生工pUCm-T载体

T-载体PCR产物克隆试剂盒

产品编号：SK2213/SK2214

包装规格：20次/100次

试剂盒组成

组分SK2213，20次SK2214，100次

T Vector 1 μg 5 μg

10×Ligation Buffer 50 μl 200 μl

50% PEG 4000 50 μl 200 μl

T4 DNA Ligase, 5 U/μl 100 U 500 U

Sterilized ddH2O 1 ml 1 ml

操作手册1份1份

保存方法及注意事项

该产品低温运输，-20°C保存，有效期见包装。

产品介绍

pUCm-T Vector是一种高效克隆PCR产物（TA Cloning）的专用载体。本载体由pUC系列载体改建而成，在pUC载体的多克隆位点处插入特殊的限制性内切酶识别位点，酶切后能在载体的3’端形成悬挂的“T”末端，大大提高了3’末端A突出PCR产物的连接、克隆效率。

本载体在插入位点两端独特设计了两个Pst I 识别位点，可以用Pst I 单酶切对插入片段进行检测，大大方便了客户的酶切检测步骤。经本载体克隆的PCR片段，可以用M13通用引物和T7启动子引物进行测序。

实验准备

1. PCR产物3’末端带有突出的A碱基：Taq、Tth、AmpliTaq、KlenTaq DNA聚合酶扩增的PCR产物3’末端均带有突出的A

碱基。建议扩增的PCR产物通过琼脂糖凝胶电泳进行回收，再进行连接转化实验，可以使用生工产品柱式DNA胶回收试剂盒（SK8131/8132）。如果PCR扩增产物特异性很高，可直接使用生工产品柱式PCR产物纯化试剂盒

（SK8145/8146）纯化PCR产物。

2. PCR产物3’末端没有突出的A碱基：Pfu、Pwo、Tli或DeepVent等DNA聚合酶具有3’5’外切酶活性，其扩增的PCR产

物末端可能不带有3’ A，要对这种平末端PCR产物进行克隆，应先对其进行3’末端加A，再进行连接转化实验。建议选用生工产品dA-Tailing Kit （SK2291/2292）进行加Ａ实验。

3. 自备试剂：SOC培养基、IPTG、X-gal等。

标准操作步骤

?一般最后加入T4 DNA Ligase。

2. 16 °C连接1~12 h。

?为了达到最佳连接效果，建议16 °C连接过夜。

3. 将100 μl感受态细胞置于冰上解冻后，加入上述10 μl连接液，轻轻混匀，冰上放置30 min。

?可选用一步法制备感受态细胞溶液（SK9307/9308）快速（5 min）制备感受态细胞。

4. 42°C水浴热激90 sec，再冰上放置5 min。

5. 加入900 μl SOC培养基，37°C振荡培养1 h。

6. 4000 rpm离心3 min，用枪头吸掉750 μl上清液，用剩余的培养基将细胞悬浮。

7. 将细菌悬液均匀涂布在含20 μl IPTG（100 mM ）和100 μl X-gal（20 mg/ml）的氨苄青霉素抗性的LB平板上。

?涂布菌液的用量可以根据连接的效率及感受态细胞的转化效率而进行适当的调整。

8. 将平板于37°C培养1 h，然后倒置培养过夜。

?先将平板正向放置1小时，以吸收过多的液体。

9. 用牙签挑取白色菌落，以M13通用引物或基因特异性引物进行PCR扩增，确认载体中插入片段的长度大小。或将白色

菌落挑至含氨苄青霉素的液体培养基中37°C培养过夜，提取质粒后进行酶切鉴定。

操作提示

1. PCR产物的纯度

a. 连接反应前需用琼脂糖凝胶电泳检测PCR反应产物，如果电泳检测PCR产物条带弥散，或出现非特异条带，则需要切

下目的条带，用胶回收试剂盒对目的片段进行回收。若PCR产物电泳检测只有预期大小的明显条带，也应使用PCR产物纯化试剂盒直接纯化PCR产物，以除去引物二聚体。不经纯化的PCR 产物在某些条件下可直接用于连接，但由于引物二聚体和PCR产物中其它物质的影响，造成含有插入片段的阳性克隆数减少，因而需要筛选很多克隆方可得到含有目的PCR产物的阳性克隆。

2. 平端PCR产物

a. 具有校正活性的热稳定性DNA 聚合酶如Pfu、Pwo、Tli在进行PCR扩增时产生平端PCR产物。这种平端PCR 产物

可以进行3’末端加A 尾后连接到pUCm-T载体中，采用这种方法进行连接，可大大提高克隆的效率。

3. 优化插入片段和载体的摩尔比

a. pUCm-T载体优化的插入DNA片段和载体的摩尔比为3:1，采用3-10:1 的连接比例也可成功进行连接。如果你的PCR

产物开始连接的不理想，则有必要优化连接比例。

b. PCR 产物的量可采用以下公式进行换算：

PCR片段的量（ng）= [ 加入载体的量（ng）×插入片段大小（kb）/ 载体大小（kb）] ×插入片段和载体的摩尔比4. 筛选含插入片段的转化子

a. 插入片段成功克隆到pUCm-T载体中，可阻断β 半乳糖苷酶的编码序列，因而重组克隆可在指示培养基上通过颜色进

行筛选。大多数情况下含有PCR产物的克隆菌为白色，如果PCR片段和LacZ 基因在同一读码框内，即PCR片段碱基数是3的整数倍（含3’-A），并且读码框无终止密码子，则重组克隆菌可能为蓝色。

