多色流式细胞术分析--人造血系统
CHAPTER23
Multicolor Immunophenotyping:Human
Immune System Hematopoiesis
Brent Wood
Department of Laboratory Medicine
University of Washington
Seattle,Washington98195
I.Introduction
II.Methodology
III.Normal Immunophenotypic Patterns of Maturation
A.CD45and Side Scatter Gating
B.Stem Cells and Blasts
C.Neutrophilic Maturation
D.Monocytic Maturation
E.Erythroid Maturation
F.B-Cell Maturation
G.Miscellaneous
IV.Abnormal Immunophenotypic Patterns of Maturation
References
I.Introduction
Hematopoiesis begins with a quiescent stem cell that proliferates under envi-
ronmental in?uences giving rise to progeny capable of di V erentiation along multi-
ple lineages.In humans,this process occurs largely in the bone marrow,the one
exception being T-cell di V erentiation,which occurs principally in the thymus.
Di V erentiation along each lineage occurs in a relatively linear fashion through a
sequential series of stages,resulting in fully functional mature forms that may
undergo further activation and di V erentiation as a consequence of their interac-
tion with di V erent microenvironments and stimuli.For instance,a B cell di V er-
entiates from stem cells in the bone marrow of humans and matures through a
METHODS IN CELL BIOLOGY,VOL.75
Copyright2004,Elsevier Inc.All rights reserved.559 0091-679X/04$35.00
560Brent Wood series of stages producing the functional mature B cell(McKenna et al.,2001),
whereupon it exits the bone marrow and populates lymphoid tissue throughout
the body.Additional maturation and processing of these naive B cells occurs in
the germinal center of lymph nodes and other lymphoid tissue after antigen
exposure,resulting in subsequent maturation to plasma cells or memory B cells
(MacLennan,1994).
The maturation of hematopoietic cells is a result of the tightly regulated and
sequential expression of genes and gene products(Payne and Crooks,2002).As a
consequence,the derived protein products exhibit predictable and reproducible
patterns of expression with maturation that correlate with morphological or
functional stages.Cell-surface proteins represent a subset of these proteins with
functions as diverse as extracellular enzymes,growth factor receptors,signal
transduction molecules,and adhesion molecules.The functions for many of these
molecules are relatively poorly understood,many being identi?ed simply by the
presence of antigenic reactivity.Some cell-surface antigens exhibit expression
restricted to a particular cell lineage,and others are more widely expressed but
with di V ering levels depending on maturational stage or activation state.Many of
these antigens can be used to aid in the identi?cation of maturational stages and
lineage assignment once their patterns of expression are known.In addition to
de?ning normal maturational states,disease states often exhibit alterations in
antigenic expression re?ecting abnormalities in maturation or function,and these
alterations can be used in the diagnosis and monitoring of disease states.
Flow cytometry is an excellent technique for the examination of patterns of
protein expression,particularly on the cell https://www.wendangku.net/doc/d515970617.html,ing?uorescent-labeled
antibodies that bind with high avidity and speci?city to selected antigens,a wealth
of information regarding hematopoietic maturation has been generated over the
past2decades.This chapter describes the identi?cation of normal maturational
stages of hematopoietic cells in human bone marrow by multiparametric?ow
cytometry using seven,eight,and nine simultaneous antibodies directed against
antigens commonly evaluated in a clinical setting.
II.Methodology
Anticoagulated human bone marrow was obtained from the hematopathology
laboratory at the University of Washington Medical Center as residual material
sent for clinical evaluation.This material was used in accordance with a Human
Subjects Protocol approved by our Institutional Review Board.
First,100 l of normal bone marrow containing roughly106cells was incubated
at room temperature for30minutes,with100 l of a pretitered cocktail of
monoclonal antibodies appropriate for the cell lineage being evaluated.The
sample was then treated with1.5ml of bu V ered NH4Cl containing0.25%formal-
dehyde for10minutes at room temperature followed by a single wash in phos-
phate-bu V ered saline(PBS)using centrifugation at550g for5minutes.The
resulting pellet was resuspended in100 l of PBS and roughly1,000,000
events acquired on a modi?ed LSRII(Becton-Dickinson Immunocytometry Sys-
tems,San Jose,California)capable of up to10-color analysis.The instrument
contains four spatially separated lasers(22mW407nm diode,100mW variable
488nm diode,8mW594nm HeNe,and25mW638nm diode)with independent
?beroptic-coupled detector arrays for each laser.The data were compensated and
analyzed after acquisition using software developed in our laboratory.For dem-
onstration of B-cell maturation,serum light chain was removed by prelysing100 l
of bone marrow with1.5ml of bu V ered NH4Cl for10minutes at room tempera-
ture followed by a single wash with PBS;the sample was then prepared as
described earlier,with the lyse step omitted.To demonstrate erythroid matura-
tion,1ml of bone marrow was subjected to density-gradient centrifugation
(Ficoll)and the resulting mononuclear layer was washed twice with PBS before
being used in the assay;the subsequent lysis step was omitted.
Fluorochromes used for these experiments included Paci?c blue,?uorescein
isothiocyanate(FITC),phycoerythrin(PE),PE–Cy5.5,PerCp–Cy5.5,PE–Cy7,
Alexa594,allophycocyanin(APC),Alexa700,and APC–Cy7.Zenon reagents
(Molecular Probes,Eugene,Oregon)were used for CD11b–Alexa594,and
all other antibodies were directly conjugated and obtained from either Beckman-
Coulter or Becton-Dickenson.
III.Normal Immunophenotypic Patterns of Maturation
A.CD45and Side Scatter Gating
CD45is a transmembrane tyrosine phosphatase ubiquitously expressed by
white blood cells(WBCs)and is important in modulating signals derived from
integrin and cytokine receptors(Hermiston et al.,2003).On WBCs,the level of
CD45is di V erentially expressed throughout maturation,being lower on blasts and
immature forms and highest on mature myelomonocytic and lymphoid cells.In
contrast,with erythroid di V erentiation,the low level of CD45seen on blasts
rapidly decreases and mature erythrocytes consistently show a lack of CD45
expression.
Orthogonal light scatter in large part re?ects the presence of subcellular com-
ponents capable of scattering light,in particular the presence of granules or
vacuoles.It also is correlated with overall cell size or volume and thus shows a
mild increase as cells enlarge with maturation.Consequently,the early acquisition
of large cytoplasmic primary granules in neutrophilic lineage cells is accompanied
by a marked increase in side scatter that allows their ready separation from
progenitor cells.Further maturation along the neutrophilic lineage is marked
by acquisition of smaller secondary granules and loss of primary granules with a
concomitant decrease in side scatter.Monocytic di V erentiation is marked by
a moderate increase in cell size,including increased amounts of cytoplasm con-
taining few vacuoles,resulting in a mild increase in side scatter from that seen
in
23.Human Hematopoiesis561
blasts,though not to the degree seen in neutrophilic di V erentiation.In contrast,lymphoid di V erentiation is accompanied by a mild decrease in cell size with the small amount of associated cytoplasm containing essentially no granules or vacuoles.Consequently,lymphoid cells show a moderate decrease in side scatter from that seen in blasts.Erythroid di V erentiation is accompanied by a marked increase in cell size in early forms with a gradual decrease in size to the erythro-cyte stage,with all stages having only modest amounts of cytoplasm without signi?cant cytoplasmic structures.This results in an early increase in side scatter with a gradual decline to a ?nal level similar to that seen in lymphocytes.
When combined,CD45expression and orthogonal light scatter provide a powerful,simple,and reproducible method for distinguishing major cell lineages in bone marrow (Borowitz et al .,1993).As a result,CD45–side scatter gating has become one of the most common techniques used for immunophenotyping in the clinical laboratory.The characteristic patterns seen using this method are illustrated in Fig.
1.
Fig.1
CD45versus side scatter representation of normal human bone marrow.Each of the major cell lineages di V erentiates from the early blast/stem cell population (yellow)(asterisk ).The major more mature blast population (red)is easily identi?ed by this display.Subsequent maturation toward the neutrophil (green),monocyte (purple),B lymphocyte (blue),and erythrocyte (gray)populations are indicated by the appropriate black line.(See Color Insert.)562Brent Wood
23.Human Hematopoiesis563
B.Stem Cells and Blasts
The earliest easily identi?able hematopoietic cell in the marrow is a quiescent
cell having the ability to di V erentiate along multiple lineages depending on the
environmental in?uences to which it is exposed(i.e.,a hematopoietic stem cell).
