Western_Blot过程步骤详解
做了五个月的Western Blot ，有一点点小心得，给新手点经验．
蛋白提取：
１．总蛋白提取（胞膜，胞浆，胞核）：
组织匀浆后,15000g, 4度, 20分钟后,取上清.
Buffer:NP40 750ul, 脱氧胆酸钠0.5克, SDS 0.1克, 加1*PBS 至100ml. 再加入PMSF(7.4mg/ml) 0.1ml. (现用现加)
7.4mg/ml PMSP异丙醇溶液: 取A mg PMSF 加A/7.4 ml 异丙醇.工厂-20度储存
２．组织膜蛋白提取：所在操作冰上进行
（1）取组织，用PBS冲洗干净组织上的血液. 加入10ml Buffer A , 用剪刀尽可能剪碎组织,于冰上充分匀浆。每次30秒,重复3-5次.
（2）离心机1000rpm，4℃离心10min 后，所得上清液转入超速离心管。(去掉大块组织及结缔组织)
（3）100000g，4℃离心1hr, 弃去上清.(此为胞浆蛋白,若只提取胞浆蛋白,可用10000rpm, 4度, 30分钟离心，取上清即可)。沉淀用适量的Buffer B重悬，4度过夜后，分装至EP管，Eppendorf 台式离心机10000rpm，4℃离心30min。
（4）收集所得上清液即为膜组份。
Buffer A：0.32M 蔗糖，5mM Tris-HCl（PH 7.5），120mM KCl，1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。
Buffer B 20mM HEPES（PH 7.5），10% 甘油，2% Triton X-100, 1mM EDTA, 1mM EGTA, 0.2mM，PMSF, 1ug/ml Leupeptin, 1ug/ml Pepstatin A, 1ug/ml Aprotinin。冰上预冷。
所得蛋白分装EP管（每管约50ul），取一管测蛋白浓度，其它放入-70度深冻冰箱保存。
如果要定量的话，最好能立即根据浓度，加入上样缓冲，煮沸，4度保存。反复冻融蛋白会降解，浓度不准。
考马斯亮兰Ｇ２５０测蛋白浓度：
考马斯亮兰Ｇ２５０配方：G250 0.4克, 95%乙醇100ml, 85% 磷酸200ml, 加水至2000ml,过滤后使用。
BSA标准液：0.5mg/ml BSA, 双蒸水配制。
配制标准液(浓度分别为0，10，20，30，40，50ug/ul)：
1 2 3 4 53 6
G250 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml 3ml
0.5mg/ml
BSA ------ 20ul 40ul 60ul 80ul 100ul
ddH2O 100ul 80ul 60ul 40ul 20ul -----
待测蛋白配液：每管3ml G250，2ul样品，98ul ddH2O。（若加入样品后，液体没有变蓝色，则可再加2ul样品，ddH2O减为96 ul，标准液浓度可适当扩大。）
紫外分光光度计，595nm，用1号管调零，制出标准曲线, 标准方程及R值（R值应大于0.99, 否则操作误差较大）,测量待测蛋白OD值，算出蛋白浓度。（若加入2ul样品，则浓度值需除2，方为真正浓度；若加4ul样品，则除4）
聚丙烯酰胺电泳：
1．自来水，洗涤剂清洗玻璃板，用ddH2O冲洗干净，立放于盒子内，60度烤箱烘干备用。2．配胶：
凝胶储备液（30% Acr/Bise）：
丙烯酰胺29克，双体甲叉双丙烯酰胺1克，加水至100ml。（有说要棕色瓶保存，3个月换新的，30%的丙烯酰胺如有沉淀，最好弃掉）
10%APS：0.1克过硫酸铵，加ddH2O至1 ml.(4度保存,一周内使用)，本人都是配新鲜的用。10%SDS: 1克SDS,10 ml ddH2O. (不溶时,可加热50度左右助溶.)
TEMED: 原液即可.
0.5M Tris-HCl (PH6.8)；
1.5M Tris-HCl (PH8.8): 9.0855克Tris, 加入ddH2O溶解后,用HCL调PH至8.8,加ddH2O到50ML 配胶的浓度和方法书上都有，不详细说了！
本人做的是70KD 和17KD 的分子量，分别配了10%和12%的分离胶，4%的浓缩胶。摇动溶液充分混合（不要过于剧烈以免引入过多地氧气）灌入2/3的分离胶后（估计距梳子底1CM）应立即用ddH2O封胶。等到能看清水和胶的分界线，则可配浓缩胶。用面巾纸吸干水后，注入浓缩胶，至顶。插入梳子，不要有气泡。
蓝色字体是从别人贴子上看到的
这些小孔的孔径随“双丙烯酰胺～丙烯酰胺” 比率的增加而变小，比率接近1：20 时孔径达到最小值。SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“双丙烯酰胺～丙烯酰胺”为1：29 配制，试验表明它能分离大小相差只有3% 的蛋白质。
分离胶及浓缩胶均可事先配好（除AP及TEMED外），过滤后作为储存液避光存放于4℃，可至少存放1个月，临用前取出室温平衡（否则凝胶过程产生的热量会使低温时溶解于储存液中的气体析出而导致气泡，有条件者可真空抽吸3分钟），加入10%AP（0.7~0.8:100, 分离胶浓度越高AP浓度越低，15%的分离胶可用到0.5:100）及TEMED（分离胶用0.4:1000, 15%的可用到0.3:1000，浓缩胶用0.8：1000）
PAGE配胶的试剂和配方比例对电泳结果的质量当然有决定性的影响，这个配胶的比例，在《分子克隆》上有详细的论述。容易忽视的问题主要在于过硫酸铵（AP）一定要新鲜——最好用小指管配AP（写日期）保存在-20度，超过2周的AP扔掉算了，或者已经反复打开使用多次的AP 都别用。胶浓度＜10%时可用0.1%的SDS封，浓度＞10%时用水饱和的异丁醇或异戊醇，也可以用0.1%的SDS），封胶后切记，勿动。如用醇封胶需用大量清水及ddH2O冲洗干净，然后加少量0.1%的SDS，目的是通过降低张力清除残留水滴。
等浓缩胶凝的时间，就可以配蛋白了。按照想要的浓度加入LOADING BUFFER配制。本人按每孔总体积20ul, 终浓度1* RSB，含50ug蛋白混合样品，不足的体积用1* PBS补足。短暂离心后，沸水中煮5分钟，放室温，用时再短暂离心。
例如. 50ug/20ul，做2.5孔, 即50ul，125ug
1 2 3 4
蛋白浓度10．33 ug/ ul 13．91 ug/ ul 14．87 ug/ ul 19．03 ug/ ul
所需体积12.1 ul 9 ul 8.4 ul 6.6 ul
5*RSB 10 ul 10 ul 10 ul 10 ul
1* PBS 27.9 ul 31 ul 31.6 ul33.4 ul
5*RSB: 1.89克Tris-HCL(PH 6.8), 5克SDS, 0.125克溴酚蓝, 25ML 甘油.(很粘稠)
Beta-巯基乙醇用时现加,按25%比例.
10* PBS: Nacl 4.25克,Na2HPO4. 12H2O 15.4g, NaH2PO4 2H2O 1.4g, 调PH到7.2-7.4,加ddH2O到500ml
约30分钟左右, 取下梳子,将胶板放入电泳槽内,加入1*电泳缓冲液, 冲洗加样孔. 微量进样器逐个加样,空泳道加入1* RSB. 两胶板之间的电泳液要满. 接好正负极, 开始电泳, 可先小电压,约50V ,大约跑过浓缩胶后再改为100V. 观察MARKER的情况, 适时终止电泳.
建议说目的带要跑到分离胶的2/3处比较好,但本人一直都在上1/3处,结果也还可以.
预染MARKER很重要,开始选了一个国产的,总是跑不好,后来换成NEB的,效果很好,而且也不贵,范围也比较广,把我要的7.,42.17全都包括在内.
如果浓缩胶跑的好的话, 几个孔的蛋白会跑成一条直线.
注意加样时间要尽量短，以免样品扩散，为避免边缘效应，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液
未聚合的丙烯酰胺具有神经毒性,操作时应该戴手套防护.梳子插入浓缩胶时,应确保没有气泡,可将梳子稍微倾斜插入以减少气泡的产生,梳子拔出来时应该小心,不要破坏加样孔,如有加样孔上的凝胶歪斜可用枕头插入加样孔中纠正但要避免枕头刺入胶内.
10* 电泳缓冲液: Tris7.58克, 甘氨酸36克, SDS 2.5克, ddH2O定容到250ML.
不好溶,可用搅拌器.
可重复使用,每次加一些新的进去.但本人每次都是配新的,也不麻烦.
转膜：
跑完电泳后,取出胶,可以一块做考马思亮蓝R250染色约30分钟, 脱色液脱色, 看看蛋白条带跑的如何,上样量如何.
另一块可用做转膜. 放入转移缓冲液中摇30分钟左右（有次着急只晃了10分钟，结果也挺好的）。开始用的PVDF膜, 0.45um, 用国产的MARKER后,总是染的不清楚, 而且无论时间长短, 最后一块滤纸都会被染色. 后来换了NEB后,PVDF也不容易上色(可能和PVDF的质量有关,我买的虽然也是MILLIPORE,但好像比较便宜20CM*10CM才50块钱). 丽春红染色也很少能看清条带,后来发现,染色后用甲醇洗,比较容易看出来,但是很难洗掉红色，不知道有没有影响。后来换成NC膜，0.22um ，效果挺好的，MARKER易染上，丽春红也易着色，还一洗就掉。能比较清楚的了解转膜效果。
不同转膜仪和电源转膜的条件不同，我用的是BIO-RAD 的半干转（电压不过25V的那款），电源是BIO-RAD的PC200，70KD的我转50分钟，20V，17KD的转20V，30分钟左右，条件不是很稳定，有时半路打开盖子看看MARKER转的情况，但膜和胶的位置一定不能窜。也有人说用恒流，说1.2-2MA/CM2我看了一下，我的胶大约都是5*3左右大的，20V一般电流会是60-30MA 之间，要是这样算的话,最高就30MA, 我不太清楚.
如果用PVDF膜，先用甲醇浸泡一段时间，我一般是5分钟，但也有人说不过30秒，不清楚。换了NC膜就直接放入转移缓冲液中的，晃30分钟左右。
滤纸开始是买的那种专用滤纸，上面三张，下面三张，后来有人说这种滤纸是做湿转用的，应当用那种比较厚的，上下各一张，我也不知道，后来就换成普通滤纸了，上下大约各15张左右，有时着急还反复用过，效果也还可以，估计问题不大。
因为这款半干转膜仪说明书上说不会短路，所以一般滤纸》膜》胶. 他们之间一定不要有气泡.。膜上要做好标记，识别正反面和上下,切个小角是常用的方法, 有MARKER也方便记.
转膜后的胶可用考染看看转膜情况.
考马斯亮蓝R250: R250 0.25克, 甲醇50ML, 冰乙酸40ML, 加水到100ML.
脱色液: 乙酸50ML, 甲醇225ML(可用乙醇), ddH2O500ML
10*丽春红(20ML): 2%丽春红(0.4克), 30%三氯乙酸(6克), 30%磺基水杨酸(6克). 用时加入9 倍的ddH2O
10*转膜缓冲液:
70KD分子量: Tris29克, 甘氨酸14.5克, SDS 1.85克, 加水到500ML.
用时取10ML, 加20ML 甲醇, 加70ML 双蒸水
17KD分子量: Tris29克, 甘氨酸14.5克, 加水到500ML.
用时取10ML, 加50ML 甲醇, 加40ML 双蒸水
封闭：
用5%的封闭液(伊利的高钙脱脂), 室温,摇床1小时.