引物设计基本方法

Primer 5.0搜索引物： 1.Primer Length我常设置在18－30bp,短了特异性不好，长了没有必要。当然有特殊要求的除外，如加个酶切位点什么的。 2.PCR Product size最好是100－500bp之间，小于100bp的PCR产物琼脂糖凝胶电泳出来，条带很模糊，不好看。至于上限倒也不必要求苛刻。 3.Search parameters还是选Manual吧，Search stringency应选High，GC含量一般是40－60％。其它参数默认就可以了。 4.搜索出来的引物，按Rating排序，逐个送Oligo软件里评估。当然，搜索出的引物，其扩增产物很短，你可以不选择它，或是引物3端≥2个A或T,或引物内部连续的G或C太多,或引物3端≥2个G或C，这样的引物应作为次选，没得选了就选它。对于这样的引物，如果其它各项指标还可以，我喜欢在引物末端去掉一个不满意的或加上一个碱基，看看引物的评估参数有没有变好点。 Oligo 6.0评估引物： 1.在analyze里,Duplex Formation不管是上游引物、下游引物还是上下游引物之间，The most stable 3’-Dimer绝对值应小于4.5kcal/mol, The most stable Dimer overall绝对值一般应小于多少kcal/mol跟PCR退火温度有关，我几次实验感觉在PCR退火温度在65°的时候，The most stable Dimer ove rall 6.7kcal/mol没有问题。 2.Hairpin Formation根据黄金法则 3.False priming sites: Primer的priming efficiency应该是错配地方的4倍左右，更多当然更好。 4.在PCR栏，个人感觉其所显示的optimal annealing temperature数值值得参考。在PCR摸索条件的时候，退火温度为其数值加减2的范围就可以了。 5.Internal stability很重要：我们希望引物的内部稳定性是中间高、两边低的弧形，最起码保证3端不要过于稳定。下图1引物3端过于稳定，很容易导致不适当扩增。△G参照黄金法则，这其实很好理解：把一滴水放到大海里，这滴水就会不停的扩散分布，扩散的越厉害越稳定，所以△G绝对值越大结构越稳定。 最后说一句，敢于尝试就会成功。 第二贴 －－科室工作很多，小医生了，没有办法，所以肯怕不能满足很多战友的要求（qq聊或帮助设计），在此表示抱歉。就楼上的问题我试着回答一下，不一定正确，供参考吧。 －－1、两个评价系统不一样，个人感觉oligo评价引物好点，primer出来的引物，我一般按效率排序，再结合退火温度和引物长度，选择引物到oligo测试。这是初步的选择，其实引物到了oligo里，退火温度也不一样。 －－2、3端的二聚体应该避免，这个要看你的退火温度决定，一个50°的退火温度肯定和65°对二聚体的影响不一样了，一般来讲尽量控制在－4.5kcal/mol以下（个人观点，很多东西真得还是需要自己摸索）。 －－3、个人感觉3端有A无A影响不大，3端有T的没有经验。有T是不是一定不行，个人感觉不见得。软件是评估，法则也不是没有例外，不是1＋1＝2那么确定。 －－4、错配和二聚体谁轻谁重，个人觉得“到致命的程度”谁都重要，我也说不好。我设计的时候，尽量两个都不得罪。 －－5、GC含量并非不重要，它直接影响引物各端稳定性，3端来两个G或C,稳定性就上去了，粘在模板上很牢。所以我设计的时候，尽量避免这样的情况出现。 谈一下我学这个引物设计的过程吧：

生物工程设备

1.生物质原料的粉碎的设备：锤式、辊式、湿式、超细、纳米粉碎机、球磨机、切片机。 2.连续灭菌流程：加热、保温（湿）、冷却。 3.啤酒生产中麦芽汁的制备设备：糊化锅、糖化锅、过滤槽、麦汁煮沸锅、糖化醪过滤槽。 4.糊化锅的作用：用于煮沸大米粉和部分麦芽粉醪液，使淀粉糊化和液化。 5.氧传递模型：双膜理论、渗透扩散、表面更新理论。 6.常用通风式（固态）生物反应器种类：填充床、流化床、转鼓式、浅盘式、搅拌生物反应器和压力脉动固态发酵生物反应器。 7.生物反应器的放大方法：经验放大法、因次分析法、时间常数法、数学模拟法。 8.经验放大法原则：几何相似放大、以单位体积液体中搅拌功率相同放大、以单位培养液体积的空气流量相同的原则进行放大、以空气线速度相同的原则进行放大、以kLa相同的原则进行放大、搅拌器叶尖速度相同的准则、混合时间相同的准则。 9.液液萃取设备：混合设备、分离设备、兼有混合和分离两种功能的设备。 10.蒸发器组成：加热室、分离器。 11.固体输送设备：带式输送机、斗式提升机、螺旋输送机。 12.垂直管中气力输送设备流程：粒子向下加速运动；粒子相对静止；粒子向上加速运动。 13.生物除菌方法：辐射杀菌、化学药品杀菌、干热杀菌。 14.空气过滤除菌流程：两级冷却、加热除菌流程；高效前置过滤空气除菌流程。 15.过滤除菌效率与空气流速关系：当气流速度较大时，v↑η↑，此时惯性冲击起主要作用；当气流速度较小时，v↑η↓，此时扩散起主要作用；当气流速度中等时，可能是截留起主要作用；如果气流速度过大，除菌效率又下降，则是由于重新污染。1.GMP：药品生产质量管理规范，指在药品生产全过程中运用科学的原理和方法来保证生产出优质产品的一整套科学管理办法。 2.冷冻干燥：将物料冷冻至水的冰点以下，并置于高真空的容器中，通过供热使物料中的水分直接从固态冰升华为水汽的一种干燥方法。 3.渗透平衡：两溶液过一段时间后的分压相同，相当于进入半透膜的水与出半透膜的水相同，就会达到渗透平衡。不管是什么溶液体系给够足够时间后一定能达到渗透平衡。 4.渗透：渗透是水分子经半透膜扩散的现象。它由高水分子区域（即低浓度溶液）渗入低水分子区域（即高浓度溶液），直到细胞内外浓度平衡（等张）为止。水分子会经由扩散方式通过细胞膜，这样的现象，称为渗透。 5.离子交换法：应用合成的离子交换剂作为吸附剂，将溶液中的物质，依靠库仑力吸附在交换剂上，然后用合适的洗脱剂将吸附物质从交换剂上洗脱下来，达到分离、浓缩、提纯的目的。 6.湿热灭菌：指用饱和水蒸气、沸水或流通蒸汽进行灭菌的方法，以高温高压水蒸气为介质，由于蒸汽潜热大，穿透力强，容易使蛋白质变性或凝固，最终导致微生物的死亡。 7.双水相萃取：一些亲水性高分子聚合物的水溶液超过一定浓度后可以形成两相，并且在两相中水分均占很大比例，即形成双水相系统。 8.超临界流体：温度和压力均在本身的临界点以上的高密度流体，具有和液体同样的凝聚力、溶解力。 9.体积传质系数：是决定反应器结构的最相关的参数，它是质量传递的比速率，是指在单位浓度差下，单位时间、单位界面面积所吸收的气体。

