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粪固醇作为海洋环境中粪便污染指示物的研究_徐恒振

第29卷第6期海洋环境科学V o l.29,N o.6 2010年12月MAR I NE ENV I RONM ENTAL SC I ENCE D ece mber.2010

=调查与研究>

粪固醇作为海洋环境中粪便污染指示物的研究

徐恒振,刘星,姚子伟

(国家海洋环境监测中心,辽宁大连,116023)

摘要:在建立一种气相色谱/质谱选择离子模式(GC/M S-S I M)测定污水、沉积物样品中粪固醇的检测方法的基础上,构建

8个粪固醇比值指数,表征不同动物粪便的污染来源,探讨污水和沉积物中不同粪固醇对海洋环境污染的指示作用。结果表明,不同粪固醇可以作为污水、沉积物中不同来源粪便的指示物。

关键词:粪固醇;粪便;指示物;污水;沉积物

中图分类号:X55文献标识码:A文章编号:1007-6336(2010)06-0777-04

Faecal sterols as an i ndi cator of pollution feces i n m ari ne environ m ent

XU H eng-z hen,L I U X i ng,YAO Z-i w ei

(Nati onalM ari ne Environm entalM on i tori ng C en ter,Dali an116023,Ch i na)

A bstract:A m et hod of deter m i n ati on of faecal sterols in se w age and m ari n e s ed i m en ts w as estab li shed by gas ch ro m at ography co m b i ned

m ass s p ectro m etry w ith s i ngle ion m on itori ng(GC/M S-SI M).E i gh t rati os of f aecal sterol ind ex w ere appli ed for d i scri m i nati on of s e w-age and b i ogen ic s ou rces,and p rov i ded a u s eful i nd icati on of f aecal inpu ts i n se w age and m ari n e s edi m en ts,relati ve to ot her sources of

f eces.The resu lt sho w ed that faecal sterol s cou l d be used as t he i nd i cator of poll u tion sou rces of feces i n se w age and m ari ne sed i m en ts.

K ey words:faecal sterols;feces;i nd icat ors;se w age;m ari n e sed i m ents.

我国是一个人口众多的农牧业大国,由人畜等粪便(或排泄物)造成的污染较为严重。目前国内常采用粪大肠杆菌数量表征生活污水的污染程度,虽然这种方法是标准方法,但却难以区分不同来源的生活污水。

已有研究[1~5]表明,不同动物(草食动物、杂食动物和肉食动物)因摄食习惯、消化系统和消化功能不同,可形成不同动物粪便的/粪固醇指纹0。

草食动物,其粪便中主要含有24-乙基-粪醇,少含有胆固醇和粪醇[1,2,5]。如牛等粪便中5B-C28甾烷醇(如24-甲基-5B-胆甾-3B-醇)和5B-C29甾烷醇(如24-乙基-5B-胆甾-3B-醇)的含量较高,而羊粪便中仅含有24-乙基-差向异构-粪醇。

杂食动物,其粪便中5B-C27甾烷醇一般比5B-C29甾烷醇含量高[1,2,5]。如人类粪便中粪固醇浓度一般为其它动物的4~5倍,且以粪醇和24-乙基-粪醇为主;猪粪便中的粪醇种类与人粪便中的相似,但总浓度和个别主要固醇浓度一般比人类的低4~10倍;老鼠以及灵长类动物亦可产生粪醇;鸟粪便中少含粪醇而富含胆固醇和谷甾醇。

肉食动物,其粪便中5B-C27甾烷醇一般高于5B-C29甾烷醇[1,2,5]。如猫粪便中粪固醇种类与人粪便中的类似,主要含粪醇、胆固醇和24-乙基-粪醇,浓度却低很多,尤其是粪醇;狗粪便中富含胆固醇,约占总固醇的71%。海洋肉食哺乳动物鲸和海豚粪便中主要含胆固醇而不含有粪醇,而海豹和海狮的粪便中主要含有粪醇。

粪便一旦排向水体,其中粪固醇将会稀释和分解,但可以通过检测不同生物标志物的含量和差异而将其来源鉴别出来。在未被粪便污染的水体中,一般难以检测出5B-粪甾醇(如粪醇)。这是因为只有厌氧菌才可将胆固醇氢化还原为粪醇,而这种菌群却很少存在于富氧的水体中。因此,自然环境中的C27-固醇类一般是以5A-胆固醇的形式存在。在未被粪便污染的沉积物中,尽管可以

收稿日期:2009-03-21,修订日期:2009-6-15

基金项目:国家自然科学基金项目(40876056)

