一种大鼠海马神经元的原代培养方法

原代海马神经元细胞培养

原代海马神经元细胞培养 溶液的配制： (1) 4%多聚甲醛溶液：4g多聚甲醛溶于100ml pH=7.4的0.01mol/l PBS中，混匀过滤， 室温保存。 (2)磷酸盐缓冲液（PBS）（0.01mol?l-1）：KH2PO4，0.1g；Na2HPO4?12H2O，1.7g；KCl， 0.1g；NaCl，4.0g，双蒸水加至500ml，pH=7.2～7.4。用0.2μm滤膜过滤，4℃保存。 (3) 1%蛋白酶的配制：用磷酸缓冲液（pH=7.2～7.4）配制成浓度为1%的胰蛋白酶母液 冻存。使用时，用解剖液稀释至0.25%。 (4) 培养皿涂被多聚赖氨酸：配制0.01%的多聚赖氨酸，分装冻存。将上述多聚赖氨酸 放入培养皿中涂两遍，自然晾干后备用。 (5) 解剖液：葡萄糖，3.0g；蔗糖，7.5g；NaCl，8.0g；KCl，0.4g；Na2HP04?7H20，0.18g； KH2PO4，0.03g；HEPES，2.14g；加双蒸水1000ml，调pH=7.0～7.4，过滤，4℃保存。 (6) 种植液：DMEM 79%，胎牛血清，10%；马血清，10%；谷氨酰胺培养液1%。 (7) 饲养液：Neurobasal培养基，97%；谷氨酰胺培养液，1%；B-27，2%。 (8) 阿糖胞苷：用双蒸水配制成浓度为l mg?ml-1的母液储存。用0.2μm滤膜过滤，-20℃ 储存。使用时，取6μl母液加入2ml培养液中，终浓度为3μg?ml-1。（根据实验情况调整浓度） 大鼠原代海马神经元细胞的培养 (1) 新生SD大鼠（＜12h），75%酒精浸泡消毒后断头，剥离出全脑并将其放入盛有解 剖液的培养皿中。 (2) 在解剖液中解剖大脑，分离出海马，移入另一盛有解剖液的培养皿中。在分离出全 部的海马后，去除血管等组织，然后用剪刀将海马分成数小块，放入盛有0.25%胰蛋白酶的培养皿中，将培养皿放入9%CO2、37℃消化20min。 (3) 将培养皿中的海马碎片移入离心管中，去除含胰蛋白酶的液体并用种植液将海马碎 片冲洗2～3遍，终止酶的消化作用。

大鼠 海马 电生理学杂记

神经系统由大量的神经元构成。这些神经元之间在结构上并没有原生质相连，仅互相接触， 其接触的部位称为突触 细胞突起是由细胞体延伸出来的细长部分，又可分为树突和轴突。 树突棘是树突表面的棘状突起，也就是形成突触的部位 一般认为，NMDA受体主要分布在神经细胞的突触后膜。在兴奋性神经元，NMDA受体主要 分布在树突棘头的突触后膜，且主要分布在突触后致密区（postsynaptic density, PSD） 突触可塑性：突触在形态和传递效能上的改变 突触后致密区（PSD）：在电镜下所见的突触后膜胞质面聚集的一层均匀而致密的物质，见 于cns中所有树突棘突触的突触后膜上。主要功能是细胞粘附性的调节，受体集聚的控制和 受体功能的调节。 旷场试验：用来观察小鼠自发性探索运动活性和焦虑行为 反应实验动物在陌生环境中的自主行为与探究行为，以尿便次数反应其紧张度。 开场实验，open field test，这个测的是5min内，动物在一个开阔环境中的行为学变化，我 们用一个强光打在开场中央，开场有方形和圆形两种。圆形是一个大缸，白色的，具体尺寸 我忘记了。需要用的指标是：跨格数、站立数、排便数和梳理数（也就是理毛次数），前两 个指标为主。这个实验可以用中央场次数作为焦虑样行为的观察指标。 运动能力(locomotion， open field test 主要是评价动物的焦虑状态，它主要以动物进入中央区的时间百分率来评价焦虑状态，它也可以度等。 物在一个开放的新的地方会很小心，rodent动物喜暗而避明的特性会让自己躲在暗处，也会 对开阔地方有探索行为（好奇心），同时又有害怕紧张担心和焦虑心理，具有一定的新奇性 同时又具有一定的害怕。如果动物焦虑少，停留在中间等位置时间长久一些，不然反之。比 较这些特性可以比较动物的焦虑程度。具有抗焦虑作用的药物会让动物有更多的对开阔地方 有探索行为，焦虑紧张的动物更喜欢停留在开场的边缘和暗处。 LTP定义：给突触前纤维一个短暂的高频刺激后，突触传递效率和强度增加几倍且能持续数 小时至几天保持这种增强的现象。按LTP的时程分①PTP，强直后增强，一般5分钟后衰减； ②STP，短时程增强，持续半小时左右；③，LTP长时程增强，持续一小时以上 CaMKII这个蛋白是个很特殊的蛋白，在脑内含量非常高，大约占总蛋白量的1-2%。在突触 部位的含量很高，并且是PSD（postsynaptic density）主要蛋白。但这个蛋白最特殊之处是 其具有自身调节能力，仿佛自己本身就是一个具有学习记忆的功能。 因为把随着神经等器官、组织的兴奋所产生的动作电位作为其活动指标是最容易记录的现 象，所以常常用记录动作电位来深入研究神经系统等的机能。 高频刺激可引发突触后细胞的持久增强反应——最初被称为“持久增强作用”（

