4植物基因克隆的策略与方法

植物基因克隆的策略与方法

基因的克隆就是利用体外重组技术,将特定的基因和其它ＤＮA顺序插入到载体分子中。基因克隆的主要目标是识别、分离特异基因并获得基因的完整的全序列，确定染色体定位,阐明基因的生化功能,明确其对特定性状的遗传控制关系。通过几十年的努力由于植物发育,生理生化,分子遗传等学科的迅速发展,使人们掌握了大量有关植物优良性状基因的生物学和遗传学知识,再运用先进的酶学和生物学技术已经克隆出了与植物抗病、抗虫、抗除草剂、抗逆，育性、高蛋白质及与植物发育有关的许多基因。我们实验室对天麻抗真菌蛋白基因作了功能克隆的研究(舒群芳等，19９５;舒群芳等,199７),为了克隆植物基因也探讨了其它克隆方法,本文论述基因克隆的策略、方法及取得的一些进展。?1功能克隆（funｃtｉonal Cloｎing) 功能克隆就是根据性状的基本生化特性这一功能信息,在鉴定和已知基因的功能后克隆（Colｌis,1995)。其具体作法是：在纯化相应的编码蛋白后构建cDＮＡ文库或基因组文库,DNＡ文库中基因的筛选根据情况主要可用二种办法进行,(1)将纯化的蛋白质进行氨基酸测序,据此合成寡核苷酸探针从cDNA库或基因组文库中筛选编码基因,（2)将相应的编码蛋白制成相应抗体探针，从ｃＤNA入载体表达库中筛选相应克隆。功能克隆是一种经典的基因克隆策略,很多基因的分离利用这种策略。

Hain等从葡萄中克隆了两个编码白藜芦醇合成的二苯乙烯合成酶基因(Vst１和Vst2),葡萄中抗菌化合物白藜芦醇的存在,可以提高对

灰质葡萄孢（Bｏtrytiｓ cineｒce)的抗性，在烟草和其它一些植物中无二苯乙烯合成酶,因此克隆该基因经过转基因后,对有些植物产生对灰质葡萄孢的抗性很有意义(Hａin等,１985)。Kondo等198９年对编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的基因组DNA做了克隆和序列分析(Kondo等,1989）。周兆斓等构建了水稻ｃDNA文库，分离了编码水稻巯基蛋白酶抑制剂的ｃDNA(周兆斓等,1996)。植物蛋白酶抑制剂是一类天然的抗虫物质,它可抑制摄食害虫对蛋白质的消化，使害虫因缺乏所需氨基酸而导致非正常发育或死亡。胡天华等人从烟草中分离出流行于我国的黄瓜花叶病毒(Cucｕmｂer Mｏｓaic virus)（CMV)，并克隆了编码该病毒外壳蛋白的cDNA基因(胡天华等,19８９)。王春香等从感病的烟草叶片中分离纯化了马铃薯x病毒(ｐotato ｖｉruｓ X， pvx）,克隆了完整的马铃薯x病毒外壳蛋白基因，并将外壳蛋白基因转入马铃薯中，以期获得抗pｖｘ病毒的栽培种马铃薯(王春香等,1991)。病毒外壳蛋白（Ｃoａt proteiｎ cp)基因的成功克隆，可使转基因植物中产生病毒外壳蛋白基因介导的抗性(Coat Proteｉn Mediated Rｅsiｓtａnｃｅ CPMR)或病毒ＣP-ＲN Ａ介导的抗性。Vａｎｋａn 报道从真菌中成功的克隆出无毒基因Avr9，可直接利用此基因介导广谱高效的基因工程植物（Van Ｋan 等,１9９1)。我们１9９5年构建了天麻cDＮA文库,制备抗体探针成功地分离了编码天麻抗真菌蛋白基因的ｃDNA克隆,为抗真菌基因在农业、医药等方面的应用打下了基础(舒群芳等,1995;舒群芳

等,1997)。功能克隆的特点是用基因表达的产物蛋白质来克隆基因、