The frequency of this population in normal bone marrow is low but can
be routinely identi?ed if a su Y ciently large number of cells are evaluated(Bender
et al.,1991;D’Arena et al.,1998;Gaipa et al.,2002;Macedo et al.,1995;
McGuckin,2003;Terstappen et al.,1992;Tjonnfjord et al.,1996).This population
shows the expression of low forward and side scatter,intermediate CD45,inter-
mediate human leukocyte antigen-DR(HLA-DR),bright CD34,low to absent
CD38,intermediate CD133,low to intermediate CD13,low CD117,variable
CD90,low CD123and CD135,and very low CD33without the expression of
antigens characteristic of a particular lineage or later stages of di V erentiation
(Fig.2).As the cells mature,they begin to proliferate with a gain in the expression
of CD38and CD117,mildly decreased expression of CD34and CD133,and
decreased CD90.Further maturation results in each cell demonstrating a commit-
ment to di V erentiation along a single lineage with resulting fragmentation of this
relatively uniform-appearing population into di V erent components,such as mye-
lomonocytic,erythroid,lymphoid,and others.This is accompanied by the acqui-
sition of lineage-associated antigens and patterns of antigen expression
characteristic of that lineage,with all lineages ultimately showing a loss of
CD34,CD133,CD117,and CD38.The earliest and most lineage-speci?c antigen
expressed during myelomonocytic di V erentiation is CD64,with an associated mild
increase in CD13,increased CD33,HLA-DR,and CD15,and increased side
scatter.Early B cells show a loss of CD33and CD13,a decrease in CD45and
side scatter,and the acquisition of CD10and CD19with retention of HLA-DR.
Di V erentiation along the erythroid lineage is characterized by the acquisition of
bright CD71intermediate CD36and a decrease in CD45,HLA-DR,CD13,and
CD33while showing a mild initial increase in side scatter.
C.Neutrophilic Maturation
Neutrophils mature from blasts through a linear process,historically divided
into morphological stages termed promyelocytes,myelocytes,metamyelocytes,
bands,and neutrophils.It is not until the band/neutrophilic stage that the cells
are fully functional and capable of bactericidal action.Although these stages have
associated antigenic changes,from an immunophenotypic perspective they are not
so clearly de?ned and largely appear as a single continuum(Elghetany,2002;
Terstappen and Loken,1990;Terstappen et al.,1990,1992).A selection of
informative and useful antigens and their expression patterns with maturation
are presented in Table I.Of particular interest are antigens that exhibit dramatic
increases in expression at de?ned stages of maturation,such as acquisition of
CD15and CD66b by promyelocytes,acquisition of CD11b,CD11c,CD24,and
CD66a by myelocytes,gain of CD55by metamyelocytes,gain of CD35and CD87
564Brent Wood
Fig.2Maturation and lineage commitment of blasts in human bone marrow.Normal human bone
marrow was evaluated with two combinations of antibodies,one containing nine simultaneous
?uorochromes(top three rows)and one containing eight simultaneous?uorochromes(bottom row)as
labeled.The blast population is displayed following CD45/side scatter gating with stem cell(yellow),
blast(red),neutrophil(green),monocyte(lavender),B cell(light blue),and erythroid(blue)
populations colored.Note the complex patterns of maturation present in this subset of views that allow
the unique identi?cation of each of the major cell lineages.These views represent less than20%of the
total information contained in these antibody combinations.(See Color Insert.)
23.Human Hematopoiesis565
Table I
Surface Antigen Expression During Neutrophil Maturation
Blast Promyelocyte Myelocyte Metamyelocyte Band Neutrophil CD10àààààtt
CD11bààtttttttt
CD11cààtttttttt
CD13tt/tttttt/tttt/ttttttt
CD14àààààt
CD15àtttttttttttttt
CD16àààtttttt
CD18tttttttttttt
CD24ààttttttt
CD33tttttttttt
CD35ààààtttt
CD44tttttttttttt
CD45ttttttttt
CD55tttttttttttttt
CD64àtttttàà
CD65àtttttttttttt
CD66aààtttttttt
CD66bàtttttttttttt
CD87ààààtttt
CD117tttàààà
by bands,and gain of CD10by granulocytes.Another useful group of antigens
including CD13,CD44,and CD55is expressed early in maturation and exhibits a
decrease at an intermediate stage of maturation only to increase with terminal
di V erentiation.A less common pattern of antigen expression,exempli?ed by
CD64,is characterized by an absence of expression on blasts,an increase at
intermediate stages of maturation,and a loss with terminal di V erentiation.
A?nal group of antigens(e.g.,CD33)is expressed at relatively high levels on
early myeloid forms and declines with maturation.The combined use of antigens
from each of these groups in multiparametric combinations serves a particularly
useful function in more precisely de?ning maturational stages and makes
the appreciation of maturational abnormalities in disease states more readily
apparent.Examples of these expression patterns are displayed in Fig.3.
D.Monocytic Maturation
Monocytes mature from blasts as a continuum through one intermediate stage
termed the promonocyte(Terstappen and Loken,1990;Terstappen et al.,1992).
The expression levels of individual antigens are listed in Table II and illustrated in
Fig.4.With maturation toward promonocytes,blasts gain the expression of
CD64,CD33,HLA-DR,CD36,and CD15,with an initial mild decrease in
CD13and an increase in CD45.Further maturation toward mature monocytes
566Brent Wood
Fig.3Maturation of cells during neutrophilic di V erentiation.Normal human bone marrow was
evaluated with a single combination of nine simultaneous antibodies.Maturation from early(yellow)
and late(green)blasts proceeds through promyelocyte(light blue),myelocyte(blue),metamyelocyte/
band(lavender)and neutrophil(pink)stages.Eosinophils can also be noted by their increased
auto?uorescence(orange).Though recognizable,these stages are not discretely de?ned and the
subdivisions are somewhat arbitrary.The blasts have been emphasized and other populations largely
excluded to improve visibility of the maturational relationships.These views represent less than20%of
the total information contained in these antibody combinations.(See Color Insert.)
23.Human Hematopoiesis567
Table II
Surface Antigen Expression During Monocyte Maturation
Blast Promonocyte Monocyte CD4à/ttt
CD11bàttttt
CD13ttt/tttt/ttt
CD14àt/ttttt
CD15àttt
CD16ààà/t
CD33ttttttttt
CD36àttttt
CD45tttttt
CD64àttttt
HLA-DRttttttt/ttt
shows a progressive increase in CD14,CD11b,CD13,CD36,and CD45,with a
mild decrease in HLA-DR and CD15.Unlike with maturing myeloid forms,the
expression of CD64,HLA-DR,and CD33are retained on maturing monocytes at
relatively high levels and serve as useful monocytic markers.Mature monocytes
show expression of bright CD14,relatively bright CD33,variably bright CD13,
bright CD36and CD64,and low CD15.
E.Erythroid Maturation
Examination of erythroid maturation requires a di V erent method of specimen
preparation than the red blood cell lysis methods commonly used to process bone
https://www.wendangku.net/doc/d515970617.html,monly used lysing reagents such as NH4Cl with subsequent washing
steps generally leave only very early erythroid precursors(proerythroblasts)to
evaluate or at a minimum noticeably compromise more mature erythroid forms as
detected by a prominent loss in forward scatter.Additionally,mature red blood
cells must also be signi?cantly reduced in number without undue loss of immature
forms if one wants to examine antigens highly expressed on mature red blood cells
(e.g.,CD235a).Density-gradient centrifugation with either Percoll or Ficoll is an
acceptable alternative for this purpose.
Erythroid forms have historically been divided into maturational stages based
on their morphological appearance with the nucleated forms termed proerythro-
blasts,basophilic erythroblasts,polychromatophilic erythroblasts,and orthochroma-
tophilic erythroblasts,and the anucleate forms termed polychromatophilic
erythrocytes and erythrocytes.These morphological stages correlate reasonably
well with observed immunophenotypic changes(De Jong et al.,1995;Loken et al.,
1987;Rogers et al.,1996;Scicchitano et al.,2003),although the di V erences
between polychromatophilic and orthochromatophilic stages are ill-de?ned.The
earliest erythroid forms to arise from blasts are identi?ed by their acquisition of
568Brent Wood
evaluated with a single combination of nine simultaneous antibodies.Maturation from early(yellow)
and late(green)blasts proceeds through promonocyte(light blue)and monocyte(lavender)stages.
Though recognizable,these stages are not discretely de?ned and the subdivisions are somewhat
arbitrary.The blasts have been emphasized and other populations largely excluded to improve
visibility of the maturational relationships.These views represent less than20%of the total
information contained in these antibody combinations.(See Color Insert.)
