基因工程2

名词解释
1、限制修饰系统：限制修饰系统是大多数细菌体内存在的类似动物免疫系统的由限制性内切酶和甲基化酶组成的保护系统。即通过限制性内切酶破坏噬菌体的D NA 而导致噬菌体的寄主范围受到限制，同时通过甲基化酶的作用，将细菌自身的D NA 甲基化，使D NA 得以修饰，从而免遭自身限制性酶的破坏。
2、质粒不亲和性：在没有选择压力的情况下，两种不同质粒不能够在同一宿主细胞系中稳定地共存的现象。
3、cDNA 文库：是指某生物某一发育时期所转录形成的c D NA 片段与某种载体连接而成的克隆的集合。
4、R A CE ：是一种通过PC R 进行c D NA 末端快速克隆的技术，是以m R NA 为模板反转录成c D NA 第一链后用PC R 技术扩增出某个特异位点到3'或5'端之间未知序列的方法。
5、T-Acloning :又名PC R 克隆。T a qD NA 聚合酶具末端转移酶活性，故用T a q D NA 聚合酶进行PC R 反应，反应产物在其3’末端往往习惯性的带上一个腺嘌呤粘性末端（-A）,从而难以将该产物以平末端连接的方式直接克隆到载体上；针对PC R 产物的这一特点，将普通的质粒载体在其多克隆位点上用一种限制性内切酶处理，获得线形的平末端载体，再在该载体的基础上用末端转移酶给其3’末端加上一个胸腺嘧啶粘性末端（-T），由此获得的新型载体称之为T载体；用T载体的3’T与含PC R 产物的3’A进行配对，而将PC R 产物以粘末端连接的方式直接高效的克隆到T载体上的过程称之为T-Acloning 。
6、RT -PC R :先用逆转录酶作用于m RN A ，以寡聚dT 为引物合成c D NA 第一链，然后用已知一对引物，扩增嵌合分子，这种方法称为逆转录PC R
7、I n s e r t i na c t i on :即插入失活，基因工程载体上的某些选择标记基因常常含某种或某几种限制性内切酶的单一酶切位点，在该位点用相应的限制性内切酶处理，并将外源D NA 片段插入该位点，则插入的外源D NA 片段将破坏原有基因的读码框，往往导致原有的选择标记基因无法翻译表达，或即使翻译表达，形成的也是丧失了原有生物活性的蛋白质，这一现象称为插入失活。
8、S-D序列：在大肠杆菌m RN A 的核糖体结合位点上，含有一个转译起始密码子及同1 6S 核糖体R NA 3'末端碱基互补的序列，该序列最初由Sh i ne 、D a l ga rn o 发现，故后来命名为Sh i n e—D a l ga r no 序列，简称S-D序列。
9、穿梭质粒载体：指一类由人工构建的具有两种不同复制起点的选择标记，因而可在两种不同宿主细胞中存活和复制的质粒载体
10 、M CS ：指载体上人工合成的含有紧密排列的多种限制核酸内切酶的酶切位点的D NA 片段。
11 、转化：严格地说是指感受态的大肠杆菌细

胞捕获和表达质粒载体D NA 分子的生命过程
12 、质粒不亲和性：在没有选择压力的情况下，两种不同质粒不能够在同一宿主细胞系中稳定地共存的现象。
13 、c D NA 文库：是指某生物某一发育时期所转录形成的c D NA 片段与某种载体连接而成的克隆的集合。
14 、基因文库：通过克隆方法保存在适当宿主中的某种生物，组织，器官或细胞类型的所有D NA 片段而构成的克隆集合体。
15 、载体：指基因工程中携带外源基因进入受体细胞的运载工具，它的本质是D NA 复制子。
16 、P r ob e :探针：指被标记物质标记了的核酸。
17 黏粒载体：含有c os 位点的质粒载体。
18 ．魔斑：m a g i c s po t ，当细菌生长过程中，遇到氨基酸全面缺乏时，细菌将会产生一个应急反应，停止全部基因的表达。产生这一应急反应的信号是鸟苷四磷酸(pp G pp )和鸟苷五磷酸（pp p G pp ）。Pp G p p与pp p G pp 的作用不只是一个或几个
操纵子，而是影响一大批，所以称他们是超级调控子或称为魔斑。
19 ．转导与转染：转导，t r a ns d u c t i on ，指以噬菌体为载体，在细菌之间转移D NA 的过程，有时也指在真核细胞之间通过逆转录病毒转移和获得细胞D NA 的过程。转染，t r a ns f e c ti on ，指病毒或以它为载体构建的重组子导入真核细胞的过程。
20 ．R NA 干扰：是一种进化上保守的抵御转基因或外来病毒侵犯的防御机制。将与靶基因的转录产物m RN A 存在同源互补序列的双链R NA 导入细胞后,能特异性地降解该m R NA ,从而产生相应的功能表型缺失,这一过程属于转录后基因沉默机制范畴。
22 ．考斯质粒：c os m i d，是经过人工构建的一种外源D NA 载体，保留噬菌体两端的CO S 区，与质粒连接构成。
23 重叠基因不同基因的核苷酸序列有时为相邻两个基因共用,将核苷酸彼此重叠的两个基因称为重叠基因。
26 ..基因置换：是指将致病基因整个地被有功能的正常基因所置换,使致病基因永久地得到更正.
