽量在ORF 上游，或在特定的功能域 (可能引起密码子缺失和移码)
右图：切点在外显子末端或前端（可能引起移码，或内含子识别位点缺失使内含子不被剪切）
特异性检查：虽然对植物基因打靶的特异性不是重要的问题（万一有负面作用的脱靶发生，与原受体亲本杂交就可排除），但应该将候选靶序列+NGG （5’端加几十碱基）对目标基因组做Blast ，避免在靶序列3’端+NGG 与其它功能基因有高相似性。但是打算用一个靶序列敲除2个或以上的同源基因时，就选择几个目标基因完全相同的区域为靶位点。
3.2 靶位点接头设计例
4. 多靶点pYLCRISPR/cas9-MT(II)载体构建
4.1 gRNA 表达盒构建示意图（三靶点为例）
GG -3
起始密码PAM
G T ATGATAATGCAGTATGGTTA-3
内含子
外显子
3’
3’-5’
ggc A aggatgggggcacttacca tcctacccccgtgaatggt caaa -5’-3’
5’-3’-For U3-gRNA
gcc G aggatgggggcacttacca tcctacccccgtgaatggt caaa -5’-3’
5’-3’--For U6a-gRNA gtt G aggatgggggcacttacca tcctacccccgtgaatggt caaa -5’-3’
5’-3’--For U6b-gRNA
tca G aggatgggggcacttacca tcctacccccgtgaatggt caaa -5’
-3’
5’-3’--For U6c-gRNA
Note: stick ends B1’ and BL are complementary to the B1 and BL’ ends in pYLCRISPR/Cas9-MT (I)vector, respectively.
为了提高接头连接效率，使用较高的接头浓度（0.05-0.1 μM ），这样主要是产生线性连接，而环状连接较少。但2种方式在随后的PCR 中，都是通过上游片段正链和下游片段负链通过接头序列配对延伸而产生完整的目标片段
4.2 gRNA 表达盒扩增引物 For T1：
Ugccg-B1’: AT AAATT ggtctc a gccg TGGAATCGGCAGCAAAGG-3 （U6启动子上游引物） gRctga-B2: AT AATTT ggtctc t tcag CCATCCACTCCAAGCTC-3 (gRNA 引物) For T2:
Uctga-B2’: AT AAATT ggtctc a ctga TGGAATCGGCAGCAAAGG-3 gRaaga-B3: ATAATTT ggtctc t tctt CCATCCACTCCAAGCTC-3 For T3:
Uaaga-B3’: AT AAATT ggtctc a aaga TGGAATCGGCAGCAAAGG-3 gRgact-B4: ATAATTT ggtctc t agtc CCATCCACTCCAAGCTC-3 For T4:
Ugact-B4’: AT AAATT ggtctc a gact TGGAATCGGCAGCAAAGG-3 gRgttt-BL: AT AATTT ggtctc t aaac CCATCCACTCCAAGCTC-3
4.3 靶标gRNA 表达盒排列
目前只有1个U6启动子，该启动子在双元载体的多次重复排列可能在农杆菌发生重组变异。建议目前版本构建最多3-4个靶点。我们正在克隆更多的拟南芥U3/U6启动子，以方便做更多靶点的稳定载体.
引物使用方法
1个靶点：用引物对B1’/BL 扩增相应的pU-T1-gRNA
线性连接
PCR 扩增
U6
2个靶点：用引物对B1’/B2, B2’/BL 扩增相应的pU-T1-gRNA, pU-T2-gRNA;
3个靶点：用引物对B1’/B2, B2’/B3, B3’/BL 扩增相应的pU-T1-gRNA, pU-T2-gRNA, pU-T3-gRNA; 4个靶点：用引物对B1’/B2, B2’/B3, B3’/B4, B4’/BL 扩增相应的pU-T1-gRNA, pU-T2-gRNA, pU-T3-gRNA, pU-T4-gRNA
4.4 靶标gRNA 表达盒与pYLCRISPR/cas9-MT(II)的连接示意图
5 多靶点载体构建详细操作方法：
1.
