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PEG诱导浊点萃取系统

上海交通大学

硕士学位论文

PEG诱导浊点萃取系统

姓名：梁蕊

申请学位级别：硕士

专业：微生物与生化药学指导教师：齐瀚实;王志龙

20090101

PEG诱导浊点萃取技术

摘要

非离子表面活性剂水溶液在温度高于其浊点或有一定添加物存在的条件下会自动形成表面活性剂浓度很小的稀相和表面活性剂富集相，这一系统常被称为浊点系统。用浊点系统进行的萃取过程被称为浊点萃取。浊点萃取分离一般采用低HLB值的非离子表面活性剂以便在不太高的温度条件下实现萃取/反应过程。然而，有机化合物与低HLB值的非离子表面活性剂的分离非常困难，使产品分离和表面活性剂的重复利用难以实现。本课题研究的由高分子PEG和高HLB值非离子表面活性剂组成的PEG 诱导的浊点系统（PEG-CPS）技术，可以在一定程度上解决这个问题。

在PEG-CPS中，高HLB值的非离子表面活性剂（TX-100）可以在室温下实现浊点萃取。本课题以高沸点的1-萘酚作为模式有机溶质，在PEG-CPS中进行萃取，约90%的1-萘酚被萃取至PEG-CPS的表面活性剂富集相中。之后在以表面活性剂富集相与异丁醇体积比为5：3，25℃的条件下进行WinsorⅡ萃取，可以将约96%的表面活性剂和1-萘酚萃取至有机相中。蒸发掉有机溶剂并溶解残留有机溶质和表面活性剂后，以该水溶液与乙醚体积比为5：12，6℃的条件下进行WinsorⅠ萃取，有机溶

质和表面活性剂的回收率均在79%以上。

另外，本课题还研究了在PEG-CPS中的微生物转化以及下游的分离过程。实验结果显示，在15%亲水性TX-100与 6.4%PEG20000组成的PEG-CPS中，产物可达到6.38g/L。分离过程采用微乳液萃取过程，即发酵上清液与乙醚（体积比为5：12）在6℃形成WinsorⅠ微乳液，从而将产物/底物与非离子表面活性剂/PEG分离；之后将WinsorⅠ微乳液的水相与异丁醇（体积比为5：3）混合，在25℃形成WinsorⅡ微乳液，从而将非离子表面活性剂与PEG分离。

关键词：非离子表面活性剂;PEG;浊点系统;微生物转化;微乳液;萃取

PEG INDUCED CLOUD POINT EXTRACTION

ABSTRACT

When an aqueous micelle solution of a nonionic surfactant is at a temperature above its cloud point or in the presence of certain additives, phase separation occurs to form a surfactant-dilute phase and a surfactant-rich phase or coacervate phase. Such a system is called a cloud point system (CPS). The cloud point system has also been utilized as a separated method, which is known as cloud point extraction (CPE). Generally, in order to implement extraction/reaction at a relatively lower temperature, the nonionic surfactant with low hydrophile-lipophile balance (HLB) value is used. However, it’s difficult to strip organic compounds from nonionic surfactant with low HLB, which makes it difficult for the product recovery and nonionic surfactant reutilization.

A novel PEG induced cloud point system (PEG-CPS) with high molecule PEG and nonionic surfactant with relatively higher HL

B has been developed. The experimental results suggest that in PEG-CPS, a CPE can be carried out with a relatively higher HLB (TX-100) value nonionic surfactant at about room temperature. High boiling point 1-naphthol has been used as a

model organic solute, and the recovery in nonionic surfactant rich phase of PEG-CPS is 90%. A volume ratio of surfactant rich phase to organic solvent iso-butyl alcohol on 5:3 has been proposed to extract surfactant and solute into O m phase of WinsorⅡ, and the recovery of surfactant and solute are both about 96%. After removal of organic solvent and resolving the residual organic solute and surfactant with water, the solution has been used to Winsor Ⅰextraction with volume ratio of solution to ethyl ether on 5:12 at 6℃, and the recovery of surfactant and solute are both above 79%.

PEG-CPS has been developed as a novel medium for whole cell microbial transformation, and the downstream process has also been researched. The experimental results suggest that in PEG-CPS with 15% hydrophilic TX-100 and 6.4% PEG20000, the yield of product is about 6.38g/L. The microemulsion extraction has been used as the separation technique, i.e., WinsorⅠwith volume ratio of supernatant to ethyl ether on 5:12 at 6℃ has been conducted to strip product/substrate from nonionic surfactant/PEG; WinsorⅡwith volume ratio of water phase of WinsorⅡ to iso-butyl alcohol on 5:3 at 25℃ has been conducted to separate nonionic surfactant and PEG.