5%封闭液: 1克脱脂奶粉, 20ML洗膜液.
洗膜液: 10*PBS 50ML, 450ML ddH2O, 0.5ML TWEEN-20
抗体孵育：
将膜上的封闭液洗去(轻轻晃晃就可)
一抗:用杂交液配置.浓度可根据点蛋白实验,及ECL要求来定.
4度,过夜.最好有那种4度摇床.我一般早上到实验室后,再摇床上再摇3个小时左右.
洗膜液洗3次,每次10分钟.
二抗: 用杂交液配置.室温,摇床,1小时.
洗膜液洗3次,每次10分钟.PBS洗5分钟.
如果一抗没有混浊,放置时间不长,可以重复使用,本人一般连作二天时,才会重复用,如果因为一抗的原因而不出结果,太不值了.
杂交液: BSA0.5克, 洗膜液50ML.4度保存,如有混浊,重配.
点蛋白试验:
在正式作WESTERN之前可先做这个,如果没有结果可能提蛋白中不含目的蛋白,也可能一抗与目的蛋白结合不好,或一,二抗结合不好.(之前拿一滴二抗和ECL试一下是否发光,以排除二抗的问题).若有结果,可能选择一个比较合适的一,二抗浓度.
取小块膜,放到24孔板中(PVDF先有甲醇泡,烘干),滴上不同浓度的蛋白(先加5UL,37度烘干,再加5UL,烘干),加封闭液,室温,摇床一小时, 洗去. 加不同浓度一抗,2-3小时, 室温,摇床.洗膜液洗3次,每次10分钟.不同浓度二抗一小时, 室温,摇床. 洗膜液洗3次,每次10分钟.PBS洗5分钟.显色
ECL显影
将膜上多余的水吸干,与胶相邻的一面向上,按ECL说明书配置发光液.点在膜上.
不同厂家ECL要求不一样,本人用的ECL二种液体1:1混合后,0.125/CM2, 放置2分钟,吸干(可以用微量加样器抽回来,可连续用下一张膜),放在保鲜膜上,包好,压片.
若肉眼可见发光,可压10-20秒; 若看不到,可压30分钟.(再长的时间没试过,一般30分钟不出,就重新再回一次ECL,重做一次,若再不出,就认为没有了.)
转完膜后的膜如果不能及时做,可放在洗膜液中,4度保存,最多放过2天,时间长了就不知道了.
四、WEST BLOTTING
Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答)
作者：佚名文章来源：本站原创点击数：12403 更新时间：2009-9-30 9:50:44
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术:
一、原理
二、分类
i.放射自显影
ii.底物化学发光ECL
ECF
iv.底物DAB呈色
三、主要试剂
四、主要步骤
五、实验常见的问题指南
1.参考书推荐
2.针对样品的常见问题
3.抗体
4.滤纸、胶和膜的问题
5.Marker的相关疑问
6.染色的选择
7.参照的疑问
8.缓冲液配方的常见问题
9.条件的摸索
10.方法的介绍
11.结果分析
一、原理
与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，
经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。
二、分类
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、主要试剂
1、丙烯酰胺和N，N’-亚甲双丙烯酰胺，应以温热(以利于溶解双丙稀酰胺)的去离子水配制含有29%(w/v)丙稀酰胺和1%(w/v)N，N’-亚甲双丙烯酰胺储存液丙稀酰胺29g，N，N-亚甲叉双丙稀酰胺1g，加H2O至100ml。)储于棕色瓶，4℃避光保存。严格核实PH不得超过7.0，因可以发生脱氨基反应是光催化或碱催化的。使用期不得超过两个月，隔几个月须重新配制。如有沉淀，可以过滤。
2、十二烷基硫酸钠SDS溶液:10%(w/v)0.1gSDS，1mlH2O去离子水配制，室温保存。
3、分离胶缓冲液:1.5mmol/LTris-HCL(pH8.8):18.15gTris和48ml1mol/LHCL混合，加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。
4、浓缩胶缓冲液:0.5mmol/LTris-HCL(pH6.8):6.05gTris溶于40mlH2O中，用约48ml 1mol/L HCL调至pH6.8加水稀释到100ml终体积。过滤后40C保存。这两种缓冲液必须使用Tris碱制备，再用HCL调节PH值，而不用Tris.CL。
5、 TEMED原溶液N，N，N’N’四甲基乙二胺催化过硫酸铵形成自由基而加速两种丙稀酰胺的聚合。PH 太低时，聚合反应受到抑制。10%(w/v)过硫酸胺溶液。提供两种丙稀酰胺聚合所必须的自由基。去离子水配制数ml，临用前配制.
6、 SDS-PAGE加样缓冲液:pH6.8 0.5mol/L Tris缓冲液8ml，甘油6.4ml，10%SDS 12.8ml，巯基乙醇3.2ml，0.05%溴酚蓝1.6ml，H2O 32ml混匀备用。按1:1或1:2比例与蛋白质样品混合，在沸水终煮3min混匀后再上样，一般为20-25ul，总蛋白量100μg。
7、 Tris-甘氨酸电泳缓冲液:30.3gTris，188g甘氨酸，10gSDS，用蒸馏水溶解至1000ml，得0.25mol/L
Tris-1.92mol/L甘氨酸电极缓冲液。临用前稀释10倍。
8、转移缓冲液：配制1L转移缓冲液，需称取2.9g甘氨酸、5.8gTris碱、0.37g SDS，并加入200ml甲醇，加水至总量1L。
9、丽春红染液储存液：丽春红S 2g 三氯乙酸30g 磺基水杨酸30g 加水至100ml 用时上述储存液稀释10倍即成丽春红S使用液。使用后应予以废弃。
10、脱脂奶粉5%(w/v)。
11、 NaN3 0.02% 叠氮钠(有毒，戴手套操作)，溶于磷酸缓冲盐溶液(PBS)。
12、 Tris缓冲盐溶液(TBS):20mmol/LTris/HCL(pH7.5)，500mmol/LnaCl。
13、 Tween20(15)鼠抗人-MMP-9(16)鼠抗人-TIMP-1。
14、过氧化物酶标记的第二抗体。
15、 NBT(溶于70%二甲基甲酰胺，75mg/ml)。
16、 BCIP(溶于100%二甲基甲酰胺，50mg/ml)。
17、 100mmol/LTris-HCL(pH9.5)。
18、 100mmol/L NaCl。
19、 50mmol/LTris-HCL(pH7.5)，5mmol/L EDTA。
（可以参看分子克隆）
四、主要步骤
主要包括以下4个基本步骤
1.样品制备
原始样品可为细胞、组织、培养上清、免疫沉淀或亲和纯化的蛋白，以下为定性检测目的蛋白时细胞样品的处理方法，其余的样品制备方法参阅相关文献。
1．培养细胞或药物处理。
2．弃培养基，用1X PBS漂洗细胞2次，去尽残留培养基。
3．加入1X SDS样品缓冲液(6-well plate, 100 μl /w或75 cm2 plate, 500-1000 μl/瓶)，刮落细胞，转移到Ep 管。注意：冰上操作。
4．超声10~15秒剪切DNA以减低样品粘性。
5．煮沸样品5 minutes。
6．离心12000g, 5 min，取上清。
7．电泳分离：上样15μl~20 μl 至SDS-PAGE 胶( 10 cm x 10 cm)电泳。
如要定量检测某蛋白的表达水平，应用RIPA裂解液(1 ml per 107 cells/ 100 mm dish/ 150 cm2 flask)裂解细胞，收集裂解液至离心管中，在振荡器上混匀4～15min，14000g离心15min（4℃），弃沉淀，用Bradford 法或其它蛋白质测定方法测定上清中蛋白浓度以调整上样体积和上样量，进行Western杂交时还需设置内或外参照，通常用beta-actin。
注意：一般上样20~30 μg已足够，如待检蛋白为低丰度蛋白，可加大上样量至100μg，但电泳条带易拖尾，可制备亚细胞组份或采用更敏感的检测方法。
2.电泳分离（参照SDS-PAGE电泳方法）
3.转膜
杂交膜的选择是决定Western blot成败的重要环节。应根据杂交方案、被转移蛋白的特性以及分子大小等因素，选择合适材质、孔径和规格的杂交膜。用于Western blot的膜主要有两种：硝酸纤维素膜(NC) 和PVDF 膜。NC膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物，在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，但在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，选择不同孔径的NC膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。通常用0.45μm和0.2μm两种规格的NC膜。大于20kD的蛋白可用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如用0.45μm的膜就会发生“Blowthrough”的现象。PVDF膜灵敏度、分辨率和蛋白亲和力比常规的膜要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇浸泡饱和1-5秒钟。
蛋白质常用的转移方法主要有两种：槽式湿转和半干转移。前者操作容易，转移效率高；而后者适用于大胶的蛋白转移，所用缓冲液少。以下为槽式湿转的操作步骤。
1. 将胶浸于转移缓冲液中平衡10min。
注意：如检测小分子蛋白，可省略此步，因小分子蛋白容易扩散出胶。
2. 依据胶的大小剪取膜和滤纸6片，放入转移缓冲液中平衡10min。如用PVDF膜需用纯甲醇浸泡饱和
3-5秒钟。
3. 装配转移三明治：海绵?3层滤纸?胶?膜?3层滤纸?海绵，每层放好后，用试管赶去气泡。切记：胶放于负极面（黑色面）。
4. 将转移槽置于冰浴中，放入三明治（黑色面对黑色面），加转移缓冲液，插上电极，100V，1h（电流约为0.3A）。注意：应再次检查三明治和电极是否装配正确，电源是否接通。
5. 转膜结束后，切断电源，取出杂交膜
4.免疫杂交与显色
1．用25 ml TBS 洗膜5min，室温，摇动。
2．置膜于25 ml 封闭缓冲液中1h, 室温，摇动。
3．15ml TBS/T洗3次（5 min/T）。
4．加入合适稀释度的一抗，室温孵育1-2h或4°C过夜，缓慢摇动。
5．15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。
6．加入合适稀释度的碱性磷酸酶（AP）或辣根过氧化酶（HRP）标记的二抗，室温孵育1h，缓慢摇动。
7．15 ml TBS/T洗3次（5 min/T）。
8．15 ml TBS洗1次。
9．蛋白检测(显色法或发光法，按相应试剂说明操作)。
注意事项：
1．操作中戴手套，不要用手触膜。
2．PVDF膜在甲醇中浸泡时间不要超过5秒。
