Molecular cloning of a thermostable -Glucanase Gene from Bacillus subtilis ZJF-1A5

农业生物技术学报Journal of Agricultural Biotechnology2006,14(1):147~148

*基金项目：国家自然科学基金项目(No.20276064)资助。

何国庆:男，1957年生，教授。

**通讯作者。Author for correspondence.Email:.Tel:0571－86971166收稿日期：2005-01-10接受日期：2005-04-03·研究简报·

枯草芽孢杆菌ZJF-1A5β-葡聚糖酶基因的克隆、序列分析和表达*

何国庆**张秀艳陈启和阮辉汤兴俊

(浙江大学生物系统工程与食品科学学院,杭州310029)

关键词：热稳定内切-β-1,3-1,4-葡聚糖酶；芽孢杆菌ZJF-1A5；克隆；重组表达

中图分类号:S188文献标识码:A文章编号:1006-1304(2006)01-0147-02

Cloning,Sequence Analysis and Expression ofβ-glucanase Gene from

HE Guo-Qing**ZHANG Xiu-Yan CHEN Qi-He RUAN Hui TANG

Xing-Jun

thermostable endo-β-1,3-1,4-glucanase;;cloning;recombinant expression

β-1,3-1,4-葡聚糖酶是重要的工业用酶，可有效减少大麦β-葡聚糖在啤酒酿造中所造成的麦汁过滤困难和啤酒的非生物性浑浊等负面影响。但内源β-葡聚糖酶在麦芽干燥和糖化过程中丧失了大部分活性。而微生物来源β-葡聚糖酶与麦芽内源酶有相同的底物专一性，且热稳定性优于麦芽内源酶。本研究对mutant葡聚糖酶基因进行克隆、序列分析和表达，并对酶在细胞中的分布和酶的热学性质进行了研究。

1材料和方法

1.1菌株、质粒和酶

mutant为本实验室保藏。TG1、BL21(DE3)和PET28a(+)为Novagen产品；所有用酶均购自宝生物工程(大连)有限公司；地衣多糖购自Sigma。

1.2基因组提取

参照Saito and Miura(1963)方法。

1.3β-葡聚糖酶基因的克隆、序列分析和诱导表达

以枯草芽孢杆菌基因组为模板，

引物1:5'

3';

引物2:5'GGGAAGCTTATTTACAGAGGGGAGAA3'。

进行PCR扩增。对扩增产物进行测序，并用DNAStar分子生物学软件对序列进行分析和比对。根据表达载体PET28a(+)的诱导方法，用IPTG对重组菌株进行诱导，表达产物进行15％的SDS-PAGE电泳。1.4胞外、胞内和周质空间的β-葡聚糖酶分布

参照Cornelis(1982))的方法进行。

1.5β-葡聚糖酶的酶活测定

参照汤兴俊和何国庆(2002)方法进行。

2结果和分析

2.1β-葡聚糖酶基因的克隆和序列分析

PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳，获得1条约为849 bp的扩增条带(图1,A)。PCR产物与pET28a(＋)连接后，对重组质粒进行PCR和酶切鉴定(图1,B)，说明PCR产物已克隆到表达载体pET28a(＋)，将此重组质粒命名为pET28a。对重组表达载体测序和同源分析的结果显示：从

mutant扩增的片断与Murphy.(1984)发表的序列有2，4，26个碱基的不同。所对应的氨基酸序列分别有1，3，4个的不同(序列未发表)。这些替换的意义目前还不清楚。

2.2重组表达载体的诱导表达

基因工程菌经0.4mmol/L IPTG诱导，表达产物经15％的SDS-PAGE电泳，发现在发酵上清和菌体内都得到了大小约为27kD的蛋白质(图2)。对表达产物进行β-葡聚糖酶活性测定，结果显示胞内和胞外的表达产物都有β-葡聚糖酶活性。

2.3胞外、胞内和周质空间的β-葡聚糖酶分布

β-葡聚糖酶在大肠杆菌中的表达是以大肠杆菌T7启动子启动，以自身信号肽进行引导的。由于大肠杆菌有外膜，所

农业生物技术学报2006年以酶不仅被分泌至细胞外，而且也积累在细胞内和周质空

间，但酶在3个空间的分布却因宿主的不同而不同。图3为

β-葡聚糖酶在大肠杆菌BL21(DE3)中的分布情况。

图1.PCR扩增(A)及重组质粒的鉴定(B)

Fig.1.PCR amplication(A)and identification

of recombinant plaspmid(B)

A.DL-2000;1,blank;2,PCR product;

B.DL-2000;PCR amplication of plasmid pET28a-;l and2,recombinant plasmid pET28a-BGLS digesting with H

Ⅰand dⅢ;3,pET28a-.

图2β-葡聚糖酶的SDS-PAGE分析

Fig.2SDS-PAGE analysis ofβ-1,3-1,4-glucanase M,molecular mass markers；1,BL21,no pET28a(+)；2,BL21with

pET28a-；3,BL21with pET28a induced with IPTG;4,culture supernatants of the BL21with pET28a-induced with IPTG.

2.5β-葡聚糖酶的热稳定性

酶液分别在不同温度的水浴中保温20min,立即冰浴,然后按常规条件测定酶活,结果见图4。由图4看出：该酶的值为62.5℃。

图3.β-葡聚糖酶在细胞外、细胞内和周质空间的分布

Fig.3.The proportion ofβ-glucanase in extracellular,cellular and the

periplasmic space

◆Cellular activities;■Extracellular activities;▲Periplasmic

activities;●Total activity

图4.葡聚糖酶的热稳定性

Fig.4.Thermostability ofβ-glucanase

参考文献

Cornelis P,Digneffe C and Willemot K.Cloning and expression of a

amylase gene in.

,1982,186:507~511

Murphy N,McConnell D J and Cantwell B A.The DNA sequence of the gene and genetic control sites for the excreted

enzyme beta-glucanase,,1984,12

(13),5355~5367

Tang Xing jun(汤兴俊)and He Guo qing(何国庆).Screening thermostableβ-glucanase producing strain and characteristics of enzyme production.(农业生物技术学报),2002，10(4)385~389(in

Chinese) 148