引物设计原则(必看)

mi引物设计原则 1. 引物的长度一般为15-30 bp，常用的是18-27 bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于Taq DNA聚合酶进行反应。 2. 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错配。引物3’端出现3个以上的连续碱基，如GGG或CCC，也会使错误引发机率增加。 3. 引物3’端的末位碱基对Taq酶的DNA合成效率有较大的影响。不同的末位碱基在错配位置导致不同的扩增效率，末位碱基为A的错配效率明显高于其他3个碱基，因此应当避免在引物的3’端使用碱基A。另外，引物二聚体或发夹结构也可能导致PCR反应失败。5’端序列对PCR影响不太大，因此常用来引进修饰位点或标记物。 4. 引物序列的GC含量一般为40-60%，过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。 5. 引物所对应模板位置序列的Tm值在72℃左右可使复性条件最佳。Tm值的计算有多种方法，如按公式Tm＝4(G+C)＋2(A+T)，在Oligo软件中使用的是最邻近法(the nearest neighbor method)。 6. ΔG值是指DNA双链形成所需的自由能，该值反映了双链结构内部碱基对的相对稳定性。应当选用3’端ΔG值较低（绝对值不超过9），而5’端和中间ΔG 值相对较高的引物。引物的3’端的ΔG值过高，容易在错配位点形成双链结构并引发DNA聚合反应。 7. 引物二聚体及发夹结构的能值过高（超过4.5kcal/mol）易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使PCR反应不能正常进行。 8. 对引物的修饰一般是在5’端增加酶切位点，应根据下一步实验中要插入PCR 产物的载体的相应序列而确定。 引物序列应该都是写成5-3方向的， Tm之间的差异最好控制在1度之内， 另外我觉得扩增长度大一些比较好，500bp左右。 要设计引物首先要找到DNA序列的保守区。同时应预测将要扩增的片段单链是否形成二级结构。如这个区域单链能形成二级结构，就要避开它。如这一段不能

生工设备复习(2011.5.25)

湖北工业大学生物工程设备习题(2011.5) 一.单项选择题: 1. 空气过滤系统中旋风分离器的作用是______________。 A.分离油雾和水滴 B.分离全部杂菌 C.分离二氧化碳 D.分离部 分杂菌 2. 无论是种子罐或发酵罐，当培养基尚未进罐前对罐进行预先灭菌，我们称为空罐灭菌，此时对灭菌温度和灭菌时间的要求是 ____________________，只有这样才既合理经济，又能杀灭设备中各死角残存的杂菌或芽孢。 A.高温瞬时(133℃，15秒钟) B.同实罐灭菌一样(115℃，8-15分钟) C.高温长时(121℃，30分钟) D.间歇灭菌(100℃，30分钟，连灭三次) 3. 机械轴封的动环的硬度比静环_______。动环的材料可用 ___________，静环最常用的材料是___________。 A.大，碳化钨钢，铸铁 B.大，碳化钨钢，聚四氟乙烯 C.小，聚四氟乙烯，不锈钢； D.小，聚四氟乙烯，碳化钨钢。 4. 空气过滤系统中空气加热器的作用是______________。 A.对空气加热灭菌 B.升高空气温度，以降低空气的相对湿度 C.对空气加热，蒸发除去空气中的部分水份 D.升高空气温度，杀灭不耐热的杂菌 5. 机械搅拌发酵罐中最下面一档搅拌器离罐底距离一般 ____A______搅拌器直径的高度，最上面一个搅拌器要在液层以下0.5

米(大罐)。 A.小于一个 B.大于一个小于两个 C.等于一个 D.等于两个 6. 安装在空气压缩机前的过滤器主要作用是______________。 A.将空气过滤为无菌空气 B.过滤分离空气中的油雾 C.过滤分离空气中的水滴 D.减轻总空气过滤器的过滤负荷 7. 为了减轻空气过滤系统的负荷空气压缩机最好选用_________空气压缩机。 A.往复式 B.离心式 C.高压 D.无油润滑 8. 培养基连续灭菌流程中选用管道维持器，应该使培养基在管道的流速达到______，才能保证先进先出。 A.过渡流 B.层流 C.活塞流 D.湍流 9. 冷冻升华干燥主要是升华___________。 A.游离水 B.结构水 C.冷凝水 D.气态水。 10. 实现真空冷冻干燥的必要条件是___________。 A．干燥过程的压力应高于操作温度下冰的饱和蒸汽压 B．干燥过程的压力应低于操作温度下冰的饱和蒸汽压 二. 多项选择题: (每题1分) 11. 好气性发酵需要无菌空气，概括起来无菌空气在发酵生产中的作用是______。 A.给培养微生物提供氧气 B.也能起一定的搅拌作用，促进菌体在培养基中不断混合，加快生长繁殖速度 C.打碎泡沫，防止逃液 D.保持发酵过程的正压操作

引物合成的步骤及方法介绍

引物合成的步骤及方法介绍 Oligo DNA的人工化学合成始于50年代初期，1980年，全自动的固相DNA合成仪面市后，使得快速、高效合成Oligo DNA成为可能，这大大地推动了生物工程技术的蓬勃发展。 现在一般都采用β-乙腈亚磷酰胺化学合成Oligo DNA，将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的合成时从3' →5' 方向进行，通常3' 端的第一个碱基结合在Glass担体 (Controlled Pore Glass，CPG)上。其具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。 合成步骤 Step1：脱掉附加在CPG担体上的第一个碱基5' -OH基团上的保护基 (DMTr)，准备附加下一个新的碱基；Step2：活化新的碱基单体 (Phosphoramidite)，准备与第一个碱基进行反应； Step3：第二个碱基与第一个碱基发生偶联反应； Step4：将没有反应的第一个碱基的5' -OH加帽封死 (Capping)，使其不再进一步参与反应； Step5：将核苷亚磷酸酯氧化成更稳定的核苷磷酸酯 (即将三价磷氧化成五价磷)。 Step6：重复进行Step1～Step5的循环，直至合成完所需的Oligo DNA序列。 Step7:合成结束后，将Oligo DNA分子从CPG上切下，再进行进一步的纯化。 图1 Oligo DNA合成原理。N1代表第一个碱基，N2代表第二个碱基，依此类推。 OD数的确定 一般PCR扩增，2 OD引物，可以做200-500次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退 火后做连接，1 OD就足够了。但是有些研究人员，就做几次PCR，但是却要5-10 OD。做全 基因构建的引物都比较长，但是我们有些研究人员也要求高OD数。片段越长, 最后全长得 率就越低，出错的几率就越大。超出需要之外的OD数要求，也是一种浪费。 引物纯度检测 实验室方便的作法是用PAGE方法。使用加有7M尿素的16%的聚丙烯酰胺凝胶进行电泳。取

