RNA干扰技术抑制新加坡石斑鱼虹彩病毒感染_省略_多肽ICP46与绿色荧光蛋白融
第34卷第4期2010年4月
水产学报
JOURNAL OF FISHERIES OF CHINA
Vol.34，No.4Apr.，2010
文章编号：1000－0615（2010）04－0611－07DOI ：10.3724/SP.J.1231.2010.06703
收稿日期：2009-11-12
修回日期：2009-12-24
资助项目：国家“八六三”高技术研究发展计划（2006AA09Z411，
2006AA100306）；国家自然科学基金项目（30930070）；广东省自然科学基金项目（06104920）
通讯作者：秦启伟，
Tel ：020－89023638；E-mail ：qinqw@https://www.wendangku.net/doc/dd10601229.html, RNA 干扰技术抑制新加坡石斑鱼虹彩病毒感染细胞多肽ICP46
与绿色荧光蛋白融合基因的表达
夏立群1，2，梁海鹰1，张红莲1，2，秦启伟
3*
（1.广东海洋大学水产学院，广东湛江524025；
2.中山大学生命科学学院有害生物控制与资源利用国家重点实验室，广东广州510275；
3.中国科学院南海海洋研究所中国科学院海洋生物资源可持续利用重点实验室，广东广州510301）
摘要：新加坡石斑鱼虹彩病毒（singapore grouper iridovirus ，
SGIV ）是一种严重的能引起全身性疾病的病原体，对石斑鱼养殖造成了重大的经济损失。将含有SGIV 感染细胞多肽ICP46（infected cell polypeptides 46）基因的真核表达载体pEGFP-ICP46转染到胖头鲤细胞（fathead minnow cells ，FHM ）中进行融合表达，用荧光显微镜观察到ICP46-GFP 融合蛋白主要分布于FHM 细胞的细胞质中。根据SGIV ICP46的序列，设计并体外化学合成了特异性干扰SGIV ICP46的siRNA （siRNA-ICP46），与pEGFP-ICP46共转染到FHM 细胞中，通过荧光显微镜观察不同时间点荧光强度的变化。转染后24 48h ，实验细胞（共转染siRNA-ICP46和pEGFP-ICP46）和阳性对照细胞（共转染siRNA-GFP 和pEGFP-ICP46）中的荧光微弱，发荧光的细胞数量较阴性对照（共转染siRNA-Negative 和pEGFP-ICP46）少70%左右，但其后实验细胞和阳性
对照细胞的荧光强度开始增强，在转染后72h 其与阴性对照组已差别不大。说明体外化学合成的siRNA-ICP46转染后24 48h 可有效抑制FHM 细胞中外源导入SGIV ICP46基因的表达。
关键词：RNA 干扰；绿色荧光蛋白；石斑鱼虹彩病毒；感染细胞多肽ICP46中图分类号：Q 78；S 941文献标识码：A 新加坡石斑鱼虹彩病毒（singapore grouper iridovirus ，SGIV ）是近年来分离自养殖石斑鱼（Epinephelus tauvina ）的一种新型致病性虹彩病毒，
该病毒可导致石斑鱼死亡率达90%以上，鱼类感染后的主要症状为脾肿大、出血
［1－2］
。目前
SGIV 的分离鉴定、分子分类、基因组学、转录组学、蛋白组学及快速检测方法等相关基础研究已经完成［3－5］
，对SGIV 重要功能基因的研究正陆续
展开
［6－8］
。
SGIV 转录图谱研究确定ORF162L 是一个立即早期基因
［5］
，通过对SGIV ORF162L 的生物信
息学分析，发现这个基因与感染细胞多肽ICP46（infected cell polypeptides 46）具有较高同源性。
Eaton 等［9］对全基因组测序的12种虹彩病毒进行
了比较基因组研究，并找出26个虹彩病毒科的核心基因，ICP46即为核心基因之一，提示ICP46可能在虹彩病毒科病毒的感染过程中具有重要的作
用。目前，尚未有ICP46功能的研究报道［10］
。对立即早期基因SGIV ICP46（ORF162）的研究有助于在分子与细胞水平上了解虹彩病毒与宿主的相互作用机制及其感染致病机理，并为防治虹彩病毒病害提供有力的科学依据。