胎鼠海马神经元培养及其鉴定

［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究 工作. 昆明医学院学报2011，（5）：17～19Journal of Kunming Medical University CN 53-1049/R 胎鼠海马神经元培养及其鉴定 李玉1），王波1），但齐琴2 ） （1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所，云南昆 明650031 ）［摘要］目的建立胎鼠海马神经元体外培养方法，观察细胞生长情况，免疫组织化学染色鉴定神经元特 异性．方法取胎鼠海马，分裂获得细胞悬液，接种于24孔板，经2h 差速帖壁去除成纤维细胞，将细胞液转移并继续培养，以获娶纯度较高的海马神经元．培养第5、11、15天观察细胞和突起生长情况，用NeuN 抗体以免疫组化SP 二步法染色鉴立神经细胞．结果培养头3d ．细胞生长缓慢，5d 时细胞开始生长，可见突起， 11d 时突起连成网状．经Neun 染色培养细胞呈阳性反应，证明是神经元．结论 本方法获取生长良好，纯度 较高的海马神经元． ［关键词］胎鼠；海马神经元；Neun ；培养 ［中图分类号］Q831.1+1［文献标识码］A ［文章编号］1003－4706（2011）05－0017－03 I dent ificat ion and Cult ur e of Hippocampus Neur ons in Fet al Rat s LI Yu 1），WANG Bo 1），DAN Qi －qin 2 ） （1）Deat.of Neurosurgery ；2）Institute of Neuroscience ，Kunming Medical University ， Kunming Yunnan 650031，China ） ［Abstract ］Objective To establish the protocol for culturing hippocampus neurons in vitro and explore the neuronal growth character istics ．Methods Tissues from hippocampus of fatal rats were harvested ，then digested into cell suspension by using 0.125%trypsin ．After planted into wells for 2hours ，cell suspension was transferred into next well for continuing incubation ．The cell growth was observed at day 5，11and 15．Neurons specific Enolase （NSE ）antibody ，recognized specifically NSE antigen in cultured cells ，was used to identify neurons by SP-two-step staining method ．Results After incubated for 2hours ，transferred suspensions in wells showed some pure neurons ，which is identified by NSE staining ．However ，they grew slowly during 1～3days ，then grew well from 5th day ，with gradual increasing the neuritis outgrowth ．Conclusion Purified neurons with neurite outgrowth states can be acquired by this method. ［Key words ］Fetal rats ；Hippocampus neurons ；NSE staining ；Culture 海马神经元细胞培养是研究神经细胞生物学特性和外源干扰因素作用（细胞因子）的有效细胞模型，其在神经生物学，发育生物学体外实验研究中已被广泛应用[1-3]．然而，要获得纯度较高， 生长状态较好的海马神经元也不是一件易事．本实验长期从事海马神经细胞生物特性及其应用研究，故需建立该细胞模型．鉴于胚胎来源的细胞 生长状态较成年动物来源者好[4，5] ．本实验建立大

氟西汀对海马神经元生长的影响

氟西汀对海马神经元生长的影响 各位读友大家好，此文档由网络收集而来，欢迎您下载，谢谢 【关键词】氟西汀;细胞培养;海马神经元;大鼠 氟西汀是5-羟色胺（5-HT）再摄取抑制剂之一，是应用较广的抗抑郁药。氟西汀除有抗抑郁作用外，尚可治疗其他中枢神经系统疾病。有研究表明，氟西汀对海马的神经保护作用是其发挥抗抑郁效应的机制之一［1］。关于氟西汀对体外培养的海马神经元生长的影响未见报道，本研究初步探讨了氟西汀对原代培养的海马神经元生长的影响。 1材料与方法 新生大鼠海马神经元的分离和培养 技术方法在参考文献［2］基础上加以改进。取出生24h内的新生SD大鼠（东南大学医学院动物实验中心提供），无菌分离出双侧海马，用显微剪剪碎，

D-Hank#39;s液清洗2或3次，将剪碎的海马组织转移至离心管中，加入等量%的胰酶（美国Sigma公司），37℃消化30min，中间振摇1或2次，加入10%的DMEM/F12（美国Gibco公司）5ml，轻轻吹打15次，然后1000r·min-1离心5min，制成单细胞悬液，置于CO2培养箱（德国Heraeus公司产品）中，差速贴壁30min，去除成纤维细胞，吸取未贴壁的细胞，并用200目的不锈钢滤网过滤，收集过滤后的单细胞悬液于培养皿中，然后至离心管中，取一滴单细胞悬液进行计数，并用DMEM/F12将细胞密度调到1×106ml-1，然后接种于200μg·ml-1多聚赖氨酸（美国Sigma公司）包被的6孔培养板中，转移至培养箱内培养，4h后换为无血清培养基，即含2%B27的Neurobasl培养基（美国Gibco公司），以后每3天半量换液1次。使用培养6d的神经元进行染色鉴定。 大鼠海马神经元的鉴定 烯醇化酶（NSE）免疫细胞化学染

