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细胞免疫试验

细胞免疫试验

实验六单个核细胞分离及细胞免疫功能检测

T细胞介导免疫应答的特征是由T DTH(Th1)细胞介导的以单个核细胞(淋巴细胞和单核细胞)浸润为主的炎症反应和T C(CTL)细胞发挥的特异性细胞毒效应。

临床上反复发作的病毒感染,胞内菌感染、真菌感染、寄生虫感染,常令人想到细胞免疫缺陷,而肿瘤患者、长期使用免疫抑制剂的患者也常有细胞免疫缺陷,必须进行细胞免疫检测。

细胞免疫检测首先是单个核细胞分离,然后进行T细胞数量和功能的测定。

【实验目的】

1.了解淋巴细胞分离方法。

2.了解人类T细胞的主要表面标志SRBC—R(CD2)、CD3的检测方法及其临床意义。

3.了解T淋巴细胞亚群测定方法及其临床意义。

【实验项目】

1. 葡聚糖—泛影葡胺法分离淋巴细胞

2. 流体细胞仪分离淋巴细胞(录像)

3. T细胞总数测定(E花环试验)

4. T细胞亚群测定

一、单个核细胞分离法

(一)葡聚糖—泛影葡胺法分离单个核细胞

葡聚糖—泛影葡胺分离淋巴细胞的方法是一种密度梯度离心法,采用葡聚糖—泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)混合液(比重介于1.075~1.092之间)作为分离液,加入外周血进行离心,离心后不同比重的血细胞在分离液中呈梯度分布,红细胞和多核白细胞比重较大(1.092),分布于最底层,单个核细胞比重较小(1.075~1.090),分布于血浆与分离液的交界处。界限清楚,层次分明。将该层细胞吸出,即为单个核细胞(主要是淋巴细胞)。

细胞免疫试验

离心前离心后

血细胞在密度梯度分离前后的分布示意图

【材料】

1.肝素抗凝血。

2. 单个核细胞分离液:葡聚糖—泛影葡胺(Ficoll-Hypaque)混合液(比重介于1.075~0.092之间)。

3.(200u/ml)肝素,用生理盐水配成。

4.Hank’s液。

5.其他:注射器、吸管、毛细吸管、微量移液器、微量移液器吸嘴(TIP头)、血细胞计数板、玻片、盖玻片、水平离心机、显微镜等。

【方法】

1.取肝素抗凝血2ml,加等量Hank’s液稀释。

2.用毛细吸管吸吹稀释后的血液,使其混匀后,吸取血液沿试管壁缓缓加到含有2m1单个核细胞分离液的试管中,使血液与分离液形成明显的界面(分离液:稀释血液约为1:2)。

3.水平离心2000r/min 20min。小心取出试管,由于细胞比重不同,离心后管内液体分成四层:第一层为血浆;第二层为单个核细胞(95%为淋巴细胞),此层很薄,似白雾状,应仔细观察;第三层为分离液;第四层为红细胞与粒细胞。

4.用毛细吸管小心吸出单个核细胞层(含大量淋巴细胞与少量单核细胞)置于另一试管中,加入Hank’s液3~4ml,洗涤离心1500r/min 10min ,倾弃上清。重复洗涤2次。

5.末次离心后,弃去上清液。加入含10%灭活小牛血清Hank’s液1 ml,混匀后进行计数。

计数方法:

A加样:将淋巴细胞悬液混匀,吸取10μl加入到40μl含10%灭活小牛血清的Hank’s液中,混匀后再吸取10μl加入到血细胞计数板上。

B加盖玻片:取盖玻片轻轻覆盖于标本上,静置片刻,置显微镜下计算淋巴细胞数。具体计数方法如下:

C计算血细胞计数板上四个角的四个大方格中淋巴细胞总数(如下图),

细胞免疫试验

血细胞计数板图解

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C. 血细胞计数

计算血细胞计数板上四个角的四个大方格中单个核细胞总数。(只计算上边和右边的压边细胞,左边和下边的不计算)