KEY WORDS: nonionic surfactant; PEG; cloud point system; microbial transformation; microemulsion; extraction

上海交通大学

学位论文原创性声明

本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或集体已经发表或撰写过的作品成果。对本文的研究做出重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式表明。本人完全意识到本声明的法律结果由本人承担。

学位论文作者签名：梁蕊

日期：2009 年1月28 日

上海交通大学

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保密□，在___年解密后适用本授权书。

本学位论文属于

不保密□√。

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学位论文作者签名：梁蕊指导教师签名：齐瀚实

日期：2009 年1月28 日日期：2009 年1月28 日

1 文献综述

1.1浊点系统

当表面活性剂水溶液的浓度高于一定值时，表面活性剂分子会自组装成各种超分子结构，例如胶束，薄片状，囊泡，反胶束，六棱形等，这个浓度为表面活性剂的临界胶束浓度（Critical Micelle Concentration，CMC）。当非离子表面活性剂胶束溶液的温度升高到一定值，或者添加一定的添加物后，原本均一的溶液会发生相分离，形成一个表面活性剂稀相和一个表面活性剂富集相。图1[1]为一种典型的非离子表面活性剂溶液相图。分相后稀相是L1型胶束，即表面活性剂溶于水形成的正相胶束；富集相是L2型胶束，即水溶于表面活性剂形成的反向胶束[2]。这样一个两相分离的系统就是浊点系统（Cloud Point System, CPS）。而相分离的温度为浊点温度（Cloud Point，CP）。浊点温度由非离子表面活性剂的分子结构所决定[3]，而受非离子表面活性剂水溶液的浓度和添加物的影响[4-6]。如图1所示，非离子表面活性剂溶液的浊点随其浓度变化而出现最小值，一般文献所指的非离子表面活性剂的浊点温度就是指这个最低温度。

图1 TX-100水溶液温度-浓度相变图

Fig.1Temperature–concentration phase diagram of TX-100 aqueous solution. At the temperature below the cloud point, the surfactant solution is a single isotropic solution phase region; at the temperature above cloud point, the solution separates into two coexisting isotropic phases. The surfactant-rich phase is known as coacervate phase, the other is dilute phase. Symbols: Diamond is surfactant concentration assayed after phase separation; Triangle is surfactant concentration calculated by conservation of mass after phase separation; Circle is determined from cloud point method and fork is CMC, which indicates that the nonionic surfactant concentration in the dilute phase of the cloud point system is higher than the CMC.

1.1.1 多聚物诱导相分离

多聚物对非离子表面活性剂溶液浊点的影响与聚合物链的长度有关。有多种机理模型可以解释不同分子量大小PEG对非离子表面活性剂溶液浊点的不同影响。其中一种认为，高分子量的PEG，其乙二醇链会形成不规则螺旋，而与表面活性剂亲水基团结合形成聚泡状结构，如图2所示。PEG链形成的环为相邻胶束之间的交换与碰撞建立了桥梁，PEG链越长，在每个胶束周围形成的环也就越多，这样相邻两个胶束之间交换与碰撞的机会也就越多，最终使浊点降低。而低分子量PEG（聚合度<1~15）

的乙二醇会结合到胶束表面，由于聚合链较短，所以只能覆盖胶束的一部分，这会成为胶束之间碰撞的障碍，最终使浊点升高。PEG 链的长短还会存在一种中间状态，即它可以覆盖了一个胶束表面的同时，还吸附在一个以上其他胶束表面上，而这种

情况也会使胶束更容易聚集，从而使浊点降低。

图2 相邻胶束通过聚合物链之间的交换

Fig.2 Surfactant monomer exchange between adjacent intra-chain micelles

另一点值得说明的是，PEG 链的长短是相对于溶液中非离子表面活性剂胶束大小

而言的，如图3所示[7]，PEG1000可以降低TX-114的浊点而升高TX-100的浊点，这是因为TX-100的胶束比TX-114的胶束大。总的来说，聚合物对非离子表面活性剂溶液浊点的影响主要与胶束和聚合物的大小有关。

图3 PEG 对Triton X 系列表面活性剂水溶液浊点的影响

Fig.3 A: The effect of PEG on the cloud point for TX-114 aqueous solutions; B: The effect of PEG on the cloud point for TX-100 aqueous solutions. The surfactant concentration is constant(100g/L).

