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正常成熟破骨细胞原代培养

正常成熟破骨细胞原代培养
正常成熟破骨细胞原代培养

正常成熟破骨细胞原代培养

实验材料:

1. 细胞来源:新生大鼠或兔,妊娠6个月以内的引产胎儿等;

2. 清洗液:不含Ca2+和Mg2+的1×,添加100IU/ml青霉素、100μg/ml链霉素,pH7.2;

3. 细胞支持物:薄骨片、盖玻片;

4. 培养液:199培养基、MEM或DMEM培养基均可,须补加15%—20%小牛血清、25mm ol/L HEPES及青霉素100IU/ml、链霉素100μg/ml;

实验方法:

1. 薄骨片的制备:取新鲜牛股骨干的密质部分,沿骨纵轴用骨锯切割成大小约0.5cm×0.5C M、厚为0.1cm的小块,再用金刚砂轮磨成厚约10—50μm(以便在相差显微镜下观察)的薄骨片。使用前用超声波清洗仪超声洗涤3次,每次约10min。然后依次浸泡在3个盛有含青霉素(1000IU/ml)、链霉素(1000μg/ml)、两性霉素B(3μg/ml)的抗生素溶液的小容器中,每次10—20min。最后可浸于盛有含抗生素的培养液的容器内,置4℃(短期)或-2 0℃(较长期)冰箱内保存备用;

2. 取生后3—5d的大鼠,拉颈处死后置于盛有75%酒精的容器中,消毒3—5min后,取出放入培养皿中;

3. 用手术剪剪开其四肢皮肤、肌肉,取股骨和胫骨等长骨,放入盛缓冲液的培养皿中。除去骨表面的软组织、骨膜以及软骨;

4. 将除去骨膜等多余组织后的长骨干部分清洗后,置于盛有少量培养液的培养皿中。用手术刀或手术剪纵行剖开骨干。用手术刀轻刮骨的内表面,同时用尖吸管不断吸取培养皿中的培养液,冲洗骨内表面多次,直至骨内表面变白为止;

5. 用吸管吸打上述含碎骨片及分离细胞的培养液2—5min左右,使附着于碎骨片上的破骨细胞分离脱落于培养液中。静置1—2min后,待碎骨片沉降,收集细胞悬液;

6. 将细胞悬液加入到预置有薄骨片或盖玻片的24孔培养板中,在37℃、5%CO2培养箱中培养;

7. 培养30min左右,取出薄骨片或盖玻片用培养液冲洗以除去未附着的骨髓造血细胞。冲洗后,将薄骨片或盖玻片移入另一培养板中继续培养;

原代细胞的培养与建系

原代细胞的培养与建系(一) 细胞的来源多样,培养方法也各不相同,凡是来源于胚胎、组织器官及外周血,经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。原代细胞经分散接种之手段称为传代。凡能经传代方式进行再次培养的细胞称为传代细胞。若能稳定生长传至10~20代以上的细胞可确立为细胞系。若有条件能开展单细胞克隆、纯化,经大量扩增后所形成的生物学特性稳定的克隆化细胞群,称之为细胞株或克隆细胞。此过程称为细胞的纯化或细胞克隆。这些基本技术是从事细胞培养工作的基础,只有熟悉和掌握了基本技术,才可能更快捷地学习和掌握其他方法,本章重点叙述常用的基本技术。 第一节原代细胞的取材 人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件,是进行细胞培养的第一步,若取材不当,将会直接影响细胞的体外培养,现将取材的基本要求和注意事项叙述如下: 一、取材的基本要求 (1)取材要注意新鲜和保鲜新鲜组织易于培养成功,取材时应尽量在4~6h内能制作成细胞,尽快入箱培养,若不能即时培养,应将组织浸泡于培养液内,于4℃存放。若组织块较大,应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后,切碎于培养液内4℃存放,但时间不能超过24h.对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砜的培养基,按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。 (2)取材应严格无菌所取标本材料应在无菌条件下进行,为了确保无菌,对所取材料若疑有污染的可能,应将所取组织在含高浓度抗菌素(400单位/mL)甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4℃下存放2小时以上,再用PBS洗2~3次,以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液(内含400单位/mL抗菌素)的小瓶等便于携带的物品来取材,所取材料应避免接触有毒有害的化学物质,如碘、汞等。 (3)取材和原代细胞制作时,要用锋利的器械,如手术刀或剃须刀片切碎组织,尽可能减少对细胞的机械损伤。 (4)要仔细去除所取材料上的血液(血块)、脂肪、坏死组织及结缔组织,切碎组织时应避免组织干燥,可在含少量培养液的器皿中进行。 (5)取材应注意组织类型、分化程度、年龄等,一般来讲,胚胎组织较成熟个体组织容易培养,分化低的较分化高的组织容易生长,肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。 (6)原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录,以备以后查询。 二、各类组织的取材技术

原代细胞培养与分离

原代细胞的培养与建系 凡是来源于胚胎、组织器官及外周血,经特殊分离方法制备而来的原初培养的细胞称之为原代细胞。细胞的纯化或细胞克隆技术是细胞培养工作的基础。 原代细胞的取材 人和动物细胞的取材是原代细胞培养成功的首要条件,直接影响细胞的体外培养。 一、取材的基本要求 .1.取材要注意新鲜和保鲜 .2.应严格无菌 .3.防止机械损伤 .4.去除无用组织和避免干燥 .5.应注意组织类型、分化程度、年龄等 .6.作好记录 二、各类组织的取材技术 皮肤和粘膜的取材 内脏和实体瘤的取材 血液细胞的取材 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材 动物组织取材 人胚体组织取材 鸡(鸭)鸟类胚胎组织取材鸡(鸭)鸟类胚胎组织取材 皮肤和粘膜的取材 主要取自于手术过程中的皮片,方法似外科取断层皮片手术操作,但面积一般2~4平方厘