RNA 干扰（RNA interferencing ，RNAi ）是短双链RNA 即小干扰RNA （small interferencing RNA ，siRNA ）介导的对同源基因转录后水平的抑制作用，是细胞发育基因水平的重要调节方式和宿主
抵抗病毒感染的一种重要手段［11－12］。目前，RNAi技术已广泛应用于基因功能、抗病毒感染和基因治疗等的研究［13－15］。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）对细胞无毒性，其表达可用荧光显微镜直接观察，因此作为报告基因广泛应用于基因工程实验中［16－18］。本文将SGIV ICP46和GFP基因融合表达，对SGIV ICP46在FHM细胞中的表达进行了研究，并对利用GFP作为报告分子筛选能有效抑制SGIV ICP46基因表达的siRNA。对RNA干扰技术抑制SGIV ICP46绿色荧光融合蛋白表达的研究为今后研究SGIV ICP46的功能和抗SGIV病毒感染奠定了基础。
1材料与方法
1.1病毒、细胞和质粒
新加坡石斑鱼虹彩病毒、FHM细胞、质粒pEGFP-N3、受体菌DH5α由中山大学有害生物控制及资源利用国家重点实验室保存提供。
1.2工具酶和试剂
PrimeSTAR DNA聚合酶，限制性核酸内切酶Bam HⅠ，XhoⅠ，T
4
连接酶，DNA片段纯化试剂盒购自TaKaRa公司；质粒微量提取试剂盒购自U-gene公司；M199培养基，胰酶（含EDTA）购自Gibco公司；提取无内毒素质粒试剂盒（Endo-Free plasmid mini kit）购自Omega公司；转染试剂Lipofectamine2000购自Invitrogen公司；其它试剂均为国产分析纯。
1.3SGIV总DNA的提取
取适量SGIV病毒悬液，加入等体积的碱裂解缓冲液，37?作用15min至病毒悬液变得较为澄清，再加入等体积的2%SDS和25μL蛋白酶K （10mg/mL），50?作用30min，至病毒悬液完全澄清，12000r/min离心5min，除去碱解不溶物。吸取上清用酚、酚-氯仿（1?1）与酚-氯仿-异戊醇（25?24?1）依次轻柔抽提，上清用2.5倍体积的95%冰乙醇沉淀病毒DNA，12000r/min离心20 min。沉淀用冰冷的70%乙醇洗涤2次，12000r/ min离心1min，沉淀溶于TE缓冲液后，－20?保存。
1.4ICP46-GFP融合表达载体的构建
根据SGIV（accession number：AY521625）ICP46（ORF162L，nucleotide position：139822－138674）的序列和质粒pEGFP-N3酶切位点设计引物：
P1：5?-GCCTCTCGAGTTGTGGAAGATTTAA-3?（XhoⅠ）
P2：5?-CGTGGATCCTTCAGCTGACTCTTCT-3?（Bam HⅠ）
用PrimeSTAR DNA聚合酶高保真扩增目的片段，反应条件为95?预变性5min；94?30s，52?40s，72?1min，共30个循环，再72?延伸8min。PCR产物经DNA片段纯化试剂盒纯化，酶切后以摩尔数比1?3（质粒/插入片段）的比例克隆入质粒pEGFP-N3，菌落PCR和双酶切鉴定后，阳性克隆送上海英骏生物技术有限公司测序。
1.5去内毒素质粒的提取和转染
按Omega公司（Endo-Free plasmid mini kit）说明书，提取无内毒素pEGFP-ICP46和pEGFP-N3质粒。将FHM细胞传代至24孔细胞培养板中，于25?恒温培养箱中培养，待细胞长满单层的90% 95%开始转染。每孔转染需1μg质粒，2μL转染试剂（Lipofectamin2000）。将质粒和转染试剂分别用Opti-MEM培养基稀释至50μL，两者混匀后静置20min。在静置期间，吸走培养板孔中的培养液，加入300μL Opti-MEM培养基洗涤1次，吸走洗涤液。加入质粒和Lipofectamin2000的混合液，轻摇培养板以使混合液与细胞充分接触。25?恒温培养箱中培养4 h后，吸走混合液，加入500μL含有10%胎牛血清的M199培养液，转染完成。
1.6荧光显微镜观察
转染后48h，将转染的细胞消化后传到置于6孔板中的无菌盖玻片上，继续培养12 24h后，吸去培养基，PBS漂洗一次，然后用4%多聚甲醛（paraformaldehyde，PFA）室温固定15min；PBS漂洗3次后用抗荧光淬灭封片剂封片，用荧光显微镜（ZEISS）观察。