接头合成：为了避免双链接头含有不完全长度分子。将接头引物TE 溶解成100 μM 母液，各取1μl 加入到98μl 0.5x TE 混合稀释到1 μM 。约90℃ 30 S ，移至室温冷却完成退火。
2.
gRNA 载体酶切：取pU3-gRNA 和pU6a~c-gRNA 质粒各~500 ng ，在20μl 反应用~0.25 μl （5 U)Bsa I （NEB 公司）酶切20 min （不要过度酶切，过度酶切可能产生平滑末端和质粒自连接，而未切断质粒不影响后续反应），冷冻保存公用。
3.
gRNA 表达盒连接反应：酶切过的pU6载体与所对应接头连接反应：
1 μl 10x T4 buffer ；
1 μl (~25 ng) pU3-gRNA （pU6a~c-gRNA ）载体； 0.5-1.0 μl 接头（最终浓度0.1-05 μM) 约35-70 U T4 DNA ligase (0.1-0.
2 μl ) 加 ddH 2O 至 10μl
室温连接约10-20 min （延长连接时间不会明显提高效率） 4.
PCR 扩增： 取1-2 μl 连接产物为模板，25-50 μl PCR (所有靶点的反应合计约100 μl )
按第9页选择引物对(0.2 μM) KOD （或其它高保真酶） 95 ℃ 1 min
(BL’)
U6
gRNA Target-1
(B1’)(B2)U6
gRNA Target-2
(B2’)(B3)
U6
gRNA Target-3(B3’)
Last BsaI site
10 循环：95 ℃ 15s，58 ℃ 15s ，68 ℃ 15 s（过长时间会使未切断的载体被扩增）
15-20 循环：95 ℃ 15s，68 ℃ 15 s
5μl电泳检查
5.把所有要连接的U3-靶点-gDNA和U6a~c-靶点-gDNA PCR产物混合(最好直接加入0.5μl核酸酶（ExoI,
Takara)消化单链引物），酚抽提-乙醇沉淀或PCR产物纯化kit纯化。
6.所有产物在100μl反应用20 U Bsa I 37 ℃酶切30 min，75 ℃ 3 min（使切出的12 bp末端小片段变性，
以减少连接竞争）。酚抽提乙醇沉淀或过柱纯化。（如果必要，取约100ng产物做连接，电泳检查是否能连成多聚体）
7.取约2-3 μg pYLCRISPR/Cas9-MT(II), 在50 μl（20U Bsa I）酶切30 min, 用低熔点胶电泳回收酶切
的质粒片段（去除ccdB片段）。用0.5x TE洗回收胶30分钟，65 ℃ 3 min熔解，在40 ℃加入Agarase （1U/100μl)处理30分钟后，分装成每管50-80ng冷冻保存公用（一管做一次连接，以避免多次冻融）。
8.在切好分装的pYLCRISPR/Cas9-MT(II) (约50-80ng）管中，加入相当于每种靶点PCR产物约10-15 ng(如
2种，共20-30ng，3种共约40-50 ng，4种共约60-70 ng, 更多种时适当增加；这样载体与每种插入片段摩尔比=1: 5-8) ，在10 μl连接反应（~70 U连接酶）20度连接2-3h。透析30 min-1 h后，电激转化DH10B（电激电压1500-1600V/μl）。注意：涂板培养的ccdB表达基中要加入IPTG至0.5 mM（LacIq 基因型菌种用1.0 mM)，诱导没有切除ccdB的空载质粒转化子的ccdB表达致死。
9.阳性克隆检测：用第一个靶点接头的反向引物（第6页）和U6上游引物配对，用菌落PCR筛选阳
性克隆(产物长度约340bp) 。提取质粒，取约5ng质粒为模板再用所有靶点接头反向引物和U6上游引物配对进行PCR确认（pYLCRISPR/Cas9-MT(II)空载体为对照，确认空载体不能扩出相同长度产物）；