3．如检测小于20kD的蛋白应用0.2μm的膜，并可省略转移时的平衡步骤。
4．某些抗原和抗体可被Tween-20 洗脱，此时可用1.0% BSA代替Tween-20。
5．关于封闭剂的选择：5%脱脂奶/TBS or PBS: 能和某些抗原相互作用，掩盖抗体结合能力；0.3~3% BSA in PBS：低的内源性交叉反应性。
6．如用0. 1% Tween 20、0.02% NaN 3 in PBS or TBS作封闭剂和抗体稀释液，抗体检测后可进行蛋白染色。
如要同时检测大分子量和小分子蛋白，最好用梯度胶分离蛋白。
五、实验常见的问题指南
根据问题的类型主要分成以下几类（以下资料权作参考，请勿盲目模仿！）：
1. 参考书推荐
A. 对初学者看什么资料比较好？
解答：《抗体技术实验指南》和Antibodies（a laboratory manual，wrote by Ed Harlow ，david lane）两本书不错。
2. 针对样品的常见问题
B. 做线粒体膜UCP2蛋白的Western Blot （以下简写成Western Blot），提取线粒体后冻存（未加蛋白酶抑制剂），用的博士德的一抗，开始还有点痕迹，现在越来越差，上样量已加到120μg，换了个santa cloz 的一抗仍不行。是什么原因？蛋白酶抑制剂单加PMSF行吗？
解答：怀疑是样品问题，可能是：1，样品不能反复冻融；2，样品未加蛋白酶抑制剂。同时，建议检查Western Blot过程，提高一抗浓度。对于加蛋白酶抑制剂来说，一般加PMSF就可以了，最好能多加几中种蛋白酶抑制剂。
E. 同一蛋白样品能同时进行两种因子的Western Blot检测吗？
解答：当然可以，有的甚至可以同时测几十种样品。
F. 如果目标蛋白是膜蛋白或是胞浆蛋白，操作需要注意什么？
解答：如果是膜蛋白和胞浆蛋白，所用的去垢剂就要温和得多，这时最好加上NaF去抑制磷酸化酶的活性。
G. 我的样品的蛋白含量很低，每微升不到1微克，但是在转膜时经常会发现只有一部分蛋白转到了膜上，就是在转膜后染胶发现有的孔所有的蛋白条带都在，只是颜色变淡了，有什么办法可以解决？
解答：你可以加大上样量，没有问题，还有转移时你可以用减少电流延长时间，多加5－10％甲醇。
H. 想分离的蛋白是分子量260kd的，SDS-PAGE电泳的分离胶浓度多大合适？积层胶的浓度又该用多少？这么大分子量的蛋白容易作Western Blot吗？
解答：260kd的蛋白不好做，分离胶用6％，Stacking Gel 3.5％。
I. 如果上样量超载，要用什么方法来增加上样量？如果需要加大上样量使原来弱的条带能看清楚。
解答：可以浓缩样品，也可以根据你的目标分子量透析掉一部分小分子蛋白。一般地，超载30％是不会有问题的。如果已经超了不少了，而且小分子量的也要，可以考虑加大胶的厚度，可以试试 1.5mm的comb。J. 蛋白变性后可以存放多久？
解答：－80℃，一两年没有问题。最关键两条：不要被蛋白酶水解掉；不要被细菌消化掉(也是被酶水解了)。
K. 我所测定的蛋白分子量是105KD，按理说分离胶应当采用7.5%，但我所查资料却要求分离胶和浓缩胶均采用11％的配方，不知为何？
解答：上述您提到的两种凝胶均可以使用，因为105ＫＤ的蛋白在上述两种胶的线性分辨范围内，但需注意条带位置。
L. 接下来我准备采用DAB显色技术，二抗是生物素化的多克隆抗体，三抗是亲和素生物素体系，不知采用这样的方案后，封闭液是否要作调整，能否再用5％的脱脂奶粉呢？好像有资料说脱脂奶粉会影响亲和素生物素的生成，是吗？
解答：不能使用脱脂奶粉，因为脱脂奶粉中含生物素，用ＢＳＡ代替应该好一点．
M. 还有一问题，一般一次上样的蛋白总量是多少，跟目的蛋白的表达量有关系吗？
解答：Western Blot一般上样30－100微克不等，结果跟目的蛋白的丰度、上样量、一二抗的量和抚育时间都有关系，也与显色时间长短有关。开始摸条件时，为了拿到阳性结果，各个步骤都可以量多一点时间长一点，当然背景也就出来了。要拿到好的结果，如果抗体好的话比较容易，抗体不好的话就需要反复地试
了，当然有的不适合Western Blot的怎样做也不行。所以拿到好的结果不容易。
N. 做组织样品的western的时候，处理样品有什么诀窍吗？还有，您用过大牛血清做封闭剂吗？浓度如何？效果是不是比BSA好一点？
解答：必须进行研磨、匀浆、超声处理，蛋白质溶解度会更好，离心要充分，膜蛋白需用更剧烈的方法抽提，低丰度膜蛋白可能还要分步抽提(超速离心)。还有一点就是组织中的蛋白酶活性更强，需要注意抑制蛋白酶的活性（加入ＰＭＳＦ和蛋白酶抑制剂cocktail），封闭剂一般5%脱脂奶粉较常用。如果一抗为多克隆抗体，使用ＢＳＡ也是不错的选择。
O. 您是否可以介绍一下大分子量蛋白200KD，在做western要注意什么呢？
解答：做200kd蛋白的Western Blot时要注意，分离胶最好选择>7%的；剥胶时要小心；转移时间需要相应延长；要做分子量参照（否则出现杂带不知道如何分析）。
P. 有什么方法可以提高上样量？
解答：可以浓缩样品；增大上样体积来增大上样量。
Q. 我要检测的目的蛋白是分子量大概为42kd的膜蛋白，膜蛋白提取可不可以不用到超速离心机，有没有直接用低温高速离心机就可以的提到膜蛋白的方法，42kd的蛋白分子量算不算大？
解答：如是需要提取膜蛋白，（而不是只需要提取膜蛋白），可以用Ripa buffer提取膜蛋白和胞浆蛋白，用这个做Western Blot就可以了。如果是非要只提取膜蛋白就要用到超速离心机。42kd 不算大，也不算小，所以，可以按照一般的转移方法实施。
R. 蛋白的上样量有没有什么具体的要求？
解答：上样量要根据实验的要求来定，如果要求是定量和半定量的Western Blot 则上样量要均等，如果只是要定性，则没有太大的关系，尽量多上就行了，但是不要超过0.3μg/mm2。
S. 一抗，二抗的比例是否重要？
解答：比较重要，调整好一抗，二抗的比例，可以去掉部分非特异的本底。
3. 抗体
做细胞信号传导，要做磷酸化某因子Western Blot，其二抗有何要求？
解答：对二抗无要求，要看你实验条件来选择，一般推荐用HRP标记的二抗。
U. 同一公司的另外抗体用这个稀释度做出来效果很好，所以没做预试，怕费时间，用什么样的稀释度比较好呢？我用的ELL+plus试剂盒显色。转膜过夜，一抗孵育也是过夜的，若封闭也过夜的话就要四天才看的到结果了。
解答：不同抗体，即使是同一公司的抗体，其最佳的抗体稀释度也是不一样的，需要你实验摸索。我觉得转膜过夜好像没有必要吧，转膜的目的也就是将蛋白转到膜上就行啦，何必浪费时间呢。至于具体的转膜时间，还要看你的目的蛋白分子量的大小；转膜的设备，是半干式，还是湿式。一抗当然可以过夜，如果你想所短Western Blot时间的话，可以增高一抗的孵育温度，我们实验室一般37度，两小时就足够了；你可以参照抗体说明书。至于一抗和二抗得稀释度，你可以一抗1：1500；二抗1：20000试试。另外建议你洗膜时，多洗几次，最好是在封闭；一抗和二抗后至少是5x5min，跑一张好膜不容易，多尽点心吧，这样不会浪费你的时间，只会节省你的时间！
V. 免疫组化和Western Blot可以用同一种抗体吗？
解答：免疫组化时抗体识别的是未经变性处理的抗原决定簇（又称表位），有些表位是线性的，而有的属于构象型；线性表位不受蛋白变性的影响，天然蛋白和煮后的蛋白都含有；构象型表位由于受蛋白空间结构限制，煮后变性会消失。如果你所用的抗体识别的是蛋白上连续的几个氨基酸，也就是线性表位，那么这种抗体可同时用于免疫组化和Western，而如果抗体识别构象形表位，则只能用于免疫组化。一般抗体说明书上都有注明此种抗体识别的氨基酸区间。（限于单抗）
W. Western Blot 中抗体的重复应用问题
解答：抗体工作溶液一般不主张储存反复使用，但是如抗体比较珍贵，可反复使用2－3次。稀释后应在2－3天内使用，4度保存，避免反复冻融。
4. 滤纸、胶和膜的问题
X. NC膜\ PVDF膜\ 尼龙膜怎样鉴别？
解答：尼龙膜是较理想的核酸固相支持物，有多种类型；硝酸纤维素膜是目前应用最广的一种固相支持物，价格最便宜；PVDF膜介于二者之间。
就结合能力而言：尼龙膜结合DNA和RNA能力可达480－600μg/cm2，可结合短至10bp的核酸片段；硝酸纤维素膜结合DNA和RNA能力可达80－100μg/cm2，对于200bp的核酸片段结合能力不强；PVDF膜
结合DNA和RNA能力可达125－300μg/cm2。
就温度适应性而言：尼龙膜经烘烤或紫外线照射后，核酸中的部分嘧啶碱基可与膜上的正电荷结合；硝酸纤维素膜依靠疏水性相互作用结合DNA，结合不牢固；PVDF膜结合牢固，耐高温，特别适合于蛋白印迹。就韧性而言：尼龙膜较强；硝酸纤维素膜较脆，易破碎；PVDF膜较强。
就重复性而言：尼龙膜可反复用于分子杂交，杂交后，探针分子可经碱变性被洗脱下来；硝酸纤维素膜不能重复使用；PVDF膜可以重复使用。
Y. 在做Western Blot时，PBDF膜用甲醇浸泡的目的？
解答：PVDF膜用甲醇泡的目的是为了活化PVDF膜上面的正电基团，使它更容易跟带负电的蛋白质结合，做小分子的蛋白转移时多加甲醇也是这个目的。
Z. 检测磷酸化的JNK 和非磷酸化的JNK可以在同一张膜上吗？
解答：可以。
AA. 转膜后经丽春红染色的条带，为什么大蛋白分子的一端（即点样空的一侧）的转膜好象不是很好，为什么？
解答：这是正常的，大分子的蛋白转移的慢，你延长转移时间和电流，大分子一端就会好的多，但是小分子的就有可能会变淡。
BB. 我想问您裂解细胞用三去污裂解法，还是用上样缓冲液？
解答：用上样缓冲液，这样有几个好处，可以提取总蛋白，同时又可以让磷酸化酶失活。
CC. 采用tank system有什么讲究？
解答：建议低电压，长时间，（一般tank System 用衡压好点），如28V 14－16hrs。
DD. 做HSP WESTEN定量，同样的抗体免疫组化能做出，而WESTEN却不能？
解答：这多半是抗体的问题，要看抗体的说明，是否能做Western Blot和IHC。
EE. 膜一般要如何处理？
解答：一般用甲醇泡泡就可以了。
FF. 如果是6×8转印膜，要加多少一抗？
解答：一抗的稀释度是有说明的，根据你的一抗看看就知道了，但是那么大的膜孵育体积一般最少为3－5ml。
GG. 上下槽缓冲液有何要求，怎样才能达到最佳效果。
解答：无要求。
HH. 跑电泳的时候配的胶总是“缩”是什么原因呢？是有的成分不对吗？
解答：没什么问题，就是你胶里的水分被蒸发了。过夜时拿保鲜膜包起来，在里面加点水保持湿度就可以了。如果过夜，胶里的水分被蒸发，采用保鲜膜包上也可以；也可能母液（30%聚丙酰胺）有问题，你可以重新配制一份观察；能够替换的试剂，尽量换一下，选用好的试剂，避免找问题麻烦。脱色液中甲醇的含量太高也会造成胶缩。
II. 膜、滤纸、胶大小有何讲究？