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细胞免疫试验

A. 加样

D 按下列公式求出单个核细胞总数。

104 6.细胞存活率检测:取10μl 淋巴细胞悬液加入0.4%台盼蓝染色液10μl ,混匀。取10μl 加入血细胞计数板,静置片刻,置显微镜高倍镜下观察。

【结果判定】

活细胞不着色,折光性强。死细胞由于染料可渗入细胞内,故死细胞被染成蓝色,死细胞体积较大,无光泽。正常情况下,活细胞存活率应在95%以上。

计数200个细胞中的死亡细胞数并计算其存活率:

×100%

【临床意义】

分离单个淋巴细胞技术是进行细胞免疫试验的重要技术之一,是进行各项细胞免疫检测的基础。分离所得的单个核细胞可满足许多实验需要,不仅用于淋巴细胞总数测定,还可以用于进一步纯化淋巴细胞,进行淋巴细胞分类鉴定及各种淋巴细胞功能测定。

二、T 细胞总数测定

Et 花环试验

【原理】

绵羊红细胞受体(SRBC —R 或称CD2)、CD3和TCR 是人类T 细胞的主要表面标志。常用CD3+细胞数或E 花结形成细胞数来测定T 细胞总数。CD3+

细胞数检测方法见T 细胞亚群检测,本试验主要介绍E 花结试验

人外周血T 细胞表面有SRBC 受体(又称E-受体),若将人外周血淋巴细胞与SRBC 按适当比例混合,SRBC 便会黏附于T 细胞的周围形成花结,称为E 花结或自然形成花结。显微镜检查凡吸附三个SRBC 以上的淋巴细胞即E +细胞(T 细胞)。计算E + 淋巴细胞百分率可反映机体T 细胞总数。

4

四个大方格中单个核细胞总数 单个核细胞总数= 活细胞数+死细胞数 活细胞数 细胞存活率=

正常人E+ 淋巴细胞百分率约为60%~80%,T细胞总数可作为判断机体细胞免疫功能的指标之一。

【材料】

1.5×106/ml淋巴细胞。

2.1%SRBC、含10%灭活小牛血清Hank’s液。

3. 1% 美兰液。

4. 0.8%戊二醛溶液。

5. 微量移液器、显微镜、TIP头、玻片、盖玻片。

【方法】E t花环试验操作程序

1.单个核细胞分离:

肝素抗凝血2ml +Hank’s液2ml液稀释

沿管壁缓慢加入到含有2ml淋巴细胞分离液的试管中

2000r/min 20min

吸出淋巴细胞层加入到另一试管中,再加3~4ml Hank’s液,混匀

1500r/min 10min

倾去上清,吸干余水,加3ml Hank’s液,混匀

1500r/min 10min

倾去上清,吸干余水。加入含10%灭活小牛血清Hank’s液1 ml,

混匀后进行计数和计算细胞存活率,配制5×106/ml细胞悬液

2. E t花环试验形成试验:

取5×106/ml 细胞悬液0.1ml,加入灭活小牛血清0.1ml,1%SRBC 0.1ml,混匀

37℃水浴 5min

500r/min 5min

置4℃冰箱2h

吸去大部分上清(只留1滴,约50ul), 轻轻旋转混匀

沿管壁加入0.8%戊二醛溶液1滴,再轻轻旋转混匀,置4℃固定20min

轻轻旋转使沉淀的细胞重悬浮,吸30ul悬液加于玻片上,再加30ul美兰液,

盖上盖玻片

高倍镜检查,计算200个淋巴细胞中的E+细胞数,计算E+细胞百分数(%)

