荧光定量PCR技术在疾病检测上的应用

自1983年Kary M ullis 发明聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction ，PCR ）以来，PCR 技术就作为一种重要的基因诊断方法以其简便、迅速、灵敏等优点在分子生物学等很多领域得到了迅速的应用和发展。但是传统的PCR 技术在具体的实际应用中出现了一些问题，如不能准确的定量、容易交叉污染、易出现假阳性或假阴性的结果等。实时荧光定量PCR （real-time fluorescenquantitative poly-merase chain reaction ，

FQ-PCR ）是在PCR 技术基础上发展起来的一种高度灵敏的核酸定量技术，由美国Applied Biosystems 公司1996年首先推出。它是一种在PCR 反应体系中加入荧光基团，利用荧光

信号积累实时监测整个PCR 进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。FQ-PCR 基本克服了传统PCR 缺点，并以其特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点而备受推崇，成为当前动物疫病检测中简单、快速、敏感、特异的定量检测技术，具有巨大的发展潜力和广阔的应用前景。本文就荧光定量PCR 技术在疾病诊断上的应用现状及发展前景作一简要综述。

1.荧光定量PCR 的基本原理与特点

荧光定量PCR 就是通过对每一个扩增循环的荧光信号进行收集和分析，进而实现扩增产物的定宋德海

（滨州医学院附属医院山东滨州256603）

荧光定量P CR 技术在疾病检测上的应用

摘

要：实时荧光定量PCR 技术融汇了传统PCR 技术灵敏、快速、特异的特点以及光谱技术的高敏

感性和高精确定量的优点，以直接探测PCR 过程中荧光信号的变化获得定量的结果。因其具有特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、速度快、全封闭反应等优点，成为当前疫病检测广泛采用的分子生物学诊断技术。本文就实时荧光定量PCR 技术在疾病检测上的应用作一综述。关键词：实时荧光定量PCR ；疾病；检测

Application of Real-time Fluorescent Quantita-tive PCR on Disease Detection

Song Dehai

(Binzhou Medical College Hospital,Binzhou ShanDong 256603)

Abstract:The real-time fluorescent quantitative PCR technology combines the traditional PCR and spec-troscopy's advantages.It is more sensitive,rapid and specific.It can detect the changes of fluorescencesignal in the process of PCR to obtain quantitative results.It's molecular biology diagnostic techniques widely used in disease detections because of it's specificity,sensitivity,reproducibility,quantity,rapid and capping.In this paper,real-time fluorescent quantitative PCR technology or diagnosis of diseases was reviewed.Key w ords:real-time fluorescent quantitative PCR;diseases;detection 8CAH 06/2011

量及定性分析。在反应中，引入了一种荧光化学物质，随着扩增反应的进行，扩增产物不断累加，荧光信号强度也等比例增加。每一个循环，收集一次荧光强度信号，建立起荧光强度变化和产物量的变化之间关系，从而得到一条荧光扩增曲线图。荧光扩增曲线可分为3个阶段：背景信号阶段、指数扩增阶段和平台期。在荧光背景信号阶段和平台期，由于扩增的荧光信号被荧光背景信号所掩盖，或扩增产物已不再呈指数级的增加，PCR的终产物量与起始模板量之间无线性关系。只有在荧光信号指数扩增阶段，PCR扩增产物量的对数值与起始模板量之间存在线性关系，可以选择在这个阶段进行定量分析。

2.荧光定量PCR在病毒病检测中的应用

陶志华等[1]建立了乙型肝炎病毒的荧光定量PCR检测方法，对乙肝诊断、指导临床用药和治疗监测方面具有实用价值。Richt JA等建立检测猪流感病毒（SIV）H1和H3亚型的方法，该方法鉴别检测H1和H3亚型，与病毒分离鉴定的符合率分别为94%和85%，为猪流感的诊断、基因型分析、流行性病学调查提供了快速、特异的鉴别诊断方法。Chun YH等根据C群轮状病毒（GCRV）VP6基因序列设计特异性引物，分别建立检测GCRV的SYBR Green I和TaqM an荧光定量PCR检测方法，该2种检测方法的灵敏度均为1×101拷贝/μL，是常规RT-PCR的100倍，用该2种检测方法与常规RT-PCR同时检测108份样品，常规RT-PCR 检测阳性率为24%（26/108），SYBR Green和Taq-Man荧光定量PCR检测阳性率分别为72%（78/108）和64%（70/108），提出2种荧光定量PCR 检测方法均具有敏感性高、定量准确、快速的特点。沈志强等[2]根据猪细小病毒（PPV）VP2基因序列设计特异性引物，建立检测PPV的SYBR Green I FQ-PCR方法，该方法对PRRSV、JEV、CSFV、PCV-2、PRV扩增结果均为阴性，检测敏感程度可达72.1拷贝/μL，是常规PCR检测灵敏度的100倍。该方法与常规PCR检测方法同时检测13样