米。 内脏和实体瘤的取材 内脏除消化道外基本是无菌的,但取材时要明确和熟悉所需组织的类型和部位,实体瘤取材时要取肿瘤细胞丰富的区域,要避开破溃、坏死液化部分,以防污染,尽量去除混杂的结缔组织。 血液细胞的取材 血细胞、淋巴细胞的取材,一般多抽取静脉外周血,或从淋巴组织中(如脾、扁桃体、胸腺、淋巴结等)分离细胞,取材时应注意抗凝。 骨髓、羊水、胸/腹水细胞取材 严格无菌,注意抗凝,还要尽快分离培养,离心后,用无钙、镁PBS洗两次,再用培养液洗一次后即可培养,不宜低温存放。 动物组织取材 1、鼠胚组织取材 首先用引颈或气管窒息致死法处死孕期合适的动物,然后将其整个浸泡在含有75%酒精的烧杯中,5分钟后(注意时间不能太长,以避免酒精从口或其他通道进入体内,影响组织活力),取出动物,在消毒过的木板上可用无菌的图钉或大头针固定四肢,切开皮肤,用无菌操作法解剖取胚或用无菌止血钳挟起皮肤、用无菌眼科剪沿躯干中部环形剪开皮肤,用止血钳分别挟住两侧皮肤拉向头尾,把动物反包,暴露躯干,然后再固定,更换无菌解剖器材,采用无菌操作法解剖取出胚胎。 2、幼鼠胚肾(或肺)取材 幼鼠采用上述方法处死消毒后,腹部朝上固定在木板上,先切开游离毛皮并拉开至两侧:然后采用无菌法打开胸腔取肺,或背部朝上固定在木板上,先将背部毛皮切开游离并拉向两侧,

原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项

初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器:培养箱(调整至37℃),培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱(37℃) 材料:动物组织块 试剂:1640培养基(含20%小牛血清),0.25%胰酶,Hank′s液,碘酒 初代消化培养法 1. 准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面,紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局:点燃酒精灯,安装吸管帽。 3. 处理组织:把组织块置于烧杯中,用Hanks液漂洗2~3次,去除血污;如怀疑组织可能污染,可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切:用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块,以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角烧瓶中,结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化:或用恒温水浴,或置于37℃温箱消化均可,消化中每隔20分钟应摇动一次,如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离:在消化过程中见消化液发混浊时,可用吸管吸出少许消化液在镜下观察,如组织已分散成细胞团或单个细胞,立即终止消化,随即通过适宜不锈钢筛,滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 (500~1000转/分)离心消化液5分钟,吸出上清,加入适量含有血清的培养液。 7. 计数:用计数板计数,如细胞悬液细胞密度过大,再补加培养液调整后,分装入培养瓶中。对大多数细胞来说,pH要求在7.2~7.4范围,培养液呈微红色,如颜色偏黄,说明液体变酸,可用NaHCO3调整。 8. 培养:置于36.5℃温箱培养,如用CO2温箱培养,瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞,纱布塞易生霉菌,每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切:把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中,用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污,吸静Hanks液,用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布:用弯头吸管吸取若干小块,置于培养瓶中,用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部,小块相互距离以0.5cm为宜,每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶,另瓶底向上,注意翻瓶时勿另组织小块流动,塞好瓶塞,置36.5℃温箱培养2小时左右(勿超过4小时),使小块微干涸。 4. 培养:从微箱中取出培养瓶,开塞,46度斜持培养瓶,箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许,然后缓缓再把培养瓶翻转过来,让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。

细胞原代培养细胞生物学实验报告

细胞生物学实验报告 细胞原代培养 姓名: 学号: 班级: 专业: 同组成员: 一、实验原理

细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一,可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来,故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的方法: 1、组织块法在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎,每个组织块小于1mm3大小。用Hanks 液洗涤2—3次,自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块贴于培养瓶进行培养。 2、酶消化法将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20-30分钟。然后终止消化。用几层无菌纱布过滤。取过滤液,离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上清,加入带有双抗的培养基,放入培养瓶培养。 取材注意事项: 取材要注意新鲜和保鲜。取材应严格无菌。取材和原代细胞制作时,要用锋利的器械,如手术刀或剃须刀片切碎组织,尽可能减少对细胞的机械损伤。要仔细去除所取材料上的血液(血块)、脂肪、坏死组织及结缔组织,切碎组织时应避免组织干燥,可在含少量培养液的器皿中进行。取材应注意组织类型、分化程度、年龄等,一般来讲,胚胎组织较成熟个体组织容易培养,分化低的较分化高的组织容易生长,肿瘤组织较正常组织容易培养。 二、实验目的 1、理解细胞原代培养原理 2、熟悉细胞原代培养方法与过程 3、了解细胞原代培养的应用 4、独立进行细胞原代培养操作 三、实验材料 手术小直剪刀、眼科直镊子、眼科弯镊子、玻璃平皿、培养瓶、试管、移液管、巴斯德吸管、废液缸、75%酒精棉球、酒精灯。 动物:9-12日龄的鸡胚蛋 四、实验步骤

