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RT-PCRprotocol

RT-PCR

实验步骤

一、总RNA提取

1. 取200mg组织,放到1.5mlEP管中,加入1mlTrizol剪碎。

2. 震荡30s。

3. 加0.2ml氯仿,剧烈摇动30s,室温3min。

4. 12000×g,4℃离心,15min。

5. 吸上层无色水相,移入另一EP管中(约0.5ml)。

6. 加等体积异丙醇,-20℃,30min。

7. 12000×g,4℃离心,10min。在管底部可见微量RNA沉淀

8. 弃上清,加75%乙醇1ml,振荡。

9. 7500×g,4℃离心,10min。

10. 弃上清,用滤纸小心吸取残留液体,室温干燥5-10min。

11. 沉淀溶于20μlDEPC水,取1μl加入79μlDEPC水测OD260/OD280

12. 计算浓度与纯度,-70℃保存。

二、逆转录合成cDNA第一链反应体系如下

混匀快速离心一次

反应条件如下:

-20℃冰箱冻存

三、PCR反应

混匀快速离心一次

反应条件如下:

PCR产物-20℃冰箱保存

取PCR产物8μl 加5×Loading Buffer 2μl 2%琼脂糖凝胶电泳120V。

100mA 30min 溴化乙锭染色,凝胶成象仪成象并保存结果。

RT-PCR实验方法总结1,2

RT-PCR实验有三步:抽提RNA,RT,PCR。要求:

1.做RT前必需测RNA浓度,逆转录体系对RNA量还是有一些要求,常用500ng 或1ug。

2. RT按要求做,一般不会出太大问题。

3. PCR,按常规。但如需扩长片段,则对前两步要求较高,需要有完整的cDNA 存在,不是单改变Mg2+浓度、退火温度能解决的。

1)RT和PCR时的引物设计是不是一定要先知道目的基因的序列?必须

在RT时,引物设计有3种方法即a:Random 9mers;b:Oligo dT-Adaptor Primer;和c:特异的下游引物。如果用a和b方法,是扩增的所有的cDNA(理论上),还要用此产物做PCR 的模板继续扩增。

如果用c方法,那么要去那里查它的序列呢?https://www.wendangku.net/doc/df13606470.html, 问题:

在做RT-PCR遇到一怪现象,即对同一动物不同组织扩增同一段基因,结果从一种组织中可以扩出我的目的基因,条带非常的好,而另一组织在同样的条件下却得到许多非特异性的条带,尝试其他条件同样无法得到满意的结果,百思不得其解!(注:已肯定该基因在两种组织中都表达,且内参照在两种组织都可扩增出来)

从这两种组织中提取的RNA的量是不一样的,我测过吸光度,差异还很大,会不会和这有关呢?请高手指教!解答:

1.RT-PCR有两种做法:

条件具备的话可用kit进行一步法进行;若条件不太好的话可分两步进行逆转录再PCR。但后来发现两步法的结果更加理想,条带特异性强且无拖尾现象,我推测是体系更加单一比较利于PCR的进行,当然也可能是我买的kit不太好。(promega)。 2.RT-PCR应具备的条件

高质量的RNA(保留后可做5‘,3’RACE);引物的(最好产物短点);若涉及粗略定量的话还应考虑RNA的浓度或是cDNA的浓度(如果由内标分子更好,但我发现其实很不容易将RNA的浓度以及内标分子的表达量调整的完全一样);体系的均一性等。 3.RACE

我做过RACE(3’RACE是宝生物的Kit;5‘RACE是Gibico),但现在再进行另一个同源基因的3‘RACE时却怎么也P不出来,这两个基因是由同一对引物扩增出来的,其中一个已经获得了全序列(RACE的方法),而另一个基因的3’UTR却增么也扩不出来,我推测是不是该基因的3‘UTR太长的缘故,我都快绿了,有无

RT-PCR的常用内标b-actin 和GAPDH的使用有选择性吗?比如不同的细胞,不同的刺激。

有关内参:

RT-PCR内参照可以在一个管子里做(那样也是图好看一些),最好分开两管,把除了引物之外的mixture统一配,拍照后,算目的基因和内参的比值,这就是基因表达的相对浓度。

问:我曾经作过同一管的PCR,内有actin 和目的基因引物。虽然可见到两条均一条带但图片质量不理想(而且酶量、Mg2+加倍)。请教mxbdna2003 ,你是如何处理同一管的PCR的各成分的浓度?

答: it should determined the amount of RNA. but it not for the quantitity of the PCR . it just was convienent to guess the amount ot the template<(for RT and PCR) and bet trer for publication and editor if he don not know the preocedure much. but the amoun t just using "accurate piptte" is wrong. it shoud be remembered to do the inner control of housekeeping gene everytime.