解答：如果是用的是半干转，顺序为：阴极－》滤纸－》胶－》膜－》滤纸。滤纸的长宽分别比胶小1－2mm，而膜的长宽分别比胶大1－2mm。绝对禁忌：上下两层滤纸因为过大而相互接触，这样会短路，电流不会通过胶和滤纸。
JJ. 蛋白质的分子量跨度很大，如要分离小21KD，中至66KD，大至170KD，可以一次做好吗？
解答：这么广的分布不好转移，一般建议：21kd和66kd可以一起转，12％SDS-PAge，湿转36V ，3－5hrs就可以了，可以根据你实验室的经验调节；170kd 用7%SDS－page，48V 10hrs－16hrs。
KK. 不能很好地将大分子量蛋白转移到膜上，转移效率低怎么样解决？
解答：可以考虑：转移缓冲液中加入20%甲醇（是指终浓度）(优化的转移缓冲液，可以参考《蛋白质技术手册》)，因为甲醇可降低蛋白质洗脱效率，但可增加蛋白质和NC膜的结合能力，甲醇可以防止凝胶变形，甲醇对高分子量蛋白质可延长转移时间；转移缓冲液加入终浓度0.1%SDS，也是为了增加转移效率；用优质的转移膜，或使用小孔径的NC膜（0.2微米）；使用戊二醛交联；低浓度胶，如低至6％。太大时还可以考虑用琼脂糖胶；提高转移电压／电流；增加转移时间。
LL. 如何选择最合适的蛋白杂交膜？
解答：蛋白质印迹杂交是分子生物学实验中极为常用的一门技术。选择质量上层、合乎要求、方便适用的杂交膜是决定这项实验成败的重要环节。根据杂交方案、被转移生物大分子的特性以及分子大小等等因素，
我们要量体裁衣，从杂交膜的材质、孔径和规格上都要做出合理的选择。
硝酸纤维素膜：硝酸纤维素膜是蛋白印迹实验的标准固相支持物。在低离子转移缓冲液的环境下，大多数带负电荷的蛋白质会与硝酸纤维素膜发生疏水作用而高亲和力的结合在一起，虽然这其中的机制还不是十分清楚，但由于硝酸纤维素膜的这个特性，而且易于封闭非特异性结合，从而得到了广泛的应用。在非离子型的去污剂作用下，结合的蛋白还可以被洗脱下来。根据被转移的蛋白分子量大小，要选择不同孔径的硝酸纤维素膜。因为随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量蛋白的结合就越牢固。但是膜孔径如果小于0.1mm，蛋白的转移就很难进行了。因此，我们通常用0.45μm和0.2μm两种规格的硝酸纤维素膜。大于20kD的蛋白就可以用0.45μm的膜，小于20kD的蛋白就要用0.2μm的膜了，如果用0.45μm的膜就会发生“Blowthroμgh”的现象。从膜的质地上来看，最重要的指标就是单位面积上能够结合的蛋白的量。硝酸纤维素膜的结合能力主要与膜的硝酸纤维素的纯度有关，市场上有些硝酸纤维素膜通常会还有大量的醋酸纤维素，因而降低了蛋白的结合量。S&S公司采用的是100%纯度的硝酸纤维素，保证了最大的蛋白结合量，可达80-150μg/cm2。由于100%的纯度，因而也大大减少了非特异性的结合，降低杂交背景，无需高严谨度的洗脱步骤。其次，膜的强度和韧性也是需要考虑的因素。常规的硝酸纤维素膜比较脆，漂洗一两次就会破损，不能反复使用。
PVDF转移膜：PVDF是一种高强度、耐腐蚀的物质，通常是用来制造水管的。PVDF膜可以结合蛋白质，而且可以分离小片段的蛋白质，最初是将它用于蛋白质的序列测定，因为硝酸纤维素膜在Edman试剂中会降解，所以就寻找了PDVF作为替代品，虽然PDVF膜结合蛋白的效率没有硝酸纤维素膜高，但由于它的稳定、耐腐蚀使它成为蛋白测序理想的用品，一直沿用至今。PVDF膜与硝酸纤维素膜一样，可以进行各种染色和化学发光检测，也有很广的适用范围。这种PVDF膜，灵敏度、分辨率和蛋白亲和力在精细工艺下比常规的膜都要高，非常适合于低分子量蛋白的检测。但PVDF膜在使用之前必需用纯甲醇进行浸泡饱和1-5秒钟。
离子交换型转移膜：硝酸纤维素和PVDF膜是靠疏水作用结合蛋白的，还有一类膜是根据离子交换的方式结合生物大分子的。由DEAE（二乙氨乙基）修饰的纤维素制成的DEAE阴离子交换膜同样可以作为蛋白质印迹的固相支持物。DEAE可以有效的结合阴离子基团，包括那些高于其等电点的蛋白质。在pH10以下，DEAE基团都能带电荷，在低离子强度的转移液中结合蛋白分子。其最适的pH环境为5-7。DEAE膜可以用于蛋白多糖、病毒、酶以及血红蛋白的研究。这种0.45μm孔径的DEAE膜，除了可以做Western Blotting 外，还可以用于核酸结合研究。
还有一种离子交换型膜是羧甲基（CM）修饰的纤维素膜，它可以结合蛋白和多肽分子，以及其他的一些带正电荷的样品，最适结合pH范围在4-7。结合的多肽分子可以从CM膜上洗脱下来，用于氨基酸系列分析或微测序。
5. Marker的相关疑问
MM. 我用的是可视marker（BIO_RAD），但是电泳总跑不全8条带，请问什么原因？怎样改善？胶用过8％，10％，12％，都是这样。marker是新买的。
解答：一般来说，是小分子量Marker跑走了，增加胶浓度或减少电泳时间试试看。当然梯度胶也是不错的选择。
NN. 用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd组成的marker。开始做Western Blot时还能够看到marker，当然也仅能看见其中最多三条带。用80V进行SDS-PAGE电泳，用恒压10V45min转印的。前几次做Western Blot时没有进行丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是30KD的条带出现。再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析，用培养基样品进行分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体（Anti-V5-HRP）。但就是出不来结果，我很茫然。谢谢您过给予指点！
解答：1、“我用的是Roche molecular Biochemicals公司的由100kd，75kd，45kd，30kd，20kd，10kd组成的marker。开始做Western Blot时还能够看到marker，当然也仅能看见其中最多三条带。”有的时候，Prestained Marker 放久了效果就会变差，电泳是条带不清晰，扩散。但是你的问题可能还有其他的方面的问题，可能是蛋白跟膜结合的不紧密。转移是多加点甲醇。
2、“前几次做Western Blot时没有进行丽春红染色，但尽管用了此方法也仅能看到marker有一条大约是
30KD的条带出现。”转移时半干法建议用恒流，你这样的也就30kd-50kd的转移地比较好。
3、“再就是把70KD和130KD两个目的蛋白同时在一块胶上进行分析，用培养基样品进行分析，没有用间接法，而是直接用融合蛋白C端的V5表位的酶联抗体（Anti-V5-HRP）。”
是否检测了表达量，二抗是否是好的，你做了阳性对照？你要做这么大的蛋白最好转移时间延长到1.5hrs。
6. 染色的选择
OO. Western Blot哪种染色好？
解答：（1）阴离子染料是最常用的，特别是氨基黑，脱色快，背景低检测极限可达到1.5μg，考马虽然与氨基黑有相同的灵敏度，但脱色慢，背景高。丽春红S和快绿在检测后容易从蛋白质中除去，以便进行随后的氨基酸分析。缺点是：溶剂系统的甲醇会引起硝化纤维素膜的皱缩或破坏。不能用语正电贺的膜。灵敏度低。
（2）胶体金，灵敏度高，检测范围可到pg级，但染色比稳定。
（3）生物素化灵敏度位于1、2之间，可用于任何一种膜。
7. 参照的疑问
PP. 是否Western Blot实验半定量一定要加ACTIN内参？
解答：对于发表文章的实验最好加内参，实验严谨。
QQ. 用BANDSCAN分析结果行吗？
解答：分析一般的结果没问题。
RR. 核内抗原Western Blot内参选择什么合适？
解答：可以选用组蛋白，组蛋白在细胞核中的表达是很稳定的，有很多都可以当成内参，在网上查查就可以选出你要的内参。
SS. 转膜时采用电流是否比电压准确，是否根据0.8mA/cm2，一般1小时左右？
解答：不是的，半干法推荐用恒流，一般根据目的蛋白的大小来确定电流和时间。
TT. 做半定量人卵巢癌细胞系的Western Blot，内参B-actin，GAPDH，那个好？
解答：选用beta-actin就可以。
8. 缓冲液配方的常见问题
UU. 转膜后的脱脂奶粉封闭时，所用的防沫剂A是什么？还有Tris-HCl是不是就是用Tris和盐酸配出来的呢？
解答：转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉。Tris－HCl就是Tris盐用HCl调ph值，配置而成。
VV. 准备做大鼠脑子的Western Blot，蛋白质位于细胞核中，请问此蛋白质的提取液及操作方法是？每一步都必须要低温吗？这种蛋白质是磷酸化的蛋白质，操作时如何防止去磷酸化的发生？
解答：可以用提取总蛋白的buffer提核蛋白，可以加NaF防止去磷酸化。
WW. 想问一下细胞裂解液选择蛋白酶抑制剂时有什么原则吗？受不受组织来源的影响？胞膜和胞浆有区别吗？
解答：一般来说提取时加入光谱的蛋白酶抑制剂就可以了，操作时保持低温。除非有文献特别指明用特殊的方法，一般来说都没有区别。
XX. 最近作了两次Western Blot，不但没阳性结果，显色背景都没有，电泳和转膜都染过，有条带。底片和显色液及DAB显色液均试过，没问题。1、检测GAD--分子量67kd，提取液有蔗糖，其余同三去污裂解液。蔗糖不会有影响把？样本--20度放置一周内测。2、一抗放置2年，可能效价不高！用的是1:100。如果是一抗的原因，不会背景都没有把？3、第一次有不均匀背景，因为一抗过夜时密封袋不均匀。后两次无背景显色。4、封闭液用的是含15%脱脂奶粉TBST，漂洗液用的是含1%BSA的TBST液，TWEEN-20为0.1%，不会是封闭液的问题吧？
解答：可以在下面几个问题上找找原因。1. 封闭液用5％Milk，漂洗液（washing buffer 用TBST）2. 看看一抗是否能work，降到1：20。3. 看看二抗是否有问题。
YY. 加甲醇的目的是什么？
解答：加甲醇起着一定的固定作用，因为小分子蛋白质容易转出去.(特别是在硝酸纤维素膜上，因为NC膜结合蛋白质的能力较弱)。
ZZ. “转膜后的脱脂奶粉封闭液是5%的TBST脱脂奶粉”，其中TBST最后那个T是Tween吗，浓度多大？解答：是Tween，配方如下:Tris-Buffered Saline Tween-20 (TBST), Dissolve 8.8g of NaCl，0.2g of KCl，and 3g of Tris base in 800ml of distilled H2O, Add 500ul of Tween-20, Adjust the pH to 7.4 with HCl, Add distilled
H2O to 1L, Sterilize by autoclaving.
AAA. 封闭，一抗，二抗时的温度有没有什么规定呢，比如现在我就在室温里做，或者要在4度下?