细胞培养常见问题的原因及其解决的办法

细胞培养常见问题的原因及其解决的办法: 问题1培养液pH值变化太快 可能原因 (1)CO2张力不对 (2)培养瓶盖拧得太紧 (3)NaHCO3缓冲系统缓冲力不足 (4)培养液中盐浓度不正确 (5)细菌、酵母或真菌污染 建议解决方法 (1)按培养液中NaHCO3浓度增加或减少培养箱内CO2浓度,2.0g/L到3.7g/L浓度NaHCO3对应CO2浓度为5%到10%。 (2)松开瓶盖1/4圈。 (3)改用不依赖CO2培养液。加HEPES缓冲液至10到25mM终浓度。 (4)在CO2培养环境中改用基于Earle′s盐配制的培养液,在大气培养环境中培养改用Hanks盐配制的培养液。 (5)丢弃培养物,或用抗生素除菌。 问题2:培养液出现沉淀,但pH值不变 可能原因 (1)洗涤剂清洗后残留有磷酸盐,将培养基成分沉淀下来 (2)冰冻保存培养液 建议解决方法 (1)用去离子水反复冲洗玻璃器皿,然后灭菌。 (2)将培养液加热到37℃,摇动使其溶解如沉淀仍然存在,丢弃培养液。 问题3:培养液出现沉淀,同时pH发生变化 可能原因 细菌或真菌污染 建议解决方法

丢弃培养物,或用抗生素除菌。 问题4:培养细胞不贴壁 可能原因 (1)胰蛋白酶消化过度 (2)支原体污染 (3)培养瓶瓶底不干净 (4)培养液pH值过碱(NaHCO3分解) (5)消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不 细胞老化(如传代前细胞已汇合导致失去贴附性) (7)接种细胞起始浓度太低或太高 建议解决方法 (1)缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。 (2)分离培养物,检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染,丢弃培养物。 (3)注意刷洗,或换用一次性塑料培养瓶 (4)使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2(将培养液敞口放入培养箱也可) (5)重新配置消化液或培养液 启用新的保种细胞 (7)调节最佳接种细胞浓度 问题5:悬浮细胞成簇 可能原因 (1)培养液中含钙、镁离子 (2)支原体污染 (3)蛋白酶过度消化使得细胞裂解释 (4)DNA污染 建议解决方法 (1)用无钙镁平衡盐溶液洗涤细胞,轻轻吹吸细胞获得单细胞悬液。 (2)分离培养物,检测支原体。如发现支原体污染,丢弃培养物。

常规细胞培养方法(原代培养和传代培养)

原代上皮细胞与原代成纤维细胞培养的分离纯化 2010-12-02 10:29 来源:PriCells 点击次数:335 关键词:上皮细胞成纤维细胞培养分离纯化 分享到:收藏夹腾讯微博新浪微博开心网 PriCells- 原代上皮细胞与原代成纤维细胞培养的分离纯化 原代细胞、传代细胞绝大多数都呈混合生长,既有上皮样细胞又有纤维样细胞,纤维样细胞又包括成纤维细胞、肌细胞、骨细胞、滑膜细胞等。混杂的细胞会直接影响实验结果。 在体外培养原代细胞时,为了保证实验结果的可靠性、一致性、稳定性、和可重复性,要求采用单一种类细胞来进行实验,这样才能对某一细胞的功能、形态等变化进行一系列研究,因而培养细胞的纯化就成为实验研究的重要一步,甚至需要从混杂的细胞群中分离出单个细胞来进行培养和开展实验研究。 一、原代细胞增殖优势纯化方法:

自然纯化是利用某一种类细胞的增殖优势,在长期传代过程中靠自然淘汰法,不断排挤其他生长慢的细胞,靠自然增殖的潜力,最后留下生长优势旺盛的细胞,达到细胞纯化的目的。但这种方法常无法按照需要和实验要求及研究目的来选择细胞。此法花费时间长,留下的往往是成纤维细胞。仅有那些恶变的肿瘤细胞或突变的细胞可以通过此方法而保留下来的,不断纯化而建立细胞系。 二、原代细胞常用纯化方法: 人工纯化是利用人为手段造成对某一细胞生长有利的环境条件,抑制其他细胞的生长从而达到纯化细胞的目的。 1 、细胞时间差酶消化法: 酶消化法是比较常用的纯化方法,不仅对贴壁细胞可行,能利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同,是两者分开,达到纯化的目的;另外对贴壁细胞与半贴壁细胞及黏附细胞间的分离纯化也是十分有效的。

《细胞实验》02 原代细胞培养和传代培养的方法

原代细胞培养和传代培养的方法 原代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器:培养箱(调整至37℃),培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱(37℃) 材料:动物组织块 试剂:1640培养基(含20%小牛血清),0.25%胰酶,Hank′s液,碘酒 初代消化培养法 1. 准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面,紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局:点燃酒精灯,安装吸管帽。 3. 处理组织:把组织块置于烧杯中,用Hanks液漂洗2~3次,去除血污;如怀疑组织可能污染,可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切:用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块,以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角烧瓶中,结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化:或用恒温水浴,或置于37℃温箱消化均可,消化中每隔20分钟应摇动一次,如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离:在消化过程中见消化液发混浊时,可用吸管吸出少许消化液在镜下观察,如组织

已分散成细胞团或单个细胞,立即终止消化,随即通过适宜不锈钢筛,滤掉尚未充分消化开的组织块。低速(500~1000转/分)离心消化液5分钟,吸出上清,加入适量含有血清的培养液。 7. 计数:用计数板计数,如细胞悬液细胞密度过大,再补加培养液调整后,分装入培养瓶中。对大多数细胞来说,pH要求在7.2~7.4范围,培养液呈微红色,如颜色偏黄,说明液体变酸,可用NaHCO3调整。 8. 培养:置于36.5℃温箱培养,如用CO2温箱培养,瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞,纱布塞易生霉菌,每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切:把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中,用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污,吸静Hanks液,用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布:用弯头吸管吸取若干小块,置于培养瓶中,用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部,小块相互距离以0.5cm为宜,每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶,另瓶底向上,注意翻瓶时勿另组织小块流动,塞好瓶塞,置36.5℃温箱培养2小时左右(勿超过4小时),使小块微干涸。 4. 培养:从微箱中取出培养瓶,开塞,46度斜持培养瓶,箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许,然后缓缓再把培养瓶翻转过来,让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。 传代培养法 原理 细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时 也将细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养)。传代培养也是一种将细胞种保存下去