并用AscI切出串联的U6-gRNA表达盒片段（pYLCRISPR/Cas9-MT(II)空载体为对照）(1个表达盒约420bp )。一般不需要测序检测。如果要测序，用第9页的扩增引物从阳性克隆扩出表达盒片段（1个靶点），用U6上游引物测序。当2个靶点或以上，就只能将扩增产物克隆，再用靶点接头反向引物和相应的U6上游引物进行PCR，选出相应靶点的克隆进行测序。
10.在农杆菌的稳定性检测：获得的克隆转化农杆菌，从农杆菌提取质粒，取约5ng质粒为模板再用所有
靶点接头反向引物和U3/U6上游引物配对进行PCR确认。
11.打靶效果检测：打靶成功往往在靶点缺失若干碱基。以靶点切点为中心，在两侧各离开约20-30 bp处
合成引物（PCR产物约80-100 bp)，扩增T0转化体gDNA(和野生型对照），PAGE电泳。如果转化体产生一些小条带（对照没有这些小条带），表明打靶可能成功了。可将小条带回收，再扩增和克隆到T-载体测序。如果靶点切点处有酶切位点，可酶切gDNA消除野生型背景后再扩增。为了减少测序费用，可在其中一条引物的5’端加入Hin dIII位点，将PCR产物Hin dIII切后，就可以反向双体形式连接到T-载体。这样测序1个克隆可以获得2个片段序列。
HindIII酶切，
连接到T-载体A
A
T
T
HindIII
附加序列信息：
pAtU6-gRNA ：
ACTAGT GATAT GGTCTC A GTTT TAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGT TATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGAGTCGGTGCTTTTTTT C
AAGAGCTTGGAGTGGATGGAATTTTCCTCCGTTTTACCTG TGGAATCGGCAGCAAAGG A GAAATCTCAAAATTCCGGCAG AACAATTTTGAATCTCGATCCGTAGAAACGAGACGGTCA TTGTTTTAGTTCCACCACGATTATATTTGAAATTTACGTGAGTGTGAGTGAGACTTGCATA AGAAAATAAAATCTTTAGTTGGGAAAAAATTCAATAATATAAATGGGCTTGAGAAGGAAGC GAGGGATAGGCCTTTTTCTAAAATAGGCCCATTTAAGCTATTAACAATCTTCAAAAGTACC ACAGCGCTTAGGTAAAGAAAGCAGCTGAGTTTATATATGGTTAGAGACGAAGTAGTG ATTG A GAGACC TCTGAAGATAACAT ACTAGT
Bsa I Bsa I
SpeI SpeI U6 上游引物序列gRNA
gRNA 引物
PCR 扩增的AtU6-gRNA 单元序列：
AAATT ggtctc a NNNN TGGAATCGGCAGCAAAGG AGAAATCTCAAAATTCCGGCAG AACAATTTTGA ATCTCGATCCGTAGAAACGAGACGGTCATTGTTTTAGTTCCACCACGATTATATTTGAAATTTACGTG AGTGTGAGTGAGACTTGCATAAGAAAATAAAATCTTTAGTTGGGAAAAAATTCAATAATATAAATGGG CTTGAGAAGGAAGCGAGGGATAGGCCTTTTTCTAAAATAGGCCCATTTAAGCTATTAACAATCTTCAA AAGTACCACAGCGCTTAGGTAAAGAAAGCAGCTGAGTTTATATATGGTTAGAGACGAAGTAGTG ATTG (19-20碱基靶序列）
GTTT TAGAGCTAGAAATAGCAAGTTAAAATAAGGCTAGTCCGTTATCAACTTGAAAAAGTGGCACCGA
GTCGGTGCTTTTTTT C AA GAGCTTGGAGTGGATGG NNNN a gagacc AAATT
Background of the CRISPR system：
1. The original funtion of CRISPR:
名词解释：
crRNA: CRISPR RNA；tracrRNA: trans-activating CRISPR RNA；PAM : protospacer adjacent motif；
2. Cas9 can be guided by single chimeric RNA(gRNA):
抗肿瘤药物靶向纳米载体的构建及应用研究
抗肿瘤药物靶向纳米载体的构建及应用研究根据肿瘤环境的生理特征,人为构筑具有特定结构与功能的纳米尺度药物载体,使之对肿瘤组织具有特异性靶向、影像诊断并实现多种治疗功能,将成为癌症高效诊断与治疗的关键。将空心-介孔纳米载体的高比表面积以及选择透过性与超顺磁氧化铁纳米颗粒（IONPs）的生物相容性以及多种在体诊断-治疗模式相结合,发展肿瘤的多模态分子影像诊断以及联合治疗策略,将为纳米技术应用于癌症的临床个体化诊疗提供重要的科学依据与方法参考。 本研究主要在新型超顺磁空心-介孔纳米结构的制备方法,及其作为多功能药物载体在肿瘤成像以及光热-化学联合治疗方面开展了相关工作:一、设计合成了具有内部空腔及介孔外壳的二氧化硅纳米管（SNT）;以该结构为模板,发展了Fe3O4的高温热分解原位合成方法,获得了 SNT@Fe3O4功能复合载体;该超顺磁纳米管具备良好的阿霉素负载及pH响应释放性能、较大的饱和磁化强度以及磁共振成像（MRI）性能;在其表面包裹透明质酸后,可特异性靶向过表达CD44的肿瘤细胞（如小鼠4T1乳腺癌细胞）;静脉注射入小鼠后,药物载体可在受体靶向及磁场靶向共同作用下,显著提高在肿瘤组织内的富集,并实现肿瘤的MRI诊断及化学治疗。二、发展了以功能化氧化硅模板以及氧化铁修饰层原位沉积制备“蛋黄-蛋壳”型多功能药物载体的新策略。 利用氧化铁外壳的介孔特性,实现了对所负载化疗药物的酸响应释放,确保了药物在递送过程中的微量释放以及在肿瘤组织中的特异性释放,以提高其肿瘤治疗效果;利用金纳米棒的光热转换特性,实现药物的温度响应快速释放,即实现药物的外源刺激控制释放。将该多功能药物载体进行表面改性后,实现了对肿瘤
TALEN靶向基因操作技术
TALEN靶向基因操作技术 技术介绍： TALE 技术（Transcription activator–like effectors）是一种崭新的分子生物学工具。科学家发现，来自植物细菌Xanthomonassp.的TAL蛋白的核酸结合域的氨基酸序列与其靶位点的核酸序列有恒定的对应关系。利用TAL的序列模块，可组装成特异结合任意DNA序列的模块化蛋白，从而达到靶向操作内源性基因的目的。目前TALE技术主要有两种应用： 1）TALEN（transcription activator-like (TAL) effector nucleases）技术构建针对任意特定核酸靶序列的重组核酸酶，在特异的位点打断目标基因DNA，进而在该位点进行DNA操作，如Knock-out、Knock-in或点突变。它克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的活性，使基因操作变得更加简单、方便。 2）TALEA（transcription activator-like (TAL) effector activator）技术，针对基因启动子上游任意特定DNA序列构建转录激活因子，可提高特异内源基因的表达水平，而不需要购买或克隆 cDNA。 TALE技术已经成功应用到了细胞、植物、酵母、斑马鱼及大、小鼠等各类研究对象，日益成为功能强大的实验室工具，使得过去无法逾越的项目成为可能。 技术特点： 1.无基因序列、细胞、物种限制。