解答：均可在室温进行，如果时间不够，一抗孵育可以先在室温进行一个小时，然后4度过夜。
BBB. 实验室暂无NP40我用sds可以吗？另外有过用尿素和硫脲提取膜蛋白吗？配方如下：7M 尿素，2M 硫脲，Triton-x-100 0.2ml，新鲜加入：65mM DTT
蛋白酶抑制剂：试剂盒HaltTM Protease inhibitor cocktail kit 1%(v/v)
是用于抽提双向电泳用蛋白的配方。不止用于抽提细胞全蛋白（主要是想得到其中的膜蛋白）是否可行？改良的RIPA裂解缓冲液(Tris.HCl，50 mmol/L，pH 7.5; NaCl，150 mmol/L; NP-40，1%; 脱氧胆酸钠，0.5%; SDS，0.1%; EDTA，1 mmol/L; PMSF，1 mmol/L; Leupeptin，2 μg/ml)不知对于膜蛋白效果如何？此外该方中的EDTA，是否用做蛋白酶抑制剂？
解答：做２－Ｄ绝对不推荐使用ＮＰ－４０（因为即使进口的ＮＰ－４０也不纯，，其中的杂质会影响质谱结果）。对于动物细胞，其蛋白酶活性较弱（相对于组织和大肠杆菌等），可以不使用cocktail，因为7M 尿素＋２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ构成的变性环境已经足以抑制大部分蛋白酶的活性，２Ｍ硫脲＋４％ＣＨＡＰＳ对于抽提膜蛋白有很大的帮助，不过如果您专职做膜蛋白建议采用分级抽提法。此外还可以采用梯度离心法和一些基于去垢剂的方法。ＥＤＴＡ用于灭活金属蛋白酶（主要是其鏊合作用）。加过多的蛋白酶抑制剂可以导致蛋白质的修饰，做ＷＢ无所谓，做ＭＡＩＬＤＩ时会给正确鉴定带来麻烦。裂解缓冲液中少了两性电解质(在2-D裂解缓冲液中，两性电解质起的作用：提供连续的PH梯度，从很大程度上增加蛋白质的溶解性;还可以去除一部分核酸)；也不推荐采用SDS，因SDS会与蛋白质结合导致其等电点发生改变，如果您实在要用，终浓度降到0.1%以下。
METHOD2
（50ml总量）：?-mercaptoethanol 342 μl；20% SDS 5 ml；Tris-Cl pH 6.7 3.125 ml；加ddH2O至50 ml。方法：将用过的膜浸入stripping buffer中，置
50℃水浴箱中30min，间断振摇。之后用TTBS洗3*5min就好。此时你已经可以按新的转移好的膜来再次使用了。
该方法的优点：省事，省力，省钱，符合国际惯例。
METHOD3
1、beta-metaptoethanol 35ul
2、10%SDS 1ml
3、tris ( 0.5M，pH6.7) 625ul
4、dH2O 3.34ml
50 -55℃，30min。
METHOD4
stripping buffer应该是可以放置很久的。不过我习惯于现配——毕竟，加了β-mercaptoethanol 以后太难闻了，配了就用；而且，有了现成的Tris-HCl缓冲液和SDS的母液，现配还是很方便的。每次用量5ml少了点，我每次用50ml。
westernblot详细图解
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测的方法。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。 经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以
检测电泳分离的特异性目的基因表 达的蛋白成分。该技术也广泛应用 于检测蛋白水平的表达。 实验材料蛋白质样品 试剂、试剂盒丙烯酰胺SDS Tris-HCl β-巯基乙醇 ddH2O 甘氨酸Tris 甲醇PBS NaCl KCl Na2HPO4 KH2PO4 ddH2O 考马斯亮兰乙酸脱脂奶粉硫酸镍胺H2O2 DAB试剂盒 仪器、耗材 电泳仪电泳槽离心机离心管硝酸纤维素 膜匀浆器剪刀移液枪刮棒 实验步骤一、试剂准备 1. SDS-PAGE试剂：见聚丙烯酰胺凝胶电泳实验。 2. 匀浆缓冲液：1.0 M Tris-HCl(pH 6.8) 1.0 ml；10%SDS 6.0 ml；β-巯基乙醇0.2 ml；ddH2O 2.8 ml。 3. 转膜缓冲液：甘氨酸2.9 g；Tris 5.8 g；SDS 0.37 g；甲醇200 ml；加ddH2O定容至1000 ml。
奇门遁甲怎样起局问卜
奇门遁甲怎样起局问卜 奇门遁甲怎样起局问卜 一:起卦时所依据的时间归属:[1]年月日时的天干地支[2]用事时辰在24节令中归属哪个节令[3]此时此刻在奇门遁甲中属阳遁还是阴遁[4]在阴或阳遁九宫十八局上中下三元中的哪一元[5]在日期距局象超前.或退后.或适逢的情况下你是选择置润或坼补 二:确定上述大条件后,一般地说在没有专业工具的情况下用笔在纸上谈兵起局[1]先画井字格或米字格,然后按阴阳遁阳顺阴逆排列出当时用局的位置在几宫确定地盘:戊.已.庚.辛.壬.癸.丁.丙.乙.(五宫寄生二宫)[2]然后找出当时天盘大值符值班星宿(六甲之一)在几宫并把它转加临在地盘时辰的天干上,这样天上九星位置就确定了[3[八门中当时值始门在人盘里是随天盘时干宫转走在哪里就定位在那里[4]鼑盘小值符八神是随大值符定位后按阳逆阴顺的办法妥善安置[5]纸上起局好了以后就要查看一下当时当地的地理方位,这点非常重要,不要分不清东南西北闹笑话 好啦!奇门遁甲的用事起局就这么简单,但怎么样去分析研究判断用事局象,那里的学问可就大啦,今天就谈到此为止吧.奇门定局 一、定局概述
我国古代把每天二十四个小时分为子、丑、寅、卯、辰、巳、午、未、申、酉、戍、亥十二个时辰，每个时辰相当于现在的两个小时。时家奇门是一个时辰一个格局，按奇门历法，每年冬至上元到第二年冬至上元为一个循环，总共是360日。每天十二个时辰，一个时辰一个格局，全年的局数是12＊360＝4320，为四千三百二十局。但在这4320局中，实际上每一局是重复了四次的。拿阳遁一局来说，冬至上元、惊蛰上元、清明中元、立夏中元，都完全一样，皆属于阳遁一局。这四个元共二十天，但落实到时家奇门排局，其格局类型以每个时辰一个格局计算，并不是12＊20＝240，而是12＊20/4＝60（因每一局重复了四次）。即六十个格局，正好占据了从甲子到癸亥这十天干与十二地支的六十种结合。阳遁一局是如此，其它各局也无不如此，即都重复了四次。所以全年360日，4320个时辰，因为就格局讲都重得了四次，全年时辰的格局类型则为4320/4＝1080（局）。这就是传说的黄帝命风后创立的一千零八十局。又据说传到姜太公吕望时，将这一千零八十局简化为七十二局。这七十二局不难理解，因按二十四节气论算，每个节气为十五天，一节又分上、中、下三元，每元为五天。一节三元，全年二十四节气的元数则是3＊24＝72。 全年1080个局，但并不是每一局都要用一个盘去演示，如果用活盘演示，每个活盘可演示从甲子到癸亥60个时辰
WB实验步骤
Western blotting实验步骤 1．蛋白质的样品制备： 取心肌组织50mg，待组织块自行溶解，用滤纸吸去其表面水分，将组织块放入玻璃匀浆器球状部位，用组织剪尽量将其剪碎，将剪碎的心肌组织放入玻璃匀浆器的杆状部，按1mlRIPA+10ulPMSF/100mg心肌组织的比例加入RIPA和PMSF（先加RIPA再加PMSF），将玻璃匀浆器插入冰中，匀浆约30分钟。 将心肌组织匀浆转移到离心管中，4℃12000g离心5分钟，收集上清（如有粘稠物进一步用超声处理），样品分装冻存于-20℃备用。 2 .测定蛋白浓度： 2.1 按50：1配置BCA工作液。 2.2 10ulC液（蛋白标准）+90ulPBS液稀释成0.5mg/ml的蛋白标准液。 2.3 分别以0、1、2、4、8、12、16、20ul将蛋白标准液加入96孔板的第1~8标准孔中，在其他样品孔中加入10ul待测样品。 2.4 分别加PBS定容至20ul。 2.5 各孔中加入200ulBCA工作液，室温放置2小时。 2.6 用酶标仪测定蛋白浓度：测定A562，依标准曲线算出蛋白浓度。 3 SDS-PAGE电泳： 3.1 制胶: 按比例配制分离胶，缓缓地摇动溶液，使激活剂混合均匀，将凝胶溶液平缓地注入两层玻璃极中，再在液面上小心注入一层水，以阻止氧气进入凝胶溶液中，静置40min。同前按比例配制浓缩胶，但混匀溶液时不要过于剧烈以免引入过多地氧气。吸去不连续系统中下层分离胶上的水分，连续
平稳的注入凝胶溶液，然后小心插入梳子并注意不得在齿尖留有气泡，静制60min以上以保证完全聚合。 3.2 预电泳：将聚合好的凝胶安置于电泳槽中，小心拔去梳子，加入电泳缓冲液后低电压10-20V的预电泳20-30min。（目的是清除凝胶内的杂质，疏通凝胶孔径以保证电泳过程中电泳的畅通）。 3.3 样品准备：首先计算上样体积，然后按样品：上样buffer=4：1的比例加入上样bufer混匀，沸水煮10分钟，冰上5分钟。 3.4 加样：预电泳后依次加入标准品（Marker）和待分析样品。（加样时间要尽量短，以免样品扩散，可在未加样的孔中加入等量的样品缓冲液避免边缘效应。每个泳道加5ul。 3.5 电泳：加样完毕，选择80V恒压进行电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿到达两胶交界处（一般约20分钟），更换至100V恒压电泳，电泳直至溴酚蓝染料前沿下至凝胶末端处，即停止电泳（一般约为1小时20分钟）。 4．转膜： 4.1 切胶：将电泳完毕的胶完整的放在盛有电转液的玻璃皿中，将目的蛋白所在区域切下来，测量其长宽，并记录。 4.2 剪膜和滤纸：按胶的尺寸剪膜和滤纸（滤纸长宽较凝胶小0.5~1mm，PVDF 膜长宽较凝胶大0.5~1mm），滤纸浸入盛有电转液的玻璃皿中10秒钟，膜放入盛有10%甲醇的玻璃皿中10秒钟，然后将两者都放入盛有去离子水的玻璃皿中3分钟，进一步放入盛有电转液的玻璃皿中3分钟。 4.3 向电转槽中倒入部分电转液，将海绵浸入。按如下顺序制作“三明治”（注意避免两边滤纸相互接触，以免发生短路）。从正极到负极按如下顺序排列：
westernblot实验详细步骤(1)
Western Blot实验技术一、制胶 SDS-PAGE分离胶配方表 1、检查制胶器是否漏水，吸干玻璃中水分
2、配置分离胶，加入玻璃板中（注意：不能有气泡和杂物），距离玻璃上口1.5mL停止加胶。 3、再加ddH2O或异丁醇水封除去气泡，凝胶后倒掉水，吸干水到浓缩胶插梳。 二、上样 1、先在内槽加满电泳液才可以拔梳子。 2、拔梳子时垂直向上拔出，不可左右摇晃梳子。 3、拔完梳子后观察梳子孔，是否有缺口和歪，用针头拨正。 4、上样时从左到右依次上样。 5、若上样组不多时，左右第一孔不加样。 6、要预留Marker的上样孔。 三、电泳 四、转膜
PVDF膜即聚偏二氟乙烯膜（polyvinylidene fluoride）是蛋白质印迹法中常用的一种固相支持物。PVDF膜是疏水性的，膜孔径有大有小，随着膜孔径的不断减小，膜对低分子量的蛋白结合就越牢固。 （转膜缓冲液：需4度预冷，现配现用，不能放太久。） 1、转印滤纸：全胶长8.5cm，宽5.5cm，需剪裁成7层滤纸，压平后约3mm。需在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 2、海绵垫：在转膜液中平衡浸泡备用。 3、PVDF膜：剪裁8.5cm*5.5cm ，需在甲醇中浸润2min（活化膜上正电基团），然后在转膜缓冲液中平衡浸泡备用。 4、凝胶：凝胶也需要在预冷的转膜转膜缓冲液中平衡浸泡3－5分钟。否则在转膜过程中会出现皱缩，导致出现转移的条带变形。 三明治夹心法：负极（黑）-海绵垫-滤纸-胶-PVDF膜-滤纸-海绵垫-正极（白） 转膜时间：通电恒流，60V，一个槽100mA左右，1h
