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微生物代谢组学研究方法_秦晴

微生物代谢组学研究方法

秦晴洪美胡纯铿*华侨大学生物工程与技术系厦门361021

摘要代谢组学是后基因组时代新兴的一种研究生物样品中所有小分子代谢物的技术,是系统生物学的有机组成部分,并在近年来取得很大进展。该文就微生物代谢组学研究中有关样品制备、代谢产物分析鉴定和数据分析等涉及的主要方法进行了概述,并用一些典型实例介绍微生物代谢组学的应用,对微生物代谢组学研究中潜在的问题和未来发展趋势进行了讨论。

关键词数据分析代谢物鉴定微生物代谢组学

文献标识码:A文章编号:1003-4331(2009)03-0029-05

The techniques employed in microbial metabolomics research

Qin Qing Hong Mei Hu Chunkeng*

(Department of Biological Engineering,Huaqiao University,Xiamen361021,China)

Abstract Being an essential component of systematic biology,metabolomics is a post genomic technology aimed at seeking to provide a comprehensive profile of all the metabolites present in a biological sample.Investigations into microbial metabolomics have advanced greatly in recent years.This review summarizes the major techniques involved in the research procedures of microbial metabolomics, including sample preparation,analysis and identification of metabolites and data analysis.The applications of microbial metabolomics are also given based on several typical examples.The existing problems in,and the future trends for,microbial metabolomics research are discussed eventually.

Key words data analysis metabolite identification microbial metabolomics

代谢组学(metabolomics)是继基因组学、转录组学和蛋白质组学之后出现的一门新学科,已成为系统生物学的重要组成部分。代谢组学是通过考察生物体系受刺激或扰动后(如将某个特定的基因变异或环境变化后)所有小分子代谢产物随时空的变化情况,来研究生物体系的代谢途径的一种技术[1]。与转录组学和蛋白质组学等其他组学相比,代谢组学具有以下优点[2]:(1)基因和蛋白表达的微小变化会在代谢物水平得到放大;(2)代谢组学的研究不需进行全基因组测序或建立大量表达序列标签的数据库;(3)代谢物的种类远少于基因和蛋白的数目;(4)由于给定的代谢物在每个组织中都是一样的,所以,研究中采用的技术更通用。

代谢物是细胞调控过程的终产物,是基因型与环境共同作用的综合结果,它们的种类和数量变化被视为生物系统对基因或环境变化的最终响应[3]。作为新兴的生物技术,代谢组学技术已广泛应用于生命科学的各个研究领域。由于微生物的基因数据中包含一些功能未知的基因,基于基因信息分析得到的代谢途径显然不完全,迫切需要微生物代谢组学策略共同译解其全部基因功能[4]。

代谢组学研究的技术平台一般流程包括样品制备、代谢产物的检测和分析鉴定、数据分析与模型建立。图1显示研究方法的一般步骤[5]。由于微生物中代谢物的种类繁多,而目前可用的成分检测和数据分析方法又多种多样,根据研究对象不同,采用的样品制备、分离鉴定手段及数据分析方法各不相同。

图1

微生物代谢组学研究方法_秦晴

代谢组学研究流程

基金项目:福建省自然科学基金项目(E0810018)、华侨大学高层次人才科研基金项目(05BS306)。

*通讯作者:胡纯铿,E-mail:ckhu@http://www.wendangku.net/doc/df49f788c850ad02df8041ae.html。

1样品制备

微生物代谢物样品的制备一般分为微生物培养、淬灭和代谢产物的提取。根据研究对象、目的和采用的分析技术不同,所需的样品提取和预处理方法各异,不存在一种普适性的标准化方法。

微生物代谢组学研究要求微生物的生长条件是可以控制和重复的。在一个生物反应器中,需要严格控制温度、pH、培养基组成、溶解氧和二氧化碳等,以明确界定生长条件,建立标准的和可重复的参考培养条件。微生物的培养可以以分批、补料或者连续培养模式进行。由于连续培养的菌体生理稳定,易于控制且重现性较好,所以,大多数研究者倾向于应用生物反应器连续培养操作模式。

在样品淬灭和代谢物的提取过程中,应遵循的原则[6]是:(1)淬灭工艺最好可以立即冻结细胞代谢。(2)在淬灭过程中要求细胞膜无明显损伤,以免胞内代谢物外泄。(3)提取过程中应该尽可能多的提取胞内代谢物。(4)代谢产物不应该遇到任何物理或化学修饰。(5)得到的样品基质应与所选择的分析方法相容。冷甲醇和液氮是最常用的淬灭方法,而在提取方面由于特定的提取条件往往仅适合某些类化合物,目前尚无一种能够适合所有代谢产物的提取方法。应该根据不同的化合物选择不同的提取方法,并对提取条件进行优化。