原代神经细胞培养方法精编版

原代神经细胞培养方法 精编版 MQS system office room 【MQS16H-TTMS2A-MQSS8Q8-MQSH16898】

神经细胞培养体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神 经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持 结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提 供了体内生长过程在体外重现的机会。(2)能在较长时间内直接观察活细胞的 生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、 荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免 疫组化和电生理等手段进行研究。(3)易于施行物理(如缺血、缺氧)、化学 和生物因子(如神经营养因子)等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直 接或间接作用。(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制,药 物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影 响。我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作,取得了一些 经验,现将培养细胞分类及方法简要介绍如下: 一. 鸡胚背根神经节组织块培养 主要用于神经生长因子(NGF)等神经营养因子的生物活性测定。在差倒 置显微镜下观 察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。 1.材料和方法 (1)选正常受精的鸡蛋,置于37℃生化培养箱内孵化,每日翻动鸡蛋一 次。 (2)取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳,从气室端敲开蛋壳,用消毒镊剥除气

室部蛋壳。 (3)用弯镊钩住鸡胚颈部,无菌条件下取出鸡胚置小平皿内,除去头部后,腹侧向上置 灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔,除去内脏器官。 (4)在解剖显微镜下,小心除去腹膜,暴露脊柱及其两侧,在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧 排列的背根节(图1),用一对5号微解剖镊小心取出。 (5)置背根节于解剖溶液内,用微解剖镊去除附带组织,接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料 培养瓶中,在DMEM无血清培养液中培养。 2.结果 鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, ,20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长。 二.新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养 背根神经节(DRG)细胞起源于神经嵴,NGF研究先驱Levi-Montalcini 的实验表明,外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。在体外,分离培养的神经节在NGF存在的情况下,神经突起的生长在一天之内可长达数毫米,因此,利用培养的DRG细胞,进行轴突生长发育的研究,是最为经典而常用的方法之一。 1.材料和方法 取新生一天的大鼠(wistar种)和小鼠(昆明种)。用眼科剪在无菌条件下除去背部皮肤, 然后剪取一段脊髓,背侧朝上置于灭菌毛玻璃片上,在解剖显

原代细胞培养:原代肝细胞

【嘉美生物】肝是生物转化和蛋白质合成的主要器官,也是药物毒性作用发挥的主要场所。因此许多的体外测试都选用肝细胞来研究药物间的相互作用和其他一些生化过程。 嘉美生物用于培养原代细胞的组织采集于各大医院(包括协和医院、301医院、北三医院等),采集根据美国IRB 和HIPAA批准的方案进行。这些原代细胞均来自新鲜组织,并采用公司专利的技术来优化目的细胞生长条件,降低杂细胞(如脂肪细胞、纤维细胞等)的污染。分离的细胞经过短暂培养、传代,然后迅速冻存。这些保持分化状态的细胞可以用于评估体外药物模型系统和调节特定基因的遗传功能。 嘉美生物原代肝细胞产品均经过严格的QA/QC检测,可以直接用于药物优化和筛选、基因克隆、表达图谱分析以及各种分子生物学和药物学实验的研究。 凭借着先进的技术设备和资深的专业经验,嘉美生物能为您提供高品质的原代细胞产品和特殊的定制服务: 1、各种新鲜原代肝细胞 嘉美生物除提供多种人、小鼠、大鼠、猴等新鲜肝细胞产品外,嘉美生物还可以为您提供特定动物、特定组织、特定年龄的新鲜肝细胞定制服务。 2、各种原代细胞提取物 嘉美生物除提供的人、小鼠、大鼠、猴等四大类的肝微粒体、肝S9、CYP450酶和其他亚细胞提取物外,嘉美生物还可以为您提供专业的原代细胞提取物定制服务。 嘉美生物可以同时提供高质量的原代细胞产品和专业的个性化定制服务,为您的研究提供最新鲜优质的实验材料,提供其他原代细胞相关专业服务(原代肝细胞靶药分析服务、原代细胞靶药优化服务和原代细胞药物筛选等)。嘉美生物能完美整合各类原代细胞类服务,是原代细胞分离,原代细胞提供,原代细胞实验课题服务中的佼佼者。