作者简介:徐恒振(1957-),男,山东莒南人,研究员,主要从事海洋环境有机化学研究。

778海洋环境科学第29卷

检测出少量的5B-粪甾醇,但其含量却低于固醇总量的

2%[1,3,4]。

粪醇与人类新鲜粪便具有较强的相关性,通常可以

作为人类粪便排泄的指示物。差向异构-粪醇与人类陈旧

粪便具有较强的相关性,赋存于生活污水中;胆固醇是

5A-C27甾烷醇(二氢胆固醇)和5B-C27甾烷醇(粪醇与

差向异构-粪醇两种)的前身;二氢胆固醇是环境中热力学

稳定的异构体;当coprostanol/cholestano l比值小于0.5

时,5B-C27甾烷醇难以指示人类粪便排泄物[4,5]。

24-乙基-粪醇和24-乙基-差向异构-粪醇与草食动物

粪便具有较强的相关性,通常可以作为草食动物排泄的

污染指示物。24-乙基-胆固醇是5A-C29甾烷醇和5B-C29

甾烷醇的前身;同二氢胆固醇一样,24-乙基-二氢胆固醇

亦是环境中热力学稳定的异构体,当24-ethy lcopro stano l/

24-e t hy l cho lestanol比值小于0.5时,用5B-C29甾烷醇难

以指示出草食动物粪便排泄物[4,5]。

综上所述,不同粪固醇可以作为不同来源粪便的污

染指示物。目前国内尚未见到有关粪固醇作为污水、沉

积物中粪便来源鉴别指标的报道。鉴于此,本文应用毛

细管GC/M S-SI M检测污水、沉积物样品中的粪固醇,探讨

各种粪便来源的鉴别指标,旨在为我国生态污染监测提

供基础资料。

1材料和方法

1.1仪器与试剂

1.1.1仪器

A g ilent6890/5973N气相色谱-质谱联用仪,K S-型康

氏超声振荡器,ZFA-型旋转蒸发装置,氮吹装置,马脑钵,

过滤筛(80目等)。

1.1.2试剂

C H

2C l

2

(色谱级,T edia,U S A),n-C

6

H

14

(色谱级,T e-

d i a,U SA),无水N a

2SO

4

(550e下加热4h,干燥器中保

存),硅胶(80~100目,300e下加热4h,加5%水,去活

化,混匀,干燥器中保存),中性氧化铝(80~120目, 550e下加热6h,加5%水,去活化,混匀,干燥器中保存),高纯铜粉,高纯H e气(纯度99.99%),高纯N

2

气(纯

度99.99%),H

2

O(M illi pore超纯水)。

1.2实验方法

1.2.1仪器条件

色谱条件:色谱柱,H P-5M(30m@0.25mm@0.25 L m);升温程序:初始温度80e(保持3m i n),升温速度(5e/m i n),终止温度285e(保持16m i n);载气(H e)流速1mL/m i n;进样口温度260e;无分流进样;进样量1L L。

质谱条件:电子轰击(E I)离子源;质量扫描范围m/z 50~550;电子能量70e V;接口温度,280e;离子源温度230e;四极杆温度150e;扫描方式T I C;溶剂延迟3m i n。

1.2.2样品前处理

样品来源:排污口海水样品和沉积物样品采自大连

湾沿岸排污口附近海域。

排污口海水样品的提取:准确量取2L排污口海水于震荡器的玻璃瓶中,加50mL C H

2

C l

2

,振荡萃取5m i n,静

止分层,分离水和CH

2

C l

2

相,再用30mL CH

2

C l

2

萃取上述

水样,重复萃取2次,合并3次萃取的C H

2

C l

2

溶液,浓缩2.0mL,加入1.0g高纯铜粉,超声振荡5m i n,放置8h,除硫,作为样品提取液。

沉积物样品的提取:准确称取阴干后研磨均匀(80目,过筛)的沉积物样品5.00g,置于三角玻璃瓶中,加入

50mL C H

2

C l

2

,混匀,超声振荡5m i n,静置10m i n,分离沉

积物相和C H

2

C l

2

相,再用30mL C H

2

C l

2

萃取上述沉积物

样品,重复萃取2次,合并3次萃取的C H

2

C l

2

溶液,浓缩2.0mL,加入1.0g高纯铜粉,超声振荡5m i n,放置8h,除硫,作为样品提取液。

排污口海水/沉积物样品的净化:将上述2.0mL污水或沉积物样品提取液,全量转移到用无水硫酸钠(1.0 g,上层)-硅胶(5.0g,中层)-中性氧化铝(5.0g,下层)填充的玻璃层析柱(内径1cm,长50c m;层析柱采用湿法装