Demyanchuk et al [8]通过光学显微镜观察了PEG/水富集区从非离子表面活性剂

C 12E 6富集母体中分离的过程。通过形态学的观察，研究者认为区域增长的主要机制是

聚集诱导的聚集机制，即两个小滴碰撞聚集会引发更进一步的增长，如图4所示。Collen et al [9]研究了表面活性剂/聚合物系统在提取蛋白方面的应用,图5为TX-114/Reppal PES 水溶液系统在

21℃的相图。

图4 聚集诱导的聚集机制示意图

Fig.4 Coalescence-induced coalescence via flow in the PEG(3%)/C 12E 6/H 2O mixture(wt 10% of C 12E 6) after (a)630, (b)705, (c)780, and (d)855s. The coalescence between 1 and 2 (a) induces hydrodynamic flows (b and c), and as a result generates the next coalescences (d).

图5 21℃时TX-114/Reppal PES100/水系统相图

Fig.5 The phase diagram for TX-114/Reppal PES100/water system at 21℃

1.1.2 盐诱导相分离

盐的加入会影响表面活性剂溶液的特性，比如CMC，以及系统的相行为等。总的

说来，少量无机盐对非离子表面活性剂溶液的影响较小，这是因为离子与非离子表面活性剂之间的静电作用非常微弱。然而，大量无机盐的加入则会通过影响水的特性从而改变非离子表面活性剂溶液的浊点，这主要取决于不同盐的盐析或盐溶作用

[10-12]。比如，加入可聚集水分子的阴离子（强碱，F ?，OH -，SO 42

?，和Cl ?）以及特定的阳离子（NH 4+,除Li +以外的碱金属离子）会降低溶液的浊点，这主要是由于离子与

离子、离子与偶极子之间存在电性作用，使水分子聚集在离子周围，自由水减少，即盐析作用使非离子表面活性剂易从水中析出，导致浊点降低。而加入可破坏水化层的阴离子（大的可极化的阴离子，弱碱，SCN -，I -

）以及特定的阳离子（多价阳离子，H +，Li +），由于离子与非离子表面活性剂之间的相互作用（如色散作用，离子与极性头之间的电性作用等），会使水从离子和非离子表面活性剂周围的水化层排

出，自由水增加，导致盐溶，使浊点升高[13-15]。无机电解质的加入对溶液浊点的影响比较复杂，一般是两种因素共同作用的结果[16-20]。谢红国等人[21]研究了TX-100/

所示。

无机盐双水相萃取体系在常温时的相行为，如图6

图6 TX-100/Na2SO4水溶液相图

Fig.6 ADC: Binodal curve; ABC: Tie lines. ADC is the critical concentration of two phases, i.e. the left part and inferior part are uniform system, and the right part and superior part are two phases system-one is TX-100 rich phase and the other is salt rich phase. The concentration of TX100/salt of every B point on the single tie line can be decided by A and C. Although the concentrations on A and C are constant, the volumes of two phases are different, which makes the total count of B is different. The longer of the tie line, the more difference between the two phases.

1.1.3 温度诱导相分离

对于浊点系统来说，温度是影响分相的一个重要因素。Favre-Reguillon et al[22]利用非离子表面活性剂TX-114结合鳌合剂8HQ，并利用温度诱导相分离从水样中提取铀，如图7所示。另外环氧乙烷（EO）和环氧丙烷（PO）的无规则共聚物EOPO也具有较低的浊点温度，即在此温度之上，溶液会形成新的两相系统，发生温度诱导

相分离，目的产物分配在含水的上相，而富含EOPO的下相得以回收。目前，温度诱导的相分离系统除被应用在金属离子提取中，还被广泛应用在不同其他领域，包括

等的分离。

酶[23]，甾族化合物[24]，黄岑甙[25]和氨基酸[26，27]

Fig.7 Experimental procedure of temperature-induced cloud-point extraction

1.2 浊点萃取的应用

1.2.1 萃取生物物质

Bordier et al[28]首次将浊点萃取系统应用在生物大分子分离领域，他报道了疏水性膜蛋白在TX-114水溶液中的分配，从此开启了浊点萃取系统在生物领域中的应用。

浊点系统对疏水性蛋白和亲水性蛋白的溶解机制不同，使其成为分离两种蛋白的有效手段。疏水性蛋白更倾向于分配在表面活性剂富集相，主要驱动力是疏水性相互作用。当温度升高或浓度增加时，非离子表面活性剂分子会自组装成亲水基向外，疏水基向内的胶束结构，而疏水性蛋白为了逃避与水分子的接触，更倾向进入到胶束内的疏水性环境中。另外，对于非离子表面活性剂形成的胶束来说，各分子