神经元细胞培养

神经元细胞培养 1. 孕16 d SD 大鼠经戊巴比妥钠麻醉后，碘酒、75%乙醇消毒腹部皮肤，依次剪开皮肤、肌肉、皮下筋膜，无菌操作下取出胚胎放入预冷的D-Hanks’平衡盐液中。 2. 在解剖显微镜下分离并取出胚胎大脑皮层，除去脑膜，剪碎组织成约1mm3 大小，加入胰酶-EDTA 消化液并放入37℃孵箱内消化20 min，中间摇晃一次。 3. 随后用滴管吸出组织转移到装有预冷的培养液(DMEM＋10%FBS)的离心管内终止消化液作用5 min。 4. 用滴管吸出组织转移到装有预冷的DMEM＋10%FBS 的离心管内，用火焰抛光的巴斯德滴管吹打数次，静置后取上清吸到另一支离心管内。重复上述步骤2～3 次。 5. 将所收集的上清经200 目筛网过滤。 6. 过滤后的细胞悬液于800 rpm 离心5 min，弃上清，管内加入新鲜培养液(DMEM＋20%FBS)并吹打成单细胞悬液。 7. 细胞计数，调整细胞密度按（700000个）1.5×105/cm2 种入6 孔板内，放入CO2 孵箱中培养。 (1)把细胞悬液用(DMEM＋20%FBS)悬浮，种到培养皿上6－12 h 后，全量换成2% B27 的neurobasal 培养基，继续培养，3 d 半量换液。（+0.5mmol/L谷氨酰胺） 鉴定 1.形态学的观察，在DIC下可以很清楚的看到神经元特有的形态，轴突树突以及胞体非常 明显。 2.免疫学鉴定：正如楼上几位所说，NF（神经丝）或者tubulin 或者MAP2等都是目前 鉴定神经元的Marker,不论你好似免疫荧光还还是免疫组化，阳性表达即可！ 3.在进一步你可一做mRNA水平的实验，也就是RT-PCR了。这就更能支持2的阳性表达 了。 4.电生理学的鉴定：测定神经元特有的电生理学也是证据之一啊！ 从以上几个方面去做，应该能证明是神经元了！ 错误之处还请赐教！ TUJ1

电针对脑功能障碍大鼠海马物质影响的研究进展

电针对脑功能障碍大鼠海马物质影响的 研究进展 （作者： _________单位：____________ 邮编：___________ ） 【摘要】目前，电针对脑缺血模型大鼠海马细胞影响的研究报道很多，对海马与学习记忆关系的研究已成为国内研究的重 点。本文就电针对脑功能障碍大鼠海马物质影响的研究作简要综述。 【关键词】电针海马物质 海马的生理功能目前仍在探讨之中.大量的动物模型研究表明，海马与学习记忆有关。当脑缺血等致海马受损时，可引起学习记忆功能的严重障碍。电针刺特定穴位可影响脑功能障碍大鼠海马物质的表达。现就目前电针对脑功能障碍大鼠海马物质影响的研究作一综述。 1电针对海马细胞凋亡相关蛋白表达的影响 1.1 Bel ]2是功能最为明确的细胞凋亡拮抗基因Bcl[2蛋白基本生物学功能为延长细胞的生命期限、增加细胞对多种凋亡刺激因素的抗性。Bax与Bcl]2作用相反，能够促进凋亡，Bcl〕2表达水平较高时，形成Bcl[2/Bcl[2同源二聚体，抑制细胞凋亡；Bax表达水平较高时，形成

Bax/Bax同源二聚体，加速细胞凋亡；BcL2和Bax水平相当 时，则形成Bcl[2/Bax异源二聚体，终止细胞凋亡。近年的研究提示 Bcl[2与Bax调节细胞凋亡，不仅取决于自身表达的高低，还与 Bax/Bcl_2比率有关，当比率增大时，细胞趋于凋亡[1 ]o caspase ]3 激活是触发凋亡的关键（有“分子开关”之称是凋亡的最终执行蛋白。Bcl]2家族基因在调节线粒体通透性上发挥重要作用，Bcl]2或其他 抗凋亡Bcl_2家族成员下调，或促凋亡Bcl_2家族成员如Bax在线粒体膜上过度表达和移位，均导致线粒体通透性增加，使细胞色素C 从线粒体释放入胞浆，与Apaf”、dADP形成复合体，再与胞浆中的caspase ]9前体形成凋亡小体，导致caspase[9被裂解激活，随后再裂解caspase家族其他成员包括caspase[3,引发凋亡。赵建新等[2] 报告电针刺激脑缺血小鼠“肾俞”膈腧”百会；各观察时点均可上调小鼠海马细胞Bcl[2表达，下调Bax表达，降低凋亡率。故电针可起到抑制凋亡、保护神经元的作用电针可显著上调内源性海马Bcl[2表达，降低Bax表达，有可能进一步抑制caspase [3的激活，或影响神经生长因子、过氧化物歧化酶、CHAT等促神经细胞存活相关基因的表达而发挥抗凋亡作用，有待今后动物实验验证。Noxa为BH3only 亚家族成员]3]，脑缺血研究发现，Noxa在脑缺血引起的细胞凋亡中起重要作用[4 ]。朱燕珍等]5]报告，电针刺激血管性痴呆模型大鼠“大椎百会：海马CA1区的Noxa阳性细胞数增加，Caspase ]3 阳性细胞数增加，提示Noxa调节的线粒体凋亡途径促进血管性痴呆的发展；电针治疗抑制