2.TAL的核酸识别单元与A、G、C、T有恒定的对应关系。实验设计简单准确、实验周期短、成本低。 3.成功率几乎可达100%。 4.毒性低、脱靶情况少。 5.克服了常规的ZFN方法不能识别任意目标基因序列，以及识别序列经常受上下游序列影响等问题，而具有ZFN相等或更好的活性。 TALE构建与应用： 1.TALE靶点识别模块构建 TAL的核酸识别单位为重复34个恒定氨基酸序列，其中的12、13位点双连氨基酸与A、G、C、T有恒定的对应关系，即NG识别T，HD识别C，NI识别A，NN识别G。为获得识别某一特定核酸序列的TALE，只须按照DNA序列将相应TAL 单元串联克隆即可。由于物种基因组大小的不同，选择的特异序列长度也不同，对于哺乳类动物包括人类，一般选取16-20bp的DNA序列作为识别靶点。 2.TALEN的基因敲除 将识别特异DNA序列的TALE与内切核酸酶FokI偶联,可构建成剪切特异DNA序列的内切酶TALEN。而且FokI需形成2聚体方能发挥活性，大大减少了随意剪切的几率。在实际操作中，需在目标基因的编码区或外显子和内显子的交界
去唾液酸糖蛋白受体介导的肝靶向药物载体研究
史上最快最全的网络文档批量下载批量上传，尽在：https://www.wendangku.net/doc/dc10288258.html,/item.htm?id=9176907081 去唾液酸糖蛋白受体介导的肝靶向药物载体研究 马臻, 王尊元，沈正荣* （浙江省医学科学院浙江杭州310013） 摘要：目的综述去唾液酸糖蛋白受体介导的肝靶向药物载体的研究进展。方法查阅国内外近年的相关文献资料进行分析与综述。结果去唾液酸糖蛋白受体介导的肝靶向性具有独特的优势，虽然还处于起步阶段，存在一些实际应用方面的问题，但随着研究的深入，这些问题正在或将被认识和解决。结论去唾液酸糖蛋白受体介导的肝靶向研究开辟了新的道路，具有广阔的应用前景。 关键词：去唾液酸糖蛋白受体ASGP-R 受体介导肝靶向药物载体 去唾液酸糖蛋白受体（asialoglycoprotein receptor, 简称ASGP-R）是数量丰富的一种异源低聚物的内吞受体，主要存在于肝脏实质细胞，具有对糖的特异性[1,2]。由于各种糖蛋白在用酶水解或用酸解除去末端唾液酸后，暴露出的次末端是半乳糖残基，所以ASGP-R的糖结合特异性实际上在于半乳糖基，故又称半乳糖特异性受体。利用ASGP-R的这一特性可以将一些外源的功能性物质经过半乳糖等“靶头”修饰后，定向地转入到肝细胞中发挥作用。因而ASGP-R在基因定向转移、靶向药物、临床检测等方面具有很高的应用价值。本文着重对ASGP-R介导的肝靶向药物的载体进行综述。 1 以去唾液酸胎球蛋白（AF）为载体 胎球蛋白是胎牛血清中的一种糖蛋白，去掉唾液酸后，暴露出半乳糖基，可被肝实质细胞膜上的ASGP-R识别并被摄取[3]，是ASGP-R的天然配体。AF可用做蛋白质、脂质体的肝靶向载体，也可与抗疟药伯氨喹、抗病毒药阿糖腺苷 基金项目：浙江省自然科学基金Y207790；浙江省科技厅科技创新人才计划2006R20004 作者简介：马臻，女，硕士，副研究员Tel：(0571)88215626 Email：mazhen69@https://www.wendangku.net/doc/dc10288258.html, 通讯作者：沈正荣，男，研究员Tel：(0571)88215506 Email：shenzr601@163. com
以适体作为药物靶向载体的研究进展
中国医药生物技术 2010年8月第5卷第4期Chin Med Biotechnol, August 2010, V ol. 5, No. 4 297 DOI:10.3969/cmba.j.issn.1673-713X.2010.04.013 · 综述·以适体作为药物“靶向载体”的研究进展 杨传旭，葛志强 药物的靶向给药已成为近年来药物输送系统领域研究的热点。药物的靶向可分为被动靶向和主动靶向，被动靶向是指依靠药物自身的设计或所制备的药物载体的粒径、形状等因素减少与非靶细胞、组织及器官的非特异性相互作用来增加靶部位/非靶部位的药物水平比率。而主动靶向是指利用抗原-抗体结合或配体-配基结合等生物特异性相互作用来实现药物的靶向传递，目前可作为主动靶向的配体或“靶向载体”的主要是抗体、多肽、叶酸、多糖。