生物工程设备

生物工程设备 教学大纲 生物科学与工程学院 生物工程教研室编2009年9月第三次修改

编写说明 生物工程设备是生物工程专业的专业核心课程之一，在我系的专业课教学中占有特别重要的地位。生物工程设备是专门研究生物工厂设备的一门学科，是生物工程专业的专业课，在学过的生物工艺，化工原理，生物化学的基础上开设的。生物技术是以基因工程为先导，结合发酵工程、酶工程和生化工程等技术，构成现代生物技术。生物工程设备则是生物工程技术和化学工程与设备交叉的结合体。具体内容包括：生化反应器、生化反应物料处理及产物分离纯化设备和辅助系统设备的原理和设计及计算。通过本课程的学习使学生能够了解和掌握发酵工厂常用的发酵设备、分离提取原理及设备。并为学习其他工艺学奠定基础。 为了规范教学，提高我系的生物工程专业课的教学质量，特编写此大纲。 生物工程设备教学大纲，全面系统的介绍发酵工艺的内容，结合本学科的最新成果组织编写。本大纲的内容有：教学目的与要求、教学重点与难点、教学内容、并提供了思考题、教学参考书及课时分配表等。 本大纲由李树立老师编写，教研室集体审定。 生物工程教研室 2009年9月

课时分配表

目录理论教学部分： 第一章概述 第二章物料处理和输送设备 第一节固体物料的处理与粉碎设备 第二节固体物料输送设备 第三节液体物料的输送设备 第三章空气净化除菌设备 第一节空气净化除菌的方法与原理 第二节空气过滤除菌设备及计算 第四章培养基的制备设备 第一节糖蜜原料的稀释与澄清 第二节淀粉质原料的蒸煮糖化设备 第三节啤酒生产麦芽汁的制备 第四节培养基的灭菌 第五章通风发酵设备 第一节机械搅拌通风发酵罐 第二节气升式发酵罐(ALR) 第三节自吸式发酵罐 第四节通风固相发酵设备 第五节其他类型的通风发酵反应器简介第六章嫌气发酵设备 第一节酒精发酵设备 第二节啤酒发酵设备 第三节连续发酵 第七章植物细胞(组织)和动物细胞培养反应器第一节植物细胞(组织)培养反应器 第二节动物细胞培养反应器 第三节微藻培养反应器 第八章生物反应器的比拟放大 第一节生物反应器的放大目的及方法 第二节通气发酵罐的放大设计 第九章过滤、离心与膜分离设备 第一节过滤速度的强化 第二节过滤设备 第三节离心分离设备 第四节膜分离设备 第十章离子交换分离原理及设备 第一节离子交换树脂 第二节离子交换分离原理 第三节离子交换设备 第十一章蒸发与结晶设备 第一节常压与真空蒸发设备

测序引物设计指南

测序引物设计指南 ?P CR引物设计方法： 1.引物最好在模板cDNA的保守区内设计。 DNA序列的保守区是通过物种间相似序列的比较确定的。在NCBI上搜索不同物种的同一基因，通过序列分析软件（比如DNAman）比对（Alignment），各基因相同的序列就是该基因的保守区。 2.引物长度一般在15~30碱基之间。 引物长度（primerlength）常用的是18-27bp，但不应大于38，因为过长会导致其延伸温度大于74℃，不适于TaqDNA 聚合酶进行反应。 3.引物GC含量在40%~60%之间，Tm值最好接近72℃。 GC含量（composition）过高或过低都不利于引发反应。上下游引物的GC含量不能相差太大。另外，上下游引物的Tm值（meltingtemperature）是寡核苷酸的解链温度，即在一定盐浓度条件下，50%寡核苷酸双链解链的温度。有效启动温度，一般高于Tm值5~10℃。若按公式Tm=4（G+C）+2（A+T）估计引物的Tm值，则有效引物的Tm为55~80℃，其Tm值最好接近72℃以使复性条件最佳。 4.引物3′端要避开密码子的第3位。 如扩增编码区域，引物3′端不要终止于密码子的第3位，因密码子的第3位易发生简并，会影响扩增的特异性与效率。 5.引物3′端不能选择A，最好选择T。 引物3′端错配时，不同碱基引发效率存在着很大的差异，当末位的碱基为A时，即使在错配的情况下，也能有引发链的合成，而当末位链为T时，错配的引发效率大大降低，G和C错配的引发效率介于A、T之间，所以3′端最好选择T。 6.碱基要随机分布。 引物序列在模板内应当没有相似性较高，尤其是3’端相似性较高的序列，否则容易导致错误引发（Falsepriming）。降低引物与模板相似性的一种方法是，引物中四种碱基的分布最好是随机的，不要有聚嘌呤或聚嘧啶的存在。尤其3′端不应超过3个连续的G或C，因这样会使引物在GC富集序列区错误引发。 7.引物自身及引物之间不应存在互补序列。 引物自身不应存在互补序列，否则引物自身会折叠成发夹结构（Hairpin）使引物本身复性。这种二级结构会因空间位阻而影响引物与模板的复性结合。引物自身不能有连续4个碱基的互补。 两引物之间也不应具有互补性，尤其应避免3′端的互补重叠以防止引物二聚体（Dimer与Crossdimer）的形成。引物之间不能有连续4个碱基的互补。 引物二聚体及发夹结构如果不可避免的话，应尽量使其△G值不要过高（应小于4.5kcal/mol）。否则易导致产生引物二聚体带，并且降低引物有效浓度而使P CR反应不能正常进行。

引物合成基础问题

Q1.引物是如何合成的？ 目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种,无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。 (1) 去保护：加入Deblocking脱去碱基上5- OH的保护基团DMT，获得游离的5- OH； (2) 耦合：同时加入活化剂和新的碱基，新的碱基5-OH仍然被DMT保护，3端被活化与溶液中游离的5-OH 发生耦合反应； (3) 封闭：耦合反应中极少数5- OH没有参加反应，用封闭试剂终止其后继续发生反应； (4) 氧化：加入氧化剂使其由核苷亚磷酸酯形成更稳定的核苷磷酸酯。 Q2.引物合成如何处理？ 切割与脱保护基：将合成好的寡核苷酸链从支持物上化学切割下来。常用新鲜的浓氨水来裂解CPG与初始核苷之间的酯键。断裂下来的寡核苷酸带有自由的3’羟基。 纯化：根据所合成寡核苷酸的组成和应用来选定纯化的方法。常用的纯化方法有：C18、OPC、PAGE和HPLC。 定量：根据寡核苷酸在260nm处的紫外吸收来定量。 储存：分装抽干。 Q3.合成的引物5’端是否有磷酸化？ 合成的引物5’为羟基，没有磷酸基团。如果需要您可以用多核苷酸激酶进行5’端磷酸化，或者要求我们合成时直接在5’或3’端进行磷酸化，需要另外收费。 Q4.需要什么级别的引物？ 根据实验需要，确定订购引物的纯度级别。 应用引物长度要求纯度级别要求 一般PCR扩增< 60base HEPD >60 base PAGE 诊断PCR扩增< 40base HEPD, PAGE