原代细胞的取材

原代细胞的取材 一、取材的基本要求 (1)取材要注意新鲜和保鲜新鲜组织易于培养成功,取材时应尽量在4~6h内能制作成细胞,尽快入箱培养,若不能即时培养,应将组织浸泡于培养液内,于4℃存放。若组织块较大,应在清除表面血块、坏死组织、脂肪和结缔组织后,切碎于培养液内4℃存放,但时间不能超过24h。对于已切碎的组织或血液、淋巴组织应加入含10%二甲基亚砜 (DMSO) 的培养基,按细胞冻存方式于液氮中冷冻保存。 (2)取材应严格无菌所取标本材料应在无菌条件下进行,为了确保无菌,对所取材料若疑有污染的可能,应将所取组织在含高浓度抗菌素(400单位/mL)甚至加入适量的两性霉素B或10%达克宁液的培养液内于4℃下存放2小时以上,再用PBS洗2~3次,以确保所取材料无菌。要用无菌包装的器皿或事先消毒好的带少许培养液(内含400单位/mL抗菌素)的小瓶等便于携带的物品来取材,所取材料应避免接触有毒有害的化学物质,如碘、汞等。(3)取材和原代细胞制作时,要用锋利的器械,如手术刀或剃须刀片切碎组织,尽可能减少对细胞的机械损伤。 (4)要仔细去除所取材料上的血液(血块)、脂肪、坏死组织及结缔组织,切碎组织时应避免组织干燥,可在含少量培养液的器皿中进行。 (5)取材应注意组织类型、分化程度、年龄等,一般来讲,胚胎组织较成熟个体组织容易培养,分化低的较分化高的组织容易生长,肿瘤组织较正常组织容易培养。取材时应尽量选用易培养的组织进行培养。 (6)原代细胞取材时要同时留好组织学标本和电镜标本。对组织的来源、部位、包括供体的一般情况要做详细的记录,以备以后查询。 原代细胞的分离和制作 人或动物体内(或胚胎组织)由于多种细胞结合紧密,不利于各个细胞在体外培养中生长繁殖,即使采用1mm3的组织块,也只有少量处于周边的细胞可能生存和生长,若需获取大量细胞,必须将现有的组织块充分散开,使细胞解离出来,常采用的方法如下: 一、悬浮细胞的分离方法 组织材料若来自血液、羊水、胸水或腹水的悬液材料,最简单的方法是采用1000r/min 的低速离心10分钟,若悬液量大,可适当延长离心时间,但速度不能太高,延时也不能太长,以避免挤压或机械损伤细胞,离心沉淀用无钙、镁PBS洗两次,用培养基洗一次后,调整适当细胞浓度后再分瓶培养,若选用悬液中某些细胞,常采用离心后的细胞分层液,因为,经离心后由于各种细胞的比重不同可在分层液中形成不同层,这样可根据需要收获目的细胞. 二、实体组织材料的分离方法 (一)机械分散法 所取材料若纤维成分很少,如脑组织,部分胚胎组织可采用剪刀剪切、用吸管吹打分散组织细胞或将已充分剪碎分散的组织放在注射器内(用九号针),使细胞通过针头 压出,或在不锈钢纱网内用钝物压挤(常用注射器钝端)使细胞从网孔中压挤出。此 法分离细胞虽然简便、快速,但对组织机械损伤大,而且细胞分散效果差。此法仅适 用于处理纤维成分少的软组织。 (二)消化分离法 1、酶消化分离法 酶消化分离法常采用胰蛋白酶和胶原酶,其分离方法如下: (1)胰蛋白酶分散技术 胰蛋白酶(简称胰酶)是广泛应用的消化剂。胰蛋白酶是一种胰脏制品,对蛋白质有水介作用,主要作用于赖氨酸或精氨酸相连接的肽键,使细胞间质中的蛋白质水介而使细胞分散开.胰蛋白酶对细胞的作用,取决于细胞类型、酶的活力、配制的浓度、消化的温度、无机盐离子、pH以及消化时间的长短等。 ①细胞类型胰蛋白酶适于消化细胞间质较少的软组织,能有效地分离肝、肾、甲状腺、羊膜、胚胎组织、上皮组织等。而对含结缔组织较丰富的组织,如乳腺、滑膜、子宫、纤维肉瘤、肿瘤组织等就无效.

细胞培养中常见的问题

细胞培养中常见的问题 2006-11-23 15:53 细胞中的颗粒到底是怎么回事? 我的细胞总有颗粒,开始是细胞中有,后来细胞之间也好像有许多颗粒。好像是细胞碎片一样。是什么东西啊?是支原体污染吗?这可是我刚买回来的细胞啊! 我们实验室也有这种情况,是不是黑的小碎片,有人说是细胞代谢产物,后来拿到高倍镜下看还会动,就怀疑是污染了,也想问问大家到底是什么 是黑色的小碎片。我没注意到它会动,只是觉得不像是活的微生物。我觉得是由于某种污染或外界因素导致的细胞状态变差,裂解出的东西。但是,是什么东西不清楚。 的确很常见 在以前帖子见到说是“黑焦虫”。长时间培养的很容易出现,我根据自己的经验估计是一种污染,因为随着黑点增多,本来生长旺盛的细胞逐渐停滞甚至死亡。而且我后来原代培养的几批细胞并没有发现,我怀疑有好多细胞系本身就是污染的。不过增加换液次数的情况下,好象一般不太娇气的细胞生长不是很受影响。 以前听很有经验的老师说黑焦虫是国产血清的问题,可以有条件换进口血清试试,或者离心一下也可能能解决问题。那么所谓的“黑焦虫”到底是什么东西啊?有谁知道? 我培养的细胞也出现过此中问题,放到高倍镜下看时有东西在动,但培养液不混浊,估计不是细菌污染,可能是血清问题,是支原体污染。 我培养的细胞也出现过这样的问题,我个人认为是一种支原体污染。国产血清是罪魁祸首,因为只要将细胞饥饿一下,不超过24小时,这种东西就会疯长 我培养的细胞也有出现这中情况。但是并不影响细胞生长。应该不是支原体污染 最近,我复苏细胞细胞的时候也发现过这样的东西,尽管我用的是GIBCO的FBS,后来,每天换液之前洗几遍后,就慢慢变少,现在没了 细胞培养的细菌污染 我们新建的细胞室。每周都会做清洁,用0。2%新洁尔灭消毒,照紫外。实验前也会照至少30分钟。培养基中加青霉素,链霉素。可是培养细胞时还是常有细菌污染,有时甚至分析不出原因。用培养瓶还好一点,用多孔板或平皿就更凄惨。我养的是哺乳动物细胞,不知各位有什么好的方法避免污染!谢谢! 很可能是超净台无效了,,或者培养基?其实严格操作箱污染都难 我们是新的超净台,不可能失效。而且用同一瓶培养基,一瓶传两瓶,原始的一