23.Human Hematopoiesis569
Table III
Surface Antigen Expression during Erythrocyte Maturation
Blast Proerythroblast Basophilic Poly/Ortho Retic Mature CD34ttà/tàààà
CD36àtttttttà/tà
CD38tttà/tààà
CD45tttà/tààà
CD71àtttttttttt/ttà
CD117ttttàààà
CD235aàt/tttttttttttttt
HLA-DRtttttààà
bright CD71,intermediate CD36and expression of CD117with intermediate
CD45,and slightly higher forward and side scatter.Glycophorin A(CD235a)is
expressed at a low level at this stage.Maturation to the basophilic erythroblast is
accompanied by a decrease in CD45and acquisition of bright CD235a expression
to the level seen throughout the remainder of erythroid maturation,including
mature erythrocytes.Transition to polychromatophilic/orthochromatophilic ery-
throblasts shows a further loss of CD45and HLA-DR and a mild decrease in
CD36.After these stages,the cells rapidly lose CD71and CD36after becoming
anucleate.These changes are described in Table III and illustrated in Fig.5.
F.B-Cell Maturation
In humans,B-cell maturation occurs from the hematopoietic stem cell in the
bone marrow and proceeds through relatively discrete well-de?ned stages unlike
the continuum seen in myelomonocytic and erythroid maturation(Davis et al.,
1994;Dworzak et al.,1997,1998;Loken et al.,1987;Longacre et al.,1989;Lucio
et al.,1999;McKenna et al.,2001).Upon reaching a functional stage character-
ized by expression of immunoglobulin on the cell surface,B cells exit the bone
marrow and undergo further maturation in the presence of antigen in peripheral
tissues such as lymph node.A subset of these B cells will undergo terminal
di V erentiation to plasma cells and few will return to the bone marrow.Conse-
quently,bone marrow B cells typically consist of a mixture of maturing B cells,a
few mature but naive B cells,and a small number of plasma cells.
The immunophenotypic stages of B-cell maturation present in normal bone
marrow are detailed in Table IV and examples of the observed patterns of antigen
expression are shown in Fig.6.The antigens expressed by the earliest identi?able
B cells include TdT,CD79a,and low CD10without CD19,but the size of this
population is very small and is generally not observed.The next stage(early)is the
?rst that can be readily identi?ed and shows the acquisition of CD19,an antigen
that serves as a useful marker of B cells through terminal plasma cell di V erentia-
tion.At this stage,the B cells express the immature antigens CD34and nuclear
570Brent Wood
evaluated with a single combination of seven simultaneous antibodies.Maturation from early(yellow)
and late(red)blasts proceeds through proerythroblast(green),basophilic erythroblast(yellow),
polychromatophilic and orthochromatophilic(light blue and blue),and erythrocyte(lavender)stages.
Though recognizable,these stages are not discretely de?ned and the subdivisions are somewhat
arbitrary.The blasts have been emphasized and other populations largely excluded to improve
visibility of the maturational relationships.These views represent less than20%of the total
information contained in these antibody combinations.(See Color Insert.)
23.Human Hematopoiesis571
Table IV
Surface Antigen Expression during B-Cell Maturation
Early Intermediate Late Mature Plasma cell CD10ttttttàà
CD19ttttttttttt
CD20àt/tttttttà
CD21àààttt
CD22ttttttà
CD24tttttttttttà
CD34ttàààà
CD38tttttttt/tttttt
CD45ttttttttttt
HLA-DRtttttttttt/à
cIgMàttttttà
Kappaààtttt
Lambdaààtttt
TdTtttàààà
TdT with bright CD10and low CD45without CD20or surface immunoglobulin.
Transition to the intermediate stage of maturation results in an abrupt decrease in
CD10,a gain in CD45,gradual acquisition of CD20,and a loss of CD34and
nuclear TdT.The last immature stage(late)is generally small in number but is
characterized by the brightest level of CD20,a further decrease in CD10,increased
CD45,and acquisition of surface immunoglobulin.Mature B cells show a loss of
CD10,bright CD20,and the brightest CD45with expression of surface immuno-
globulin.Plasma cells are readily identi?ed by their extremely bright expression of
CD38or CD138without CD20.The relative proportions of each of these matu-
rational stages are dependent on the overall regenerative state of the bone marrow
and the presence of ongoing in?ammatory reactions.
G.Miscellaneous
A number of other cell populations mature or are present in normal bone
marrow and include eosinophils,basophils,dendritic cells,natural killer cells,
and megakaryocytes.For most of these populations,the patterns of maturation
are either not well de?ned or di Y cult to visualize using routine methods of
analysis.
Of these populations,eosinophil maturation is the easiest to demonstrate and is
characterized by one immature stage(eosinophilic myelocyte),showing expression
of high side scatter,intermediate CD45at a level slightly higher than neutrophilic
myelocytes,low to intermediate CD11b,intermediate CD13,and low CD33with
bright CD66b without CD16.Maturation to the mature eosinophil is accompa-
nied by an increased level of CD45,a mild decrease in side scatter,and an increase
in CD11b with a decrease in CD33.Eosinophilic maturation is illustrated in Fig.7.
572Brent Wood
with a single combination of eight simultaneous antibodies.Maturation from early(yellow)B cells
proceeds through an intermediate stage(light blue)before acquiring surface light-chain expression
(blue and red:kappa and lambda,respectively)as late immature B cells(bright CD20)before reaching
maturity(bright CD45without CD10).Rare plasma cells are also present(green).Note the relatively
discrete nature of the maturational stages.These views represent less than20%of the total information
contained in these antibody combinations.(See Color Insert.)
IV .Abnormal Immunophenotypic Patterns of Maturation
The normal patterns of antigenic expression detailed earlier re?ect the well-orchestrated expression of genes characteristic of normal di V erentiation.In he-matopoietic neoplasms,an increasing variety of speci?c genetic abnormalities have been described that are either directly or indirectly capable of perturbing these normal patterns of protein expression.Stem cell disorders such as myelo-dysplastic syndromes serve as an informative model of maturational dysregulation and illustrate the association between genetic and immunophenotypic abnormal-ities (Kussick and Wood,2003a;Wells et al .,2003).Figure 8shows an example of the type of abnormalities seen in myelodysplasia.Immunophenotypic abnormal-ities can be identi?ed in most hematopoietic neoplasms including acute myeloid and lymphoid leukemia (Weir and Borowitz,2001),myeloproliferative disorders (Kussick and Wood,2003b),and B-and T-cell lymphoma (Stetler-Stevenson and Braylan,2001).These abnormalities can be used to diagnose,classify,and monitor disease following therapy and techniques capable of detecting these abnormalities,such as ?ow cytometry,play an increasingly important role in clinical
medicine.
Fig.7Maturation of cells during eosinophilic di V erentiation.Normal human bone marrow was evaluated with a single combination of nine simultaneous antibodies.Maturation from blasts proceeds through the eosinophilic myelocyte stage (yellow)to the mature eosinophil (red).Note the high side scatter present throughout maturation,as well as the increased CD45and lower CD11b relative to neutrophilic precursors.These views represent less than 20%of the total information contained in these antibody combinations.(See Color Insert.)
23.Human Hematopoiesis 573
574Brent Wood
Fig.8Myelodysplasia.Human bone marrow was evaluated with a single combination of nine
simultaneous antibodies.Blasts are increased in number(red)and show abnormal expression of
CD117,CD34,CD13,and CD45.In addition,the neutrophilic lineage shows hypogranularity
(decreased side scatter)with abnormal maturational expression of CD13,CD11b,and CD16with a
dyssynchronous pattern of CD13and CD16expression.Monocytes also show a relative increase in
immature forms with abnormal CD45and CD14expression.These?ndings are characteristic of
myelodysplasia.(See Color Insert.)
