海洋真菌多糖间接竞争ELISA检测方法的建立及方法学评价

中国生化药物杂志Ｃｈｉｎｅ靶Ｊｏ岫１ａｌ

ｏｆＢｉｏｃｈｅｍｉｃａｌ

Ｐｌｌ蚰ｎ船ｅ砸ｃ８２００８年第２９卷第４期

２２３

１

０８

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Ｏ６

５

２

气０４

０２

０一▲一．Ｐｒｏｔｅｉｎ；一●一．ｆ’ｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｏ

图１

ＹｃＰ，ＢｓＡ偶联反应物ｓｅｐｌｌａｃｒｙｌｓ－４００凝胶柱色谱

ＦｉｇｌＧｅｌＩｉｌｔｒａｔｉｏｎｏｆ山ｅｒｅａｃｔｉｏｎｍｉｘｔｕｒｅｏｆＢＳＡ

ｃｏｎｊｕｇａｔｅｄ

ｔｏ

ＹＣＰ

ｏｎ

ａ

ｓｅｐｈａｃｒｙｌ

Ｓ．４００ｃｏｌｕｍｎＲ２５０

亮蓝Ｒ２５０染色。图２显示位于分离胶前缘的ＢＳＡ条带（条带２）和位于分离胶后缘的单一ＹｃＰ—ＢｓＡ偶联产物条带（条带１），ＹｃＰ泳道（条带３）未见染色带，表明ＢｓＡ与ＹｃＰ偶联后的相对分子质量显著增大，且纯化后的ＹＣＰ．ＢｓＡ包被抗原中不含游离的

ＢＳＡ。

１＋ＹＣＩ，＿ＢＳＡ：２．ＢＳＡ：３．ＹＣＰ

图２ＳＤｓ．ＰＡＧＥ电泳ＹｃＰ、ＢｓＡ、ＹｃＰ－ＢｓＡ考马斯亮蓝Ｒ２５０

染色结果

Ｆｉｇ２

ＳＤＳ－ＰＡＧＥ

ｐａｔｔｅｎ

ｏｆ

ＹＣＰ，ＢＳＡ，ＹＣＰ－ＢＳＡ锄ｄｔｌｌｅｇｅｌ

ｗａｓ

８ｔａｉｎｅｄｗｉｔｈＣｏｏｍａｓｓｉｅｂｌｕｅＲ２５０

３．３

包被抗原的浓度筛选

方阵滴定的结果见表ｌ。当Ａ。，。接近１．０时，包

被抗原的浓度为２．５ｒ－∥Ｌ，故试验采用２．５ｍｇ／Ｌ作为包被抗原的工作浓度。

３．４抗原最佳包被时间的选择

结果表明，４℃包被过夜做ＥｕＳＡ测定，Ａ４５０为１．０３。３７℃包被１和２ｈ，所得Ａ４５０（０．９８，０．９２）稍偏小，故试验采用包被过夜作为抗原最佳包被时间。

３．５

ＹＣＰ．ＭｃＡｂ精确稀释倍数的筛选

方阵滴定的结果见表２，当ＹｃＰ．ＭｃＡｂ精确稀释

度为１：５０００时，所得到的灵敏度更高，同时也满足了零抑制时Ａ帖。值达到１．０的要求。３．６标准曲线的建立

结果见表３及图３。从表３可知，当ＹｃＰ达到０．１肛ｇ／Ｌ时的Ａ４５０与Ｏ弘ｇ／Ｌ时的Ａ４５０出现明显差

异，故检测限为０．１∥Ｌ。从图３可知，在１—１

０００

肛ｇ／Ｌ之间，曲线呈良好的线性关系，且此段曲线的

斜率较大，因此最适的检测范围为１—１

０００ｐｇ／Ｌ。

线性回归方程为ｌｇ（Ｂ／Ｂ０％）＝一Ｏ．１７１

８

ｌｇＣＹｃＰ

＋１．９６３８，ｒ＝０．９９ｌ６。

３．７精密度

在问接竞争ＥｕｓＡ工作条件下，５，５０，５００，１

０００

肛叽浓度下的日内殿沏（ｎ＝５）分别为５．４５％，

３．０９％，３．７２％，１．２３％；日间兄妨（ｎ＝５）分别为

８．３７％，５．４８％，４．７０％，２．７９％，表明该方法稳定，重复性好。３．８特异性试验

特异性试验中，抗体与ＹｃＰ多糖结合反应被ＹＣＰ特异性的抑制（１５０＝ｏ．０３４８肛ｇ／ｍＬ），除直链淀

粉（１５０＝５０弘ｇ／ｍＬ）和糖原（１５０＝５０弘ｇ／ｍＬ）对抗体与ＹＣＰ多糖结合反应成微弱抑制之外，余下的纤维二糖、芦荟多糖对抗体与ＹｃＰ多糖结合反应均无抑制

作用，间接竞争ＥｕｓＡ方法检测ＹＣＰ的含量有着较好的特异性。４讨论

竞争法一般有３种反应模式：①用酶标记抗原竞争性地检测抗原【１５１；②用酶标记抗体竞争性地检测抗原（直接抑制法）［蚓；③用酶标记第二抗体竞争性地检测抗原（间接竞争ＥＬＩｓＡ法）¨７｜。前两种方

表１包被抗原工作浓度的筛选（Ａ伽）

仙１

．１１ｌｅｗｏｒｋｉｎｇｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｆｏｒ锄ｔｉｇｅｎ

ｔｏｃｏａｔｔｈｅ

ＥｕｓＡｐｌａｔｅｓ（Ａ４５０）

４

糖

，

多一

●

，号一自，

蛋一

▲

，

一