成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定

昆明医学院学报2011，（6）：29～32 CN53-1049/R Journal of Kunming Medical University 成年小鼠海马神经细胞培养及其鉴定 李玉1），但齐琴2），习杨彦彬2） （1）昆明医学院第一附属医院神经外科，云南昆明650031；2）昆明医学院神经科学研究所， 云南昆明650031） ［摘要］目的观察体外培养成年小鼠海马神经细胞生长情况及其形态学变化．方法获取成年海马组织，制成细胞悬液，接种于培养板，分别于1，3，7，10，13，15d观察细胞生长情况，用神经元特异烯醇化酶抗体经免疫组织化学染色技术鉴定神经元．结果成年海马神经元接种后1～3d，有较多的杂质和部分细胞漂浮，贴壁细胞较少量．每隔3d半量换液后，杂质不断减少，但第1周细胞生长缓慢，第7～10d才见细胞生长良好．培养15d后，大部分细胞出现有明显的颗粒等早期退化征象．免疫组化染色证实培养细胞呈现神经元特异烯醇化酶染色阳性染色，免疫阳性产物主要分布于细胞质；证明是神经元．结论体外培养成年海马神经元早期生长缓慢，7～10d才显示良好的生长状态，2周左右细胞则开始退变．提示10d以前的细胞是供体外研究用的理想细胞． ［关键词］大鼠；神经细胞；海马；细胞培养；免疫组化 ［中图分类号］Q813.1+1［文献标识码］A［文章编号］1003－4706（2011）06－0029－04 Cult ur e and Ident ificat ion of Hippocampus Neur ons in Adult Rat s LI Yu1），DAN Qi－qin1），XIYANG Yan－bin2） （1）Dept.of Neurosurgery，The1st Affiliated Hospital of Kunming Medical University，Kunming Yunnan 650032；2）Institute of Neuroscience，Kunming Medical University，Kunming Yunnan650031，China） ［Abstract］Objective To observe the morphology and characteristics of hippocampus neurons in adult rats in vitro．Method The hippocampus tissues from adult rats were collected，then digested into cell suspension by using0.125%trypsin．Cell suspension was planted into wells and observed at day1，3，7，10，13，and15 after incubation．Neurons specific Enolase（NSE）antibody，recognized specifically NSE antigen in cultured cells，was used to identify neurons by SP-two-step staining method．Results During1-3days，the extensive bodies of floating cells and tissue blocks were seen，but a few cells attached to the bottom of well．The growth of attached cells was also extensively slow，specifically within1week，while it began to grow quickly after7days，and maintained till15days．Amazingly，cells exhibited aging character with more particles in cytoplasm after15 days．NSE staining showed that cultured cells were positive staining by neuronal specific enalose antibody．Conclusion Adult hippocampus neurons grow slowly during the first week，but they are better from7day to15，then begin to degenerate after15days in vitro．This suggests that neurons from hippocampus of adult rats cultured in10days could be better for related neurobiological studies. ［Key words］Adult rats；Hippocampus neurons；NSE staining；Culture ［作者简介］李玉（1965～），男，云南昆明市人，医学硕士，副教授，主要从事癫痫外科和功能神经外科临床研究工作.

海马神经元细胞免疫荧光检验

海马神经元细胞免疫荧光检验 神经元鉴定： 一、烯醇化酶鉴定： 培养细胞用100%乙醇固定---10min---PBS漂洗5min×3次---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS 漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min 以减少排特异背景颜色------加第一抗体特异烯醇化酶（chemicon，1:1000），4℃冰箱孵育18~24小时---PBS漂洗5min×3次---加入2步法：PV9000试剂Ⅰ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---PV9000试剂Ⅱ,37℃，30min---PBS漂洗5min×3次---DAB显示红棕色；70%，80%，90%，100%I，100%II 梯度酒精透水；二甲苯Ⅰ，Ⅱ透明2次，每次30min---中性树胶灯片---镜下观察。 二、β-微管蛋白Ⅲ（β-tubulinⅢ）荧光显示： 培养细胞用预冷PBS液轻柔漂洗3次，4%多聚甲醛固定，1h，4℃---吸去多余甲醛---PBS漂洗5min×3次---0.25%triton，室温，15min---3%H2O2室温孵育30min，目的用于去除内源性过氧化物酶---PBS漂洗5min×3次---5%羊血清（0.3%TritonPBS配制），室温封闭30min以减少排特异背景颜色------弃血清，加入β-tubulinⅢ抗体（1:100稀释），4℃，过夜---PBS漂洗5min×3次---滴加FITC 标记的山羊抗小鼠lgG（体积比1:200稀释），37℃，1h---DAPI复染10min---抗荧光猝灭封片液封片---荧光显微镜观察---选择10个视野，统计学处理。

各类神经元细胞的培养方法

体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能 上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下: 一、鸡胚背根神经节组织块培养 主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。 1、材料和方法 （1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。 （2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。 （3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。 （4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。 （5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。 2、结果 鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长。 二、新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养 背根神经节（DRG）细胞起源于神经嵴，NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明，外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。在体外，分离培养的神经节在NGF存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数

大脑地解剖结构和功能——布鲁德曼分区

大脑的解剖结构和功能——布罗德曼分区系统 布罗德曼分区是一个根据细胞结构将大脑皮层划分为一系列解剖区域的系统。神经解剖学中所谓细胞结构（Cytoarchitecture），是指在染色的脑组织中观察到的神经元的组织方式。 布罗德曼分区1909年由德国神经科医生科比尼安·布洛德曼（Korbinian Brodmann）提出。根据皮质细胞的类型及纤维的疏密把大脑皮质分为52个区，并用数字给予表示。Brodmann Area 1, BA1 Brodmann Area 2, BA2 Brodmann Area 3, BA3 位置：位于中央后回 (postcentral gyrus) 和前顶叶区。 功能：分别为体感皮层内侧、末尾和前端区,BA1、BA2、BA3共同组成体感皮层； 具备基本体感功能（first somatic sensory area）接受对侧肢体的感觉传入。Brodmann Area 4, BA4 位置：位于中央前回(precentral gyrus)，中央沟(central sulcus)的内侧面 功能：初级运动皮层（first somatic motor area)，包含“运动小人”（motor homunculus ）。 控制行为运动，与BA6 （前）和BA3 、BA2 、BA1、（后）相连，同时与丘脑腹外侧核相连。 体感小人（Somatosensory Homunculus ） 传入体感信息较多的身体区域获得的皮层代表区域较大。比如手部在初级体感皮层中的代表区域比背部的大。体感皮质定位可用“体感小人”（Somatosensory homunculus）来表示。 Brodmann Area 5, BA5 位置：位于顶叶前梨状皮质区（梨状皮质piriform cortex为下边缘皮质的组成部分）。功能：与BA7形成体感联合皮层。 Brodmann Area 7, BA7 位置：位于顶叶皮质顶部，体感皮层后方，视觉皮层（visual area)上方。 功能：将视觉和运动信息联合起来；与BA5形成体感联合皮层；视觉-运动协调功能。 Sensory Areas---------Somatosensory Association Area 位置：位于初级躯体感觉皮层后方（BA5、BA7）