DNA测序20base左右HEPD 亚克隆，点突变等根据实验要求定HEPD, PAGE，HPLC 基因构建（全基因合成）根据实验要求定HEPDPAGE 反义核酸根据实验要求定HEPDPAGE 修饰引物根据实验要求定PAGE, HPLC Q5.需要合成多少OD数？ 根据实验目的确定。一般PCR扩增，2 OD引物，可以做500-1000次50ul标准PCR反应。如果是做基因拼接或退火后做连接，1 OD就足够了。 Q6.如何计算引物的浓度？ 引物保存在高浓度的状况下比较稳定。一般情况下，我们建议将引物的浓度配制成100pmol/ul，称为保存浓度，而引物的工作浓度一般配制成10-50pmol/ul。加水的体积（微升）可直接参照合成报告单上推荐的体积，也可按下列方式计算： V (微升)= OD数x 33 x 10000 /引物的分子量 引物的分子量可以从合成报告单上获得。注意：1 OD260= 33 ug/ml。 溶解前您需要核对合成报告单和引物标签上的引物OD数是否一致。如果不一致，请和我们联系。我们可以根据生产记录查到实际产量是多少。 Q7.如何计算引物的Tm值？ 引物设计软件都可以给出Tm，与引物长度、碱基组成及所使用缓冲夜的离子强度有关。 长度为25base以下的引物，Tm计算公式为：Tm = 4℃(G + C)+ 2℃(A + T) 对于更长的寡聚核苷酸，Tm计算公式为： Tm = 81.5 + 16.6 x Log10[Na+] + 0.41 (GC%) – 600/size＊ ＊公式中，Size =引物长度。 Q8.引物（含修饰）的分子量是如何确定的？ 非修饰的引物的分子量（MW）在随引物提供的报告单上可以找到。如果需要估计一个引物的分子量按每个碱基的平均分子量为324.5，引物的分子量=碱基数x碱基的平均分子量，或按下列公式计算MW= (NA

引物设计大全

引物设计和Primer-BLAST的应用 Lv Peng 2015.11.18

CONTENT 1.PCR-引物设计目的 2.引物设计原则 3.设计引物软件 4.在线设计工具 5.probeBase 简介

1.1PCR（Polymerase Chain Reaction） 聚合酶链式反应 1971 Khorana 提出设想 1985 Kary Mullis 发明了PCR 1986年5月 Mullis在冷 泉港实验室 做专题报告 冷泉港实验室（The Cold Spring Harbor Laboratory，缩写CSHL），又译为科尔德斯普林实验室。

几不同的PCR技术 1.扩增已知序列两侧DNA的PCR：反向PCR（Inverse PCR，IPCR）、锚定PCR（anchored PCR）、RACE（Rapid Amplification of cDNA Ends）、连接介导的PCR（ligation-mediated PCR，LM-PCR）； 2.检测有限量稀有靶序列，即一对引物扩增产物不足以以通过凝胶电泳观察到的时：巢式PCR（nested PCR）； 3.快速、灵敏、特异而准确定量的PCR：实时荧光定量PCR （real-time quantitative PCR，RQ-PCR）。

特性 优化 碱基组成 （G+C ）含量应在40%-60%，4种碱基要分布均匀；长度 一般为18-27个核苷酸长度。上下游引物长度差别不能大于3bp ；重复和自身互补序列 不能有大于3bp 的反向重复序列或自身互补序列存在；上下游引物互补性一个引物的3’末端序列不能结合到另一个引物的任何位点上； 解链温度（Tm ） 两个引物的Tm 值相差不能大于5℃，扩增产物与引物的Tm 值相差不能大于10℃3’末端 引物3’末端碱基尽量为G 或C ，不能使3’末端有NNGC 或NNCG 序列引物序列不要有局部的GC rich 或AT rich （特别是3’端），避开T/C 或A/G 的连续结构 1.2引物设计原则 引物特性及优化设计

引物合成步骤

引物化学合成不同于酶促的DNA合成过程从5'→3'方向延伸，而是由3'端开始。具体的反应步骤如下： 一、脱保护基(Deblocking) 用三氯乙酸(Trichloroacetic Acid，TCA)脱去连结在CPG(Controlled Pore Glass)上的核苷酸的保护基团DMT(二甲氧基三苯甲基)，获得游离的5'-羟基端，以供下一步缩合反应。 二、活化(Activation) 将亚磷酰胺保护的核苷酸单体与四氮唑活化剂混合并进入合成柱，形成亚磷酰胺四唑活性中间体(其3'-端已被活化，但5'-端仍受DMT保护)，此中间体将与GPG上的已脱保护基的核苷酸发生缩合反应。 三、连接(Coupling) 亚磷酰胺四唑活性中间体遇到CPG上已脱保护基的核苷酸时，将与其5'-羟基发生亲合反应，缩合并脱去四唑，此时合成的寡核苷酸链向前延长一个碱基。 四、封闭(Capping) 缩合反应后为了防止连在CPG上的未参与反应的5'-羟基在随后的循环反应中被延伸，常通过乙酰化来封闭此端羟基，一般乙酰化试剂是用乙酸酐和N-甲基咪唑等混合形成的。 五、氧化(Oxidation) 缩合反应时核苷酸单体是通过亚磷酯键与连在CPG 上的寡核苷酸连接，而亚磷酯键不稳定，易被酸、碱水解，此时常用碘的四氢呋喃溶液将亚磷酰转化为磷酸三酯，得到稳定的寡核苷酸。经过以上五个步骤后，一个脱氧核苷酸就被连到CPG的核苷酸上，同样再用三氯乙酸脱去新连上的脱氧核苷酸5'-羟基上的保护基团DMT后，重复以上的活化、连接、封闭、氧化过程即可得到一DNA片段粗品。最后对其进行切割、脱保护基(一般对A、C碱基采用苯甲酰基保护；G碱基用异丁酰基保护；T碱基不必保护；亚磷酸用腈乙基保护)、纯化(常用的有HAP，PAGE，HPLC，C18，OPC等方法)、定量等合成后处理即可得到符合实验要求的寡核苷酸片段。固相合成Oligo是在DNA合成仪上进行的,上述方法合成的Oligo在脱去保护基后,目的Oligo纯度是极低的,含有大量的杂质,主要杂质有所脱下的保护基与氨形成的苯甲酸氨和异丁酸氨，腈磷基上脱下的腈乙基以及合成时产生的短链等,以至于粗产品中Oligo 含量仅为15%左右。尽管合成时每一步的效率都在97%～98%,但累积的效率并不高。以链长20mer和50mer为例，(97.5%)20≈60%、 (97.5%)50≈28%,可见在粗产品中目的Oligo含量很低，甚至10%都不到。这些杂质,尤其是存在于粗产品中的大量盐和短链,不但造成定量不准,影响下一步的反应,因此必须对Oligo进行纯化。建议采用聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)纯化,该方法纯化的产品纯度高,可用于绝大部份的分子生物