细胞的原代培养

细胞原代培养 【实验目的】 1.理解细胞原代培养原理 2.熟悉细胞原代培养方法与过程 3.了解细胞原代培养的应用 4.独立进行细胞原代培养操作 【实验原理】 1、原代培养实验原理 细胞培养是生物学和医学研究中最常用的手段之一,可分为原代培养和传代培养两种。原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养,即组织直接从机体获取后,通过组织块长出单层细胞,或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养,在首次传代前的培养可认为是原代培养。由于培养的细胞刚刚从活体组织分离出来,故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生物体细胞的生长,代谢,繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后,经机械法或各种酶类(常用胰蛋白酶)和鳌合剂(常用EDTA)处理,使之分散成单个细胞,加入适量培养基,置于合适的培养容器中,在无菌、适当温度和一定条件下,使之生存、生长和繁殖的过程。 原代培养的方法有: a.组织块法:在平皿中用弯头剪把组织尽量剪碎,每个组织块小于1mm3大 小。用Hanks液洗涤2—3次,自然沉淀。用吸管吸去上清液。将组织块 贴于培养瓶进行培养。 b.酶消化法:将1mm3大小的组织块放入1个三角瓶内加入10—30ml的 0.125%的胰蛋白酶。370C磁棒搅拌消化20-30分钟。然后终止消化。用 几层无菌纱布过滤。取过滤液,离心800rpm 5—10分钟收集细胞。弃上 清,加入带有双抗的培养基,放入培养瓶培养。 【实验仪器、材料、试剂及用品】 1.仪器:荧光显微镜,CO2培养箱 2.材料:孕鼠 3.试剂:(1) 培养液:为DMEM,添加10%新生牛血清(NBS)、青霉素100 u / ml 、链霉素100ug/ml。(2)消化液:为0.125%胰蛋白酶—0.02%EDTA 混合消化液。 4.用品:镊子,剪刀,培养瓶,试管,移液管,巴斯德吸管,废液缸,75% 酒精棉球,酒精灯、小指管。 【实验步骤】 (一)小鼠胚胎的准备:

小鼠脾脏细胞原代培养

小鼠脾脏细胞原代培养及观察计数 实验背景: 一、细胞培养的基本条件: 1.无菌条件:净化工作室,风淋室,传递窗,高效过滤器,洁净层流罩,生物安全柜,超净工作台,紫外灯,电热干燥箱,滤器,高压灭菌器,抗生素 2.细胞生长条件:纯水蒸馏器,纯水仪,培养板,培养瓶,CO2培养箱,培养基,血清 3.细胞检测条件:倒置显微镜,酶标仪,微孔板震荡器,高速离心机,移液器 4.细胞保存条件:液氮罐 1.超净工作台的工作原理是利用鼓风机驱动空气遁过高效滤器除去空气中的尘埃颗粒,使空气得到净化。净化空气徐徐通过工作台面,使工作台内构成无菌环境。 2.Zeiss滤器:过滤除菌:大多数培养用液,如人工合成培养基、血清、酶液等均采用滤过法除菌。

3.CO2培养箱: CO2培养箱设定的条件为37 ℃,5%CO2 。 使用CO2培养箱培养细胞时应注意的问题: ①用螺旋口瓶培养细胞时,需将瓶盖微松,以保证通气。 ②保持培养箱内空气干净。定期消毒(90 ℃,14 h)。 ③箱内灭菌蒸馏水3000毫升蒸馏水槽中以保持箱内湿度,避免培养液 蒸发。 三、细胞培养用液的配制: 1.水:新鲜配置的三蒸水或去离子水 2.平衡盐溶液:无Ca2+、Mg2+的缓冲液 PBS:NaCl 8.0 g KCl 0.2 g Na2HPO4.H2O 1.56 g KH2PO4 0.20 加水至1000 ml 3.消化液: ①胰蛋白酶作用于与赖氨酸或精氨酸相连接的肽健,除去细胞间粘蛋白及糖蛋白,影响细胞骨架,从而使细胞分离。 ②胰蛋白酶液浓度越高,作用越强,但超过一定限度会损伤细胞。 ③胰蛋白酶是一种黄白色粉末,用无Ca2+、Mg2+的PBS缓冲液配制常用的胰蛋白酶液浓度是 0.25%。用滤器过滤除菌。 ④胰蛋白酶液消化时间:2-10分钟。 ⑤用含血清培养液终止其对细胞的消化作用 4.培养基: 培养基(培养液)是维持体外细胞生存和生长的溶液,分天然培养基和合成培养基。 ①天然培养基: 天然培养基有血清、血浆和组织提取液(如鸡胚和牛胚浸液)。 优点:营养成分丰富,培养效果好 缺点:来源受限,成分复杂,影响对某些实验产物的提取和实验结果的分析。易发生支原体污