海马细胞培养与鉴定

3.1海马原代培养操作 准备： 1、取海马：培养皿6个（3对），D-hanks（100ml，提前预冷），75%酒精，眼科镊2把， 小剪刀3把，小镊子4把（三个弯头，一个直头），冰袋3个，中号镊一把。 2、细胞室：小dish，多聚赖氨酸（1个EP），纸抽，细胞剪，胰酶（2个EP），DMEM（10% 胎牛血清+青霉素+链霉素，提前拿出），离心管2个，24孔板1个，细胞筛2个，废液缸1个, D-hanks 3、分装：胰酶：1ml、D-hanks:100ml、青霉素：500ul、链霉素：500ul、胎牛血清：10ml、 DMEM：90ml、B27：40ul、Neurobasal：1.6ml 4、玻璃器皿：移液管，培养皿，24孔板内的玻璃片，泡酸过夜，自来水清洗10遍，一蒸 10遍，三蒸3遍，烤干，高压，再烤干 步骤： 1、培养前30min包被多聚赖氨酸置于培养箱中备用； ↓ 2、75%酒精浸泡鼠，断头取脑（1把中镊，1把中剪） ↓ 3、剥离海马（D-hanks液，冰盒，4把小镊） ↓ 4、去血管、被膜（显微镊2把） ↓（进细胞间） 5、吸去多余D-hanks，剪碎，吸入15ml离心管 ↓ 6、D-hanks：胰酶=1:1，吹打20次 ↓ 7、15-20 min，37℃，期间5min震荡一次 ↓ 8、1:1比例加（DMEM+青链+胎牛血清）终止消化，吹打20次 ↓ 9、配平，1000rpm，5min ↓ 10、弃上清，得沉淀 ↓ 11、加（DMEM+青链+胎牛血清），吹打20次 ↓ 12、100目过筛， ↓ 13、放入15ml离心管，吹打

↓ 14、配平，1000rpm，5min ↓ 15、弃上清，得沉淀，加DMEM，吹打 ↓ 16、200目过筛 ↓ 17、计数（1×106） ↓ 18、500微升/孔（24孔板） ↓ 19、24孔板放入恒温培养箱中，37℃，5%CO2 ↓ 20、第二天换Neurobasal+B27（N:1.6ml，B27:40ul） ↓ 21、隔三天换液 注意事项：1、取海马的操作过程要迅速，提高神经细胞的存活率。 2、从断头处死鼠到胰酶消化前整个过程都要在冰上进行。 3、如果是胎鼠，不要取一个分离一个，而是要快速把所有胎鼠大脑都迅速取出 放到预冷的液体中。 4、一定要尽可能的去掉所有的血管和血管膜。 5、吹打动作要轻柔，以免损伤细胞。 6、种板时密度很重要，过密和过稀都会影响细胞生长。 7、种板后需轻摇晃板，切记！不能圈圈摇晃。应左右平行，上下平行摇晃。 3.2 海马细胞的鉴定： 取培养7-9天的细胞 海马神经细胞特异性抗体：神经元特异性烯醇化酶（NSE）、微管相关蛋白质2（MAP2）、生长相关换蛋白43（GAP-43） NSE：神经元特异性烯醇化酶，血清NSE是神经元和神经内分泌细胞所特有的一种酸性蛋白酶 GAP-43：GAP-43是一种膜相关的鳞蛋白，与神经纤维生长的调节有关，主要分布于海马神经元的轴突 MAP2：MAP2是一种细胞骨架蛋白，定位于海马神经元的胞体和树突。

海马结构及图

海马结构,希望有所帮助 海马结构(hippocampal formation，HF)属于脑的边缘系统(1imbic system)中的重要结构，与学习、记忆、认知功能有关，尤其是短期记忆与空间记忆。海马皮质从海马沟至侧脑室下角依次为分子层、锥体层和多形层。齿状回也分三层：分子层、颗粒细胞层和多形层。依据细胞形态、不同皮质区的发育差异以及纤维排列的不同，将海马分为4个区，即CAl、CA2、CA3、CA4区。海马结构是大脑边缘系统的重要组成部分．在进化上是大脑的古皮质，位于大脑内侧面颞叶的内侧深部，左右对称。一般认为海马结构由海马或称Ammon角、齿状回、下托及海马伞组成，结构比较复杂。在功能和纤维联系上，不仅与嗅觉有关，更与内脏活动．情绪反应和性活动有密切关系。细胞学研究表明，海马头部主要是由CAI区折叠而成，而CAI区对缺氧等损伤最为敏感，也被称为易损区，因此海马头部也是最易发生病变的部位。 海马结构由海马(hippoeampus)、齿状回(dentate gyrls)、下托(subiculum)和围绕胼胝体的海马残体(hippoeampal rudimerit)组成，其中海马为体积最大最主要的部分。 大脑海马（hippocampus）是位于脑颞叶内的一个部位的名称，人有两个海马，分别位于左右脑半球. 它是组成大脑边缘系统的一部分，担当着关于记忆以及空间定位的作用. 名字来源于这个部位的弯曲形状貌似海马(希腊语hippocampus). 在阿兹海默病中,海马是首先受到损伤的区域; 表现症状为记忆力衰退以及方向知觉的丧失。大脑缺氧(缺氧症)以及脑炎等也可导致海马损伤 . 在动物解剖中, 海马属于脑的演化过程中最古老的一部分。来源于旧皮质的海马在灵长类以及海洋生物中的鲸类中尤为明显。虽然如此, 与进化树上相对年轻的大脑皮层相比灵长类动物尤其是