间的相互作用是非共价键，因而形成的胶束整体并不稳定，也就是说胶束的大小、形状等物理特征会随着溶液的一些性质而发生较大的改变，如表面活性剂的浓度、温度、盐的种类和浓度以及溶液的pH值[29，30]等。在同一个溶液中，胶束的大小与形状也不尽相同，同样可以通过调节上文所述的参数而改变[31]，这也使得不同大小的疏水性蛋白质进入胶束内成为可能。

相反，亲水性蛋白更倾向于处在表面活性剂稀相中。这是因为胶束与亲水蛋白之间存在空间位阻作用。Nikas et al[32]提出了空间位阻是亲水性蛋白质在浊点系统两相中分配的主要推动力的假设，并在这个假设下，做了一系列研究。其中空间位阻包括两个内容：1、胶束的自组装特性，在温度或者表面活性剂浓度发生改变时，他们会增长成为长圆柱形微观结构；2、不同大小的圆柱形胶束在溶液中广泛分布。由于在浊点系统中，富集相中胶束间所形成的网孔要远大于球形蛋白直径（如图8所示），也就是说，蛋白质只与与其相邻的胶束发生作用，胶束之间是否形成网状结构对蛋白的分配影响不大。而又因为表面活性剂对蛋白所形成的空间位阻作用，使得亲水蛋白更倾向于分配在胶束浓度较低的稀相中。而从熵变的角度来看，由于胶束稀相中的自由空间更大，亲水性蛋白更容易在此相中形成大数量的聚合体[33]，所以也就更倾向于在此相中分配。

图8 胶束网状结构以及其与蛋白的相对大小示意图

Fig.8 Schematic comparison of the length scales (sizes) associated with proteins and micelles (either as individual coils or as a net) which exhibit significant one-dimensional growth: D is the diameter of a protein molecule, Wm=2Ro is the diameter of a micelle, Dm is the average length of a micelle, and ξm is the mesh size of the micellar net. 在这个假设的基础上，他们还得出了一个亲水性蛋白质分配的公式：

])1)((exp[2o p

b t p R R K +??=φφ

其中，K p 是亲水蛋白含量在表面活性剂富集相与稀相中的比值，Φt 和Φb 分别是

胶束在表面活性剂富集相和稀相中的体积分数。R p 是蛋白质动态半径，R o 是圆柱形胶

束横切面的半径。这个公式说明，K p 主要取决于两个因素：1、两相中胶束浓度的差

别，也就是（Φt -Φb ）

，这与温度有关；2、相关的胶束和蛋白的大小，也就是R p /R o 。一系列亲水蛋白的实验结果与此公式的预示结果一致。另外，按照这个公式的理论，用浊点系统也可以分离大小不同的亲水性蛋白，而这一点也得到了证实[34]，如图9所示。

图9 不同温度下，三种蛋白在C10E4胶束系统中的分配系数

Fig.9 Experimentally measured partition coefficients, Kp, of cytochrome c(▲), ovalbumin(●), and catalase (■) at different temperatures in the two-phase aqueous C10E4 micellar system. The error bars represent 95% confidence limits of the measurement. Also shown are the predicted Kp’s of cytochrome c(…)，ovalbumin(---), and catalase (——) as a function of temperature.

另外，在许多领域，需要将病毒和蛋白分离开来，比如从目标蛋白溶液中灭活病毒或者去除病毒[35-39]；或者在基因治疗中，需要将携带核酸的重组病毒从含有蛋白的发酵液中分离出来[40-45]等等。Liu et al[34]研究了三种蛋白包裹的噬菌体在浊点系统中的分配，然而实验所得的分配系数大于用空间位阻理论推导出来的数值。Kamei et al[46，47]以P22噬菌体和细胞色素c分别作为病毒和蛋白的代表，分别在不同温度即不同两相体积比的条件下，对这个现象进行了研究。结果表明，对于P22来说，其分配系数随着相体积比减少而减少，也就证明存在一种夹带作用明显的影响了其在两相中的分配；而对于细胞色素c来说，其分配系数随着相体积比减少而几乎不变，即夹带作用可以忽略。总的说来，浊点系统中病毒在两相中的分配是由两种作用，即空间位阻作用和夹带作用，共同决定的。

由于非离子表面活性剂浊点系统良好的生物相容性，该系统现已被广泛的应用

在各种生物大分子的提取与纯化方面，表1列出了一些有代表性的应用。

表1 浊点系统在生物大分子提取纯化上的应用

Tab.1 The application of cloud point system in biomacromolecule extraction and purification

Analyte Surfactant/ Condition Discription Ref.