生工设备复习题

第七章过滤、离心与膜分离设备 1、改变发酵液过滤特性的主要方法有哪些？其简要机理如何？ (1)降低液体粘度（加水、加热）:稀释后液体的粘度下降能有效提高过滤速度加热可降低粘度 (2).调整PH: （1）对于两性物质（氨基酸、蛋白质），调PH至等电点，所带净电荷为零，溶解度最小，发生等电点沉淀。（2）膜过滤中，调整PH改变易吸附分子的电荷性质，减少堵塞和污染；（3）细胞、细胞碎片及某些胶体物质等在某个PH值下有可能凝聚成较大颗粒，有利过滤。 (3)凝聚与絮凝: 加入电解质——异电离子作用下，双电原电位降低——胶体稳定下降——相互碰撞而凝聚。絮凝剂（能溶于水的高分子聚合物，相对分子质量数万—1千万，长链结构） +）、不带电的非离子型基团——链节上含有许多活性官能团，阴离子（-）或阳电子（-NH 3 ——通过静电引力、范华力、氢键等吸收在胶粒表面——当许多链节分别吸附在不同胶粒表面上——产生桥架联授——形成较大絮团。 (4)加入助滤剂: 是一种不可压缩的多孔微粒，使滤饼疏松，过滤阻力下降，滤速加快 (5)加入反应剂: 加入某些不影响目标产物的反应剂，可消除发酵液中的一些杂质对过滤的影响，从而提高过滤速度。 2、试述生物工业中常用固液分离设备的原理、特点及适用范围。 3、真空鼓式过滤机的结构，它是如何进行过滤操作的？与板框压滤机相比有哪些特点？ 4、离心机可分为哪几类？其分类依据？ 5、阐述碟片式离心机的结构与工作原理。何谓分离因素？ 6、试述硅藻土的特性及用途。 7、什么叫做膜分离? 膜分离过程有哪些特点？常用的膜分离过程有哪几种？ 8、什么叫做浓差极化现象？如何降低浓差极化效应？ 膜分离过程中，溶剂透过膜，而溶质被膜截留，因而膜表面附近溶液的浓度升高，高于料液主体的浓度，即浓差极化现象 9、分析微滤和超滤的异同点，并举例说明微滤在微生物工程中的应用。 10、分析说明板式膜过滤器的结构与工作原理。 第八章萃取与色普分离设备 1、溶剂萃取分离物质的机理是什么？分配常数K在什么条件下才适用，为什么？ 答：（1）溶剂萃取操作是将一种溶剂加到料液中，使溶液与料液充分混合，则欲分离的物质能够较好的溶解在溶剂中，并与剩余的料液分层，从而达到分离的目的。 （2） 2、溶剂萃取的主要应用领域有那些？ 答：应用于抗生素，有机酸，激素等生产领域以及生物制品的提取与精制。 3、多级错流萃取和多级逆流萃取的工艺流程的特点是什么，其萃余分率各如何计算？ 答：多级错流萃取：多个单级萃取串联过程，多级萃取流程长，萃取剂用量大，得到的萃取液浓度低。 多级逆流萃取：连续逆流操作，混合物可分离程度高，成本降低

DNA引物合成仪项目建设方案分析参考模板.docx

DNA引物合成仪项目建设方案分析 建设方案分析参考模板，仅供参考

摘要 该DNA引物合成仪项目计划总投资11835. 12万元，其中：固定资产投资9995. 90万元，占项目总投资的84. 46%；流动资金1839. 22万元，占项目总投资的15. 54%O 达产年营业收入17423. 00万元，总成本费用13552. 14万元，税金及附加200. 78万元，利润总额3870. 86万元，利税总额4605. 55万元，税后净利润2903. 14万元，达产年纳税总额1702. 41万元；达产年投资利润率32.71%,投资利税率38.91%,投资回报率24. 53%,全部投资回收期5. 58年，提供就业职位256个。 坚持“实事求是”原则。项目承办单位的管理决策层要以求实、科学的态度，严格按国家《建设项目经济评价方法与参数》（第三版）的要求，在全面完成调查研究基础上，进行细致的论证和比较，做到技术先进、可靠、经济合理，为投资决策提供可靠的依据，同时，以客观公正立场、科学严谨的态度对项目的经济效益做出科学的评价。 本DNA引物合成仪项目报告所描述的投资预算及财务收益预评估基于一个动态的环境和对未来预测的不确定性，因此，可能会因时间或其他因素的变化而导致与未来发生的事实不完全一致。

DNA引物合成仪项目建设方案分析目录第一章DNA引物合成仪项目绪论 第二章DNA引物合成仪项目建设背景及必要性 第三章建设规模分析 第四章DNA引物合成仪项目选址科学性分析 第五章总图布置 第六章工程设计总体方案 第七章建设风险评估分析 第八章职业安全与劳动卫生 第九章实施进度 第十章投资估算与经济效益分析

生物工程设备总结

生物工程设备重点总结 1、生物反应器（Bioreactor）——为适应生物反应的特点而设计的反应装置 2、生物反应器与化学反应器在使用中的主要不同点是： 书本上答案： （1）生物（酶除外）反应都以“自催化”方式进行，即在目的产物生成的过程中生物自身生长繁育。 （2）生物反应速率较慢，生物反应器的体积反应速率不高，与其他相当生产规模的加工过程相比，所需反应器体积大。 PPT上答案： ①生物反应中存在活细胞，在反应中可将他们视为催化剂 ②由于细胞是生长着的，它对营养有一定的要求，使参与反应的成分很多 ③生物反应的途径通常不是单一的，反应过程往往也伴随着生成代谢产物的反应，它受许多环境因素的影响 3、生物反应器的作用： 为生物体代谢提供一个优化的物理及化学环境，是生物体能更好地生长，得到更多所需的生物量或代谢产物。 4、生物反应器的目的可归纳为： ①生产细胞 ②收集细胞的代谢产物 ③直接用酶催化得到所要的产物 5、生物反应器的种类 ①厌气生物的反应器 ②通气生物的反应器 ③光照生物的反应器 ④膜生物反应器 6、生物反应器设计的主要目的： （1）最大限度地降低成本 （2）用最少的投资最大限度地增加单位体积产率 7、生物反应器的设计原理是基于： （1）强化传质、传热等操作 （2）将生物体活性控制在最佳状态 （3）降低总的操作费用 （4）稳定生物反应器部状态（原文是生物反应器部状态也是不可忽视的影响因素） 8、厌氧生物反应器中加入惰性气体的原因： （1）保持罐的正压 （2）防止染菌 （3）以及提高厌氧控制水平 9、一个优良的培养装置应具有： PPT （1）严密的结构 （2）良好的液体混合性能 （3）高的传质和传热速率