27 .基因敲除：基因敲除是向正常生物个体内引入某个突变的基因位点而选择性地使某特定基因功能失活的技术.
28 ．载体：v e c to r ，能在连接酶的作用下和外源D NA 片段连接并运送D NA 分子进入受体细胞的D NA 分子。
29 ．不相容性：i nc om pa t i bi l it y ，是指在没有选择压力的情况下，两种亲缘关系密切的不同质粒不能共存于同一宿主细胞内。
30 ．c DNA 基因文库：c D NA l i b ra r y，是指以m RN A 为模板，在反转录酶及其他一系列酶的催化作用下所获得的双链c D NA ，经与适当载体连接并转化到寄主细胞内进行扩增，由此而构成包含着相应基因编码序列的一群克隆。
32 ．核酶：r i b oz ym

e，具有催化活性的R NA ，在R NA 的剪接加工过程中起到自我催化的作用。
二：说明下列各项在基因工程中的主要作用或功能
1 SD 序列：是核糖体与m RN A 结合序列，对翻译起到调控作用。.
2.Kl e no w酶：D NA 聚合酶I大片段，只是从D NA 聚合酶I全酶中去除了5’3’外切酶活性
3.蓝-白斑筛选：含L a c Z基因（编码β半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-g al 产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源D NA 插入后，L a c Z基因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。
4.互补干扰R NA ：m i c RN A ，或称反义R NA ，与m R NA 序列互补，可抑制m RN A的翻译。
5.限制性内切核酸酶：常简称为限制酶，是一类能识别双链D NA 分子中特异核苷酸序列并由此切割D NA 双链结构的水解酶。
6.核酶：具有催化活性的R NA ，在R NA 的剪接加工过程中起到自我催化的作用。
7.DNA 探针：是带有标记的一段已知序列D NA ，用以检测未知序列、筛选目的
基因等方面广泛应用。
9.分子克隆：在体外对D NA 分子按照即定目的和方案进行人工重组，将重组分
子导入合适宿主，使其在宿主中扩增和繁殖，以获得该D NA 分子的大量拷贝。
三、简答题
1、理想质粒载体的必备条件？
答：⑴具有较小的分子质量和较高的拷贝数。
⑵具有若干限制性核酸内切酶的单一酶切位点。
⑶具有两种以上的选择标记基因。
⑷缺失mo b 基因。
⑸插入外源基因的重组质粒较易导入宿主细胞并自制和表达。
2、核酸操作的基本技术有哪些？
答：①核酸提取与纯化
②核酸的检测与保存
③核酸的凝胶电泳
④核酸分子杂交
3、影响核酸保存的关键因素是什么？怎样保存核酸制品？
答：关键因素：①保存液的酸碱度②保存温度
保存方法：
①一般保存可用浓盐液，Na CL -柠檬酸缓冲液或0.1m o l/L醋酸缓冲液。②对
D NA 来说，在p H 4～1 1的范围分子的碱基较稳定，超出此范围DN A 易变性或降
解，低温、稀碱下保存DN A 及低温下保存RN A 均较稳定。③固态核酸通常在0℃
以上低温干燥保存即可。
4、合成c DN A 第二链的主要策略有哪些？
答：①自身引导合成法
②置换合成法
③PC R 合成法
④快速扩增c D NA 末端法
⑤双链c D NA 末端的处理
⑥c D NA 与载体的连接
5、基因工程诞生的理论基础是什么？
答：是现代分子生物学领域理论上的三大发现和技术上的三大发明。
理论上的三大发现：
①证实了D NA 是遗传物质
②揭示了D NA 分子的双螺旋结构模型和半保留复制机理