1.7siRNA序列的设计
根据SGIV ICP46的序列信息分析结果和siRNA序列的设计原则，设计了特异性干扰SGIV ICP46的siRNA，由广州市锐博生物科技有限公司体外化学合成。正义链和反义链siRNA都为19bp，为了提高siRNA的稳定性，保护siRNA不受Rnase降解，两端各加2个脱氧核酸悬垂。
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绿色荧光蛋白融合基因的表达
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序列名：siRNA-ICP46靶序列：GGCAGATCCTTTCGACAAA
正义链（5?-3?）：5?-GGCAGAUCCUUUCGAC-AAA dTdT-3?反义链（3?-5?）：3?-dTdT CCGUCUAGGAAAG-CUGUUU-5?实验所用阴性对照siRNA （siRNA-negative ）和针对报告基因GFP 的阳性对照siRNA （siRNA-GFP ）均购自广州市锐博生物科技有限公司，目前其对照序列尚未公开。
1.8真核质粒和siRNA 共转染
将FHM 细胞传代至24孔细胞培养板中，于25?恒温培养箱中培养，等细胞长满单层的70－80%，用Lipofectamine 2000将2μL 重组质粒pEGF-ICP46分别和2.5μL （20μmol /L ）siRNA-ICP46、siRNA-GFP 或siRNA-Negative 共转染FHM 细胞。转染后24、36、48、60和72h ，用荧光显微镜观察siRNA 对外源导入FHM 细胞中SGIV ICP46基因的干扰效果，照相时随机选取视野，在GFP 激发光下拍摄绿色荧光，拍摄放大倍数为10
?40，曝光时间统一为600ms 。
2
结果
2.1
SGIV ICP46基因的高保真PCR 扩增
SGIV ICP46基因的高保真PCR 扩增产物，用
1%的琼脂糖凝胶作电泳分析（图1-A ）。得到大小约为1191bp 的目标带，与理论结果相符合，证明扩增目标带成功。2.2
ICP46-GFP 融合表达载体的构建
将ICP46基因PCR 产物与pEGFP-N3载体连接后，转化大肠杆菌DH5α细胞，挑取转化平板上生长的单菌落进行菌落PCR （图1-B ）及双酶切鉴定（图1-C ）。pEGFP-N3载体长4.7kb ，重组质粒经Xho Ⅰ和Bam H Ⅰ双酶切后，
得到与预期结果一致的大小约为1.2kb 和4.7kb 的两个片断，表明SGIV ICP46基因已正确克隆到了pEGFP-N3载体上。将重组质粒进行测序，Clustalx 1.83的比对分析结果表明，重组质粒的插入序列与已报导SGIV ICP46（ORF162L ）的序列完全一致，将成
功构建的重组质粒命名为pEGFP-
ICP46
。图1SGIV ICP46基因高保真PCR 扩增（A ），重组质粒pEGFP-ICP46菌落PCR 鉴定（B ）及酶切鉴定（C ）A ：M.DL 2000DNA 分子量标准；1.阴性对照；2.SGIV ICP46基因的高保真PCR 产物；
B ：M.DL 2000DNA 分子量标准；1 3.阳性克隆；4.阴性对照；
C ：M.DL 6000DNA 分子量标准；1.pEGFP-ICP46/Xho Ⅰ+Bam H Ⅰ；2.pEGFP-ICP46。
Fig.1
Agarose gel electrophoesis of PCR product of SGIV ICP46gene （A ），identification of the recombinant
plasmid pEGFP-ICP46by clony PCR （B ）and restriction anaysis （C ）
A ：M ：DL 2000DNA marker ；1：negative control ；2：PCR amplification of SGIV ICP46gene ；
B ：M ：DL 2000DNA marker ；1－3：positive clone ；4：negative control ；
C ：M ：DL 6000DNA marker ；1：pEGFP-ICP46/Xho Ⅰ+Bam H Ⅰ；2：pEGFP-ICP46.