（注意：在操作过程中用玻棒赶走气泡。 装置转膜仪时注意黑对黑（负对负），白对红（正对正）。 装置运行时需冰浴。） 五、封闭 在进行抗体杂交之前，需要先对转印膜进行封闭，以防止抗体对非转印蛋白区域的非特异性吸附。 封闭一般采用异源性蛋白质或去污剂，本实验室常用的有5%BSA，10%脱脂奶等，至于选择哪一类封闭液，首先应考虑与检测目的相适应（做l酪氨酸磷酸化时不推荐non-fat milk 封闭）。 1、将脱脂奶粉封闭液（1xTBST:脱脂奶粉=20mL：2g一块膜用量。牛血清蛋白、5%BSA 效果更好）倒好。 2、将PVDF膜取出放入封闭液中，盖子改好。 3、封膜一般常温1-2小时即可，也可4℃封闭过夜。 六、一抗 抗体反应主要采用间接法: 即先加入未标记特异性一抗与膜上抗原结合后，再加入标记的二抗进行杂交检测，标记二
Westernblot基本操作步骤
W e s t e r n b l o t基本操作步骤 一、细胞蛋白的提取 弃去培养基，加入预冷的PBS洗一遍，加入的RIPA裂解液（含1mM PMSF(100×)，每10ml加蛋白酶抑制剂和磷酸酶抑制剂各一片，六孔板每孔150-250μl，60mm×15mm 培养皿300-400μl，），于冰上裂解约5分钟，裂解总液12000rpm离心10 min。取上清，用BCA法测定蛋白浓度。用于western blot的蛋白样品取一定量加4×loading buffer，10×reducing，再用裂解液补齐到所需上样体积。离心，使蛋白沉底。将EP管于沸水中煮5min，变性，之后再离心后准备上样。 二、BCA法测蛋白浓度操作步骤 将蛋白标准配制溶液溶解蛋白标准（BSA），配制成5mg/ml的蛋白标准溶液，10μl 分装，-20℃冷冻保存。 完全溶解蛋白标准品，取10μl用PBS稀释至100μl，使终浓度为0.5mg/ml。 据样品数量，按50体积BCA试剂A加1体积BCA试剂B(50:1)配制适量BCA工作液，充分混匀。BCA工作液室温24小时内稳定。 将标准品按0, 1, 2, 4, 8, 12, 16, 20μl加到96孔板的标准品孔中，加稀释标准品的溶液补足到20μl。 加适当体积样品到96孔板的样品孔中（可以通过预实验摸索稀释倍数），加PBS 到20μl。 各孔加入100μl BCA工作液，37℃放置30分钟。 测定580nm条件下吸光度。根据标准曲线计算出蛋白浓度。 三、Western blot基本操作步骤 1、溶液配制： ①Runnig Buffer(1×)：SDS Runnig Buffer（20×）50mL，加MiliQ水至1L； ②Transfer Buffer(1×): Transfer Buffer(10×)100mL,甲醇200mL（20%，v/v），加MiliQ水至1L； ③TBST缓冲液 1M Tris·HCl（pH7.6）：60.5g Tris-base，加入约30ml浓盐酸，调PH至7.6，加MiliQ 水至500ml。 TBS缓冲液（10×）：1M Tris·HCl 100ml+80g NaCl加MiliQ水1L TBST缓冲液（1×）：TBS缓冲液（10×）100ml+0.5ml Tween-20（0.05%，v/v），加MiliQ水至1L。 ④封闭液：5% BSA（5g/100ml，称取1g BSA至20ml TBST，充分混匀溶解） 2、样品准备与加样 ①用4×SDS loading buffer, 10×reducing与蛋白质样品混合，并将此EP 管放在水浴锅中沸水煮5min，使蛋白质变性。 ②将预制胶固定到电泳装置中，并在装置中加满Runnig Buffer(1×)，内槽加入0.5mL 抗氧化剂，小心拔下梳子； ③向上样孔中加入一定体积的蛋白样品（总蛋白量20μg以上）。向marker孔中加入2.5μl marker（按照实验要求设定marker量），向空白孔中加入一定体积的加样缓冲液(loading buffer)。注意采用相同（或相近）的上样体积，以保证蛋白的各带宽度相同。防止体积较大的上样孔中的蛋白质将向相邻的泳道扩散。 3、电泳
动态规划讲解大全(含例题及答案)
动态规划讲解大全 动态规划(dynamic programming)是运筹学的一个分支，是求解决策过程(decision process)最优化的数学方法。20世纪50年代初美国数学家R.E.Bellman等人在研究多阶段决策过程(multistep decision process)的优化问题时，提出了著名的最优化原理(principle of optimality)，把多阶段过程转化为一系列单阶段问题，逐个求解，创立了解决这类过程优化问题的新方法——动态规划。1957年出版了他的名著Dynamic Programming，这是该领域的第一本著作。 动态规划问世以来，在经济管理、生产调度、工程技术和最优控制等方面得到了广泛的应用。例如最短路线、库存管理、资源分配、设备更新、排序、装载等问题，用动态规划方法比用其它方法求解更为方便。 虽然动态规划主要用于求解以时间划分阶段的动态过程的优化问题，但是一些与时间无关的静态规划(如线性规划、非线性规划)，只要人为地引进时间因素，把它视为多阶段决策过程，也可以用动态规划方法方便地求解。 动态规划程序设计是对解最优化问题的一种途径、一种方法，而不是一种特殊算法。不象前面所述的那些搜索或数值计算那样，具有一个标准的数学表达式和明确清晰的解题方法。动态规划程序设计往往是针对一种最优化问题，由于各种问题的性质不同，确定最优解的条件也互不相同，因而动态规划的设计方法对不同的问题，有各具特色的解题方法，而不存在一种万能的动态规划算法，可以解决各类最优化问题。因此读者在学习时，除了要对基本概念和方法正确理解外，必须具体问题具体分析处理，以丰富的想象力去建立模型，用创造性的技巧去求解。我们也可以通过对若干有代表性的问题的动态规划算法进行分析、讨论，逐渐学会并掌握这一设计方法。 基本模型 多阶段决策过程的最优化问题。 在现实生活中，有一类活动的过程，由于它的特殊性，可将过程分成若干个互相联系的阶段，在它的每一阶段都需要作出决策，从而使整个过程达到最好的活动效果。当然，各个阶段决策的选取不是任意确定的，它依赖于当前面临的状态，又影响以后的发展，当各个阶段决策确定后，就组成一个决策序列，因而也就确定了整个过程的一条活动路线，如图所示：（看词条图） 这种把一个问题看作是一个前后关联具有链状结构的多阶段过程就称为多阶段决策过程，这种问题就称为多阶段决策问题。 记忆化搜索 给你一个数字三角形, 形式如下: 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 找出从第一层到最后一层的一条路,使得所经过的权值之和最小或者最大. 无论对与新手还是老手，这都是再熟悉不过的题了，很容易地，我们写出状态转移方程：f(i, j)=a[i, j] + min{f(i+1, j)，f(i+1, j + 1)} 对于动态规划算法解决这个问题，我们根据状态转移方程和状态转移方向，比较容易地写出动态规划的循环表示方法。但是，当状态和转移非常复杂的时候，也许写出循环式的动态规划就不是那么
最详细的WesternBlot过程步骤详解
最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解
最详细的W e s t e r n B l o t 过程步骤详解 Pleasure Group Office【T985AB-B866SYT-B182C-BS682T-STT18】
Western Blot详解(原理、分类、试剂、步骤及问题解答) Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。 本文主要通过以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术: 一、原理 二、分类 i.放射自显影 ii.底物化学发光ECL ECF iv.底物DAB呈色 三、主要试剂 四、主要步骤 五、实验常见的问题指南 1.参考书推荐 2.针对样品的常见问题 3.抗体 4.滤纸、胶和膜的问题 的相关疑问 6.染色的选择 7.参照的疑问
8.缓冲液配方的常见问题 9.条件的摸索 10.方法的介绍 11.结果分析 一、原理 与Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 二、分类 现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行，操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
奇门遁甲定局原理和起局方法
奇门遁甲定局原理和起局方法 1、二十四节气与阴阳二遁关系 下面我们先简单介绍一下定局需要用到的24节气 二十四节气是根据太阳在黄道（即地球绕太阳公转的轨道）上的位置来划分的。视太阳从春分点（黄经零度，此刻太阳垂直照射赤道）出发，每前进15度为一个节气；运行一周又回到春分点，为一回归年，合360度，因此分为24个节气。 早在春秋战国时代，我国人民中就有了日南至、日北至的概念。随后人们把一年平分为二十四等份，并且给每等份取了个专有名称，这就是二十四节气。 到战国后期成书的《吕氏春秋》“十二月纪”中，就有了立春、春分、立夏、夏至、立秋、秋分、立冬、冬至等八个节气名称。 这八个节气，是二十四个节气中最重要的节气，因此它们也是衡量奇门中各
种五行旺衰的重要标准。这八个节气标示出季节的转换，清楚地划分出一年的四季。 后来到了《淮南子》一书的时候，就有了和现代完全一样的二十四节气的名称。这24节气中，反映四季变化的节气有：立春、春分、立夏、夏至、立秋、秋分、立冬、冬至8个节气。其中立春、立夏、立秋、立冬叫做“四立”，表示四季开始的意思。 反映温度变化的有：小暑、大暑、处暑、小寒、大寒5个节气。 反映天气现象的有：雨水、谷雨、白露、寒露、霜降、小雪、大雪7个节气。 反映物候现象的有：惊蛰、清明、小满、芒种4个节气。 节气主要的作用在于纪日纪月。它是我国古代记录时间的一种分段方式。以五日为候（一候为60时辰，正好是奇门一局走完），三候为气，六气为时，四时为岁，一年二十四节气共七十二候。 为何冬至起就要用阳局，夏至起就要用阴遁？这就是古人的研究成果，即对于季节的变化进行研究而来，他们用“圭表”测日影的办法。这也是目前太极图的来源，也是阴阳消长的概源所在。 古人用一根八尺的杆，立于地面，观察每天的日影长短变化，这样可以知道季节的变迁。古人把这种方式制作成“圭表”。因此用“圭表”来预测时间变化，从日影长短来看“阴阳消长”，这也才是“阴阳”的真正起源！大家看看下面的图表。 夏至，日影最短，就在图上记录最短的日影了。冬至，日影最长，就在图上记录最长的日影了。其他节气的日影记录，分别在图表上记录。把记录下来的点，连线，就成了太极图的样子了。
WB操作步骤-自己整理