原代神经细胞培养方法重点讲义资料

神经细胞培养 体外神经细胞的培养已成为神经生物学研究中十分有用的技术手段。神经细胞培养的主要优点是:(1)分散培养的神经细胞在体外生长成熟后,能保持结构和功能上的某些特点, 而且长期培养能形成髓鞘和建立突触联系,这就提供了体内生长过程在体外重现的机会。(2)能在较长时间内直接观察活细胞的生长、分化、形态和功能变化,便于使用各种不同的技术方法如相差显微镜、荧光显微镜、电子显微镜、激光共聚焦显微镜、同位素标记、原位杂交、免疫组化和电生理等手段进行研究。(3)易于施行物理（如缺血、缺氧）、化学和生物因子（如神经营养因子）等实验条件, 观察条件变更对神经细胞的直接或间接作用。(4)便于从细胞和分子水平探讨某些神经疾病的发病机制，药物或各种因素对胚胎或新生动物神经细胞在生长、发育和分化等各方面的影响。我们实验室从80年代始开展了神经细胞的体外培养工作，取得了一些经验，现将培养细胞分类及方法简要介绍如下: 一.鸡胚背根神经节组织块培养 主要用于神经生长因子（NGF）等神经营养因子的生物活性测定。在差倒置显微镜下观察以神经突起的生长长度和密度为指标半定量评估NGF的活性。 1．材料和方法 （1）选正常受精的鸡蛋，置于37℃生化培养箱内孵化，每日翻动鸡蛋一次。 （2）取孵化8-12 d 的鸡蛋, 用70% 酒精消毒蛋壳，从气室端敲开蛋壳，用消毒镊剥除气室部蛋壳。 （3）用弯镊钩住鸡胚颈部，无菌条件下取出鸡胚置小平皿内，除去头部后，腹侧向上置灭菌毛玻璃片上,用眼科弯镊子打开胸腹腔，除去内脏器官。 （4）在解剖显微镜下，小心除去腹膜，暴露脊柱及其两侧，在椎间孔旁可见到沿脊柱两侧排列的背根节（图1），用一对5号微解剖镊小心取出。 （5）置背根节于解剖溶液内，用微解剖镊去除附带组织，接种于涂有鼠尾胶的玻璃或塑料培养瓶中，在DMEM无血清培养液中培养。 2．结果 鸡胚背根神经节在含神经生长因子(NGF, 2.5S，20ng/ml)的无血清培养液中培养24 h,神经节长出密集的神经突起。而未加NGF的神经节培养24 h, 未见神经突起生长。 二．新生大鼠、新生小鼠及鸡胚背根神经节分散细胞培养 背根神经节（DRG）细胞起源于神经嵴，NGF研究先驱Levi-Montalcini的实验表明，外原性NGF能刺激DRG细胞生长发育并形成广泛的神经网络。在体外，分离培养的神经节在NGF 存在的情况下，神经突起的生长在一天之内可长达数毫米，因此，利用培养的DRG细胞，进行轴突生长发育的研究，是最为经典而常用的方法之一。 1．材料和方法 取新生一天的大鼠(wistar种)和小鼠(昆明种)。用眼科剪在无菌条件下除去背部皮肤, 然后剪取一段脊髓,背侧朝上置于灭菌毛玻璃片上,在解剖显微镜下沿椎管两侧水平剪除腹侧一半椎骨,暴露脊髓和神经节,用解剖镊分离出神经节。鸡胚背根神经节的取材方法同前。剥除神经节被膜, 用0.125%胰蛋白酶消化(37℃ 30min)分散后用种植(Plating)培养液稀释成0.2×105个细胞/ml密度的细胞悬液，接种于涂有鼠尾胶的35mm塑料培养皿中,每皿2ml细胞悬液置。置标本于36℃、10%CO2培养箱中培养。24h后倾去培养皿内种植培养液，改用饲养(Feeding)培养液培养。接种第3d, 在培养皿中分别加入细胞分裂抑制剂5-氟-2'-脱氧尿苷15μg/ml和尿苷35μg/ml以抑制非神经细胞的增殖, 作用48 h后更换新鲜饲养培养液，以后每周换液两次, 每次更换一半新鲜饲养培养液。

原代神经元培养

原代神经元培养 Document number：BGCG-0857-BTDO-0089-2022

神经细胞原代培养 从动物（大鼠或小鼠等）的胚胎或新生动物的脑组织取下某一局部区域，分离细胞，培养在培养容器后不再移植，常称为原代神经细胞培养。 一、培养前准备 1. 器械和器皿 器械：外科剪、镊子、虹膜剪等、小剪刀、细镊子和虹膜小刀等 各种金属器械如解剖器械，使用后及时刷洗干净，用酒精棉球擦拭后晾干，或经60℃烘干，以防生锈。由于湿热消毒对手术器械容易可用70－80％酒精浸泡1小时以上消毒。 器皿： 1)玻璃瓶及相应的胶塞或胶木螺旋盖， 2)用于分装血清、多聚赖氨酸、解剖液、各种盐溶液和培养液等。 3)培养瓶、盖玻片 4)培养用的盖玻片必须不含铅、不发霉，可用盐酸浸泡10分钟，用蒸馏 水洗2次，每次10分钟，然后移入丙酮或乙醇浸泡10分钟，再用双蒸水洗2次，每次10分钟，烘干待消毒。凡组织学用过的旧盖玻片一般不用。 5)移液管、吸管、烧杯、离心管和培养皿。 6)塑料培养皿（35mm）、塑料培养板（6、24、96孔）。 辅助工具：放置试管、吸管和玻璃瓶等的架子。 2. 培养基和培养用液的配制