23.Human Hematopoiesis575 References
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2020年细胞和基因治疗CDMO行业调查报告
2020年细胞和基因治疗CDMO行业调查报告 1 细胞和基因治疗：创新疗法的新方向 （一）细胞治疗：CAR-T 是目前商业化的主流方向 细胞疗法的原理是通过向患者移植正常或生物工程改造过的人体细胞以替代失去正常功能的细胞。人体中包含200多种不同的特殊细胞类型，例如肌肉，骨骼或脑细胞。这些细胞在体内执行特定功能，疾病或衰老可能导致人体细胞失去这些分化细胞。在许多情况下，这种缺失是不可逆的，也就意味着患病或丢失的细胞不再能被健康的细胞所补充。细胞疗法旨在将新的健康细胞人为地引入患者体内，以替代患病或缺失的细胞。 细胞治疗最早可以追溯到上个世纪30年代，而近代细胞治疗的快速兴起则是在2011年之后。2011年10月，法国科学家拉尔夫·斯坦曼因“发现树突状细胞和其在后天免疫中的作用”获得诺贝尔医学奖，标志着生物免疫治疗成为癌症治疗的新型疗法。此后，细胞治疗迅速兴起，在一些复杂的肿瘤疾病治疗中率先进行临床试验，被Science杂志评为2013年10大科技突破之首。 细胞疗法按照引入的细胞种类可以分为干细胞治疗和免疫细胞治疗。 干细胞治疗是利用人体干细胞的分化和修复原理，把健康的干细胞移植到病人体内，以达到修复病变细胞或重建功能正常的细胞和组织的目的。干细胞是一类具有无限的或者永生的自我更新能力的细胞、能够产生至少一种类型的、高度分化的子代细胞，具有多能性和全能性、自我更新能力和高度增殖能力等优点。患者自体干细胞较易获得，致癌风险也很低，同时也没有免疫排斥及伦理争议等问题，被更多地应用于临床。用于临床治疗的干细胞种类主要有骨髓干细胞、造血干细胞、神经干细胞等。干细胞治疗被广泛应用于临床各类疾病的治疗，主要包括血液类疾病、器官移植、心血管系统疾病、肝脏疾病、神经系统疾病、组织创伤等方面。 干细胞的全能型可以被用于细胞治疗 免疫细胞治疗的原理是采集人体自身的免疫细胞并进行体外培养扩增，同时加强其靶向性和杀伤力，最后再输入到病人体内以消灭病原体、癌细胞。免疫细胞是指参与免疫应答或与免疫应答有关的细胞，包括NK细胞、T细胞、B 细胞、巨噬细胞等。目前免疫细胞疗法主要被运用于癌症的治疗，根据所使用的的免疫细胞不同，分为细胞因子诱导的杀伤细胞（CIK）疗法、API生物免疫治疗、DC+CIK细胞疗法、自然杀伤细胞（NK）疗法、DC-T细胞疗法等。 免疫细胞疗法在癌症治疗上的应用主要是通过过继性免疫治疗实现的。过继性免疫治疗是指从肿瘤患者体内分离免疫活性细胞，在体外进行扩增和功能鉴定，然后向患者回输，从而达到直接杀伤肿瘤或激发机体的免疫应答杀伤肿瘤细胞的目的。过继性免疫治疗主要分为三大类：一种方法是利用从患者的肿瘤中分离出的肿瘤浸润淋巴细胞（TIL），在实验室中扩大其数目，然后再注入患者体内；第二种方法是改造从患者身上收获的T细胞，使其表达肿瘤抗原特异性T细胞受体（TCR），以便T细胞可以识别和攻击表达这种抗原的肿瘤细胞；第三种方法与TCR类似，区别在于其在T 细胞上构建的是一个嵌合型抗体受体（CAR），从而让免疫T细胞不仅能够特异性地识别癌症细胞，同时可以激活T细胞杀死癌症细胞。 目前CAR-T是唯一被FDA批准的过继性免疫疗法。TIL和TCR治疗只能靶向和消除在特定情况下（当抗原与主要组织相容性复合物或MHC结合时）呈递其抗原的癌细胞。而CAR的主要优势在于，即使不通过MHC将抗原呈递到表面，
干细胞行业分析
干细胞行业分析报告 贵州省科技风险投资管理中心 贵州省科技风险投资有限公司 贵州鼎信博成投资管理有限公司
目录 一、干细胞概述 (3) （一）产品定义 (3) （二）干细胞产品分类 (3) 二、干细胞行业及发展概况 (5) （一）国际行业发展概况 (5) （二）国内行业发展概况 (6) （三）干细胞行业特点 (8) 三、国内外干细胞临床研究的概况 (10) （一）国外干细胞临床研究现状 (10) （二）国内干细胞临床研究现状 (10) 四、干细胞市场现状分析 (11) 五、干细胞市场供需分析 (16) 六、涉及干细胞技术研究与应用的上市公司基介绍 (21) 七、干细胞行业产业链及投资价值分析 (22) 附件一：2011年最新国外干细胞研发企业及其相关产品 (25) 附件二：干细胞产业政策研究 (33) 附件三：人类干细胞之伦理原则与监管政策 (35)
一、干细胞概述 （一）产品定义 干细胞(stem cells，SC)是一类具有自我复制能力(self-renewing)的多潜能细胞，在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。干细胞(Stem Cell)是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，改变了人类疾病的应对方法，医学界称为“万用细胞”。 （二）干细胞产品分类 1、干细胞具有自我更新能力（Self-renewing），能够产生高度分化的功能细胞。干细胞按照生存阶段分为以下五类： （1）胚胎干细胞 胚胎干细胞当受精卵分裂发育成囊胚时，内层细胞团（Inner Cell Mass）的细胞即为胚胎干细胞。胚胎干细胞具有全能性，可以自我更新并具有分化为体内所有组织的能力。 （2）成体干细胞 成年动物的许多组织和器官，比如表皮和造血系统，具有修复和再生的能力。成体干细胞在其中起着关键的作用。在特定条件下，成体干细胞或者产生新的干细胞，或者按一定的程序分化，形成新的功能细胞，从而使组织和器官保持生长和衰退的动态平衡。
流式细胞术 FCM 介绍及简易操作步骤
流式细胞术 FCM 介绍及简易操作步骤 分享 首次分享者：☆秋秋☆已被分享29次评论(0)复制链接分享转载举报一. 流式细胞术概述 流式细胞术(Flow Cytometry， FCM)是七十年代发展起来的高科学技术，?它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体，同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状，还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等，可对群体细胞在单细胞水平上进行分析，在短时间内检测分析大量细胞，并收集、储存和处理数据，进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞，分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产: Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)和BECKMAN- COULTER公司。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。B-D?公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA 和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外，还具有细胞分选功能，?多用于科学研究。 二.流式细胞仪主要技术指标 1．流式细胞仪的分析速度： 一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞，大型机可达每秒上万个细胞。2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子，两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。 3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小，一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。 4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，，一般流式细胞仪能够达到<2.0%，这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。 5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。 三.流式细胞仪主要构造和工作原理流动室及液流驱动系统 流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。 流动室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔，检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力，鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息
流式细胞术原理及功能介绍
流式细胞术详解 一. 流式细胞术概述 流式细胞术(Flow Cytometry, FCM)是七十年代发展起来的高科学技术 ,它集计算机技术、激光技术、流体力学、细胞化学、细胞免疫学于一体, 同时具有分析和分选细胞功能。它不仅可测量细胞大小、内部颗粒的性状,还可检测细胞表面和细胞浆抗原、细胞内DNA、RNA含量等,可对群体细胞在单细胞水平上进行分析, 在短时间内检测分析大量细胞,并收集、储存和处理数据,进行多参数定量分析; 能够分类收集(分选)某一亚群细胞,分选纯度＞95%。在血液学、免疫学、肿瘤学、药物学、分子生物学等学科广泛应用。 国内使用的流式细胞仪主要由美国的两个厂家生产:BECKMAN- COULTER公司和Becton-Dickinson公司(简称B-D公司)。流式细胞仪主要有两型:临床型（又称小型机、台式机）和综合型（又称大型机、分析型）。BECKMAN-COULTER公司最新产品为EPICS ALTRA和EPICS XL/XL-MCL, B- D公司最新产品为FACS Vantage和FACS Calibur。EPICS XL/XL-MCL和FACS Calibur是临床型;EPICS ALTRA和 FACS Vantage是综合型，除具备检测分析功能外,还具有细胞分选功能 ,多用于科学研究。 二.流式细胞仪主要技术指标 1．流式细胞仪的分析速度： 一般流式细胞仪每秒检测1000～ 5000个细胞,大型机可达每秒上万个细胞。 2．流式细胞仪的荧光检测灵敏度：一般能测出单个细胞上<600个荧光分子,两个细胞间的荧光差＞5%即可区分。 3．前向角散射（FSC）光检测灵敏度：前向角散射（FSC）反映被测细胞的大小,一般流式细胞仪能够测量到0.2μm～０.5μm。 4．流式细胞仪的分辨率：通常用变异系数CV值来表示，,一般流式细胞仪能够达到<2.0%,这也是测量标本前用荧光微球调整仪器时要求必须达到的。 5．流式细胞仪的分选速度：一般流式细胞仪分选速度＞1000个/秒，分选细胞纯度可达99%以上。 三.流式细胞仪主要构造和工作原理 流动室及液流驱动系统 流式细胞仪主要由以下五部分构成:①流动室及液流驱动系统②激光光源及光束形成系统③光学系统④信 号检测与存储、显示、分析系统⑤细胞分选系统。 流动室（Flow Cell或Flow Chamber）是流式细胞仪的核心部件，流动室由石英玻璃制成，单细胞悬液在细胞流动室里被鞘流液包绕通过流动室内的一定孔径的孔,检测区在该孔的中心，细胞在此与激光垂直相交，在鞘流液约束下细胞成单行排列依次通过激光检测区。流动室里的鞘液流是一种稳定流动，控制鞘液流的装置是在流体力学理论的指导下由一系列压力系统、压力感受器组成，只要调整好鞘液压力和标本管压力, 鞘液流包绕样品流并使样品流保持在液流的轴线方向，能够保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而使激光激发的荧光信息准确无误。见图12.1流动室示意图。流动室孔径有60μm、100μm、150μm 、250μm等多种，供研究者选择。小型仪器一般固定装置了一定孔径的流动室。 图12.1流动室示意图(采自Coulter Training Guide) 四. 流式细胞仪主要构造和工作原理 激光光源及光束形成系统