Western Blot 相关实验方法与试剂（湿转法） 人工肝实验室学习姚瑶 （一）目的蛋白提取： （1）单层贴壁细胞总蛋白的提取： 1、倒掉细胞培养液，加入Hanks液洗涤一次后倒掉，根据所用细胞决定是否用胰酶消化，加入适量（约5ml）新鲜细胞培养液后，将贴壁细胞吹起，并转移至4支离心管内，配平后，1500转离心10min。 2、倒掉上清，用4度预冷PBS溶液洗涤沉淀，1500转离心10min。 共洗三次，每次十分钟。 3、倒掉上清，吸净，每管加入50ul 细胞裂解液RIPA，吹散，加入后由于DNA的释放可迅速变粘稠，故应尽快转移至1.5ml EP 管内，-20℃裂解30min。 4、超声波细胞裂解仪上将各管裂解15s。（可不做） 5、4℃，12000转离心10min。 6、将上清转移至0.5ml EP管中，每管100ul，冰浴待用。 （2）组织中总蛋白的提取： 1、取约100mg肝组织于研磨器内，加入500ul 细胞裂解液RIPA，研磨后吸出于1.5ml EP管内，再加入500ul RIPA，研磨后吸出于上EP管内。冰上裂解30min。
2、配平后，4℃，14000转离心10min。 3、将上清分装于0.5ml EP管内，每管100ul，冰浴待用（二）蛋白含量的测定： 1、稀释标准品：10ul标准品C液+90ul PBS溶液，混匀。 2、按0、1、2、4、8、12、16、20ul将稀释后的标准品加入于96孔板内，并用PBS将各孔补足20ul。 3、将第2、3排96孔板分别加入样品1ul、0.5ul，（可采用倍比稀释法），并用PBS将各孔补足20ul。 4、配制工作液：按A液：B液=50：1配制适量工作液，每孔加入200ul。 5、37℃水浴30min。 6、酶标仪测定各孔OD值（A570，Mode1）。 7、绘制标准曲线，计算样品蛋白浓度。 （三）SDS-PAGE电泳： （1）清洗玻璃板 （2）灌胶与上样： 1、配胶：根据目的蛋白的大小，决定分离胶的浓度。
《奇门遁甲》排盘教程
奇门遁甲的起局（排盘）方式有飞盘和转盘之分；按时间起局来分，有年家奇门、月家奇门、日家奇门、时家奇门、刻家奇门之分；按定局方法，有阴盘、阳盘、有拆补法、超神置闰法、茅山法。 今天给大家整理了道家起局法的时家转盘奇门的排盘方法如下，如果你看懂了，你就有玄学天分啦！“玄”不只是玄乎、虚幻之意，还有至高无尚、顶极的意思喔！至于你学了玄学的人，是用虚幻的事来忽悠人还是拥有顶级智慧，那就看个人的师承和人品啦！ 奇门遁甲是按问事预测当时的时间（年、月、日、时辰）来起局断事的。事面上有好多软件可以查到当时四柱八字，这个就忽略了。这里是按已经知道当时的八字来讲奇门遁甲是怎样排盘的。
奇门遁甲排盘起局步骤如下： 一、定时空： 即起局当时的时间维年月日时、节气、阴阳遁、局数。用四柱八字的形式写出来：年干月干日干时干 年支月支日支时支 这里需要的数据： 1、农历月、日的数字即几月几日。 2、农历年、时用十二地支的序数为其所代表的数字： 计算方法：（年的地支+月+日+时的地支）/9，余数为几即为几局。 至于阴遁还是阳遁，看起局时的节气是在阳遁区间还是阴遁区间。 夏至到冬至期间用阴遁，冬至到夏至期间用阳遁。 夏至在每年公历6月21日或22日，过了夏至，虽然太阳直射点逐渐向南移动，但北半球白天一天比一天缩短，黑夜一天比一天加长。 冬至在每年的公历12月21日至23日之间。冬至是北半球全年中白天最短、黑夜最长的一天，过了冬至，白天就会一天天变长。 例： 公元：2016年10月23日17时30分
农历：2016年九月二十三日酉时 例中，2016年是丙申年，申在12地支中排第9, 公园10月23日对应的农历九月廿三，17点30分对应酉时，酉在12地支中排10位。 （9+9+23+10）/9=5余6 10月23日在夏至后冬至前，为阴6局。 二、排地盘（按九宫数字跳宫排布三奇六仪） 是几局就把三奇六仪队伍里打头的“戊”写在九宫格中这个局数那个宫位，其他的三奇六仪按“戊己庚辛壬癸丁丙乙”的顺序，在九宫中按数字，阳遁顺跳、阴遁逆跳。 天干（三奇六仪）的顺序永远是：戊己庚辛壬癸丁丙乙。 阳遁用天干（三奇六仪）在九宫格里跳：123456789，从小数到大数跳。 阴遁用天干（三奇六仪）在九宫格里逆跳：987654321，从大数到小数跳。
WB实验步骤
蛋白电泳（制胶、SDS-PAGE电泳） 实验材料： SDS-PAGE凝胶制备试剂盒、电泳缓冲液、提取的蛋白或全细胞裂解液、广谱彩虹预染中分子量蛋白Marker、SDS-PAGE Loading Buffer（还原，5×）、G250蛋白快速染色试剂、若干蒸馏水 实验仪器、耗材： 蛋白电泳仪、制胶仪、水平摇床、15ml离心管、5ml移液器、微量移液器、1.5ml离心管、塑料饭盒（可在微波炉里加热使用） 配制溶液： ●配制10%APS溶液：-20度保存 0.5g APS + 5ml蒸馏水、2.5g APS + 25ml蒸馏水 ●配制200 ml电泳缓冲液：CW0045 Tris-Glycine SDS（ph8.3,10×） 20 ml Tris-Glycine SDS + 180 ml 蒸馏水 ●配制1 ml loading buffer： 200 ul 5×loading buffer +800 ul蒸馏水 实验步骤： 一．制胶： 1.参照凝胶模具说明书，装配好凝胶模具。 2.根据分离蛋白的大小配制分离胶和浓缩胶。 3.配制10%分离胶： 将不同体积的30%Acr-Bis(29:1)、分离胶缓冲液和双蒸水在小烧杯或试管中混合。 加入10%APS和TEMED，轻轻搅拌使其混匀，避免产生气泡。 配制SDS-PAGE分离胶
4.待胶灌至距离玻璃板顶端1.5cm的时候停止灌胶，加入蒸馏水水封。静置40分钟 至1小时。 5.待分离胶凝固后（水层胶层中间出现折线），倒掉蒸馏水，用滤纸将水溶液吸干。 6.配制5%浓缩胶： 7.将浓缩胶溶液加至分离胶的上面，直至凝胶溶液到达前玻璃板的顶端。 注意：灌胶速度要快，防止凝胶。 8.将梳子插入凝胶内，避免产生气泡。静置20分钟，等待浓缩胶聚合。 9.待凝胶聚合后，小心地拔出梳子，以免破坏加样孔。赶走气泡。 二．SDS-PAGE电泳: 1. 在电泳槽的内外槽灌至电泳缓冲液。 2. 制备样品： 1）蛋白样品： 根据植物蛋白或动物组织蛋白定量结果，计算蛋白提取液加入量，制备上样溶液。 蛋白提取液+ 5×上样缓冲液+ 蒸馏水，上样量为40-60ug。 制备的样品，煮沸5分钟，12,000 rpm离心5分钟，取上清，上样。
Western_Blot操作步骤
Western Blot操作步骤 一、 Western blot 实验步骤概述 1. 组织取材：组织块称重 2. 利用液氮、研钵粉碎组织块 3. 加入RIPA缓冲液(每克组织3 ml RIPA)，PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，利用Polytron进一步匀浆(15,000转/分*1分钟)维持4℃ 4. 加入PMSF(每克组织30μl，10 mg/ml PMSF)，冰上孵育30分钟 5. 移入离心管4℃约20,000 g(约15,000转)15分钟 6. 上清液为细胞裂解液可分装-20℃保存 7. 进行Bradford比色法测定蛋白质浓度 8. 取相同质量的细胞裂解液(体积*蛋白质浓度)，并加等体积的2×电泳加样缓冲液 9. 沸水浴中3分钟 10. 上样 11. 电泳(浓缩胶20mA，分离胶35mA) 12. 电转膜仪转膜(100mA 40分钟) 13. 膜用丽春红染色，胶用考马斯亮蓝染色 14. Westernblot 试剂盒显色 15. 分析比较记录 二、 Western具体实验步骤 Western，也称Western blot、Western blotting、Western印迹，是用抗体检测蛋白的重要方法之一。Western可以参考如下步骤进行操作。 1.收集蛋白样品(Protein sample preparation):可以使用适当的裂解液裂解贴壁细胞、悬浮细胞或组织样品。对于某些特定的亚细胞组份蛋白，例如细胞核蛋白、细胞浆蛋白、线粒体蛋白等，可以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白，也可以使用试剂盒进行抽提。收集完蛋白样品后，为确保每个蛋白样品的上样量一致，需要测定每个蛋白样品的蛋白浓度。根据所使用的裂解液的不同，需要采用适当的蛋白浓度测定方法。因为不同的蛋白浓度测定方法对于一些去垢剂和还原剂等的兼容性差别很大。如果使用北京博奥森生物技术公司生产的WIP细胞裂解液，可以使用BCA蛋白浓度测定试剂盒。 2.电泳(Electrophoresis) (1) SDS-PAGE凝胶配制:SDS-PAGE凝胶可以参考一些文献资料进行配制，也可以使用博奥森生产的SDS-PAGE凝胶配制试剂盒。该试剂盒提供了除水和配胶器具外的所有试剂以及配制各种浓度SDS-PAGE的配方。
奇门遁甲入门基础学习知识
《奇门遁甲》入门学习总结 参考学习清华大学崔国文教授《奇门遁甲入门课程PPT》 一、何谓“奇门遁甲” 十天干：甲、乙、丙、丁、戊、己、庚、辛、壬、癸。 十二地支：子、丑、寅、卯、辰、巳、午、未、申、酉、戌、亥。 奇：指乙、丙、丁三奇。乙为日奇、丙为月奇、丁为星奇。所谓“日生于乙、月明于丙、丁为南极”。三奇分布在奇门遁甲中的天盘和地盘，并随天地盘转动，凡遇着三奇皆为吉。 六甲：当天干与地支相配时，满一周天为60年，即六十甲子。六十甲子中，正好有：甲子、甲戌、甲申、甲午、甲辰、甲寅，称为六甲。六甲为统帅，然而甲为阳木，怕庚金所克，顾需将六甲隐藏起来。 六仪：天干剩余的：戊、己、庚、辛、壬、癸称为六仪。六仪则相当于六甲元帅的“仪仗队”。 遁甲：把六甲隐与六仪之下，避免六甲被庚金所克，即为遁甲。 门：指八门，人的八种因素。八门为：休、生、伤、杜、景、死、惊、开。八门分布在奇门遁甲的人盘上，其中：开、休、生为三吉门，死、惊、伤为三凶门，杜、景为中平。 故，“奇门遁甲”乃指三奇、八门及遁甲。是古代最高决策学与预测学，融合了阴阳五行、易经八卦、古天文学等知识与理论在内，为古中国三大术数之一，被奉为帝王之学。其价值：时空选择模型。 三大术数指：太乙、奇门、六壬。其中太乙管国家大事、奇门管军事、六壬管民生百事。
二、奇门遁甲的体系结构 2.1奇门遁甲的五个坐标 天、地、人、神、时间。 天地为空间，神为外力，融合了时间、空间、人及自然的各种因素。古人认为人与宇宙天地、时间、自然环境等因素存在关联，处于一种整体和谐、平衡的状态，在各种事物的发展中，遵循宇宙时空的一般规律。奇门遁甲就是研究这种规律，进行预测。 2.2奇门遁甲的64个参数 天干（10）、地支（12）、八卦（8）、九宫（9）、九星（9）、八门（8）、八神（8），总和共计64，为奇门遁甲预测学的64个参数。
动态规划matlab仿真实例
动态规划在火力分配中的应用 1.问题描述 设有m个目标，目标价值(重要性和危害性)各不相同，用数值A K( K=1, 2, ..m )表示，计划用n枚导弹突袭，导弹击毁目标的概率P= ，其中是常数，取决于导弹的 特性与目标的性质；为向目标发射的导弹数，问题：做出方案使预期的突击效果最大。 2.问题建模 上述问题可以表述为 约束条件为 ( 为非负整数) 3.算法描述 下面通过一个实例说明：设目标数目为4 (m=4),导弹为5 (n=5), 和a K取值情况如下表所示：表1：A k，取值情况 将火力分配可分为4个阶段，每个阶段指标函数为: 可能取值为0，1, 2，3, 4，5,将函数值带人如下表: 表2函数值