1)??培养基质：有多聚赖氨酸、牛皮胶原和鼠尾胶原。本室目前常用分子量为7-140000多聚赖氨酸（Poly-L-lysine，浓度为ml。 2)??平衡盐溶液：主要以无机盐和葡萄糖配制而成。各种平衡盐溶液主要的不同点在于NaCl的浓度、离子浓度及缓冲系统的不同，可根据实际需要选用适当的平衡盐溶液。 3)??培养液：目前已有现成的干粉出售，按说明书进行配制即可。神经细胞培养需高糖，培养液应含有或加葡萄糖至6g/L。目前培养海马神经元可选用B27无血清培养液。 4)??血清：有胎牛血清、小牛血清和马血清等。分装成小瓶，4℃保存备用（分装前需56℃灭活30分钟）。 5)??胰蛋白酶溶液：用于分离细胞。先用少量灭菌三蒸水将胰蛋白酶粉末溶成糊状，然后补水至%浓度，振荡摇匀，4℃过夜，待完全溶解后用滤器过滤灭菌，并分装成1-2ml冻存。用前以D-Hanks平衡盐水或其他无钙镁离子溶液溶解稀释至%或%。实际使用温度一般为37℃ 20-30分钟。 6)??解剖溶液：由平衡盐水（D1-无钙镁离子的Puck氏液）、HEPES缓冲液和蔗糖－葡萄糖溶液组成称为D1-SGH。 D1平衡盐水：NaCl 、KCl 、、KH2PO4 、酚红、三蒸水50ml。 蔗糖－葡萄糖（SG）：蔗糖、葡萄糖3g、三蒸水50ml。 HEPES（H，）：用25ml左右的三蒸水溶解的HEPES后，用NaOH或HCl 调pH至，加三蒸水至28ml。

海 马 神 经 元 培 养

海马神经元培养 （1）材料 ①孕鼠：海马：孕18d，皮层或纹状体：孕16d ②Neurobasal medium (Gibco-BRL, cat. no. 21103) L-Glutamine (Gibco-BRL, cat. no. 25030) 谷氨酰胺 Glutamic acid (Sigma, cat. no. G-1626) 谷氨酸 B27 (Gibco-BRL, cat. no. 17504) ③Poly-D-lysine (mol wt 30,000—70,000) (Sigma, cat. no. P-7280)多聚赖氨酸 ④Hank’s balanced salt solution (HBSS) (Gibco-BRL, cat. no. 14025) ⑤HBSS without Ca2+, Mg2+ (Gibco-BRL, cat. no. 14175) ⑥trypsin 胰酶 ⑦NaHCO 3 ⑧Na pyruvate (Gibco-BRL, cat. no. 11840)丙酮酸钠 ⑨Trypan blue, 0.4% 台盘蓝 ⑩巴氏吸管，前端用火抛光 刻度吸管 离心管 闪烁瓶 玻璃培养皿：小：3套 大：2套 冰袋、纱布 手术器械、筛网 培养瓶或培养板

（2）步骤 ①准备 a．配制试剂 i) Poly-D-lysine（需保存在聚苯乙烯容器中，不能保存在玻璃、聚碳酸酯或聚丙烯容器中） 配制硼酸缓冲液（pH8.4） A液（硼砂溶液）：1.907g硼砂溶于100ml纯水（0.05M），0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 B液（硼酸溶液）：1.237g硼砂溶于100ml纯水（0.2M）0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 4.5mlA液+ 5.5mlB液 5mg P-D-L溶于10ml硼酸缓冲液中，配制成0.5mg/ml贮存液，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，-20℃保存使用时用硼酸缓冲液稀释10倍。 ii)HBSS without Ca2+, Mg2+（D-Hank’s溶液）配制 不含钙、镁的HBSS粉剂：4.75g溶于400ml纯水 NaHCO3：0.175g加入溶液 1M NaOH 调节pH至7.2-7.4 纯水定容至500ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 iii）1M NaOH溶液配制 NAOH：4g 溶于100ml纯水 iv）0.125%胰酶+0.02%EDTA D-Hank’s溶液10ml EDTA 20mg 溶解后 D-Hank’s溶液80ml 胰酶125mg 溶解后 1M NaOH溶液调节pH至7.2 D-Hank’s溶液定容至100ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 v）D-Hank’s溶液配制（0.035% NaHCO3，1mM Na pyrurate，10mM HEPES，pH7.4） 不含钙、镁的HBSS粉剂： 2.375g溶于200ml纯水 NaHCO3：0.088g加入溶液 HEPES：0.596g加入溶液 Na pyrurate（100mM）： 2.5ml加入溶液 1M NaOH 调节pH至7.4 纯水定容至250ml，0.22μm微孔滤膜过滤除菌，4℃保存 vi）Hank’s溶液配制（0.035% NaHCO3，1mM Na pyrurate，10mM HEPES，pH7.4） 含钙、镁的HBSS粉剂： 2.45g溶于200ml纯水 NaHCO3：0.088g加入溶液 HEPES：0.596g加入溶液 Na pyrurate（100mM）： 2.5ml加入溶液