而近几年国外以核酸适体（aptamer）（包括 DNA 或 RNA）作药物主动靶向给药载体的研究日益受到研究人员的关注，已成为主动靶向给药系统研究领域的新课题。核酸适体是一段寡聚的单链 DNA 或 RNA，一般由20 ~ 80 个碱基构成，分子量介于 6 ~ 25 kD，能折叠成特殊的三维结构，特异性地识别并结合蛋白质、糖类、核苷酸等分子[1]。大量研究结果表明，通过设计核酸适体与药物的结合体，能够实现药物或药物载体的靶向传递，提高药物疗效并减轻不良反应，为主动靶向给药系统的开发提供了新的方向。本文就以适体作为药物靶向载体的研究进展做一简要综述。 1 核酸适体作为“靶向载体”的优势 选择一种具有高特异性与亲和性的“靶向载体”一直是制约主动靶向给药系统研究的瓶颈。虽然抗体、多肽和叶酸等分子已有作为药物靶向载体研究成功的报道，但这些化合物应用均存在着目前难以克服的缺陷。例如，单克隆抗体由于潜在的免疫原性（immunogenicity）和制备的困难大大限制了其临床的应用和产业化的进程[2]；叶酸等虽然易于制备，但要求病变组织细胞具有足够多的叶酸受体，而且由于正常组织细胞也存在叶酸受体，导致其靶向作用并不理想[3-4]，而核酸适体却具有以下优点： ⑴核酸适体与靶细胞结合的特异性和单克隆受体相似，甚至更高。核酸适体识别并结合靶点的机制在于其折叠为特定三维结构，暴露出活性位点与受体发生特异性作用。特别是通过近期发展起来的全细胞配体系统进化的指数富集（systematic evolution of ligands by exponential enrichment，SELEX）筛选技术[5]、细胞表面靶点 SELEX 技术[6]和单株SELEX 筛选技术[7]得到的适体对受体具有高度的特异结合能力。 ⑵核酸适体没有明显的免疫原性[8]。适体介导的靶向药物注入人体内不会引发免疫反应，因此，在医药应用领域比单克隆抗体更加安全可靠。 ⑶核酸适体分子体积较小，比单克隆抗体更易穿透组织和器官。同时，当核酸适体连接到药物载体表面时，系统的体积不会有很大地增加，使药物载体体积更容易控制。 ⑷核酸适体容易进行各种化学修饰扩展其应用范围，例如通过放射性标记、荧光素、生物素的修饰用于监测和识别肿瘤细胞[9]。 ⑸核酸适体的制备方便，且比单克隆抗体有更高的稳定性，可以在许多缓冲溶液中保存，所以在生产、储存和运输当中有很大的优势[10]。 ⑹核酸适体结构的多样性导致其具有广泛的受体范围，从小分子到蛋白质，甚至到细胞[11-13]。正由于其受体广泛的特性，适体可以作为多种疾病的寻靶“引导子”。 2 核酸适体在靶向制剂中的应用 2.1 适体-药物结合体 药物的靶向性和活性的保持，是靶向药物成功设计和制备必须考虑的因素。现行的设计方案多是将药物与配体通过共价键或非共价键相连接成为复合体。为使两者能连接，通常要先对药物或配体进行适当的化学修饰，而修饰的结果往往会影响药物的安全性和有效性。所以，理想的方法是提出一种可以不需要对两者进行化学修饰的制备策略。 适体是单链的 DNA 或者 RNA，可以特异地并高亲和性地与小分子、肽段、蛋白质、寡聚核苷酸相结合，因此可不经过化学修饰与药物分子稳定结合，在保持药物活性的同时对受体蛋白具有特定靶向作用。Bagalkot 等[13]将多柔比星扁平的芳香环与核酸适体 A10 三维构象中的短链结构通过非共价作用连接，成功制备了适体-多柔比星结合物，此结合物的解离常数K d = 600 nM，具有很高的稳定性。该试验采用的适体 A10 能特异性靶向结合前列腺癌变细胞表面抗原（PSMA）。荧光光谱法测试表明，该适体-多柔比星结合物对 LNCaP（PSMA+）细胞具有高度的特异靶向作用。同样，核酸适体也可在蛋白药物的靶向输送上起到较好的作用。如分子量为 2.8 × 104 的细胞毒蛋白 gelonin 可通过破坏 rRNA 的糖苷键阻断蛋白质的合成，从而有效杀死肿瘤细胞。但 gelonin 本身缺少介导其转移的肽区，所以不能有效进入细胞中，因此阻碍了其应用开发。Chu 等[14]将gelonin 与 anti-PSMA 适体连接，发现其对 PSMA 阳性的LNCaP 细胞的毒性比 PSMA 阴性的 PC3 细胞大 600 多倍，且适体-gelonin 结合体的细胞毒性是单用 gelonin 的 作者单位：300072 天津大学化工学院制药工程系系统生物工程教育部重点实验室 通讯作者：葛志强，Email：gezhiq@https://www.wendangku.net/doc/dc10288258.html, 收稿日期：2010-04-14
