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新生大鼠脊髓星形胶质细胞体外培养方法

第10卷第2期2001年6月

中国组织化学与细胞化学杂志

CH I N ESE JOU RNAL O F H ISTOCH E M ISTR Y AND CYTOCH E M ISTR Y

V o l.10N o.2

Jun.2001

新生大鼠脊髓星形胶质细胞体外培养方法

杨 成 严振国

(上海中医药大学解剖学教研室神经研究室,上海 200032)

星形胶质细胞是中枢神经系统主要的胶质细胞,对神经元具有绝缘、营养、保护和支持作用。它们在中枢神经系统损伤和修复中也具有重要的作用,一方面星形胶质细胞可合成神经营养因子,促进神经再生[1~3],另一方面合成神经生长抑制因子,如硫酸软骨素蛋白多糖等[4],抑制神经再生,尤其是损伤恢复后期形成星胶瘢痕被认为是神经再生的机械性障碍。脊髓损伤后的修复一直是神经科学领域研究的一个重要课题,随着分子生物学和精密方法、仪器的发展,离体研究被越来越多地采用。星形胶质细胞是神经再生微环境中的主要成分,深入研究星形胶质细胞反应性增生的规律和调控机制,主动控制星形胶质细胞的反应性增生,既可使之合成适量的促进神经再生的因子,又能其避免形成胶质瘢痕,从而形成有利于神经再生的微环境。有关星形胶质细胞培养的文献很多,但多数是培养大脑皮质的星形胶质细胞,或应用细胞株培养[5,6],有关脊髓星形胶质细胞培养资料较少。我们实验室在脊髓损伤修复研究中摸索了一套成功的脊髓星形胶质细胞体外培养方法,介绍如下。

1.培养前的准备:

111 主要试剂和器材:

N aC I,KC l,N a2H P04?12H2O,KH2PO4,N aH2 CO3,酚红,DM E M(高糖),胎牛血清,青霉素,链霉素,胰蛋白酶,35mm培养皿,60mm培养皿,100 m l培养瓶,微孔滤膜滤器,CO2培养箱(5%CO2, 37℃),超净工作台,倒置显微镜,离心机。

1.2 主要液体:

D2H ank s液,714%N aHCO3溶液,0125%胰蛋白酶溶液,20%胎牛血清DM E M培养液,10%多聚赖氨酸。

2.培养操作:

211 原代培养 取新生2~3d内的W istar 大鼠2只,颈动脉放血处死。在75%酒精中浸泡消毒5m in,移到超净工作台上取出,俯卧于小手术台上,固定头尾。正中剪开背部皮肤,钝性分离项背部肌肉。在骶部用一把眼科镊子尖轻轻穿透椎板,向尾部划开椎管,然后两把眼科镊子交替向头端逐渐扯去椎板,暴露整段脊髓。由下向上游离脊髓,从上端切断取下,移入玻璃培养皿。滴几滴D2H ank s 液洗去血迹,于解剖显微镜下用显微镊子剥离干净脊髓被膜,将脊髓扯碎,移入10m1离心管,加3m l D2H ank s液,轻轻吹打悬浮,静置5m in。将上清液移入另一个离心管。原离心管加3m l D2H ank s液,滴加3~5滴0125%胰蛋白酶溶液,吹打,静置。将上清液移入第2个离心管,滴加数滴培养液终止消化。再重复消化组织一次,组织块基本散开。将上清液用200目滤网过滤,去除组织块。上清液离心, 1500rpm,5m in。弃上清,沉淀细胞用1m l20%胎牛血清DM E M培养液悬浮混匀,接种入35mm培养皿,放入CO2培养箱(5%CO2,37℃)。培养6h 再加培养液2m l,培养24h换液。换液时轻轻晃动培养皿,将细胞碎片和未贴壁细胞悬起,吸掉培养液,并用D2H ank s液冲洗两遍,加新培养液3m l。以后每3天换液1次,细胞长满后即可传代。

2.2 第一次传代 吸去培养液,用D2H ank s 液洗涤细胞二次。加1m l0125%胰蛋白酶,轻轻晃动培养皿,使胰蛋白酶覆盖整个皿底。室温(22℃以上)消化2~3m in。镜下见细胞皱缩,间距增大时,滴加几滴培养液终止消化。吸去液体,加3m l D2 H ank s液冲洗一次。加3m l D2H ank s液,吹打悬浮细胞。将细胞悬液移入10m1离心管。将培养皿再次加液、吹打,此时细胞基本悬起。将细胞悬液离心。1500rpm,5m in,弃上清,沉淀细胞加2m l20%胎牛血清DM E M培养液悬浮,接种入100m1培养瓶,放入培养箱。培养6h再加培养液3m l。24h换液,加6m l20%胎牛血清DM E M培养液。以后每3天换液1次。细胞长满后进行第二次传代。