2.3ICP46-GFP 融合蛋白在FHM 细胞中的表
达
将真核表达重组质粒pEGFP-ICP46转染到真核细胞后，该质粒能在自身携带的SV40早期启动子的作用下中表达一个羧基末端带有增强型
绿色荧光蛋白标签（enhanced green fluorescent protein ，EGFP ）的ICP46-GFP 融合蛋白，通过绿色荧光蛋白来研究ICP46蛋白的表达。实验以空载
体pEGFP-N3和未转染质粒的FHM 细胞为对照，转染后在倒置荧光显微镜GFP 滤镜下观察。
荧光显微镜观察结果显示，未转染质粒的FHM 细胞中没有荧光出现；pEGFP-N3转染的FHM 细胞所表达的GFP 在细胞核和细胞质中都
存在，
细胞核中的绿色荧光较强；而pEGFP-ICP46转染FHM 细胞后所表达的ICP46-GFP 则主要分布于细胞质中（图2）
。
图2带GFP 标签的SGIV ICP46融和蛋白在FHM 细胞中的表达
Fig.2
SGIV ICP46fusion protein expressed by pEGFP-ICP46in FHM cells
2.4siRNA 与pEGFP-ICP46共转染后对
ICP46抑制效果的检测
将siRNA-ICP46、siRNA-GFP 和siRNA-Negative 分别与质粒pEGFP-ICP46共转染FHM 细胞，在转染24、
36、48、60和72h 后利用荧光倒置显微镜观察拍照。结果显示，转染后24 72h ，阴性对照细胞（共转染siRNA-Negative 和pEGFP-ICP46）都有较强的荧光，且发荧光的细胞数目随
时间而不断增多；而转染后24 48h ，实验细胞（共转染siRNA-ICP46和pEGFP-ICP46）和阳性对
照细胞（共转染siRNA-GFP 和pEGFP-ICP46）中的荧光微弱，发荧光的细胞数量较阴性对照少
70%左右（图3上排，中排），但到转染后60h ，实验细胞和阳性对照细胞的荧光强度开始增强，在转染后72h 其与阴性对照组已差别不大（图3下排）。这表明从转染后24h 起，
siRNA-ICP46就能有效的抑制外源导入ICP46的表达，抑制效果可以持续到转染后48h 。这些结果说明，针对ICP46基因专门设计的siRNA-ICP46能有效抑制FHM 细胞中外源导入ICP46基因的表达。
3讨论
立即早期基因是病毒感染宿主后在细胞中最
早表达的一类基因，并在病毒感染复制、宿主细胞生长调控和免疫逃避等方面具有重要功能［19－21］
。对立即早期基因的研究，有利于在分子与细胞水平上了解病毒与宿主的相互作用机制。SGIV 转录图谱研究揭示SGIV ICP46是一个立即早期基
因
［5］
。ORF162同源类似物是虹彩病毒科的核心基因，可能对该科病毒的感染复制具有重要作用，但目前该家族功能未知
［9－10］
。对SGIV ICP46的研究，有助于进一步阐明SGIV 的感染致病机制，
并为防治虹彩病毒病害提供有力的科学依据与应用基础。本实验室通过构建稳定表达SGIV ICP46的细胞系，发现过量表达SGIV ICP46对FHM 细胞生长具有促进作用，表明ICP46可能参与细胞的生长调控。研究还发现过量表达SGIV ICP46可以显著提高SGIV 的滴度，表明ICP46可能对病毒复制起重要作用。
RNAi 技术作为一种全新的抑制基因表达技术，在基因功能研究和抗病毒感染等方面展现出
非常诱人的前景。近年来，
RNAi 抗病毒的研究更是突飞猛进。利用基因沉默机制，减少或消除病
毒侵染、增殖必需的关键基因的表达，抑制病毒的复制和侵染，对由病毒感染引起的疾病的基因治疗提供了一种非常有希望的全新手段，也为反向遗传学和功能基因组学的研究提供了有价值且经
济快捷的工具
［22－23］
。本文构建了与GFP 基因以同一编码读框共表达的ICP46-GFP 表达载体，与siRNA-ICP46共转染FHM 细胞。由于ICP46-GFP 表达载体拥有同一翻译启始序列、翻译启始密码子ATG 和一致编码读框，如果ICP46mRNA 被降解，ICP46-GFP 就不能表达，使GFP 成为反映ICP46表达的报告分子。以GFP 为报告分子，通过荧光显微镜来观
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察siRNA-ICP46对FHM 细胞中外源导入ICP46基因的表达的抑制效果，结果显示：siRNA-ICP46能在转染后24 48h 有效抑制外源ICP46基因
的表达，
说明实验设计的siRNA 靶点是有效的，为进一步研究SGIV ICP46的功能奠定了基础
。
图3
siRNA 与pEGFP-ICP46共转染FHM 细胞后的荧光变化
Fig.3
Green fluorescence detection in FHM cells after co-transfection with siRNA and pEGFP-ICP46
本实验采用化学合成siRNA 进行RNA 干扰，
这种方法具有操作简便，起效快的优点，但非修饰的siRNA 在细胞培养过程中很容易降解，因此其干扰效果是有一定时效性的，我们的研究发现siRNA-ICP46在转染后72h 干扰效果基本消失，这个结果与在哺乳动物细胞中获得的结果类似
［24－25］
。为了获得更为稳定长效的的干扰效果，使其在抗SGIV 病毒感染中具有实际应用的价