③遗传密码的破译和遗传信息传递方式的确定
技术上的三大发明：
①限制核酸内切酶的发现与D NA 切割
②D NA 连接酶的发现与D NA 片段的连

接
③基因工程载体的研究与应用
6、典型的DN A 重组实验通常包含几步？（10 分）
①提取供体生物的目的基因（或称外源基因），酶接连接到另一D NA 分子上（克
隆载体），形成一个新的重组D NA 分子。
②将这个重组D NA 分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称为
转化。
③对那些吸收了重组D NA 的受体细胞进行筛选和鉴定。
④对含有重组D NA 的细胞进行大量培养，检测外援基因是否表达。
四、PC R 的基本反应过程包括哪些？反应体系需要什么条件？（10 分）
PC R 的基本反应过程包括：变性、退火、延伸三个阶段。（5分）
需要具备的反应条件包括：a、被分离的目的基因两条链各一端序列相互补的
D NA 引物（约20 个碱基左右）。b、具有热稳定性的酶如：T a g DN A 聚合酶。c、
dN T P。d、作为模板的目的D NA 序列。（5分）
8、什么是α-互补筛选？
质粒载体具有β-半乳糖苷酶基因（l ac Z ），当外源D NA 插入到它的la cZ ，
可造成表达后的β-半乳糖苷酶失活，利用这一点就可以通过大肠杆菌转化子菌
落在添加有X-ga l-IP TG 培养基中的颜色变化鉴别出重组子和非重组子。有些大
肠杆菌上带有la cZ 基因的部分编码序列，质粒载体中含有别一部分编码序列，
当质粒转入载体后，可形成具有酶活性的蛋白质。这种la c Z基因上缺失了一部
分编码序列的突变体与带有这一部分编码序列的突变体之间实现互补的现象叫
α互补。
9、限制性核酸内切酶的活性受哪些因素影响？
⑴酶的纯度。
⑵D NA 样品的纯度。
⑶D NA 的甲基化程度。
⑷酶切反应的温度与时间。
⑸D NA 分子的构型。
⑹限制性核酸内切酶的反应缓冲液。
四、问答题
1试述5′R AC E 技术原理和方法
PC R 用于扩增代表mR NA 转录物某一单位点与其3′或5′末端之间区域的部
分cD N A称为快速扩增cD N A末端技术（R AC E ）。如果已知m RN A 的一片段链内短序
列，据此或设计基因特异引物，用原先存在的po l y(A)尾（3′末端）或附加的
同聚尾（5′末端）互补的序列做末端引物，就可以获得从未知末端直到已知区
域的部分c DN A 序列。为获得5′末端部分cD N A克隆需用基因特异引物，产物第
一链产物，可用末端脱氧核苷酸转移酶及dA T P加po ly (A)尾。通过Q T引物和反
转录使用的上游基因特异引物生成第二链c DN A 。
2 P CR 技术主要应用在哪些领域？
答：①核酸基础研究
②序列分析
③检测基因表达
④从c D NA 文库中放大特定序列
⑤研究已知片段邻近基因或未知D NA 片段
⑥进化分析
⑦医学应用
⑧分析生物学证据
⑨性别控制
⑩转基因检测。
3细菌的限制与修饰系

统有什么意义？大肠杆菌K 12 限制与修饰系统的遗传分
析揭示的4种表型是什么？？
答：宿主控制的限制与修饰现象广泛存在于原核细菌中，它有两方面的作用，一是保护自身DN A不受限制；二是破坏入侵外源D NA 使之降解。细菌正是利用限
制与修饰系统来区分自身DN A 与外源DN A的。外源D NA 可以通过多种方式进入某
一生物体内，但是它必须被修饰成受体细胞的限制内切酶无法辩认的结构形式，
才能在寄主细胞内得以生存，否则会很快被破坏。因此，在基因工程中，常采用
缺少限制作用的菌株作为受体，以保证基因操作的顺利完成。