填,溶剂为CH

2

C l

2

)上,用60mL C H

2

C l

2

作为淋洗剂,以1.0mL/m i n的速度淋洗层析柱,用玻璃浓缩瓶接收淋洗

液,再加入1mL n-C

6

H

14

,浓缩近干,1.0mL n-C

6

H

14

定容,

G C/M S测定。

1.3粪固醇比值指标

粪固醇比值指标采用如下8个比值指数表示[4,5]:

(1)Coprostano l/(5A-cho lestanol+coprostano l);

(2)Coprostano l/epicoprostanol(c/e);

(3)Coprostano l/cho leste ro l(c/ch);

(4)Coprostano l/5A-cho lestano l;

(5)24-e t hy l coprostano l/24-ethy-l5A-cho lestano;l

(6)24-e t hy l coprostano l/24-ethylcho lestero;l

(7)(coprostano l+epicoprostanol)/(24-ethy lcopro sta-

nol+24-ethylepicoprostanol);

(8)Coprostanone/24-ethy lcopro stanone。

2结果与讨论

2.1粪固醇的GC/M S鉴定

表1中列出了各种粪固醇的学名、俗名、保留时间以及特征离子。表2为沉积物样品中粪固醇色谱保留时间的6次重复性测定值。系采用同一沉积物研磨过筛,混合均匀,分别称取6个样品,依次按照上述沉积物样品前处理的方法处理样品,毛细管GC/M S-SI M测定而得。由表2可以看出,沉积物样品中粪固醇保留时间变异系数的变化范围0.009%~0.022%,由毛细管GC/M S-SI M定性沉积物样品中的粪固醇,可靠性较高。

2.2沉积物与排污海水中粪固醇的测定

表3为沉积物中各种粪固醇含量的6次重复性测定数据。由表3可以看出,沉积物样品中除二氢胆固醇含

第6期徐恒振,等:粪固醇作为海洋环境中粪便污染指示物的研究779

表1粪固醇的命名与特征离子

T ab.1Character istic i on and na m e of faecal sterols

序号学名俗名特征离子(m/z) 15B-胆甾-3B-醇(5B-cholestan-3B-ol)粪醇(cop rostanol)233

25B-胆甾-3A-醇(5B-cholestan-3A-ol)差向异构-粪醇(epicholstanol)215

35B-胆甾-3-酮(5B-cholestan-3-one)粪酮(cop rostanone)231

4胆甾-5-烯-3B-醇(choles t-5-en-3B-ol)胆固醇(cholesterol)386

55A-胆甾-3B-醇(5A-cholestan-3B-ol)二氢胆固醇(5A-cho l est anol)215

624-乙基-胆甾-5-烯-3B-醇(24-ethy-l choles t-5-en-3B-ol)24-乙基粪醇(24-ethylcoprostano l)233

724-乙基-5B-胆甾-3-酮(24-et hy-l5B-cholestan-3-one)24-乙基粪酮(24-ethylcoprostanone)231

824-乙基-胆甾-5-烯-3B-醇(24-ethy-l choles t-5-en-3B-ol)谷甾醇(s i tosterol)414

924-乙基-5A-胆甾-3B-醇(24-ethy-l5A-cholestan-3B-ol)二氢谷甾醇(sitost an ol)233表2粪固醇色谱保留时间的重复性

T ab.2epeatability of chrom atographic retenti on ti m e o f f aeca l

ste ro ls

序号名称

保留时间

平均值/m i n

标准偏差

/m i n

变异系数

/(%)

1粪醇45.9410.00680.015 2差向异构-粪醇45.9430.00460.010 3粪酮46.7360.00430.009 4胆固醇46.7420.00460.010 5二氢胆固醇46.7400.00840.018 624-乙基粪醇49.6980.01100.022 724-乙基粪酮50.8310.00960.019 8谷甾醇50.8300.00870.017 9二氢谷甾醇51.9890.00540.010注:n=6量偏差较大(变异系数:63.2%)之外,其余粪固醇含量的变异系数变化范围为5.23%~18.0%。可见,用毛细管G C/M S-S I M测定沉积物中粪固醇,其精密度较好。