高靶向载体给药系统的的分类及其设计原理
高靶向载体给药系统的的分类及其设计原理 葛蔓，全东琴（军事医学科学院,毒物药物研究所,北京,100850） 摘要：目的：综述近年来靶向给药系统的分类及设计原理。方法：查阅了近几年文献，从不同方面阐述靶向制剂的发展。结论：靶向制剂主要是一种载体制剂，这种载体多采用超微粒物由于体内物理和生理作用能将这些微粒分散体系选择地聚集于肝、脾、淋巴等部位。TDDS 分类目前也有几种不同角度：按载体的形态和类型；按给药途径的不同；按靶向部位的不同；按靶向源动力不同；按靶向性机理不同等。随着靶向给药系统研究的深入，新的靶向给药途径、新的载药方法将会不断出现，遇到的问题会逐步解决． 关键词：靶向给药，分类，特性，设计原理 常规剂型的药物经静脉、口服或局部注射后，药物分布于全身，真正到达治疗靶区的药物量仅为给药量的小部分，而大部分药物在非靶区的分布不仅无治疗作用，还会带来毒副作用．因此，药物新剂型的开发已成为现代药剂学发展的一个方向，其中靶向给药系统(Targeted drug delivery system，TDDS)的研究已经成为药剂学研究热点。TDDS指一类能使药物浓集定位于病变组织、器官、细胞或细胞内的新型给药系统．药物通过局部或全身血液循环而浓集定位于靶组织、靶器官、靶细胞的给药系统。靶向制剂最初指狭义的抗癌制剂，随着研究的逐步深入，研究领域不断拓宽，从给药的途径、靶向的专一性及特效性方面均有突破性的进展，靶向制剂发展成指一切具有靶向性的制剂。靶向制剂具有疗效高、药物用量少．毒副作用小等优点．理想的TDDS应在靶器官或作用部位释药，同时全身摄取很少，这样，既可提高疗效，又可降低药物的毒副作用．TDDS要求药物能到达靶器官、靶细胞，甚至细胞内的结构，并要求有一定浓度的药物停留相当长的时间，以便发挥药效．成功的TDDS应具备3个要素：定位蓄积、控制释药、无毒可生物降解． 靶向制剂与普通制剂和缓控释制剂相比，具有以下特点：①靶向性：药物集中于靶区； ②减少用药剂量；③提高疗效；④减少药物的毒副作用。靶向给药系统按靶向机理可分为生物物理靶向制剂、生物化学靶向制剂、生物免疫靶向制剂及双重、多重靶向制剂；按制剂类型可分类微球、复合型乳剂及脂质体等；按靶区可分为肝靶向制剂、肺靶向制剂、淋巴靶向制剂、骨髓靶向制剂、结肠靶向制剂等，按给药途径可分为口服靶向制剂、注射给药靶向制剂、经皮给药靶向制剂及植入靶向制剂。 1、分类 新的工艺、设备、优秀的载体物质、辅料的诞生及应用，使靶向制剂得以迅速发展，传统的归类方式已无法清晰地分别这些新东西。TDDS分类目前也有几种不同角度：（1）按载体的形态和类型可分为微球剂、毫微球剂、脂质体、包合物、单克隆抗体偶联物等；（2）按给药途径的不同可分为口腔给药系统、直肠给药系统、结肠给药系统、鼻腔给药系统、皮肤给药系统及眼用给药系统等；（3）按靶向部位的不同可分为肝靶向制剂、肺靶向制剂等；（4）按靶向源动力可以分为主动靶向制剂（TDDS主动寻找靶区）、被动靶向制剂（TDDS被动地被选择摄取到靶区）、前体靶向药物。被动靶向制剂是目前研究较多也是最主要的一类靶向制剂。其中最引人注目的是脂质体（liposome）、毫微胶囊（nanocapules）、毫微粒（nanoparticles）、和微球制剂（miro-spheres）。（5）按靶向性机理可以分为生物物理靶向制剂、生物化学靶向制剂、生物免疫靶向制剂和双重、多重靶向制剂等几类。