4大肠杆菌作为基因工程受体菌具有哪些特点？真核基因在大肠杆菌中表达存
在哪些障碍？
答：特点：大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，基础生物学、分子遗传学
等方面的背景知识清楚，对其基因表达调控的分子机理也比较了解，而且历经二
十年的基因工程实践，大肠杆菌已发展成为一种安全的基因工程实验体系，有多
种适用的寄主菌株和载体系列，大肠杆菌易于进行工业化批量生产。
存在的障碍：
第一，在大肠杆菌的m R NA 的核糖体结合位点上，含有一个起始密码子及
16 S 核糖体R NA 3′末端碱基互补序列，即S-D序列，而真核上缺泛这个序列。
第二，许多真核基因的蛋白质产物需要经过翻译后的加工修饰，如正确的
折叠和组装，而细菌中通常并没有这样的修饰机制，从而可能导致真核基因在大
肠杆菌中的翻译产物无法产生有活性的蛋白。
第三、外源真核基因所表达的蛋白质分子往往能够被细菌的蛋白酶识别，
并被当做“异已分子”降解掉。
5如何有效地提高外源基因的表达效率？
⑴提高启动子强度⑵缩短启动子同克隆基因间距离⑶高效的翻译起
始序列⑷高效的转录终止区⑸提高质粒拷贝数及稳定性⑹用以下方法提
高翻译水平：①调整SD 序列与AU G间的距离②用点突变的方法改变某些碱基③
增加m RN A 的稳定性的⑺减轻细胞的代谢负荷：①诱导表达②表达载体的诱导复
制⑻提高表达蛋白的稳定性，防止其降解：①克隆一段原核序列，表达融合蛋
白②采用某种突变菌株③表达分泌蛋白质
6试述载体构建一般方法
A目的基因分析（1）OR F分析（2）酶切位点分析
B载体选择与分析（1）多克隆位点分析（2）抗性标记分析（3）启动子与其
他筛选标记分析
C连接体系与连接时间确定
7大肠杆菌作为基因工程受体菌的优缺点是什么？
优点：大肠杆菌培养方便、操作简单、成本低廉，基础生物学、分子遗传学
等方面的背景知识清楚，对其基因表达调控的分子机理也比较了解，

而且历经二
十年的基因工程实践，大肠杆菌已发展成为一种安全的基因工程实验体系，有多
种适用的寄主菌株和载体系列，大肠杆菌易于进行工业化批量生产。
缺点：在通常情况下，细菌的RN A 聚合酶不能识别真核的启动子；许多真核
基因的蛋白质产物需要经过翻译后的加工修饰，如正确的折叠和组装，而细菌中通常并没有这样的修饰机制，从而可能导致真核基因在大肠杆菌中的翻译产物无
法产生有活性的蛋白；外源真核基因所表达的蛋白质分子往往能够被细菌的蛋白
酶识别，并被当做“异已分子”降解掉。
8、分别说出5种以上R NA 的功能？（10 分）
1）转运R NA t R NA 转运氨基酸（2分）
2）核蛋白体R NA r R NA 核蛋白体组成成（2分）
3）信使R NA m R NA 蛋白质合成模板（2分）
4）不均一核R NA h nR N A 成熟m R NA 的前体（2分）
5）小核R NA s nR NA 参与h nR NA 的剪接（2分）
6）小胞浆R NA s c RN A /7S L -R NA 蛋白质内质网定位合成的信号识别体的组成成
分
7）反义R NA a n RN A /m i cR NA 对基因的表达起调节作用
8）核酶R i bo z ym e R NA 有酶活性的R NA
9、利用双脱氧末端终止法（Sa n ge r法）测定D NA 一级结构的原理与方法？（10
分）
原理是采用核苷酸链终止剂—2，，3，-双脱氧核苷酸终止D NA 的延长。由于它
缺少形成3/5/磷酸二脂键所需要的3-OH ，一旦参入到D NA 链中，此D NA 链就
不能进一步延长。根据碱基配对原则，每当D NA 聚合酶需要d NM P参入到正常
延长的D NA 链中时，就有两种可能性，一是参入dd NT P,结果导致脱氧核苷酸链