在同一管中做RT,其实没有什么问题,不需要taq魅加量,taq酶本来就是过量的^-^,(平时做pcr的时候,完全可以再省一些taq酶的,半斤八两就可以了,我想这肯定再很多贴子里应该都谈到了。Mg就跟不能变了,一变整个体系就变了。能看到均一条带就很好了。

关键是摸,十八摸(太少,只争朝夕,开个玩笑)虽然用不着,但是摸上3、5摸总是必要的,首先遥分开摸,然后再一起摸,直到摸的好了,还要考虑比较的不同的模板中的量,所以我们不建议再同一管中进行,因为还有互相竞争抑制的问题,即使不同基因之间。

有关内参的建议:

一定要做内参的,每一次,我想。不作内参的结果是不可信的

电泳可以不一起跑,没有关系,计算的是相对表达程度,着我在好几封帖子里都谈了,再说一边我得观点,1、半定量和定量RT-PCR做的都是基因相对表达量,不是绝对表达量,除非你能准确知道来自多少细胞,但是细胞还有死的呢。

2、以电泳为基础的半定量RT-PCR本身是不可信的,作为实验的粗筛是可以的,但不能作为最终结果的,

3、半定量RT-PCR应该再两管中进行,除非内参基因和目的基因表达相同,长度差不多,GC含量相似,或者实在穷的要省PCR管和 taq。

关于平台期和线性期的问题,实际上线性期是指数期,只不过碰巧2的冥和2的倍数是相同的。看上去任何一个时期都可以,实际上是不对的,因为牵涉到酶促动力学的问题,这个我也不懂,有一些专门的文章,好像,涉及到很多化学的东西。我们学医的,也没必要知道那些,但是其中主要是因为模板引物酶原料和buffer之间的关系,这种反应单*改变其中一种成分没有用的,酶一直是过量,再加酶也没用,引物ntp都是这样。烟鬼正传,最好选线性期的开始阶段,但是要在你的凝胶成像分辨范围内,所以选一个这两种的契合点。给你一张图你就明白了,再开始的时候酸的是切线,这图我在 *** 帖过。

关于引物设计,再可能的情况下,除了常规要求之外,最好兼顾跨内含子(不过,根据要求,还可以专门设计隔内含子的,这样还可以用于基因组PCR)、长度小于500bp-600bp等等。

引物当然要设计成一样的退火温度,即使不再一管中,也要一样的,要在一台机器里啊。我的引物占了冰箱一格,大部分是一个温度,这样任何几个都可以拿来披,也不用查。

我反复说过了,别用软件,就用眼睛看,软件涉及的在好,有些基因在它出软件的时候,还没发现呢,跟不要说在基因组的位置和序列了,怎么考虑内含子的问题呢?

18s 的引物也和著名的βactin一样是设计的,只要拿到序列就可以了,但是限制是只能用总RNA为模板,但是比actin和bubulin等可准多了,更不要说GAPDH 这个破烂了。18s除了在细胞中更相同(量)外,主要是它占的比例远远高于看家基因,所以定量更加准确,我想,不知对不对,请几位主任和 eeflying指教。我认为,就像你用某一种东西的数量去概括,因该选那种多的东西,说一座房子是由2000块砖造成的,比说又29根梁更准确吧。更不要说没有看家基因不看家的缺点,因为他是服务于整个基因组表达谱什么的。

PE有专门的用于实时PCR的内参试剂盒,就是用18s,不过我们看懂使用的那条序列,不知有没有人用过,告知其序列和genbank号。

正好问一下,我查了一些序列,一直没有去合成,主要是因为手上的actin的荧光探针还没有完,当初和成了一堆。

有那位高手用过18s的内参,请问您的序列(我指的是模板的序列)?

原位杂交最好用RNA做探针,效果好一些,反正你有钱卖roche的盒子,而且量也能保证,因为转录过程嘛,沿着一条线突突地跑就是了。正义反义也容易理清。

我觉得做RT-PCR的方法和条件及应注意的事项就是那么几条,许多专业书都有详细的描述,但是许多人还是历经多次磨难,有时就是得不出结果。因此,我认为因为每个人所要克隆的片断不同,引物不同等,因此对不同的人来说还是有他自己的特殊性,我的以下经历说明:做实验时各人的情况不同,做不出时还是要好好动一下脑子。

记得我开始我的RT-PCR时,按常规方法,提取总RNA后,首先用自己设计的下游引物进行逆转录,不断改变反应条件,进行了N次均没有结果。后来考虑到本人的克隆的PCR的片断位于我们实验另一位同学克隆的片断当中,而该同学已经用RT-PCR克隆出她的片断(尽管她用这些RT-PCR产物做模版再进行PCR时也没办法重复出她的产物),因此,我先用她的引物和条件扩增出她的片断,然后用她的RT-PCR产物作模板(有点改进,逆转录反应换用了9mers随机引物),用我的引进物进行一般PCR,终于得到我的产物,测序结果完全正确。尽管我的这个经历别人很人遇到,但足可以说明实验可以有自己的模式,书本的知识和别人的经验很重要,但有时也不定要受到书本框框和别人经验的限制

请问:

1 引物的特异退火温度怎样设定?可以根据gc 和at含量算出吗?可以用引物报告单上的Tm值吗?