流式细胞术
流式细胞术检测淋巴细胞表面标记 一、实验目的 1.了解流式细胞仪的组成、原理及应用：初步了解流式细胞仪的工作元件及基本应用原理；能够认识流式细胞术的应用，特别是常用的一些功能。 2. 熟悉用流式细胞术检测小鼠脾脏T细胞表面标志的基本流程 3. 学习并掌握流式细胞术结果的分析：能够基本看懂结果图，重点掌握“门”和“补偿”两个概念。 二、实验原理 1.流式细胞术（Flow Cytometry, 简称FCM）是一种可以快速、准确、客观，并且同时检测单个微粒（通常是细胞）的多项特性（多参数）的技术，同时可以对特定群体加以分选。 特点：可检测的样本种类多样，大小范围较广（0.2~50μm）；检测速度快，分析样本量大（快速、大量）；细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏；采用激光作为激发光源，保证其具有更好的单色性与激发效率；利用荧光染料与单克隆抗体技术结合的标记技术，保证检测的灵敏度和特异性；用计算机系统对流动的单细胞悬液中单个细胞的多个参数信号进行数据处理分析，保证了检测速度10000个细胞(微粒)/秒与统计分析精确性。 2. 流式细胞仪组成及原理 Fluidics (液流系统)——流体动力学聚焦样本形成单细胞流。 鞘液是辅助样本流被正常检测的基质液。主要作用是包裹样本流的周围，保持样本流中细胞处于喷嘴中心位置，防止其靠近孔壁而阻塞喷孔。匀速流动，保证每个细胞通过激光照射区的时间相等，从而得到准确的细胞荧光信息。 Optics (光学系统)——激发和收集光信号。 激发系统包括：激光器、透镜和反射镜，将激光聚焦到检测区 收集系统包括：光学镜片和滤光片、光信号检测器 流式细胞仪收集的信号：（1）散射光信号：细胞在液柱中与激光束相交时向周围360°立体角方向散射的光线信号，它的强弱与细胞的大小、形状、胞内颗粒折射等有关，主要分为前向散射光(信号强弱与细胞体积大小成正比)和侧向散射光(检测细胞粒度和细胞内相对复杂性)。FS-SS图可对未染色的活细胞进行分析或分选，但不能分析表面分子（2）荧光信号：荧光信号由被检细胞上标记的特异性荧光染料受激发后产生，发射的荧光波长与激发光波长不同；每种荧光染料会产生特定波长的荧光和颜色，通过波长选择通透性滤片，可将不同波长的散射光和荧光信号区分开，送入不同的光电倍增管；选择不同的单抗及染料就可同时测定一个细胞上的多个不同特征。 Electronics (电子系统)——数据处理系统，扩大信号，将光信号转化为电信号，处理信号并存储于电脑。 3.流式步骤 第一步：用带有不同荧光基团的抗体分别识别并结合细胞上不同抗原（染色）；第二步：带有荧光的细胞一个接一个通过激光；第三步：不同荧光基团有不同发射光谱，荧光染料选择原则：必须能够被流式细胞仪上所配备的激光器所激发、激发光谱必须在仪器上滤光片能够接受的合适范围内、荧光素光谱的重叠应当尽量减少；第四步：复杂的荧光信号被不同分色镜和滤光片分解；第五步：光电倍增管（PMT）将光信号变成电信号；第六步：模数变换器（ADC）进一步将模拟信号变成计算机能处理的数字信号 4.分选基本原理
干细胞抗衰老行业现状分析报告
目录 一、干细胞行业的“万用功能“及发展前景 (2) 二、干细胞行业相关政策分析 (4) 三、干细胞抗衰老作用机理 (4) 1.骨髓间充质干细胞 (5) 2.脐带血干细胞 (6) 3.脂肪干细胞 (7) 4.胚胎干细胞 (7) 四、干细胞产业链分析 (8) 五、干细胞国内相关企业分析 (9) 1.中源协和：中国干细胞产业链的整合者，全面布局上下游 (9) 2.北科生物：干细胞技术全球领先，有望成为中国的“苹果” (10) 3.金卫医疗：通过CCBC股权间接经营干细胞存储业务 (11) 4.冠昊生物：依托技术优势进军干细胞治疗领域 (12)
图表目录 图表1：干细胞治疗应用方向 (3) 图表2：干细胞抗衰老行业相关政策 (4) 图表3：随着年龄的增长，骨髓中干细胞数目急剧下降 (5) 图表4：小鼠骨髓间充质干细胞具有抗衰老作用 (6) 图表5：脐带血干细胞可以促进细胞增殖，修复受伤组织 (6) 图表6：肌肉注射胚胎干细胞后各系统疗效（临床改善指数） (7) 图表7：干细胞产业链 (8) 图表8：北科生物发展历程 (11) 图表9：金卫医疗发展历程 (12)
一、干细胞行业的“万用功能“及发展前景 干细胞是具有自我复制和多向分化潜能的原始细胞，是机体的起源细胞，是形成人体各种组织器官的原始细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞或组织器官，医学界称其为“万用细胞”，对应干细胞治疗具有极大的潜力。干细胞按发育状态分为胚胎干细胞、成体干细胞。按分化潜能分为全能干细胞、多能干细胞、单能干细胞。 干细胞治疗则是把健康的干细胞移植到病人或自己体内，以达到修复病变细胞或重建功能正常的细胞和组织的目的。即干细胞治疗从细胞层上治疗疾病，相较很多传统治疗方法具有无可比拟的优点： （1）安全：低毒性（或无毒性）； （2）在尚未完全了解疾病发病的确切机理前也可以应用； （3）治疗材料来源充足； （4）治疗范围广阔； （5）是最好的免疫治疗和基因治疗载体； （6）传统疗法认为是“不治之症”的疾病，又有了新的疗法和新的希望。 因此干细胞治疗作为一种比较优势突出的新型治疗，临床上应用的领域包括治疗心血管疾病、神经系统疾病、血液病、肝病、肾病、糖尿病、骨关节疾病等，现在比较成熟的如应用骨髓移植治疗白血病等恶性血液病，随着未来越来越多临床试验的成功，产业发展前景将十分广阔。 图表1：干细胞治疗应用方向 资料来源：银联信
流式细胞仪细胞分选的操作步骤
细胞分选的简要操作步骤 一、上样前的准备 FACSCalibu可以分选细胞进行培养或功能性研究，而这些研究需要清洁环境以保持分选后细胞不受污染继续培养，因此在样本制备，上机检测分选等过程中需严格按无菌技术操作。 1、应用无菌技术制备下列无菌工作液。 3L 70%乙醇（用无菌蒸馏水配制） 5L无菌蒸馏水 5L无菌PBS 2、在干净的鞘液筒中加入3L 70%乙醇。盖紧盖子，振摇鞘液筒，确保桶内壁被乙醇充分洗 涤。安好鞘液筒。 3、将过滤器短接，否则乙醇将破坏滤膜。。 4、用70%乙醇冲洗收集管接口处，并喷洒进样口处的空气。 5、在收集管接口处安装2支BD 50ml收集管（若不使用浓缩器）。 6、放上一支装有70 %乙醇的进样管。 7、设分选门（画一个空门使机器进行分选操作）。 9、从Acquire menu选择SortSetup。在Sort Gate菜单中选择步骤7设定的分选门。按液流控制 键RUN。 10、在Setup 方框中打叉，点击Acquisition Control 菜单中Acquire。。 11、跑乙醇直至2支收集管注满（每管注满需要9min ），点击Pause, Abort。 12、再重复上述步骤2次，共需要1h。 13、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入500mL无菌蒸馏水，振摇鞘液筒，倒掉液体，反复操作直 至洗净桶内壁残余乙醇。 14、在鞘液筒中加入3L无菌蒸馏水，盖紧盖子。安好鞘液筒。 15、在收集管接口处安装2支新的收集管。 16、放上一支装有无菌蒸馏水的进样管。 17、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 18、跑无菌蒸馏水直至2支收集管注满（每管注满需要9min），点击Pause Abort。 19、再重复上述步骤2次，共需要1h。 20、断开鞘液筒，在鞘液筒中加入3L无菌PBS盖紧盖子。安好鞘液筒。 21、在收集管接口处安装2支新的收集管。 22、放上一支装有无菌PBS的进样管。 23、点击Acquisition Control 菜单中Acquire。 24、第一支收集管（最左）中收集15 mL PBS后取下，使PBS由左至右流入下一收集管。重复 操作至2个管都收集了15 mL PBS为止。点击Pause, Abort。 25、在收集管接口处安装2支新的收集管。若要分选动物细胞，则应用无菌技术，用无菌 PBS4 % BSA缓冲液过夜包被50mL锥型管，将包被好的锥型管安置于收集接口。 26、按下述分选步骤分选样本 二、分选细胞
干细胞库建设项目可行性研究报告
干细胞研究项目 二OO九年十一月十日
目录 内容提要 第1章总论....................................................... １1 §1.1 项目背景 ................................................ １1 §1.1.1 项目名称........................................... １1 §1.1.2 项目出资方及资本结构............................... １1 §1.1.3 项目拟建地点....................................... １1 §1.1.4 立项依据........................................... １1 §1.2 可行性研究结论 .......................................... ２2 §1.2.1 市场预测和项目规模................................. ２2 §1.2.2 公用系统供应.. (2) §1.2.3 项目地址 (102) §1.2.4 环境保护 (102) §1.2.5 组织及劳动定员 (113) §1.2.6 项目建设进度 (114) §1.2.7 投资估算和资金筹措 (114) §1.2.8 项目财务和经济评价 (124) §1.2.9 项目综合评价结论 (126) 第2章项目背景和发展概况 (137) §2.1 项目提出的背景 (137) §2.1.1 国家及行业发展规划 (137) §2.1.2 项目发起人和发起原因 (7) §2.2 项目发展概况 (148) §2.3 投资的必要性 (15) 第3章市场分析与营销方案 (1710) §3.1 市场调查 (1710) §3.2 市场预测 (11) §3.3 价格策略 (28) §3.4 销售收入预测 (13)
流式细胞术样本制备.