生物工程设备复习题(完美打印版)

1、离子交换树脂的主要理化性能有：颗粒度、交换容量、机械强度、膨胀度、含水量、密度、孔结构等。 2、我们可以通过设计生物反应器来实现生物反应的三个目标：生产细胞、收集细胞的代谢产物、直接利用酶催化得到所需产物。 3、大型发酵罐设计主要考虑因素：罐的耐压要求、罐的内部清洗、罐内的对流与热交换。 4、常见的通风发酵罐类型：机械搅拌发酵罐、气升式发酵罐、自吸式发酵罐、伍式发酵罐、文氏管发酵罐。 5、按操作压强可将蒸发分为:加压、常压或减压（真空蒸发）。 6、真空干燥设备一般由哪三个部分组成：密闭干燥室、冷凝器和真空泵。 7、影响恒速干燥的主要因素：空气流速、空气湿度、空气温度等外部条件。 8、液-液萃取设备包括哪三个部分：混合设备、分离设备和溶剂回收设备。 9、固体物料粉碎按受力情况分类：挤压；冲击；磨碎；劈碎。 10、糖蜜利用之前如何处理：稀释、酸化、灭菌和增加营养盐。 11、啤酒发酵设备发展方向：向大型、室外、联合的方向发展。 12、影响传质推动力的主要因素：温度、溶液的性质、氧分压、发酵罐内液柱的高度 二、名词解释题（共16分，每小题2分） 1、富氧通风：向发酵罐中通入富氧空气或直接通入氧气，提高相应的饱和溶氧浓度。 2、离子交换法：是通过试样离子在离子交换剂（固相）和淋洗液（液相）之间的分配（离 子交换）而达到分离的方法。分配过程是一离子交换反应过程。 3、悬浮培养：是指细胞在培养器中自由悬浮生长的过程，主要用于非贴壁依赖性细胞培养， 如杂交瘤细胞等。 4、液化：淀粉糊化后，如果提高温度至 130℃，由于支链淀粉的全部（几乎）溶解，网状 结构彻底破坏，淀粉溶液的粘度迅速下降，变为流动性较好的醪液，此现象称为 淀粉的溶解或液化。 6、过滤：以某种多孔物质为介质，在外力的作用下，使悬浮液中的液体通过介质的孔道， 而固体颗粒被截留在介质上，从而实现固液分离的单元操作。 7、灭菌：采用强烈的理化因素使任何物体内外部的一切微生物永远丧失其生长繁殖能力的 措施。 8、萃取：利用液体或超临界流体为溶剂提取原料中目标产物的分离纯化操作。 9、流加发酵：补料分批发酵也叫半连续发酵、半连续培养，流加发酵，它是以分批培养为 基础，间歇或连续地补加新鲜培养基的一种发酵方法。 10、冻干技术：冷冻干燥技术(简称冻干技术)是将含水物质在低温下冻结，而后使其中的水 份在真空状态下升华的技术。 11、结晶：物质自溶液中成晶体状态析出，或从熔融状态受冷时成晶体状态凝结的过程。 12、离心分离因数：指离心力与重力的比值，或离心加速度与重力加速度的比值。K=Rω2/g 13、溶剂萃取：是将一种溶剂加入到料液中，使溶剂与料液充分混合，则欲分离的物质能够 较多地溶解到溶剂中，并与剩余的料液分层，从而达到分离的目的。 14、分子筛：具网状结构的天然或人工合成的化学物质。狭义上讲，分子筛是结晶态的硅酸 盐或硅铝酸盐

引物合成设计常见问题与技巧

1. 引物是如何合成的？ 目前引物合成基本采用固相亚磷酰胺三酯法。DNA合成仪有很多种，主要都是由ABI/PE 公司生产，无论采用什么机器合成，合成的原理都相同，主要差别在于合成产率的高低，试剂消耗量的不同和单个循环用时的多少。申能博彩公司采用的合成仪主要机型为ABI3900高通量合成仪，合成长链主要采用Beckman 1000M和PE8909 DNA合成仪，引物修饰和高OD数合成采用ABI394等。 亚磷酰胺三酯法合成DNA片段，具有高效、快速的偶联以及起始反应物比较稳定的特点。亚磷酰胺三酯法是将DNA固定在固相载体上完成DNA链的合成的，合成的方向是由待合成引物的3‘端向5’端合成的，相邻的核苷酸通过3‘→5’磷酸二酯键连接。 第一步是将预先连接在固相载体CPG上的活性基团被保护的核苷酸与三氯乙酸反应，脱去其5'-羟基的保护基团DMT,获得游离的5'-羟基； 第二步，合成DNA的原料，亚磷酰胺保护核苷酸单体，与活化剂四氮唑混合，得到核苷亚磷酸活化中间体，它的3‘端被活化，5'-羟基仍然被DMT保护，与溶液中游离的5'-羟基发生缩合反应。 第三步，带帽（capping）反应，缩合反应中可能有极少数5'-羟基没有参加反应（少于2%），用乙酸酐和1-甲基咪唑终止其后继续发生反应，这种短片段可以在纯化时分离掉。 第四步，在氧化剂碘的作用下，亚磷酰形式转变为更稳定的磷酸三酯。 经过以上四个步骤，一个脱氧核苷酸被连接到固相载体的核苷酸上。再以三氯乙酸脱去它的5'-羟基上的保护基团DMT,重复以上步骤，直到所有要求合成的碱基被接上去。合成过程中可以观察TCA处理阶段的颜色判定合成效率。 通过氨水高温处理，连接在CPG上的引物被切下来，通过OPC, PAGE等手段纯化引物，成品引物用C18浓缩，脱盐，沉淀。沉淀后的引物用水悬浮，测定OD260定量，根据定单要求分装。 2. 引物纯化方式有哪些，如何选择？ ◆C18柱脱盐：有人称其为简易反相柱，它对DNA有特异性的吸附，可以被有机溶解洗脱，但不会被水洗脱，所以能有效地去除盐分。它不能有效去除比目的片段短的小片段。实际上，它是一种脱盐的作用。这种方法一般不会对普通PCR反应产生影响。对于需要用于测序、克隆的引物不能使用这个级别。 ◆OPC纯化：OPC纯化是根据DNA保护基（DMTr基）和Cartridge柱中树脂间的亲合力作用的原理进行纯化目的DNA片段。OPC法纯化的DNA纯度大于95%.适用于40mer 以下引物的纯化。 ◆PAGE纯：PAGE纯化法是使用变性聚丙烯酰胺凝胶电泳，对DNA片段进行分离，然后从凝胶中回收目的DNA的方法。PAGE纯化法也是一种非常有效的DNA纯化方法，纯化后的DNA纯度大于95%,对长链Oligo DNA （大于50mer）的纯化特别有效。