2 PCR时20微升体系中cDNA应加多少比较合适?MgCl2应加多少?各个成分的量有无确定标准?

3 PCR结果跑电泳,actin有,但跑不出目的条带,有几种原因?与cDNA的量少有关吗?Mg离子太多是否会抑制Taqase的活性?

一般来说引物报告单伤得是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩下的可以摸的. 20中是指体积还是量?只要不明显改变体系的离子强度,加1,2ul 都可以的.mg要调的,但我总觉得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的.

如果内参照有,目的没有,至少证明不是"美丽惹"的祸.原因书里应该都说了.

在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定,一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解,而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA 分析的结果,所以RNA的制备与分析操作难度极大。在实验中,一方面要严格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。

外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等,也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。一、防止RNA酶污染的措施

1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。

2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用)。

3. 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室温10min,然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干。

4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC,在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。

6. 设置RNA 操作专用实验室,所有器械等应为专用。二、常用的RNA酶抑制剂

1. 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。

2. 异硫氰酸胍:目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA 酶有强烈的变性作用。

3. 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。

4. RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。

5. 其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

一般来说引物报告单伤得是对的,也可以自己算,实际上重要的各条引物一致,剩下的可以摸的. 20中是指体积还是量?只要不明显改变体系的离子强度,加1,2ul 都可以的.mg要调的,但我总觉得没有书里讲的那么玄乎,我都是常年不变的.

如果内参照有,目的没有,至少证明不是"美丽惹"的祸.原因书里应该都说了.

在所有RNA实验中,最关键的因素是分离得到全长的RNA。而实验失败的主要原因是核糖核酸酶(RNA酶)的污染。由于RNA酶广泛存在而稳定,一般反应不需要辅助因子。因而RNA制剂中只要存在少量的RNA酶就会引起RNA在制备与分析过程中的降解,而所制备的RNA的纯度和完整性又可直接影响RNA 分析的结果,所以RNA的制备与分析操作难度极大。在实验中,一方面要严格控制外源性RNA酶的污染;另一方面要最大限度地抑制内源性的RNA酶。RNA酶可耐受多种处理而不被灭活,如煮沸、高压灭菌等。

外源性的RNA酶存在于操作人员的手汗、唾液等,也可存在于灰尘中。在其它分子生物学实验中使用的RNA酶也会造成污染。这些外源性的RNA酶可污染器械、玻璃制品、塑料制品、电泳槽、研究人员的手及各种试剂。而各种组织和细胞中则含有大量内源性的RNA酶。一、防止RNA酶污染的措施

1. 所有的玻璃器皿均应在使用前于180℃的高温下干烤6hr或更长时间。

2. 塑料器皿可用0.1% DEPC水浸泡或用氯仿冲洗(注意:有机玻璃器具因可被氯仿腐蚀,故不能使用)。

3. 有机玻璃的电泳槽等,可先用去污剂洗涤,双蒸水冲洗,乙醇干燥,再浸泡在3% H2O2 室温10min,然后用0.1% DEPC水冲洗,晾干。

4. 配制的溶液应尽可能的用0.1% DEPC,在37℃处理12hr以上。然后用高压灭菌除去残留的DEPC。不能高压灭菌的试剂,应当用DEPC处理过的无菌双蒸水配制,然后经0.22μm滤膜过滤除菌。

5. 操作人员戴一次性口罩、帽子、手套,实验过程中手套要勤换。

6. 设置RNA 操作专用实验室,所有器械等应为专用。二、常用的RNA酶抑制剂

1. 焦磷酸二乙酯(DEPC):是一种强烈但不彻底的RNA酶抑制剂。它通过和RNA酶的活性基团组氨酸的咪唑环结合使蛋白质变性,从而抑制酶的活性。

2. 异硫氰酸胍:目前被认为是最有效的RNA酶抑制剂,它在裂解组织的同时也使RNA酶失活。它既可破坏细胞结构使核酸从核蛋白中解离出来,又对RNA 酶有强烈的变性作用。

3. 氧钒核糖核苷复合物:由氧化钒离子和核苷形成的复合物,它和RNA酶结合形成过渡态类物质,几乎能完全抑制RNA酶的活性。

4. RNA酶的蛋白抑制剂(RNasin):从大鼠肝或人胎盘中提取得来的酸性糖蛋白。RNasin是RNA酶的一种非竞争性抑制剂,可以和多种RNA酶结合,使其失活。

5. 其它:SDS、尿素、硅藻土等对RNA酶也有一定抑制作用。

wo-Step RT-PCR protocol

We will provide both one-step and two-step protocols for RT

- PCR . We recommend the two-step protocol for this class.