值，今后可以考虑通过构建RNA 干扰载体体内表达，或使用经过修饰的siRNA 来进一步开展研究。参考文献：
［1］
Qin Q W ，Lam T J ，Sin Y M ，et al .Electron micro-
scopic observations of a marine fish iridovirus isolated from brown-spotted grouper ，Epinepheous tauvina ［J ］.J Virol Methods ，2001，98（1）：17－24.
［2］Qin Q W ，Chang S F ，Ngoh G H ，et al.Characte-rization of a novel ranavirus isolated from brown-spotted grouper ，Epinephelus tauvina ［J ］.Dis Aquat Organ ，2003，53（1）：1－9.
［3］Song W J ，Qin Q W ，Qiu J ，et al .Functional
genomics analysis of Singapore grouper iridovirus ：complete sequence determination and proteomic analysis ［J ］.J Virol ，2004，78（22）：12576－12590.
［4］Song W ，Lin Q ，Joshi S B ，et al .Proteomic studies of
the Singapore grouper iridovirus ［J ］.Mol Cell
Proteomics，2006，5（2）：256－264.
［5］Teng Y，Hou Z，Gong J，et al.Whole-genome tra-nscriptional profiles of a novel marine fish iridovirus，
Singapore grouper iridovirus（SGIV）in virus-
infected grouper spleen cell cultures and in orange-
spotted grouper，Epinephulus coioides［J］.Virology，
2008，377（1）：39－48.
［6］Wang F，Bi X，Chen L M，et al.ORF018R，a highly abundant virion protein from Singapore grouper
iridovirus，is involved in serine/threonine
phosphorylation and virion assembly［J］.J Gen
Virol，2008，89（5）：1169－1178.
［7］Huang X H，Huang Y H，Gong J，et al.Identification and characterization of a putative lipopolysaccharide-
induced TNF-alpha factor（LITAF）homolog from
Singapore grouper iridovirus［J］.Biochem Biophys
Res Commun，2008，373（1）：140－145.
［8］Xia L Q，Cao J H，Huang X H，et al.Characteriza-tion of the Singapore grouper iridovirus（SGIV）
ORF086R，a putative homolog of ICP18involved in
cell growth control and virus replication［J］.Arch
Virol，2009，154（9）：1409－1416.
［9］Eaton H E，Metcalf J，Penny E，et https://www.wendangku.net/doc/dd10601229.html,parative genomic analysis of the family Iridoviridae：re-
annotating and defining the core set of iridovirus
genes［J］.Virol J，2007，4（11）：1－17.
［10］Pallister J，Goldie S，Coupar B，et al.Promoter activity in the5’flanking regions of the Bohle
iridovirus ICP18，ICP46and major capsid protein
genes［J］.Arch Viro，2005，150（8）：1911－
1919.
［11］Matzke M，Matzke A J，Kooter J M.RNA：guiding gene silencing［J］.Science，2001，293（5532）：
1080－1083.
［12］Carmichael G G.Silencing viruses with RNA［J］.
Nature，2002，418（6896）：379－380.