样本制备实例: 细胞表面蛋白荧光染色 (Immunofluorescence Staining 原理: 对细胞表面蛋白质的染色可以分为直接染色(DIF 和间接染色(IIF 两种。直接染色是指用直接联有荧光的抗体染色;而间接染色则是采用一级抗体和蛋白先结合,然后再用带有荧光的与一级抗体有亲和力的二级抗体进行染色。荧光染色的方法在蛋白质检测中使用非常普遍,因为只要采用合适的抗体,几乎任意的蛋白都可以用指定的荧光标记。但是由于各种蛋白表达的强度和荧光染料自身荧光强度不同,以及临近通道串色的问题, 多色实验的基本原则是:最强的染料配表达最弱的蛋白,最弱的染料配表达最强的蛋白; 如果使用染料的数量不大则应尽量避免使用临近通道。还需要考虑染料之间的溢漏、以及偶联染料已降解的问题。现出现了 405nm 的激光激发的新型染料如 BV421、 BV605等为多色实验提供了更多的选择空间。 材料: ?被检测细胞 ?FACS Lysing Solution (细胞裂解液, 1倍或 10倍, 10倍的要先稀释到 1倍后使用 ?相应的蛋白荧光染色抗体 (e.g. CD4 FITC, CD8 PE, CD3 APC 步骤: 1. 在 100 μL外周血加入抗体: a. 同型对照:PB 100μL +Isotope FITC 20 μL+Isotope PE 20 μL+Isotope APC 5 μL b. 单阳管:PB 100μL +CD4 FITC 20 μL+Isotope PE 20 μL+Isotope APC 5 μL c. 单阳管:PB 100μL +Isotope FITC 20 μL+CD8 PE 20 μL+ Isotope APC 5 μL
【完整版】2019-2025年中国干细胞治疗行业目标市场选择策略研究报告
（二零一二年十二月） 2019-2025年中国干细胞治疗行业目标市场选择策略研究报告 可落地执行的实战解决方案 让每个人都能成为 战略专家 管理专家 行业专家 ……
报告目录 第一章企业目标市场选择策略概述 (5) 第一节研究报告简介 (5) 第二节研究原则与方法 (5) 一、研究原则 (5) 二、研究方法 (6) 第三节研究企业目标市场选择策略的重要性及意义 (8) 一、重要性 (8) 二、研究意义 (8) 第二章市场调研：2018-2019年中国干细胞治疗行业市场深度调研 (9) 第一节干细胞治疗概述 (9) 第二节全球干细胞治疗行业发展概况 (10) 一、临床研究 (10) 二、产业分布 (11) 三、市场格局 (12) 四、全球干细胞产业正处于爆发前夜 (13) 第三节我国干细胞治疗行业发展概况 (14) 一、干细胞医疗发展历程 (14) 二、干细胞行业管理体制 (14) 三、相关政策、法规环境 (15) 四、干细胞的应用范围广阔 (16) 第四节2018-2019年中国干细胞治疗行业发展情况分析 (18) 一、中医药与干细胞研究院成立 (18) 二、2018年汉氏联合干细胞新药获受理 (18) 三、2018年我国在干细胞装备领域实现突破 (19) 四、2018年诺和诺德押宝干细胞治疗“新蓝海” (21) 第五节2018-2019年我国干细胞治疗行业竞争格局分析 (23) 一、多家上市公司积极布局干细胞领域 (23) 二、国内公司积极布局干细胞领域 (24) 三、2018年九芝堂计划引进干细胞生产技术及制备平台 (25) 四、干细胞市场上的角逐者逐年增多 (25) 五、监管变奏对行业竞争格局的影响及趋势 (26) 第六节2019-2025年我国干细胞治疗行业发展前景及趋势预测 (27) 一、细胞医疗有望迎来发展黄金期 (27) 二、干细胞医疗市场潜力巨大及市场规模预测 (29) 第七节美国干细胞产业发展政策与监管及对我国的启示 (30) 一、美国干细胞产业发展和政策概述 (31) （一）美国干细胞产业现状 (31) （二）美国联邦层面的干细胞政策 (33) （三）美国州层面的干细胞政策 (33) 二、美国干细胞监管体系与监管科学 (34) （一）美国干细胞监管法律法规概述 (34)
最详细的流式细胞仪实验方法
流式细胞仪实验方法 一、实验准备 1．标本制备： 2．最小化非特异性结合： 二、凋亡 1．凋亡的检测方法：网站和其它 2．PI染色法 3．Annexin V 法 4．TUNNEL法 三、细胞因子 1．激活的细胞因子 2．CBA 四、血小板 1．活化 2．活化检测 3．网织血小板 五、红细胞 1．网织红细胞 2．PNH 3．胎儿红细胞 六、肿瘤学 1．DNA 细胞周期 2．蛋白 3．多药耐药 4．微小残留白血病
第一部分标本处理 一、流式细胞术常规检测时的样品制备 (一)直接免疫荧光标记法 取一定量细胞(约1X106细胞／ml)，在每一管中分别加入50μl的HAB，并充分混匀，于室温中静置1分钟以上(),再直接加入连接有荧光素的抗体进行免疫标记反应(如做双标或多标染色，可把几种标记有不同荧光素的抗体同时加入)，。孵育20-60分钟后，用PBS(pH7．2—7．4)洗1-2次，加入缓冲液重悬，上机检测。本方法操作简便，结果准确，易于分析，适用于同一细胞群多参数同时测定。虽然直标抗体试剂成本较高，但减少了间接标记法中较强的非特异荧光的干扰，因此更适用于临床标本的检测。 (二)间接免疫荧光标记法 取一定量的细胞悬液(约1X106细胞／ml)，先加入特异的第一抗体，待反应完全后洗去未结合抗体，再加入荧光标记的第二抗体，生成抗原—抗体—抗抗体复合物，以FCM检测其上标记的荧光素被激发后发出的荧光。本方法费用较低，二抗应用广泛，多用于科研标本的检测。但由于二抗一般为多克隆抗体，特异性较差，非特异性荧光背景较强，易影响实验结果。所以标本制备时应加入阴性或阳性对照。另外，由于间标法步骤较多，增加了细胞的丢失，不适用测定细胞数较少的标本。 二、最小化非特异性结合的方法 1．荧光标记的抗体的浓度应该合适，如果浓度过高，背景会因为非特异性的相互作用的增加而增加。 2．在使用第一抗体之前，将样品与过量的蛋白一起培育，如小牛血清蛋白（BSA），脱脂干奶酪，或来自于同一寄主的正常血清来作为标记的第二抗体。这个步骤通过阻断第一抗体和细胞表面或胞内结构的非特异性的交互作用来降低背景。 3．在使用第一抗体之后，将样品与5%至10%的来自于同一寄主的正常血清和作为标记的第二抗体一起培育。这个步骤会减少不必要的第二抗体与第一抗体、细胞表面或胞内结构之间的交互作用。 通过用来自于同样的样品的血清稀释标记过的抗体可以略过此步骤。此步骤适用于很多方面，但有时候它也会导致已标记的第二抗体和正常血清中的免疫球蛋白的免疫复合体的形成。这种复合体会优先与一些细胞结构进行结合，或者它们最终会导致期望得到的抗体活性的丢失。 4．使用F(ab’)2片段会使背景决定于第一或第二抗体与FC受体的全分子结合。大多数的第二抗体的F(ab’)2片段容易利用。而第一抗体的F(ab’)2片段一般是不能利用或很难制作。因此，在NaN3存在的条件下，将新鲜组织或
中国干细胞存储行业市场前景研究报告