原代心肌细胞培养方法探讨[1] 3

心肌细胞的分离及培养 器械:饭盒、烧杯、弯头解剖剪(2)、小镊子(2)、平皿(4)、毛玻片、滤网、离心管(15ml)、移液管、培养瓶、废液缸、PE手套、橡胶手套、冰盒 溶液:PBS、DMEM(含血清)、DMEM(free)、胰酶 动物:小鼠 准备:用酒精棉球擦拭台面后把物品摆放好,开紫外线灯照30分钟后开鼓风机吹至实验结束,提前半小时将培养液、胰酶37℃温浴。 培养过程: 1、两个圆皿中加入5ml的PBS培养液,将小鼠浸入70%酒精<5min,用小剪子及小镊子开胸取心。 2、取出的心放在一个装有PBS的平皿中,剔除心脏周边的血凝及纤维组织。 3、PBS再冲洗后,转移至另一个预先装好5ml胰酶的平皿中,用剪子将平皿中的心脏剪成1mm3的碎块,倒入15ml离心管中,加入3-5ml胰酶冲洗平皿转移到离心管中。 4、放入水浴锅中,温和摇动,10min,自然沉淀,小心吸取上清,上清中主要是血红细胞、细胞碎屑和死细胞。 5、再将8-10ml胰酶加入盛有组织的离心管,吸管轻轻吹打1min,消化10min,小心转移上清+2ml DMEM至另一离心管中,细胞悬液离心,1000转×10min,弃上清,加培养基为管1。 6、重复第5步,3-8次,直至至组织块消化为止。 7、将多次细胞悬液经100目滤网过滤,混合。 8、加入1ml DMEM重悬,显微镜下观察并计数。 9、培养1-1.5小时,收集培养液中的非贴壁细胞,小心不要晃动。 10、显微镜观察并计数,细胞密度调至5×105-6×105细胞/ml。 11、4-6小时后,用培养基轻轻冲洗2次,加入培养基继续孵育过夜。 或从第5步起,加胰酶10-15ml,30min 37℃水浴,每5min用吸管吹打5ml完全培养基终止。

细胞培养常见问题

问题1:培养液pH 值变化太快 可能原因 (1)CO2 张力不对 (2)培养瓶盖拧得太紧 (3)NaHCO3 缓冲系统缓冲力不足 (4)培养液中盐浓度不正确 (5)细菌、酵母或真菌污染 建议解决方法 (1)按培养液中NaHCO3 浓度增加或减少培养箱内CO2 浓度,2.0g/L 到3.7g/L 浓度NaHCO3 对应CO2 浓度为5%到10%。 (2)松开瓶盖1/4 圈。 (3)改用不依赖CO2 培养液。加HEPES 缓冲液至10 到25mM 终浓度。 (4)在CO2 培养环境中改用基于Earle′s 盐配制的培养液,在大气培养环境中培养改用Hanks 盐配制的培养液。 (5)丢弃培养物,或用抗生素除菌。 问题2:培养液出现沉淀,但pH值不变 可能原因 (1)洗涤剂清洗后残留有磷酸盐,将培养基成分沉淀下来 (2)冰冻保存培养液 建议解决方法 (1)用去离子水反复冲洗玻璃器皿,然后灭菌。 (2)将培养液加热到37℃,摇动使其溶解如沉淀仍然存在,丢弃培养液。 问题3:培养液出现沉淀,同时pH 发生变化 可能原因 细菌或真菌污染 建议解决方法 丢弃培养物,或用抗生素除菌。 问题4:培养细胞不贴壁 可能原因 (1)胰蛋白酶消化过度 (2)支原体污染 (3)培养瓶瓶底不干净 (4)培养液pH值过碱(NaHCO3分解) (5)消化液或培养液配制错误、过期储存、储存不当 (6)细胞老化(如传代前细胞已汇合导致失去贴附性) (7)接种细胞起始浓度太低或太高 建议解决方法 (1)缩短胰蛋白酶消化时间或降低胰蛋白酶浓度。 (2)分离培养物,检测支原体。清洁支架和培养箱。如发现支原体污染,丢弃培养物。(3)注意刷洗,或换用一次性塑料培养瓶 (4)使用无菌醋酸溶液调整pH值或充入无菌CO2(将培养液敞口放入培养箱也可)(5)重新配置消化液或培养液 (6)启用新的保种细胞 (7)调节最佳接种细胞浓度

细胞实验原代培养

细胞生物学实验 原代培养 一、实验目的 1.理解细胞原代培养原理 2.了解细胞原代培养的一般方法与步骤 3.了解细胞原代培养的应用 4.独立进行细胞原代培养操作 5. 熟悉无菌操作技术 二、实验原理 细胞培养是生物学和医学研究最常用的手段之一,可分为原代培养和传代培养两种。 原代培养是直接从生物体获取组织或器官的一部分进行培养。由于培养的细胞 刚刚从活体组织分离出来,故更接近于生物体内的生活状态。这一方法可为研究生 物体细胞的生长、代谢、繁殖提供有力的手段。同时也为以后传代培养创造条件。 原代培养: 组织直接从机体获取后, 通过组织块长出单层细胞, 或者用酶消化或机械方法将组织分散成单个细胞开始培养, 在首次传代前的培养可认为是原代培养。 原代培养的过程指动物的组织或器官从机体取出后,经机械法或各种酶类(常用胰蛋白酶)和鳌合剂(常用EDTA处理,使之分散成单个细胞,加入适量培养基 置于合适的培养容器中,在无菌、适当温度和一定条件下,使之生存、生长和繁殖

的过程。 三、实验步骤 鸡胚成纤维细胞的原代培养 (1)入无菌室之前首先穿实验服,佩戴一次性手套、帽子。要用肥皂洗手, 用新洁尔灭溶液拭擦双手消毒。 (2)关闭已照射超净台台面20 分钟左右的紫外灯,打开抽风机清洁空气。打开照明灯。 (3)超净台台面应整洁,用75%酒精擦双手消毒,并擦拭超净台台面。 (4)准备好所需试剂及仪器,摆放在超净台中。 (5)按照1%的比例向含10%FCS勺DMEM培养基中加入双抗(本次试验的培养基约为80ml,故加入800卩I的双抗) (6)取鸡胚蛋一枚放入超净工作台中,用酒精棉球擦拭鸡蛋壳后,用镊子在鸡蛋气室位置(大头处)敲一个小口,然后用镊子小心去除气室部分的蛋壳。 (7)换用洁净的无菌镊子揭开膜,再用洁净的无菌弯头镊子取出鸡胚至灭菌的培养皿中,并用D-hanks 液冲洗鸡胚,重复三次。 (8)用眼科剪去除鸡胚的头部、四肢及内脏,用D-hanks 液充分洗涤躯干部分三次。 9)将洗涤过的躯干移至干净的培养皿,吸去多余的液体,然后用眼科剪将躯干充分剪碎,剪碎速度要快。