［13］Kim D，Rossi J.RNAi mechanisms and applications ［J］.Biotechniques，2008，44（5）：613－616.［14］Berkhout B.Toward a durable anti-HIV gene therapy based on RNA interference［J］.Ann N Y Acad Sci，
2009，1175（4）：3－14.［15］Cronin S J，Nehme N T，Limmer S，et al.Genome-wide RNAi screen identifies genes involved in
intestinal pathogenic bacterial infection［J］.
Science，2009，325（5938）：340－343.
［16］Gerdes H H，Kaether C.Green fluorescent protein：applications in cell biology［J］.FEBS Lett，1996，
389（1）：44－47.
［17］程顺峰.牙鲆淋巴囊肿病毒一抗原蛋白的确认及定位［J］.水产学报，2006，30（4）：544－548.［18］单志新，林秋雄，符永恒，等.用绿色荧光蛋白（GFP）作为报告分子筛选有效的siRNA［J］.中
国生物化学与分子生物学报，2007，23（3）：231
－235.
［19］Hobbs W E，DeLuca N A.Perturbation of cell cycle progression and cellular gene expression as a function
of herpes simplex virus ICP0［J］.J Virol，1999，73
（10）：8245－8255.
［20］Moss B，Shisler J L.Immunology101at poxvirus U：immune evasion genes［J］.Semin Immunol，2001，
13（1）：59－66.
［21］Kinchington P R，Fite K，Seman A，et al.Virion Association of IE62，the varicella-zoster virus
（VZV）major transcriptional regulatory protein，
requires expression of the VZV open reading frame
66protein kinase［J］.J Virol，2001，75（19）：
9106－9113.
［22］Kleinman M E，Yamada K，Takeda A，et al.
Sequence-and target-independent angiogenesis
suppression by siRNA via TLR3［J］.Nature，2008，
452（7187）：591－597.
［23］Barichievy S，Saayman S，Arbuthnot P，et al.RNA interference-based gene expression strategies aimed
at sustained therapeutic inhibition of HIV［J］.Curr
Top Med Chem，2009，9（12）：1065－1078.
［24］Mittal V.Improving the efficiency of RNA interfe-rence in mammals［J］.Nat Rev Genet，2004，5
（5）：355－65.
［25］沈剑虹，罗其中，包映晖，等.siRNA抑制神经元NgR mRNA的时效关系和毒性研究［J］.中华神
经外科杂志，2006，22（11）：695－698.
616水产学报34卷
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绿色荧光蛋白融合基因的表达617
The inhibition of expression of SGIV ICP46-GFP in
FHM cell by RNA interferencing
XIA Li-qun1，2，LIANG Hai-ying1，ZHANG hong-lian1，2，QIN Qi-wei3*
（1.College of Fishery，Guangdong Ocean University，Zhanjiang524025，China；
2.State Key Laboratory of Biocontrol，Sun Yat-sen University，Guangzhou510275，China；
3.South China Sea Institute of Oceanology，Chinese Academy of Sciences，Guangzhou510301，China）
Abstract：Singapore grouper iridovirus（SGIV），as a causative agent of serious systemic disease，resulted in significant economic losses in grouper aquaculture.In this study，recombinant eukaryotic vector pEGFP-ICP46 which was inserted with SGIV ICP46（infected cell polypeptides46）gene was transfected into fathead minnow （FHM）cells，and ICP46-GFP fusion protein was successfully expressed in the cytoplasm of FHM cells. Candidate siRNA targeting SGIV ICP46gene（siRNA-ICP46）was designed and chemically synthesized.To investigate the inhibition effect of siRNA-ICP46，pEGFP-ICP46and siRNA was co-transfected into FHM cells，and the green fluorescence was observed by fluorescence microscope at the indicated time points（24，36，48，60and72h post transfection）.During24－48h after transfection，the green fluorescence in FHM cells co-transfected with siRNA-ICP46/pEGFP-ICP46were similar to that of positive control（co-transfected with siRNA-GFP/pEGFP-ICP46），and both of them are about70%weaker than that of negative control（co-transfected with siRNA-Negative/pEGFP-ICP46），which show the siRNA-ICP46can effectively inhibit the extrinsic SGIV ICP46gene in FHM cells during24－48h after transfection.
Key words：RNA interference；green fluorescent protein；Singapore grouper iridovirus（SGIV）；infected cell polypeptides（ICP46）
Corresponding author：QIN Qi-wei.E-mail：qinqw@https://www.wendangku.net/doc/dd10601229.html,