2017年中国干细胞存储行业市场前景研究报告 一、干细胞的定义及分类 干细胞（stemcells，SC）是一类具有自我复制能力（self-renewing）的多潜能细胞。在一定条件下，它可以分化成多种功能细胞。根据干细胞所处的发育阶段分为胚胎干细胞（embryonic stem cell，ES细胞）和成体干细胞（somatic stem cell）。 根据干细胞的发育潜能分为三类：全能干细胞（totipotentstem cell，TSC）、多能干细胞（pluripotentstem cell）和单能干细胞（unipotent stem cell）（专能干细胞）。干细胞（Stem Cell）是一种未充分分化，尚不成熟的细胞，具有再生各种组织器官和人体的潜在功能，医学界称为“万用细胞”。 干细胞分类及特征 资料来源：中商产业研究院 随着基因工程、胚胎工程、细胞工程等各种生物技术的快速发展，按照一定的目的，在体外人工分离、培养干细胞已成为可能，利用干细胞构建各种细胞、组织、器官作为移植器官的来源，这将成为干细胞应用的主要方向。 二、我国干细胞存储现状分析 干细胞的产业化发展方向有上游的干细胞库、中游的干细胞扩增技术和质检技术，以及下游的干细胞产品，从而形成一条很大的产业链。干细胞产品又包括干细胞药物、干细胞移植技术、干细胞美容与抗衰老技术，以及组织工程中的种子细胞、基因治疗的细胞载体、基于干细胞的药物筛选模型等等。 中国干细胞完整产业链示意图 资料来源：中商产业研究院 根据以上产业链划分，干细胞治疗治疗领域已具备广阔的市场规模，形成了脐带血库、新药筛选和细胞治疗三大市场板块。其中，脐血储存（脐血库）是目前国内干细胞行业中最成熟也最重要的产业化项目。 目前，脐血库（全称叫“脐带血造血干细胞库”）是专门提取和保存脐带血造血干细胞并为患者提供查询的特殊医疗机构。国际上也称之为脐血银行或生命银行。中国的脐血库包括公共库和自体库。公共库奉行公益原则，接受公众脐带血捐赠，免费保存，以作日后提供给病患进行异体移植；而自体库，实行收费保存，脐带血也只用于保存者自体移植所用。
流式细胞仪操作步骤(FACSCalibur)
一、开机程序： 1.检查鞘液桶和废液桶。确认鞘液充满状态（鞘液为鞘液桶体积的3/4位 置，可以连续工作3个小时左右）、盖紧黑盖、管道畅通、废液桶有足 够空间容纳本批标本排弃的废液。如果要添加鞘液，要先释放鞘液桶中 气压。 2.依次打开流式细胞仪FACSCalibur稳压器、主机开关、电脑开关，打印 机。 3.气压阀置于加压位置，待流式细胞仪处于STANDBY状态，做Prime，以 排除管路中气泡。 二、运行FACSComp软件、检查仪器状况 1.制备三色标准微球样本。一般情况向1ml鞘液（或过滤PBS）中加入 1滴质控小微球，也可以根据实际情况调节浓度。 2.机器预热5 min，打开FACSComp软件，选择保持路径。选择所需校 正内容，如果使用的微球是新一批产品要输入微球的批号。 3.在软件界面左侧Assay Selection选项中选择质控类型，即实验过 程中是否需要清洗样品。 4.上样品，微球溶液上样之前要充分混匀。功能键设置在“RUN”。 5.仪器自动检查，并做电压、补偿等设置。 6.FACSComp软件运行完毕，显示结果通过测试。 7.做Set up。 8.打印校正结果，退出FACSComp程序。 备注：在质控过程中，如果提示收集细胞速度慢可以提高细胞收集速度，但是在调节灵敏度（Sens）时，一定要用“Low”的状态上样，保证仪器灵敏度的准确。在使用仪器过程中要养成好的习惯，在上样品过程中，仪器保持在“Low”“Standby”状态。 三、样品分析软件：CellQuest Pro 软件，选择“联机”。 1.
（2）对实验样本进行命名； （3）对实验通道进行预设（FSC,SSC,FL1-FL4）。 备注：如果界面被关闭，重新调出步骤： 2.调出质控模板。 3.画图 选择画图工具（一般选择散点图），Inspect 界面会自动弹出，对几个常用选项进行设定：将散点图选中（用鼠标点击散点图边框才能够 选中图形），将 更改横纵坐 备注：第一个散点图横坐标为FSC，纵坐标为SSC 。 （1一般获取10000个细胞。 （2 （ 3）将所有补偿调为0 （4）将非 52 （5）FSC和SSC （6 4.上阴性对照 将阴性对照管混匀，上机，功能键设置在“RUN”,散点图出现细胞信 号，第一个图：让细胞信号出现在自己看上去舒服的区域；其他三个 散点图，要将细胞信号调整到阴性区域，即左下角区域。通过移动通
实验14-细胞凋亡的诱导和检测
实验14-细胞凋亡的诱导和检测
实验14 细胞凋亡的诱导和检测 20世纪60年代人们注意到细胞存在着两种不同形式的死亡方式：凋亡（apoptosis）和坏死（necrosis）。细胞坏死指病理情况下细胞的意外死亡，坏死过程细胞膜通透性增高，细胞肿胀，核碎裂，继而溶酶体、细胞膜破坏，细胞内容物溢出，细胞坏死常引起炎症反应。 细胞凋亡apoptosis一词来源于古希腊语，意思是花瓣或树叶凋落，意味着生命走到了尽头，细胞到了一定时期会像树叶那样自然死亡。凋亡是细胞在一定生理或病理条件下遵守自身程序的主动死亡过程。凋亡时细胞皱缩，表面微绒毛消失，染色质凝集并呈新月形或块状靠近核膜边缘，继而核裂解，由细胞膜包裹着核碎片或其他细胞器形成小球状凋亡小体凸出于细胞表面，最后凋亡小体脱落被吞噬细胞或邻周细胞吞噬。凋亡过程中溶酶体及细胞膜保持完整，不引起炎症反应。细胞凋亡时的生化变
化特征是核酸内切酶被激活，染色体DNA被降解，断裂为50～300 kb长的DNA片段，再进一步断裂成180～200bp整倍数的寡核苷酸片断，在琼脂糖凝胶电泳上呈现“梯状”电泳图谱(DNA Ladder)。细胞凋亡在个体正常发育、紫稳态维持、免疫耐受形成、肿瘤监控和抵御各种外界因素干扰等方面都起着关键性的作用。 1．细胞凋亡的检测方法 凋亡细胞具有一些列不同于坏死细胞的形态特征和生化特征，据此可以鉴别细胞的死亡形式。细胞凋亡的机制十分复杂，一般采用多种方法综合加以判断，同时不同类型细胞的凋亡分析方法有所不同，方法选择依赖于具体的研究体系和研究目的（表？）。 表凋亡的检测方法（引自DL 斯佩克特 等，2001）
(2020年编辑)流式细胞仪数据分析
流式细胞仪数据分析 5.1 数据采集及显示 光信号转换成电压脉冲后，再通过模数转换器转换成为计算机能够储存处理的数字信号。流式细胞仪的数据以FSC标准格式存储，该标准由“分析细胞学协会”制定。 根据FSC标准，数据存储格式应包括三个文件：样本获取文件，数据设置文件和数据分析结果。4参数（FSC，SSC，FITC和PE）的单细胞分析会生成8位数据。当单个样品累计 收集到10000个细胞时，FCS数据文件为80kB。 数据采集存储完毕后，细胞亚群可以几种不同格式显示。单参数如FSC或FITC（FL1）可使用直方图，横轴表示荧光通道。纵轴表示在该通道内收集到的细胞数量（如图5-1）。 处在同一通道的每一细胞均符合该通道的信号值，而且具有相同的信号密度。通道右侧信号的荧光强度明显高于左侧，越靠右侧荧光亮度越强。图5-1 流式数据分析图双参数可在二维散点图中同时显示，X轴显示通道1（FL1），Y轴显示通道2（FL2）。3维图通过X，Y，Z三个轴分别显示每个通道的细胞量（如图5-1）。 习题：数据采集及显示 1 在直方图中横轴和纵轴分别表示。 2 二维点图用于显示参数。 3 在CellQuest软件中3维图中Z轴代表。
5.2 设门 通过设门的方法可以定义细胞亚群的区域。如：血样本是混合细胞群，如果想单独分析淋巴球细胞，可根据FSC或细胞大小，在FSC，SSC的散点图中设门，其数据结果只反映淋巴细胞亚群的荧光特性。图5-2 全血样本中淋巴细胞亚群的数据分析图 习题：设门 1 设门的方法通常用于分析样本内的指定细胞。（对错） 5.3 细胞亚群的数据分析 数据分析包括从点图中的list-mode文件中显示数据,然后统计点图中的细胞分布情况。如前所述，分别有几种形式的点图用于显示数据，而且可通过设门的方法区分指定的细胞亚群。如图5-3所示，在淋巴细胞亚群周围设门，以单独分析或分选该亚群细胞。