【结果】 E+细胞判断:能结合3个以上SRBC者为E+细胞。

正常值:60%~80%

二、T细胞亚群测定

(一)免疫荧光检测法

【原理】

T淋巴细胞表面有特异性标志,如CD1+细胞是早期胸腺细胞,CD2+细胞是有绵羊红细胞受体的T细胞(E+T细胞),CD3+细胞代表总T细胞,CD4+细胞代表T辅助细胞(TH), CD8+细胞是杀伤性T细胞(Tc或CTL)或抑制性T细胞(Ts)等。应用特异性单克隆抗体与T细胞的表面CD抗原结合后,再用荧光标记二抗 (兔或羊抗鼠IgG)染色,在荧光显微镜下计数,即可计算出某种T细胞亚群的百分数或不同T细胞亚群的比例。俱此可以判断机体的细胞免疫功能。测定方法有IFA法(间接免疫荧光法)、EIA法(酶免疫测定法)、APAAP(碱性

磷酸酶抗碱性磷酸酶法)、流式细胞仪测定法等,以流式细胞仪法最优。下面主要介绍IFA 法。

【材料】

l.肝素抗凝血。

2.抗CD3、抗CD4、抗CD8单克隆抗体。

3.荧光标记(FITC)兔或羊抗鼠IgG抗体。

4.含2%小牛血清的Hank’s液。

5.淋巴细胞分离液 (比重1.077+0.001)。

6.荧光显微镜。

7.离心机、吸管、试管等器材。

【方法】

1.淋巴细胞分离:方法同本实验第一项(淋巴细胞分离法)。

取肝素抗凝全血5m1,用淋巴细胞分离液分离淋巴细胞,用含10%小牛血清的Hank’s 液洗2次,再用该液配成l×107/ml细胞悬液。

2.取3只小试管,各加细胞悬液0.1ml,然后于第一管加CD4单抗,第二管加CD8单抗,第三管加CD3单抗,均为100μl (轻轻摇匀,冰浴或4℃冰箱孵育30min)。

3.取出用小牛血清Hank’s液洗二次,去上清,稍加摇动,加荧光抗鼠标记抗体100μl (置 4℃冰箱孵育30min)。

4.取出,用Hank’s液洗二次,用滴管稍微吹打后,滴一滴在玻片上,加盖片在荧光显微镜下计算发荧光细胞的百分数。计数时需用两种光源。先用普通光源计数全视野细胞总数,再换荧光光源进行荧光细胞计数。计数200个细胞,求出CD3、CD4、CD8的百分数,并计算CD4+细胞和CD8+细胞的比值 (CD4+/CD8+)。

【结果】

在荧光显微镜下观察发荧光的细胞,可呈环状,半环状。应区别死细胞及沉渣等非特异荧光。正常参考值:CD3:53%~88% ;CD4+:32%~60%;CD8+:20%~40% ;CD4+/CD8+:

1.5~

2.0

【临床意义】

T淋巴细胞亚群在许多临床疾病中可发生异常改变,特别是免疫功能受损的病人。测定T淋巴细胞亚群变化对了解疾病的发病机制、指导临床治疗、控制疾病的发生发展均有重要意义。

1.在自身免疫病中,如SLE、RA、自身免疫性溶血性贫血,以及乙型肝炎病人常表现为CD8+细胞的数量及功能低下,有时也有CD4+细胞增高,因此CD4+/CD8+比值升高。

2.细胞免疫缺陷病患者CD4+/CD8+比值减低,如获得性免疫缺陷综合症(AIDS)患者,CD4+显著减少,常出现CD4+/CD8+比值倒置。此项指标现常用于HIV感染者的监测。

3.病毒感染时,总T细胞、CD4+细胞减少,CD8+细胞增多,CD4+/CD8+比值降低。

4.肿瘤病人总T细胞,CD4+细胞明显减少,CD8+明显增加,CD4+/C8+比值明显下降。据此,可了解患者的免疫状态以指导免疫调节剂及治疗药物的应用。

5. 血液系统疾病T细胞亚群也有相应变化,如再生障碍性贫血、粒细胞减少症时CD4+细胞减少,CD8+细胞增多,CD4+/C8+比值下降。

(二)流式细胞术检测法(Flow Cytometry ,FCM)