k=le ngth(x(1,:)) % x_is nan=~is nan( x); % t_vubm=i nf*on es(size(x)); % 判断决策级数 非空状态矩阵 性能指标中间矩阵 动态规划问题基本方程为： c =0 逐次向前推一级 K=4 K=3 K=2 K=1 ( 只需要求解的最大值然后反推回去就可以获得最优的分配方案 可取等号) 4. Matlab仿真求解 因为与取值为整数，可以采用动态规划的方法，获得的最大值, fun cti on[ p_opt,fval]=d yn prog(x,DecisFu n,SubObjFu n, Tra nsFu n,ObjFun) % 规划问题最小值函数对应的最优方 求解动态
f_opt=nan*ones(size(x)); % 总性能指标矩阵 d_opt=f_opt; % 每步决策矩阵 tmp1=find(x_isnan(:,k)); % 最后一步状态向量 tmp2=length(tmp1); % 最后一步状态个数for i=1:tmp2 u=feval(DecisFun,k,x(tmp1(i),k)); tmp3=length(u);% 决策变量 for j=1:tmp3 % 求出当前状态下所有决策的最小性能指标 tmp=feval(SubObjFun,k,x(tmp1(i),k),u(j)); if tmp <= t_vubm(i,k) %t_vub f_opt(i,k)=tmp; d_opt(i,k)=u(j); t_vubm(i,k)=tmp; end; end; end for ii=k-1:-1:1 tmp10=find(x_isnan(:,ii)); tmp20=length(tmp10); for i=1:tmp20 % 求出当前状态下所有可能的决策 u=feval(DecisFun,ii,x(tmp10(i),ii)); tmp30=length(u) ; for j=1:tmp30 % 求出当前状态下所有决策的最小性能指标 tmp00=feval(SubObjFun,ii,x(tmp10(i),ii),u(j)); % tmp40=feval(TransFun,ii,x(tmp10(i),ii),u(j)); % tmp50=x(:,ii+1)- tmp40; % 找出下一状态在x tmp60=find(tmp50==0) ; if~isempty(tmp60) if nargin<6 % 矩阵不同需要修改 tmp00=tmp00+f_opt(tmp60(1),ii+1); % set the default object value else tmp00=feval(ObjFun,tmp00,f_opt(tmp60(1),ii+1)); end % 当前状态的性能指标 if tmp00<=t_vubm(i,ii) f_opt(i,ii)=tmp00; d_opt(i,ii)=u(j); t_vubm(i,ii)=tmp00; end; end; end; end; end fval=f_opt(:,1); tmp0 = find(~isnan(fval)); fval=fval(tmp0,1); p_opt=[];tmpx=[];tmpd=[];tmpf=[]; 单步性能指标 下一状态 矩阵的位置 nargin 的值，很重要
动态规划经典案例详解(背包问题)
动态规划经典案例详解之背包问题 【摘要】本文主要从动态规划经典案例——背包问题的动态规划设计思路出发，结合具体实例，对动态规划在程序设计中的典型应用以及衍生拓展进行详细分析。 【关键字】动态规划信息学奥赛0/1背包问题 动态规划并非一个算法，而是一种解题的思路，其核心思想是通过使用大量的存储空间把中间结果记录下来，大大减少重复计算的时间，从而提高的程序的执行效率，因为信息学奥林匹克复赛题目的解决程序一般是有时间限制的，对于某些用搜索必然耗费大量时间的题目，动态规划几乎是唯一的选择。但是动态规划并没有一个简单的模型可以套用，对于每个不同的题目都有对应的不同规划思路，我们只能通过对一些动态规划经典案例的学习来训练自己的动态规划思维能力，从而以不变应万变，应付各种复杂的程序设计，本文通过对动态规划经典案例之一的背包问题进行详细阐述，旨在让学生了解动态规划和搜索的不同设计思路以及动态规划的优越性。 【原型例题】 从n个物品中选取装入背包的物品，每件物品i的重量为wi，价值为pi。求使物品价值最高的选取方法。 【输入文件】 第一行一个数c，为背包容量。 第二行一个数n，为物品数量 第三行n个数，以空格间隔，为n个物品的重量 第四行n个数，以空格间隔，为n个物品的价值 【输出文件】 能取得的最大价值。 【分析】 初看这类问题，第一个想到的会是贪心，但是贪心法却无法保证一定能得到最优解，看以下实例： 贪心准则1：从剩余的物品中，选出可以装入背包的价值最大的物品，利用这种规则，价值最大的物品首先被装入（假设有足够容量），然后是下一个价值最大的物品，如此继续下去。这种策略不能保证得到最优解。例如，考虑n=2,w=[100,10,10],p=[20,15,15],c=105。当利用价值贪婪准则时，获得的解为x=[1,0,0]，这种方案的总价值为20。而最优解为[0,1,1]，其总价值为30。 贪心准则2：从剩下的物品中选择可装入背包的重量最小的物品。虽然这种规则对于前面的例子能产生最优解，但在一般情况下则不一定能得到最优解。考虑n=2,w=[10,20], p=[5,100],c=25。当利用重量贪婪策略时，获得的解为x=[1,0],比最优解[0,1]要差。
奇门遁甲排盘步骤
奇鹏奇门遁甲|奇门遁甲排盘步骤 本文向大家介绍奇门遁甲排盘步骤，供广大奇门爱好者参考。 一、确立奇门局象 首先将公历或是农历的时间换算成干支历，再根据万年历得出该年月日时使用得是阳几局或是阴几局。 二、三奇六仪落宫 六仪者：甲子戊、甲戍己、甲申庚、甲午辛、甲辰壬、甲寅癸也。在排局时只要写出戊、己、庚、辛、壬、癸即可。三奇者：乙、丙、丁也。在阳遁中按照戊、己、庚、辛、壬、癸、丁、丙、乙进行顺布，而在阴遁中按照戊、己、庚、辛、壬、癸、丁、丙、乙进行逆布。 戊为始，为元首，无论阳遁或是阴遁，用几局？戊就首先落在哪个宫中，其余依次排布，例如：阳遁一局，则甲子戊在一宫，甲戍己在二宫，甲申庚在三宫，甲午辛在四宫，甲辰壬在五宫（中宫，寄坤二宫），甲寅癸在六宫，丁奇在七宫，丙奇在八宫，乙奇在九宫。 如果是阴遁一局的话，则甲子戊在一宫，甲戍己在九宫，甲申庚在八宫，甲午辛在七宫，甲辰壬在六宫，甲寅癸在五宫（中宫，寄坤二宫），丁奇在四宫，丙奇在三宫，乙奇在二宫。余者可仿此类推。 三、值符值使 查找值符值使非常的简单，首先确立你目前所使用的时辰是什么？则旬首即是值符，该宫里的八门即是值使，例如：甲申年乙亥月壬寅日乙巳时，乙巳时属于甲辰旬，那么甲辰壬
即是值符，该宫中的门即是值使。 四、九星排布 九星者：天蓬星、天任星、天冲星、天辅星、天禽星、天英星、天芮星、天柱星、天心星也。因所用的局不同，他们所携带的三奇六仪也不同。、值符落宫的方法就是将值符加临于所用时辰的天干宫中即可，以上阴遁九局为例，值符天禽星甲辰壬（并带有二宫的丙）在一宫，接下来就好办了，一个一个往前推就行了———天柱星甲申庚加于艮八宫，天心星甲午辛加于震三宫，天蓬星乙奇加于巽四宫，天任星甲戍己加于离九宫，天冲星丁奇加于坤二宫，天辅星甲寅癸加于兑七宫，天英星甲子戊加于乾六宫。 五、八门排布 值使的布局就是阳遁从旬首顺数至所用的时辰，阴遁从旬首逆数至所用的时辰，如上例中，死门为值使，死门（比较特殊，如果是天芮星为值符，则死门从二数起，现天禽星为值符，天禽星在中五宫，所以死门从五数起）在旬首为五数，即：甲辰时死门在五宫，乙巳时逆数则为四宫，丙午时则在三宫，丁未时则在二宫，戊申时则在一宫。知道了死门值使在哪个宫，其余的门便依次排布即可——————死门在巽四宫、惊门在离九宫、开门在坤二宫、休门在兑七宫、生门在乾六宫、伤门在坎一宫、杜门在艮八宫、景门在震三宫。 六、八神排布 八神即是：值符、螣蛇、太阴、六合、白虎、玄武、九地、九天，以值符（通常称为小值符）为首，看九星值符（通常称为大值符）落在哪个宫？则此小值符就在哪个宫？其余的七神依次排布即可，但是是按照阳遁顺时针排布，阴遁逆时针排布的方法，此阴遁九局之例
动态规划典型例题
1、单调递增最长子序列 描述 求一个字符串的最长递增子序列的长度 如：dabdbf最长递增子序列就是abdf，长度为4 输入 第一行一个整数0 2、最长公共子序列 描述 如题，需要写一个程序，得出最长公共子序列。 tip：最长公共子序列也称作最长公共子串(不要求连续)，英文缩写为LCS（Longest Common Subsequence）。其定义是，一个序列S ，如果分别是两个或多个已知序列的子序列，且是所有符合此条件序列中最长的，则S 称为已知序列的最长公共子序列。 输入 第一行给出一个整数N(0 3、括号匹配 时间限制：1000 ms | 内存限制：65535 KB 描述 给你一个字符串，里面只包含"(",")","[","]"四种符号，请问你需要至少添加多少个括号才能使这些括号匹配起来。 如： []是匹配的 ([])[]是匹配的 ((]是不匹配的 ([)]是不匹配的 输入 第一行输入一个正整数N，表示测试数据组数(N<=10) 每组测试数据都只有一行，是一个字符串S，S中只包含以上所说的四种字符， S的长度不超过100 输出 对于每组测试数据都输出一个正整数，表示最少需要添加的括号的数量。每组 测试输出占一行 样例输入 4 [] ([])[] ((] ([)] 样例输出 3 2 WesternBlot操作步骤及注意事项 【原理】 Western Blot采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋白水平的表达。 【试剂及配制】 1、SDS-PAGE试剂：见试剂盒说明书。 2、电泳缓冲液 Tris（分子量121.14） 3.03g 甘氨酸（分子量75.07） 18.77g SDS 1g 蒸馏水定容至1000ml 溶解后室温保存，可配制成10X电泳缓冲液进行保存（Tris、甘氨酸、SDS用量X10倍，蒸馏水定容至1000ml）。电泳缓冲液使用2~3次后推荐更换。 3、转膜缓冲液 湿转法 48mmol/L Tris 2.375g 39mmol/L甘氨酸11.25g 0.0375%SDS 0.375g 加少部分蒸馏水溶解 20%甲醇200ml 蒸馏水定容至1000ml 溶解后室温保存，可配制成10X转膜缓冲液（不含甲醇）进行保存（Tris、甘氨酸、SDS用量X5倍，蒸馏水定容至500ml，或按10倍用量定容至1000ml等；用时取100ml，加入200ml 甲醇再加蒸馏水稀释至1000ml）。使用转膜缓冲液时注意室内通风。转膜缓冲液用于转膜一次后，建议更换新转移缓冲液，旧转移缓冲液可用于转膜前浸泡物品。 4、TBS缓冲液 1mol/LTris·HCl（pH7.5）10ml NaCl 8.8g 蒸馏水定容至1000ml 配制后室温保存，可配制成10XTBS缓冲液，使用时稀释10倍。 5、TBST缓冲液（洗膜液） 20%Tween20 1.65ml TBS 700ml 混匀后即可使用，现配现用，因含Tris缓冲液，其PH易受空气中二氧化碳影响，此外注意使用时不要直接接触到皮肤，其有致癌作用。新手Western blot步骤及注意事项