表4为4个不同类型排污口海水样品中粪固醇的含量。由表可见,不同污水样品中粪固醇的含量差异较大。

2.3粪固醇的比值指数

表5为大连湾沉积物中各种粪固醇的比值指数(由同一沉积物的6个样品的重复性测定值计算而得,即n= 6)。表6为4个不同类型排污口海水中各种粪固醇的比值指数。

表5表明,大连湾沉积物中粪固醇主要来源于人类粪便污染,其次为杂食动物和草食动物粪便的污染。说明大连湾沉积物中粪便污染主要是人类粪便的污染。

表3沉积物中粪固醇含量的重复性测定

T ab.3R epeatab ility o f de ter m i nati on of faeca l stero ls i n sed i m ents

名称

w/10-9

123456平均值

变异系数

/(%)

粪醇 1.614 1.1791.3601.563 1.260 1.8171.46516.5差向异构-粪醇 1.685 1.3531.7661.683 1.602 1.6881.6308.90粪酮 4.001 4.2384.1223.597 4.683 3.7844.0719.31胆固醇 1.640 1.5811.7621.666 1.787 1.5851.670 5.23二氢胆固醇0.0660.0180.0880.0150.0930.0430.05463.2 24-乙基粪醇0.4890.4710.5860.5930.4250.6220.53115.0 24-乙基粪酮0.841 1.1291.1731.118 1.155 1.3101.12113.7谷甾醇0.6280.6850.7920.8580.7130.7150.73211.1二氢谷甾醇0.3310.4550.4260.4540.5490.5530.46118.0注:n=6

表4污水样品(4个不同样品)中粪固醇的含量

T ab.4Concentrati ons o f faeca l stero l s in four samp l es o f sew-

age

名称

c/ng#L-1

1234

粪醇149.447.215.414.9差向异构-粪醇80.9 6.3110.152.3粪酮272.7 4.815.4332.8胆固醇943.4 1.4147.5461.7二氢胆固醇37.2 1.40.18.0 24-乙基粪醇9.1 4.92.16.6 24-乙基粪酮 5.6 6.12.048.8

粪固醇作为海洋环境中粪便污染指示物的研究_徐恒振

表6表明,4个不同类型排污口海水中粪固醇比值差异较大,如2号和3号样品中C oprostanol/5A-Cho l estano l 的比值较大。说明这些海域除受到人类粪便污染外,尚受到其它动物粪便排泄物的污染。在2号和3号样品采样站点的附近,确有几个水产及畜牧养殖场。

3结论

(1)用毛细管GC/M S-S I M测定排污口海水、沉积物样品中的粪固醇,可从总离子流质谱中直接抽取各粪固醇的特征离子进行检测,简单可行。

(2)不同排污废水、沉积物,含有不同C27粪固醇和C29粪固醇,遭到了不同来源的粪便污染。

780海洋环境科学第29卷

表5沉积物中粪固醇的比值指数

T ab.5R a ti os o f i ndex o f faeca l stero l s i n sedi m ents

比值指标

6次重复测定

123456

coprostanol/(5A-c ho l estanol+coprostano l)0.9610.9850.9390.9900.9310.977 coprostanol/cholest erol0.9840.7460.7720.9380.7051.146 coprostanol/ep icoprostano l0.9580.8710.7700.9290.7871.076 coprostanol/5A-cho l est anol24.45565.50015.455104.2013.54842.256 24-et hylcop rost anol/24-ethy-l5A-cholestanol1.477 1.035 1.3761.3060.7741.125 24-et hylcop rost anol/24-ethylc h ol estero l0.5270.6640.5380.5290.7700.773 (coprostanol+ep i coprostanol)/(24-ethylcoprostanol+

24-et hyl ep i coprostanol)

6.746 5.376 5.3345.4746.7345.635 coprostanone/24-ethylcop rostanone4.757 3.754 3.5143.2174.0552.889

表6排污口海水中粪固醇的比值指数

T ab.6R ati o s of index of faeca l stero ls i n se w ages

比值指标

样品编号

1234

coprostanol/(5A-c ho l estanol+coprostano l)0.8010.9710.9940.651 coprostanol/cholest erol0.15833.7140.1040.032 coprostanol/ep icoprostano l 1.8477.4920.1400.285 coprostanol/5A-cho l est anol 4.01633.714154.0001.863 24-et hylcop rost anol/24-ethy-l5A-cholestanol0.5260.3770.0830.086 24-et hylcop rost anol/24-ethylc h ol estero l0000 (coprostanol+ep i coprostanol)/(24-et hylcop ros t an ol+24-ethyl epicop rost anol)25.30810.91859.76210.182 coprostanone/24-ethylcop rostanone48.6960.7877.7006.820

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