引物设计登记表

引物设计登记表 尊敬的客户， 感谢您选择生工引物设计服务，我们为在本公司进行合成的少量引物设计需求提供免费服务。我们在设计时尽可能选择理论上最佳的结果，但不保证引物的应用效果，请您务必自行检测引物的可行性，并确认是否符合您所做实验的要求。确认后请交付我公司合成部合成，合成相关问题请联系我公司合成部或当地办事处。引物设计邮箱：primer@https://www.wendangku.net/doc/d611945723.html,： 生工生物引物设计团队 三、引物设计相关工具推荐 1、引物相关问题解答 https://www.wendangku.net/doc/d611945723.html,/sangon_detail.aspx?newsID=520

2、引物参数计算工具 https://www.wendangku.net/doc/d611945723.html,/biotools/oligocalc.html 3、引物设计工具 https://www.wendangku.net/doc/d611945723.html,/ 4、引物特异性检测工具 https://www.wendangku.net/doc/d611945723.html,/tools/primer-blast/ 四、常用试剂推荐 类别编号名称规格目录价 （元） 网购价 （元） PCR BS9293/BS9294 Taq PCR Master Mix (2x, without dye) 1 ml/5×1 ml 50/200 50/200 BS9295/BS9296 Taq PCR Master Mix (2x, blue dye) 1 ml/5×1 ml 55/220 55/220 BS9297/BS9298 Taq PCR Master Mix (2x, red dye) 1 ml/5×1 ml 55/220 55/220 RT-PCR SK2431/SK2432 一步法RT-PCR扩增试剂盒(M- MuLV) 10次/100次200/1680 160/1344 SK2435/SK2436 M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒10次/20次264/462 211.2/369.6 SK2441/SK2442 一步法RT-PCR扩增试剂盒(AMV)10次/100次288/1880 230.4/1504 SK2445/SK2446 AMV第一链cDNA合成试剂盒10次/20次400/700 320/560 Real Time PCR TPCR001-005 TaqProbe qPCR Mastermix 4x 1.25 ml 1508 1206.4 QPCR001-004 Green-2-Go qPCR Mastermix 4x 1.25 ml 1508 1206.4 SK2957A/SK2957B SGExcel UltraSYBR Mixture 5 ml/1ml 398/98 318.4/78.4 SK2956A/SK2956B SGExcel UltraSYBR Mixture(With ROX) 5 ml/1ml 398/98 318.4/78.4 SK2955A/SK2955B SGExcel FastSYBR Mixture 5 ml/1ml 398/98 318.4/78.4 SK2954A/SK2954B SGExcel FastSYBR Mixture(With ROX) 5 ml/1ml 398/98 318.4/78.4 SK2932A/SK2932B SGExcel GoldStar TaqMan Mixture 5 ml/1ml 398/98 318.4/78.4 SK2953A/SK2953B SGExcel GoldStar TaqMan Mixture(With ROX) 5 ml/1ml 398/98 318.4/78.4 您可登录上海生工官网（https://www.wendangku.net/doc/d611945723.html,/sangonindex.aspx）查询产品信息及使用说明书。

生物工程设备

生物工程设备 Revised as of 23 November 2020

第一章1.为什么发酵培养基灭菌采用湿热灭菌法 湿热灭菌是利用高温饱和蒸汽将物料的温度升高使微生物体内的蛋白质变性进行灭菌的一种方式。工业发酵培养基灭菌的特点是数量多，含有很多固体物质；灭菌后要有利于生产菌的生长；方便易行及价格便宜。 由于蒸汽冷凝时会放出大量潜热，并具有很强的穿透力，灭菌效果好； 蒸汽来源及控制操作条件方便，适用于工业发酵培养基的灭菌。 2.实罐消毒灭菌操作过程的要点 A发酵罐及附属阀门无泄漏，无死角，无堵塞；B灭菌时罐内蛇管和夹层冷却部位的冷水彻底排除干净；C控制培养基颗粒大小；D罐内空气排除；E搅拌混合均匀;F液面以下与培养基接触的管道都要进蒸汽；G液面以上不与培养基接触的管道都要排气； 3.为什么灭菌后先开空气再开冷却 防止形成真空设备吸瘪，倒吸引起染菌费用 4.实罐灭菌如要缩短冷却时间，采用何种方式比较经济合理 增加冷却面积，虽然设备投资费用增加，但降低了日常的操作费用 5.生物反应器换热面积设计计算的依据生物反应器换热冷却用水量计算依 据 生物反应器换热面积的确定一般按某个生产品种的发酵过程中某个时刻最大的发酵热作为设计计算的依据。但对一些发酵热并不大的品种，应根据反应的发酵热及培养基灭菌时的冷却方法、要求来综合考虑确定。 生物反应器换热冷却用水量计算通常按发酵热来计算。但对一些发酵热

并不大的生产品种，对培养基灭菌采用实罐灭菌的应根据反应的发酵热及培养基灭菌时的冷却要求来综合考虑确定。 6.连续灭菌系统设计如何考虑节能 系统设计根据配置培养基的工艺特性选择合理的灭菌流程及高效节能的设备，流程设计考虑冷热流体的交换。 7.连续消毒灭菌的特点是什么 连续性强，快速灭菌消毒，培养基营养成分破坏少，灭菌质量稳定，发酵设备利用率高，适用于大容积发酵罐物料的连续灭菌消毒。但由于附加设备多，操作环节多，因此染菌机会增加，不适合于含大量固体物料的灭菌，对蒸汽的要求高。 8.从工程上分析影响培养基湿热灭菌的因素有哪些 培养基成分、起泡程度、培养基颗粒大小、罐内空气排除，搅拌混合均匀等。 第二章 1. 生物发酵用的无菌空气的质量指标 压强、温度、流量、相对湿度和空气洁净度 2. 压缩空气预处理的目的 提高压缩前空气的洁净度；去除压缩后空气中的油和水；保证通气发酵用无菌空气的质量指标。 3. 生物发酵热净化空气的质量指标如何控制