原代细胞的培养法

原代细胞的培养法 组织块培养法 组织块培养是常用、简便易行和成功率较高的原代培养方法,也是早期采用培养细胞的方法,故原先被称为组织培养。其方法:为将剪成的小组织团块接种于培养瓶(或皿)中,瓶壁可预先涂以胶原薄层,以利于组织块粘着于瓶壁,使周边细胞能沿瓶壁向外生长,方法简便,利于培养,部分种类的组织细胞在小块贴壁24小时后细胞就从组织块四周游出,然后逐渐延伸,长成肉眼可以观察到的生长晕,5~7天后组织块中央的组织细胞逐渐坏死脱落和发生漂浮,此漂浮小块可随换液而弃去,由组织块周围延伸的贴壁细胞也逐渐形成层片,可在显微镜下观察形态和用于实验研究。 其培养方法如下: (1)按照前述方法取材,将组织剪成或切成1mm3大小的小块,并加入少许培养基使组织湿润。 (2)将小块均匀涂布于瓶壁,每小块间距0.2 cm~0.5cm,一般在25mL培养瓶(底面积为17.5cm2)可接种20~30小块为宜,小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。 (3)培养2~4小时,待小块贴附后,将培养瓶缓慢翻转平放,静置培养,动作要轻,严禁摇动和来回振荡,以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败,若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多,以保持组织块湿润即可,培养24小时后再补液,培养初期移动和观察时要轻拿轻放,开始几天尽量不去搬动,以利贴壁和生长,培养3~5天时可换液,一方面补充营养,一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。 原代细胞培养-2 2、消化培养法 该方法是采用前述的消化分散法,将妨碍细胞生长的细胞间质(包括基质、纤维等)去除,使细胞分散形成细胞悬液,然后分瓶培养。 某些特殊类型细胞,如内皮细胞、骨细胞等的消化手段和步骤,将在有关章节中叙述。 3、悬浮细胞培养法 对于悬浮生长的细胞,如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化,可采用低速离心分离,直接培养,或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。 4、器官培养 器官培养是指从供体取得器官或组织块后,不进行组织分离而直接在体外的特定环境条件下培养,其特性仍保持原有器官细胞的组织结构和联系、并能存活,器官培养的目的和技术均与单层细胞培养不同,但可利用器官培养对器官组织的生长变化进行体外观察。并观察不同培养条件研究对器官组织的影响。器官培

原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项

原代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器:培养箱(调整至37℃),培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱(37℃)材料:动物组织块 试剂:1640培养基(含20%小牛血清),0.25%胰酶,Hank′s液,碘酒 原代消化培养法 1. 准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面,紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局:点燃酒精灯,安装吸管帽。 3. 处理组织:把组织块置于烧杯中,用Hanks液漂洗2~3次,去除血污;如怀疑组织可能污染,可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切:用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块,以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角烧瓶中,结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化:或用恒温水浴,或置于37℃温箱消化均可,消化中每隔20分钟应摇动一次,如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离:在消化过程中见消化液发混浊时,可用吸管吸出少许消化液在镜下观察,如组织已分散成细胞团或单个细胞,立即终止消化,随即通过适宜不锈钢筛,滤掉尚未充分消化开的组织块。低速(500~1000转/分)离心消化液5分钟,吸出上清,加入适量含有血清的培养液。 7. 计数:用计数板计数,如细胞悬液细胞密度过大,再补加培养液调整后,分装入培养瓶中。对大多数细胞来说,pH要求在7.2~7.4范围,培养液呈微红色,如颜色偏黄,说明液体变酸,可用NaHCO3调整。 8. 培养:置于36.5℃温箱培养,如用CO2温箱培养,瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞,纱布塞易生霉菌,每次换液时需要换新塞。 原代组织块培养法 1. 剪切:把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中,用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污,吸静Hanks液,用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布:用弯头吸管吸取若干小块,置于培养瓶中,用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部,小块相互距离以0.5cm为宜,每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。

原代神经细胞培养方法 Neuron Cell Culture

1. Preparation of coverslips 1.1- Mass culture Our standard mass cultures are plated on astrocytes. Those, in turn, are plated on glas s coverslips pre-coated with poly-D-lysine and laminin. Materials: . #1 coverslips . coverslip racks in a water-tight container (we made ours) . poly-D-lysine (PDL) stock solution (1mg/ml in dd water) . laminin stock solution (20 μg/ml in Hank’s BSS) . 35 mm plastic culture dishes . culture hood equipped with UV lamp . sterile dd water Procedure: . Place the coverslips in the racks and leave them in the culture hood under UV light for 2 hrs. . Coat the coverslips with 12.5 μg/ml PDL (5ml PDL in 400ml sterile dd water) for 2hrs. in the culture hood. . Wash the coverslips with sterile dd water five times, in the culture hood. . Place the coverslips in the sterile 35mm dishes . Add 0.4ml laminin on top of the coverslips. Wait for 45’, then aspirate the excess soluti on 1.2- Agarose-collagen microislands This protocol is based on protocols by Segal and Furshpan. Although th e following “ma cro-island” approach has allowed for greater neuronal survival, while still providing a hi

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