流式细胞术实验方法
流式细胞术实验方法 PI 染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。 3、加入2ml预冷的70%酒精，4℃固定30min，或是-20℃固定过夜。 4、离心，弃上清液。 5、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。 6、加入RNase A (工作浓度20ug/ml)于500ul 1×PBS中，37℃孵育30min，离心。 7、用1×PBS 1ml洗涤1次，离心。 8、加入PI(工作浓度50ug/ml) 于500ul 1×PBS中，室温避光孵育30min。 9、混匀，过300目筛网，置流式管中， 4℃冰箱保存，待测。 GFP PI染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、加入PBS 1ml离心洗涤1次，弃上清。 3、加入2ml预冷PFA，PFA的浓度根据细胞的特点进行调节，4℃固定30min。 以下步骤同PI 染色操作步骤的（4-9） 细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤 1、将单细胞悬液加入2ml圆底离心管中，离心，1500rpm , 5min，弃上清液。 2、以冷PBA 1ml，离心洗涤，弃上清液。 3、加入用PBA稀释的荧光素标记的抗体200ul。用微量移液器轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min-1h。 4、离心弃上清液。 5、加入冷PBS1ml,离心洗涤2次，以除去未结合的多余抗体成分。 6、向细胞中加入冷PBS 500ul,吹打混匀，置流式管中，4℃避光保存，待测。 细胞表面间接免疫荧光染色操作步骤 1-2、同细胞表面直接免疫荧光染色操作步骤 3、用PBA稀释的第一抗体200ul，对照管加入对应于一抗的正常实验动物IgG，轻轻吹打混匀，4℃或置冰上孵育1、5-2h。离心，弃上清。 4、 BS1ml离心洗涤1次，以去除多余的未结合的特异性抗体。 5、 PBA适当稀释的荧光素标记的第二抗体200ul。吹打混匀，4℃或置冰上孵育30min，避光。 6、 PBS 1ml离心洗涤2次。
干细胞存储行业研究报告
2017年干细胞存储行业研究报告 因为具有潜在的再生能力，干细胞自其诞生之日起，就被认为可能是革命性的医疗技术。2007年和2012年的诺贝尔生理或医学奖，分别授予了与干细胞有关的发现。 2011年开始，干细胞概念再次被市场热炒。根据Market Research及Transparency Market Research预计，到2018年全球干细胞储存市场容量将增长至亿美元。 干细胞存储业务的想象空间虽然不及干细胞治疗，但依然是现阶段许多干细胞公司的重要业务。对投资机构来说，一方面存储业务充沛的现金流可以缓解研发费用的压力，一方面细胞分离等技术能力的高低也能侧面反映公司的技术水平，对于分析标的的风险和潜力意义重大，值得持续关注和研究。 一、概述 干细胞是具有自我更新、高度增殖、多项分化潜能及良好组织相容性等特点的细胞群体。因为具有潜在的再生能力，干细胞自其诞生之日起，就被认为可能是革命性的医疗技术。2007年和2012年的诺贝尔生理或医学奖，分别授予了“在利用胚胎干细胞引入特异性基因修饰的原理上的发现”和“发现成熟细胞可被重写成多功能细胞，细胞核重编程技术（iPS细胞）”两项与干细胞有关的发现。 2011年开始，干细胞概念再次被市场热炒。在A股市场上，以中源协和为代表的企业当年股价飞涨。 存储业务涉及的主要是造血干细胞和间充质干细胞，前者主要来源于骨髓、外周血、脐带血、胎盘等，后者主要来源于骨髓、脐带、脂肪、脐带血、羊膜、胎盘等，进而形成了脐带血造血干细胞等细分种类。目前干细胞存储的主要市场仍在新生儿相关的业务，随着分离等技术的成熟和临床研究的深入，新生儿干细胞存储种类正在从脐带血造血干细胞转向胎盘、脐带等来源的间充质干细胞。
流式细胞分析技术讲解
流式细胞仪分析技术及应用 第一节概述 一、工作原理 二、散射光的测定 三、荧光测量 四、细胞分选原理 第二节数据的显示与分析 一、参数 二、数据显示方式 三、设门分析技术 第三节流式细胞仪技术要求 一、检测样品制备 二、常用的荧光染料与标记染色 三、胶乳颗粒的应用 四、流式细胞技术的质量控制第四节流式细胞仪技术的要求 第五节、流式细胞仪的科研应用 第六节流式细胞术在临床检测中的主要应用 一、细胞周期和DNA倍体分析 二、染色体分析 三、细胞表面标志的检测 1、淋巴细胞及其亚群的分析 2、淋巴细胞功能分析 3、淋巴造血系统分化抗原及白血病免疫分型 四、肿瘤耐药相关蛋白分析 五、AIDS病检测中的应用 六、自身免疫性疾病相关HLA抗原分析 七、移植免疫中的应用 流式细胞术(flow cytometry, FCM)亦称荧光激活细胞分选器(fluorescence-activated cell sorting, FACS):是一种集激光技术、电子物理技术、光电测量技术、电子计算机以及细胞荧光化学技术、单克隆抗体技术为一体的新型高科技仪器。 是对于处在快速直线流动状态中的细胞或生物颗粒进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。 广泛应用于基础研究和临床实践各个方面，包括细胞生物学、肿瘤学、血液学、免疫学、药理学、遗传学及临床检验学等。 流式细胞术主要包括：1、液流技术2、细胞的分选和计数技术3、数据的采集和分析技术 流式细胞术发展史: ?1930年Caspersson和Thorell开始致力于细胞计数的研究 ?1934年Moldaven最早设想细胞检测自动化，用光电仪记录流过一根毛细管的细胞 ?1940年Coons提出结合荧光素的抗体去标记细胞内的特定蛋白 ?1949年Wallace Coulter申请了在悬液中计数粒子的方法的专利 ?1950年Caspersson用显微UV-VIS检测细胞 ?1953年Croslannd-Taylor应用分层鞘流原理，成功设计红细胞光学自动计数器 ?1969年Van Dilla及其同事在Los Alamos, NM发明第一台荧光检测细胞计 ?1972年Herzenberg研制出细胞分选器 ?1975年Kohler等提出单克隆抗体技术，为细胞研究提供大量的特异免疫试剂 ?大量厂家不断生产流式细胞仪 ?目前国内主要流式细胞仪厂家：Beckton Dickinson(BD)公司、BACKMAN COULTER公司 流式细胞术的特点： 流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种信号对细胞进行定量分析或纯化分选 细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量 主要特点：单个细胞水平分析；多参数分析（同时多种荧光素标记）水平分析；高灵敏度、高分辨率、高重复性、高分选纯度；可分析大量细胞；速度快：5000-10000个细胞/秒；统计学意义：提供细