延长的终止；二是参入d NT P,使D NA 链仍可继续延长，直至参入下一个dd NT P。
根据这一方法，就可得到一组以d dN T P结尾的长短不一的D NA 片段。（6分）
方法是分成四组分别为dd A M P、d dG M P、dd C M P、dd T M P反应后，聚丙烯酰胺
凝胶电泳按泳带可读出D NA 序列。（4分）
10 、典型的D NA 重组实验通常包括哪些步骤？（10 分）
a、提取供体生物的目的基因（或称外源基因），酶接连接到另一D NA 分子上（克
隆载体），形成一个新的重组D NA 分子。（3分）
b、将这个重组D NA 分子转入受体细胞并在受体细胞中复制保存，这个过程称
为转化。（2分）
c、对那些吸收了重组D NA 的受体细胞进行筛选和鉴定。（3分）
d、对含有重组D NA 的细胞进行大量培养，检测外援基因是否表达。（2分）
11 、基因文库的构建对重组子的筛选举出3种方法并简述过程。（10 分）
1）抗生素抗性筛选、抗性的插入失活、兰-白斑筛选或PC R 筛选、差式筛选、
D NA 探针（2分）
2）多数克隆载体均带有抗生素抗性基因（抗氨苄青

霉素、四环素）。当质粒转入
大肠杆菌中后，该菌便获得抗性，没有转入的不具有抗性。但不能区分是否已重
组。（3分）
3）在含有两个抗性基因的载体中，如果外源D NA 片段插入其中一个基因并导
致该基因失活，就可用两个分别含不同药物的平板对照筛选阳性重组子。如pU C
质粒含L a c Z基因（编码β半乳糖苷酶）该酶能分解生色底物X-g a l(5-溴-4-氯-3-
吲哚-β-D-半乳糖苷)产生蓝色，从而使菌株变蓝。当外源D NA 插入后，L a c Z基
因不能表达，菌株呈白色，以此来筛选重组细菌。（5分）
12 、在P CR 扩增时，（1）P C R扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或
小，或者同时出现特异性扩增带与非特异性扩增带，为什么？有何对策？（2）
P CR 扩增后有时出现涂抹带或片状带，其原因是什么？应该如何改进？（1）PC R 扩增后出现的条带与预计的大小不一致，或大或小，或者同时出现特
异性扩增带与非特异性扩增带。非特异性条带的出现，其原因：一是引物与靶序
列不完全互补、或引物聚合形成二聚体。二是M g 2+离子浓度过高、退火温度过
低，及PC R 循环次数过多有关。其次是酶的质和量，往往一些来源的酶易出现
非特异条带而另一来源的酶则不出现，酶量过多有时也会出现非特异性扩增。（5
分）
其对策有：①必要时重新设计引物。②减低酶量或调换另一来源的酶。③降低引
物量，适当增加模板量，减少循环次数。④适当提高退火温度或采用二温度点法
(93 ℃变性，65 ℃左右退火与延伸)。（5分）
（2）PC R 扩增有时出现涂抹带或片状带或地毯样带。其原因往往由于酶量过
多或酶的质量差，d NT P浓度过高，M g2 +浓度过高，退火温度过低，循环次数
过多引起。（5分）
其对策有：①减少酶量，或调换另一来源的酶。②减少dN T P的浓度。③适当降
低M g2 +浓度。④增加模板量，减少循环次数。（5分）
13 、真核细胞基因组中的基因常有内含子存在,能否在原核细胞中表达能,为什
么不能,为什么
不能,因为原核细胞缺乏对真核基因中内含子的剪接功能和转录后加工系统.原核
生物必须有相应的原核R NA 聚合酶可识别原核细胞的启动子,以催化R NA 的合
成.
基因表达是以操纵子为单位,操纵子由数个相关的结构基因和调控功能的部位组
成的.因此在构建原核表达载体时必须有1个强的原核启动子及其两侧的调控序
列.