Extract proteinase from center blood

corpuscle azurophil granule

TX-114, 37℃ Purity>90% [48]Extract tyrosinase from mushroom hut

TX-114,37℃ 5.5 times purity and recovery is 84% [49]Extract PEX2

TX-114,37℃PEX2 concentrate in coacervate phase [50]Separate membrane conjunctive tissue

factor from tissue factor

TX-114,37℃ [51]Extract cell adhesion molecule from

mouse placenta

TX-114,37℃Cell adhesion molecule concentrate in surfactant rich phase [52]Separate α microtubulin from β

microtubulin TX-114,37℃90% α microtubulin concentrate in surfactant rich phase, β microtubulin

stay in water phase

[53]Extract VSP4A1 from Giardia

trophozoites

TX-114,37℃14 times purity, lost is insignificant [54]Extract steroid oxidase from Nocardia

rhodochrous

512E C ,37℃P F =5,C F =4; recovery is more than 90% [55]Separate gangliosides

614E C ,23℃K>60 [56]Extract steroid hormone PONPE-7.5,

35℃ C F =12~19; recovery is 67%~82% [57]

Abbreviations: PEX2=peroxisome biogenesis factor 2; VSP4A1=Variant-Specific Surface Protein of Giardia ,

P F =Purification factor is the quotient of CHO activity per mg total protein in the coacervate phase to the activity per mg total protein in the total volume, C F =Concentration factor is the ratio of the total volume of the extraction system to the volume of the coacervate phase, K=partition coefficient

1.2.2 萃取金属离子

金属离子在水溶液中，受水分子极性的作用，会电离成为带电荷的亲水性离子，并进一步结合成为水合离子，如Al(H2O)63+，Zn(H2O)62+，Ni(H2O)2+，Fe(H2O)2Cl-等，它们容易溶于水而难溶于有机溶剂。为了从水溶液中萃取某种金属离子，就必须脱去水合离子中的水分子，并中和所带的电荷，使之变成极性很弱的可溶于有机溶剂的化合物，也就是说，将亲水性的离子变成疏水性的化合物。选择适当的金属鳌合剂，可将金属离子变成疏水性的金属鳌合物。

鳌合剂一般要满足两个条件，一是含有一个以上具有孤独电子对的分子、原子或离子，能够与金属离子（电子亚层轨道中有空穴的离子）形成配位键，二是能够与配位金属离子形成环状结构，金属离子取代配位原子上的氢（或钠）而进入鳌合环中，使金属离子钝化。

当金属离子与可提供两个或两个以上配位键的鳌合剂起反应时，会生成两个或两个以上环状结构的络合物，称为鳌合物。鳌合物的环通常为五元环或六元环，结构比较稳定，如图10所示[58]。

图10 Ni2+与丁二酮肟在碱性介质中形成鳌合物

Fig.10 Schematic of the formation of metal-chelate of Ni2+ and dimethylglyoxime in alkaline medium. The metal-chelate includes four rings-two quinquevalent rings and two hexatomic rings.

能够形成鳌合物的基团很多，一般都是周期表中Ⅴ、Ⅵ族的非金属原子，如N、

P、S、O 等，可以鳌合的基团有-OH、-NH 2、-COOH、-SH、-HPO 3等。按照鳌合物中提

供的配位键原子与类型，常有“OO 型”、“NN 型”、“NO 型”、“SO 型”和“SN 型”等，图10为“NN 型”。目前已经得到实际应用的鳌合剂已经达到100多种，常见的鳌合剂见表2。

表2 浊点萃取金属离子

Tab.2 Cloud point extraction of metal ion

Metal Ions Ligand Surfactant Ref.

Cd 、Co 、Cu 、Fe 、Mn 、Ni 、Zn PAN TX-114 [59]

Al(III) PMBP TX-114 [60]

Cd 2+, Co 2+, Cr 3+, Cu 2+, Fe 3+ and Mn 2+ TTA TX-114 [61]

Hg 5-Br-PADAP

PONPE7.5 [62] Cd, Cu, and Pb

PAN TX-114 [63] Zn(II), Co(II), Ni(II) and Pb(II).

2GB TX-114 [64] Ag, Co, Cr, Cu, Fe, Mn, Ni and Pb APDC TX-114 [65]

uranium(VI) 8-HQ TX-114 [22] Zn(II), Co(II) and Ni(II) PAN TX-114 [66]

Ni ，Zn PAN TX-114 [67] Ag ，Au DDTP TX-114 [68] Cd ，Pb DDTP TX-114 [69] Cu DDTP TX-100 [70，71]

Fe APDC TX-100-45 mixture

[72]

Cr （Ⅲ），Cr （Ⅵ） APDC TX-114 [73] Cd ，Cu ，Pb ，Zn TAN TX-114 [74]

Co ，Ni TAN TX-114 [75]