In the one-step protocol, the components of RT and PCR are

mixed in a single tube at the same time. The one-step protocol

generally works well for amplifying targets that are reasonably

abundant.

Alternatively, RT - PCR can be done in two steps, first with the

reverse transcription and then the PCR . The two-step protocol is

usually more sensitive than the one-step method; yields of rare targets may be improved by using the two-step procedure. One-step RT- PCR :

? Convenient

Two-step RT - PCR :

?Saves RT reagents. One RT reactio n will provide templates for multiple PCR ’s

?Can be more sensitive than one-step RT- PCR

Two-step Protocol

Step One: Reverse Transcription Note: Wear gloves at all times to avoid RNase contamination

Reagents:

RETROscript? kit from Ambion, Catalogue # 1710 -Reverse Transcriptase MMLV-RT (100 units/μl) -10X RT Buffer (500 mM Tris-HCl, pH 8.3, 750 mM KCl, 30mM MgCl2 50 mM DTT) -Random decamers (50μM) -dNTP (2.5mM each dNTP) -RNase Inhibitor (10 units/μl)

Before you start:

?Place RNase Inhibitor and Reverse T ranscriptase ON ICE directly from the box

?Thaw 10x reaction buffer, random decamers, and dNTP mix

quickly in your hands and place ON ICE;

Use small 0.25ml PCR tubes. 1) Assemble your reaction as follows on ice. Add the enzyme last.

2) Mix gently, spin briefly. 3) Incubate in the thermacycler at:

a. 44°C for 1 hr.

b. 92°C for 10 min to inactivate the reverse transcriptase. 4) Store reaction at ?20°C or proceed to the PCR .

Step Two: PCR

A) Primer Preparation 1) Primers are shipped in dry form. Briefly spin the tube before you open the cap to avoid loss

of DNA pellet. 2) Dissolve the oligonucleotide in 10mM Tris, pH7.5 to make a primer stock at 100μM concentration. 3) Dilute from this stock 1:20 (in water) to make a working solution at 5 μM for use in setting upPCR reactions.

B) Setting up PCR reactions

Negative Controls

Use two negative controls among the PCR s.

I. The minus-RT control from the previous step, or alternatively, untreated RNA can simply be subjected to PCR .

II. A minus-template PCR , it should have all

the PCR components, but use water as template instead of an

aliquot of the cDNA (RT reaction). This control will verify that none of the PCR reagents is contaminated withDNA .

Positive Control

I. Perform PCR to amplify a cDNA that corresponds to a

basal/housekeeping transcript, e.g., ribosomal protein S17 (RpS17). The TA’s will provide each team with RpS17 primers. For your reference, these are the primer sequences:

Forward RpS17: 5' - cga acc aag acg gtg aag aag - 3'

Reverse RpS17: 5' - cct gca act tga tgg aga tac c - 3' Expected RT- PCR product size: 211bp

The primers are located on different exons that are separated by a 59bp intron.

If genomic DNA is amplified, the product size would be 270bp. II. Use genomic DNA isolated from S2 cells as template. If your primers span intron(s), note the size of the

expected PCR product and if necessary, adjust annealing temperature of the PCR program.

Reagents: Taq DNA polymerase: Invitrogen Cat# 10342-020 With 10X Buffer (-MgCl2) and 50mM MgCl2

The following table outlines the components needed for PCR . Note: do not use DEPC-treated water.

For RpS17 control:

Making Master Mixes:

Consider making master mixes if you are testing multiple sets of primers at once. A master

mix will contain everything except the聽PCR聽primers. If you are testing n sets of primers, make a master mix enough for n+1 tests.

Mix the components gently but thoroughly. Aliquot 22.5渭l of your master mix to each tube.

Add 1.25渭l of each of the appropriate primer at 5渭M working stock concentration

Assemble reactions on ice.

Incubate in Thermacycler:

a) Initial denaturation: 94°C for 4 min

b) 30 cycles: Denature at 94°C for 30 sec

Anneal at 55°C for 20?30 sec**

Extend at 72°C for 45 sec ***

c) Final extension: 72°C for 5 min

**Start with the annealing temperature suggested by your primer design software. An annealing temperature of ~55°C used with the cycling times shown is often a reasonable starting

point, but the optimal temperature and cycling times for your primer and template combination may need to be determined empirically.

***The rule of thumb is to use an extension time of 1 min per kilobase of target.

Run 15 μl of your reaction on 1-1.5% Agarose gel

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