14 、质粒单酶切点的基因连接如何降低本底和防止自我环化和提高连接效率
目的基因片断与载体由相同的单一限制性核酸内切酶(如E c oR I )消化酶切后,两
者的两端均具有相同的粘性末端,称为单酶切点的粘性末端,

又称全同源性粘性
末端
⑴高背景
载体经单一限制性核酸内切酶切割后,载体分子易于自我环化,既不利于目的基
因的重组连接,大大降低阳性克隆效率,又可使非重组性载体造成高背景.为了
防止载体的自我环化,通常用碱性磷酸酶去除载体粘性末端的5'-P以抑制D NA 的
自我环化.在连接反应中,具有5'-P,的目的基因D NA 片断可有效地与去磷酸化质
粒D NA 载体通过粘性末端发生互补连接,尽管产生的重组D NA 分子于连接点含
有两个缺口的开环分子,尽管在转化时其转化效率高于线性低于闭和环,但转化
大肠杆菌后,在菌体内其缺口可获得修复.如第二章图2-6
⑵双向插入
经单一限制核酸内切酶(如E c oR I )切割的目的基因和载体,因二者的粘性末端是
相同的,因此在连接反应中,目的基因可发生双向插入,载体对目的基因表达是
有方向的,而目的基因可双向与之相连,这种连接若以克隆目的基因片段为目的
没有影响,若以表达为目的,我们就要对插入的片段进行方向鉴定,因目的基因
由起始密码子向终止密码子方向表达是定向转录的,一旦启动子与目的基因编
码顺序方向相反就不能正确转录目的基因的m R NA .若构建表达D NA 重组体选
用双酶切切割目的基因和载体,可使目的基因与载体的连接发生定向连接重组,
以便定向克隆.
20 、对天然质粒的人工构建主要表现在哪些方面？（10 分）
天然质粒往往存在着缺陷，因而不适合用作基因工程的载体，必须对之进行改造
构建：
a、加入合适的选择标记基因，如两个以上，易于用作选择,通常是抗生素基因。
b、增加或减少合适的酶切位点，便于重组。
c、缩短长度，切去不必要的片段，提高导入效率，增加装载量。
d、改变复制子，变严紧为松弛，变少拷贝为多拷贝。
e、根据基因工程的特殊要求加装特殊的基因元件。
21 P CR 反应条件最关键的是温度、时间和循环数的选择，应该注意什么？
首先是温度与时间的设置：基于PC R 原理三步骤而设置变性-退
火-延伸三个温度点。在标准反应中采用三温度点法，双链D NA 在90 ～9 5℃变性，
再迅速冷却至40 ～60 ℃退火，然后快速升温至70 ～75 ℃使引物链沿模板延伸。
①变性温度与时间：变性温度低则解链不完全。一般情况下，93 ℃～94 ℃l mi n
足以使模板D NA 变性，若低于93 ℃则需延长时间，但温度不能过高，因为高温
环境对酶的活性有影响。（5分）
②退火(复性)温度与时间：变性后温度快速冷却至4 0℃～6 0℃，可使引物和模板
发生结合。退火温度与时间取决于引物的长度、碱基组成及其浓度，还有靶基
序列的长度。在T m值允许范围内，选择较高的复性温度

可大大减少引物和模
板间的非特异性结合，提高PC R 反应的特异性。复性时间一般为30 ～60 s e c，足
以使引物与模板之间完全结合。（5分）
③延伸温度与时间：PC R 反应的延伸温度一般选择在70 ～7 5℃之间，常用温度
为72 ℃，过高的延伸温度不利于引物和模板的结合。PC R 延伸反应的时间，可
根据待扩增片段的长度而定，一般1 Kb 以内的D NA 片段，延伸时间1m i n是足够
的。3～4 kb 的靶序列需3～4m i n；扩增1 0K b 需延伸至15 m i n。延伸进间过长会导致非特异性扩增带的出现。对低浓度模板的扩增，延伸时间要稍长些。（5分）
其次是循环次数的设置。循环次数决定PC R 扩增程度。PC R 循环次数主要取决
于模板D NA 的浓度。一般的循环次数选在30 ～4 0次之间，循环次数越多，非特
异性产物的量亦随之增多。（5分）
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