【目的要求】

掌握流式细胞术检测法的基本原理;了解流式细胞术检测结果的分析。

【原理】

T淋巴细胞表面的CD分子与相应荧光素直接标记的鼠抗人CD分子McAb结合后,细胞表面形成带有荧光色素的抗原抗体复合物,。经激光激发后发出与荧光素相对应的特定波长的荧光,其荧光强度与被测CD分子表达密度成正比例关系,由此通过流式细胞仪可检测结合有相应荧光素标记抗体的阳性细胞百分率。本实验以全血直接免疫荧光染色和FCM检测法为例。

【材料】

1.待检标本肝素抗凝人全血

2.试剂荧光素标记的鼠抗人CD分子McAb(抗CD4-FITC/抗CD8-PE/抗CD8-PE-Cys)。

3.细胞洗液含1%FCS的PBS。

4.流式细胞术专用红细胞裂解液。

5.细胞固定液(25%戊二醛3.2ml,葡萄糖2.0g加无血清细胞洗液至100ml)。

6.仪器流式细胞仪。

【方法】

1.取100μl全血,加10μl三种不同荧光素标记的鼠抗人CD3、CD4、CD8、McAb,同时设立荧光素标记的周型lg作为阴性对照,室温反应20min。

2.加专用红细胞裂解液2ml,溶血5nin;1000r/min,离心10min,弃上清。

3.用PBS洗1次(1.000r/min,离心10min);用0.5~1.0mlPBS重悬细胞,上机检测。

4.FCM分析测定前,用荧光小球校正仪器至前向角散射光(FSC)和所用荧光的变异系数(CV)均在3%以下。冲洗样品管道后,输入同型对照样品,调节样品液与鞘液之间压力差为5~10psi(随细胞浓度测定),使细胞样品液以稳定的层流通过70αm喷嘴。与高度聚焦的荧光束垂直交汇。接受每个细胞与激光相遇后产生的前向角散射光(FSC)和侧向角散射光(SSC)及荧光,经计算机处理,以FSC为纵轴,SSC为纵轴,二维图像显示细胞群分布。划出淋巴细胞密集区,图a中R1为淋巴细胞,定为分析范围。分别作CD3/SSC、CD3/CD4,CD3/CD8二维点图(图中c、d),画出相限标尺,调节三种荧光探测器电压,使对照管的对数荧光在左下象限的细胞数占总计数细胞的97%以上,换上实验管,收获2万个细胞后,电子计算机自动计算出阳性细胞百分率及总细胞计数。图b中右下象限为CD3+细胞,图c、d 中右上象限分别为CD4+、CD8+细胞。

细胞免疫试验

图人外周血CD3+、CD4+、CD8+ T细胞的二维点阵图(流式细胞术)

【结果判断】如上图所示,CD3+T细胞占总细胞数66.82%,其中CD4+T细胞占51.59%,CD8+T细胞占14.83%。

【注意事项】

1.确保细胞悬液上机检测前浓度为1×105/ml,细胞浓度过低直接影响检测结果。

2.使用蛋白封闭剂,封闭非特异结合实际位点,常用的蛋白封闭剂为0.5%牛血清白蛋白和1%胎牛血清。

3.设置对照样品,采用与抗体来源同型匹配的lg对照。

注意染色后避光,保证细胞免疫荧光的稳定。

样品制备好后如不能立即上机检测,需置于4℃冰箱避光保存。

【思考题】

1.单个核细胞分离的临床意义?

2.正常人外周血中总T细胞, CD4+T细胞,CD8+T细胞,CD4/CD8比值各是多少?有何临床意义?

3.何谓FCM?其基本原理是什么?