213 第二次传代 消化步骤同第一次传代。加3m l20%胎牛血清DM E M培养液悬浮细胞,分别接种三个60mm培养皿,放入培养箱。6h分别添加培养液3m l,24h换液,加4m l20%胎牛血清DM E M培养液。以后每3天换液1次。至细胞长满皿底80%时,可进行药物、细胞因子、条件培养液或损伤增殖研究。

3.培养星形胶质细胞的观察

首次换液可见较多的细胞碎片,换液后视野变得较为清晰。初代培养细胞成分较多,主要有星形胶质细胞、成纤维细胞和神经元。成纤维细胞呈长梭形,胞质均匀,透明;神经元胞体较大,突起少而长,基部宽,常有一条明显的长轴突,核明显;星形胶质细胞胞体较神经元稍小,圆形或多角形,轮廓清楚,突起细而多。经过两次传代后星形胶质细胞比例可达90%以上。应用胶质纤维酸性蛋白(GFA P)免疫细胞化学染色可特异性显示星形胶质细胞,借此特性能够鉴定并计数细胞。(图1,2)。

4.培养中的几点体会

411 取材为新生鼠,生后3天以内,取材迅速,严格无菌操作,剥膜干净,以免混入较多的成纤维细胞。

412 细胞纯化,通过干净剥膜,可减少成纤维细胞。神经元一般在第一次传代后自然淘汰,其他细胞较少或因条件不够而淘汰。经两次传代后星形胶质细胞纯度可达90%以上,能基本满足实验需要。

413 DM E M培养液按说明书配制,加胎牛血清后pH值在714~716之间。培养液加抗生素(1L DM E M培养液加青霉素80万u,链霉素100万u)以防止污染。

414 培养瓶皿在接种前涂以10%的多聚赖氨酸作为粘附底质,以促进细胞贴壁,接种前用D2 H ank s液冲洗2遍。

415 脊髓组织量少,剥膜时尽量减少神经组织损失。组织块较大时,在第一次收集上清液后,可加入0125%胰蛋白酶溶液吹打消化5分钟,以尽快尽量分散细胞,然后滴加含血清的消化液终止消化。

416 原代培养第一次换液时,轻轻晃动培养皿,可将细胞碎片及粘附不牢的细胞悬起,镜下观察视野清晰,可见到大量胶质细胞贴壁。

收稿2001201 修回2001203

参 考 文 献

1 郭畹华.胶质细胞与神经再生.解剖学报,1993,24

(4):424~430

2 程欣欣,郭 静.肿瘤坏死因子影响星形胶质细胞分泌神经生长因子的实验研究.神经解剖学杂志,1999;15

(3):290~292

3 K renz N R,W ezver L C.N erve grow th facto r in glia and inflamm ato ry cells of the injured rat sp inal co rd.J N eurochem,2000;74(2):730~739

4 L emons M L,How land D R,A nderson D K.Chon2 dro itin sulfate p ro teoglycan i m m uno reactivity increases fo llow ing sp inal co rd injury and transp lantati on.Exper N euro l,1999;160:51~65

5 薛庆善,郭畹华.大鼠大脑皮质星形胶质细胞的体外培养及其促神经突起生长作用研究.神经解剖学杂志,1996, 12(2):151~155

6 徐俊卿,朱敏,陈良为.星形胶质细胞和神经生长因子对新生大鼠脑内P物质受体阳性神经元存活与突起生长的影响——体外培养研究.神经解剖学杂志,1998;14

(4):367~370

图 版 说 明

图1 新生大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养3天(H E染色) ×20

图2 新生大鼠脊髓星形胶质细胞原代培养3天(GFA P免疫组织化学染色) ×10

EXPLANAT I ON OF F IGURES

F ig.1 P rem ary astrocyte of new bo rn rat’s sp inal co rd cul2

tured fo r7days(H E staining).×20

F ig.2 P rem ary astrocyte of new bo rn rat’s sp inal co rd cul2

tured fo r3days(GFA P i m m unoh istochem isto rial

staining).×10

632 中国组织化学与细胞化学杂志 第10卷