基于海马神经元细胞研究宁神灵抗抑郁作用机制

基于海马神经元细胞研究宁神灵抗抑郁作用机制 发表时间：2019-03-07T16:26:29.280Z 来源：《心理医生》2019年第4期作者：王赫霆 [导读] 研究宁神灵对抑郁症大鼠行为学及海马神经元细胞的影响 （哈尔滨市第十一中学黑龙江哈尔滨 150000） 【摘要】目的：研究宁神灵对抑郁症大鼠行为学及海马神经元细胞的影响。方法：正常大鼠随机分为空白组、模型组。采用慢性、不可预知性温和刺激（CUMS）结合孤养模型制作抑郁症大鼠模型，分中药治疗组（高、中、低剂量），对照组，各组15只，于第0、7、14、21、28天观察行为学指标（体重、糖水消耗实验、敞箱得分、大鼠活动延迟时间）。28天取大鼠海马组织，观察CA1、CA2、CA3、CA4区形态学变化及HE染色后脑组织的病理改变(Figure)。结果：相同时间点组间比较第7、14、21、28天行为学指标空白组＞中药高剂量组＞中药中剂量组＞中药低剂量组＞对照组。组内比较行为学指标高、中、低剂量组与时间呈正相关，空白组与对照组与治疗时间无差异。抑郁大鼠海马CA1区锥体细胞偶见散在的胞体固缩,深染或胞质溶解、空泡变性。CA4区可见少量锥体细胞胞体固缩,深染。治疗组大鼠 海马区神经元排列整齐，细胞体呈椎体形，较大，核大而圆，且与中药剂量呈正相关。结论：宁神灵可能通过作用于大鼠海马神经元细胞，引起相关蛋白及递质的改变，具有抗抑郁作用。 【关键词】宁神灵；抑郁症；慢性不可预知刺激；行为学；海马神经元 【中图分类号】R749.05 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8231（2019）04-0045-02 抑郁症是一种以显著而持久的情绪失常为特征的综合征，该病具有高患病率、高致残率、高自杀率的特点。据世界卫生组织进行的全球疾病负担调查估计，到2020年由抑郁症造成功能残疾的人数将仅次于心血管疾病，上升至所有病种的第2位，并将占到全球因精神因素致残患者的1/3，因此，抑郁症已成为亟待解决的最重要的精神障碍[1]。近年来，关于抑郁症发病机制的研究很多，大多集中在神经递质、基因和社会因素等方面，但对于抑郁症发生和发展的分子生物学机制仍尚不明确[2]。 1.材料与方法 1.1 实验材料 健康雄性大鼠75只，正常大鼠随机分为空白组、模型组，采用慢性、不可预知性温和刺激（CUMS）结合孤养模型制作抑郁症大鼠模型，模型组分中药高（宁神灵5.04g/kg）、中（宁神灵2.52g/kg）、低剂量组（宁神灵1.26g/kg）、对照组。 1.2 研究方法 1.2.1行为学指标观察 （1）体重测定 实验过程中每周称量一次体重观察各组大鼠体重变化及增长情况以判断抑郁状态与体重变化的关系。 （2）糖水消耗实验 根据文献所有大鼠首先受训饮用1%的蔗糖水在开始的48小时内将蔗糖水放入笼中以代替自来水接着禁食禁水24小时通过称饮水瓶重量测量大鼠在1小时内蔗糖水的饮用量此后每间隔一周均进行禁水禁食及1小时蔗糖水测试，此过程贯穿于整个实验。 （3）敞箱得分实验 将大鼠置于高40cm，直径80cm周壁为黑色底面被分成面积相等的25块方格组成的旷场里，60W灯泡照明观测每只大鼠3min内水平活动和垂直活动得分。7:30～12:00之间在安静的房间内进行此项试验观察将大鼠置于敞箱中间观察大鼠穿越方格数（四爪均进入的方格可记数，为水平活动得分）、后肢直立次数（两前爪腾空或攀附墙壁，为垂直运动得分）、清洁运动次数（理毛次数）、粪便次数。彻底清洁敞箱后再进行下一只大鼠的观察。每只大鼠测试3分钟。分别在造模前、给药前及给药后进行敞箱实验。 1.2.2标本采集 （1）HE染色 取大鼠脑组织，在4%甲醛溶液中固定24-48小时，用模具测量并用刀片切取海马区，石蜡包埋，进行切片和HE染色。使用光学显微镜对大鼠海马组织切片拍照，供分析使用。 （2）电镜显微结构观察 解剖获取大鼠脑组织，将脑组织迅速放入3%戊二醛固定液在4℃条件下固定过夜。用模具测量并用刀片切取海马区作为标本进行俄酸包埋，使用电子显微镜对大鼠海马组织切片拍照，供分析使用。 2.结果 本实验表明相同时间点组间比较第7、14、21、28天大鼠体重指数：空白组＞中药高剂量组＞中药中剂量组＞中药低剂量组＞对照组；糖水消耗实验：空白组＞中药高剂量组＞中药中剂量组＞中药低剂量组＞对照组；敞箱得分：空白组＞中药高剂量组＞中药中剂量组＞中药低剂量组＞对照组；大鼠活动延长时间：空白组＞中药高剂量组＞中药中剂量组＞中药低剂量组＞对照组。组内比较行为学指标、高、中、低剂量组与时间呈正相关，空白组与对照组与治疗时间无差异。脑组织HE染色后，显微镜拍照观察脑组织的病理改变（Figure）。结果显示，模型组大鼠海马CA1区锥体细胞偶见散在的胞体固缩，深染或胞质溶解、空泡变性。CA4区可见少量锥体细胞胞体固缩，深染。治疗组大鼠海马区神经元排列整齐，细胞体呈椎体形，较大，核大而圆，且与中药剂量呈正相关。 3.讨论 抑郁症患者常伴有一些生物性节律改变，如睡眠障碍、食欲不振、便秘、身体乏力、精力减退、性功能障碍等，这些生理症状应用西药抗抑郁药很难解决，甚至一些西药还会加重上述障碍，在上市销售明确用于抑郁症治疗的天然药物及中药复方制剂中，不是治疗单一，就是疗效不显著，而且用药一段时间极易出现病情反复的现象，同时症状更加严重。传统中药在复杂的抗抑郁治疗方面具有明显的优势，很多研究都表明祖国传统的经方名方对于抑郁症的治疗能够达到很好的疗效[3]。研究发现，柴胡加龙骨牡蛎汤复方具有较强的抗焦虑、抗抑郁作用，其作用机制可能与增加了脑内单胺类神经递质的含量密切相关[4]。宁神灵冲剂由二组药组成，一组舒肝郁、平肝火、清痰热，另一组扶心阳固心气。收敛神气之浮越，合之调节心、肝二脏之功能，使之趋于平衡，神志之病，脏腑辨证在于此二脏，二脏平和，消除各种精神神经症状。与西药作用迥然不同，它针对神经抑制和兴奋过程失调而组方，通过双向调节大脑皮层兴奋和抑制神经的过程，消除