品，常规PCR检测出5份阳性，而FQ-PCR检测出

阳性9份，灵敏度明显高于常规PCR，有效的防止

了漏检情况，大大提高了阳性样品的检出率。

3.荧光定量PCR在细菌病检测中的应用

王荣山等[3]建立了新生儿败血症和化脓性脑膜

炎的荧光定量PCR检测方法，最低能检测到10个

拷贝的16S rRNA基因，即相当于1～2个细菌，与

人基因组DNA、真菌及病毒等无交叉阳性反应；荧

光定量PCR的细菌DNA检出率为12.8％（25/195），明显高于血培养的阳性率7.1％（15/195，

P﹤0.01）。Hein I等根据金黄色葡萄球菌nuc基因

设计引物和探针，建立了检测金黄色葡萄球菌的

FQ-PCR方法，并进一步研究了干酪中污染金葡菌

的检测情况，发现该方法可检测到1.5×102~6.4×102拷贝的nuc基因/2g，且nuc基因拷贝数与金葡

菌数有很好的对应性（0.979~0.998）为金黄色葡萄

球菌病的快速诊断提供新方法。He GZ等[4]通过荧

光定量PCR方法研究肠炎沙门氏菌在鸡体内的不

同组织脏器的含量，在不同时间血液、心、肝、脾、肾、胰腺、胆囊等脏器都可以检测到沙门氏菌，为沙

门氏菌在体内的感染机制研究提供了简单、特异、

敏感、准确定量的分子生物学检测方法。蒋鲁岩等[5]

针对GenBank公布的猪链球菌2型的csp2J基因

序列设计一对引物和TaqM an探针，建立检测猪链

球菌2型的FQ-PCR方法，该方法对4株猪链球菌

2型和其他5种细菌进检测，4株猪链球菌2型均

为阳性，而其他5种细菌均为阴性，对纯培养液定

量检测敏感性达到6～8CFU/PCR反应体系。与传

统的细菌培养方法和生化鉴定相比，更加省时、操

作简便且定量准确，为猪链球菌2型的定量检测提

供了简单特异敏感的分子生物学诊断方法。孟茹等[6]通过筛选布氏杆菌omp10、omp19、omp17、omp25、omp31和结核杆菌cfp10基因的最佳引物

组合，建立鉴别诊断布氏杆菌和结核杆菌的二重实

时荧光定量PCR方法。该方法对布氏杆菌的DNA

最低检出量为20拷贝/μL，结核杆菌为50拷贝

/μL，两病原都存在时为100拷贝/μL，比常规

https://www.wendangku.net/doc/d113422054.html,9

PCR高100倍。为布氏杆菌病的快速、准确诊断提供技术保证。

4.荧光定量PCR在寄生虫病检测中的应用

江晓玲等[7]建立恶性疟原虫荧光定量检测方法，应用重组质粒制作的定量曲线循环闽值与模板浓度具有良好的线性关系，相关系数为0.998。为恶性疟原虫快速临床诊断提供了新方法。王频佳等[8]建立了弓形虫荧光定量PCR检测方法，用重组质粒制作的标准曲线循环阈值与模板浓度有良好的线性关系，相关系数0.995，平均试验间变异系数3.28％，无非特异性扩增。von Samson等根据线虫ITS2基因序列设计属特异性引物和Taqman探针，建立检测反刍动物毛圆线虫的荧光定量PCR检测方法，该方法检测灵敏度为100拷贝/μL，能快速、有效、定量检测并鉴别诊断牛、羊线虫。Higgins JA 等[9]应用TaqMan探针建立从小牛腹泻粪便中定量检测水源性寄生虫小隐孢子虫的cpl1基因和16S rRNA的FQ-PCR方法。为小隐孢子虫的快速诊断提供新技术。Straubinger RK等用荧光定量PCR技术检测了从兔犬皮肤提取的活组织和血液样品中的伯氏疏螺旋体特异性os2pA基因。为伯氏疏螺旋体的特异性检测提供技术支持。Premanandh J等[10]建立了鉴别诊断马生殖泰勒虫和驴生殖道泰勒虫的荧光定量PCR方法，该方法具有特异性强、敏感性高、重复性好、准确定量等优点，并在现地样品检测中显示出了良好的应用效果。朱祥明等根据弓形虫RH株B1基因部分序列设计引物与探针，成功建立了检测弓形虫的SYBR-Green I荧光定量PCR 方法，较常规PCR技术更快捷、敏感、准确，适合临床实验室诊断使用。

5.结语

荧光定量PCR以其快速、特异性强、灵敏度高、重复性好、定量准确、可实时监测及自动化程度高等其它方法无法比拟的优点成为核酸检测的重要工具，弥补了一般技术对疾病亚临床或潜伏感染无法确诊的缺点，为动疾病诊断技术提供了新的模式，是未来疾病快速诊断的一个发展方向，且该技术对某些烈性传染病病原体的诊断尤为安全。但是由于所需仪器、试剂价格昂贵，限制了该技术的普及。相信随着新的荧光标记材料的不断开发、FQ-PCR技术的不断改进与完善、实时定量PCR仪的不断推出、数据分析软件的不断改进更新，荧光定量PCR（FQ-PCR）技术将会有更为广阔的应用前景，实现更加理想的价值。■HF

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