许多研究者已经对不同淬灭和提取方法做了系统考察。有研究发现,当同样用冷甲醇处理细胞时,大部分原核生物(细菌)的表现与真核生物(如酵母菌和丝状真菌)不同。原核细胞如谷氨酸棒杆菌、大肠杆菌等的胞内代谢物更容易泄漏[7-8],而真核细胞如酿酒酵母、产黄青霉菌[9-10]却很少发生泄漏。这可能是因为原核生物的细胞壁和细胞膜组成与真核生物不同。Hajjaj等[11]在研究丝状真菌代谢组时用冷甲醇和液氮进行淬灭,并且采用热乙醇进行提取,发现冷甲醇和液氮都是非常有效的淬灭方法,而热乙醇提取既有效又稳定,是一种很好的提取方法。Wittmann等[12]在研究谷氨酸棒状杆菌代谢途径时发现,由于一般的淬灭和提取方法都是非特异性的,所以,采用这些方法会使某些目标氨基酸和中间代谢物丢失。Buchholz等[13]将快速取样技术和其他分析技术结合,实现了细胞内大量代谢物的快速、高频率定量,可以用于发酵过程的动态检测,有助于研究各种因素对发酵的影响,以期提高生物工程的产量。

2代谢产物的分析鉴定

生命科学领域的巨大进步与先进分析技术密不可分,进行代谢组学研究首要解决的是分析方法上的理论和技术问题。传统的酶法定量胞内外代谢物只能分析一个样品中的一个或几个代谢物,且需要的样品体积大。而胞内代谢物浓度一般很低,在淬灭或提取过程中又会被稀释,所得的样品体积一般很少,这些都将严重影响酶法定量的可靠性。代谢组学定量胞内外代谢物的分析方法要求具有高灵敏度、高通量和无偏向性的特点。在分析复杂的胞内外产物时,所选用的分析方法是十分重要的,一般根据样品的特性和试验目的,选择最合适的分析方法。目前最常用的分离分析手段是气相色谱与质谱联用(GC-MS)、液相色谱与质谱联用(LC-MS)、毛细管电泳与质谱联用(CE-MS)以及核磁共振(NMR)。

2.1质谱联用技术GC-MS是代谢组学常用的方法,原先主要应用于植物组学研究,随着代谢工程和分析技术的快速发展,其在微生物代谢组学的应用越来越引起关注。GC-MS的分离效率高,易于使用且较为经济,特别是采用标准的电子轰击(EI)模式后,其使用范围和重复性都进一步提高。但是GC-MS需要对挥发性较低的代谢物进行衍生化预处理,这一步骤会耗费额外的时间,甚至引起样品的变化。受此限制,GC-MS无法分析热不稳定性的物质和分子量较大的代谢产物。近来,多维分离技术如二级气相色谱飞行时间质谱(GC-GC-TOF-MS)[14],检测范围更广,但由于实际应用困难和花费较高等问题使其并未普遍使用。第1篇关于微生物代谢组学的文献报道了应用3种不同的GC-MS技术,分析肠系膜明串珠菌发酵生产葡聚糖过程中脂肪酸、氨基酸和糖类以监测微生物污染[15]。

LC-MS无需进行样品的衍生化处理,检测范围广,可以作为GC-MS的补充,非常适合于生物样本中低挥发性或非挥发性、热稳定性差的代谢物。LC 与电喷雾(ESI)质谱连用可以分析大部分极性代谢物[16],此外,离子配对(IP)LC-MS[17]、亲水相互作用液相色谱HILIC-MS[18]、反相LC-MS[19]等可以进行不同种类代谢物的及时定量分析。Brauer等[20]利用HILIC-MS获得了大肠杆菌和酿酒酵母饥饿胁迫应答的代谢指纹图谱,测出68种胞内代谢物的浓度发生了改变。LC-ESI-MS-MS分析被用于测量葡萄糖冲击下的酿酒酵母的糖分解和三羧酸循环中间代谢产物[21]。

CE-MS分离样品效率比普通的色谱质谱联用要高得多,仅需要极少的进液量(nL),而且其测试时间短,试剂成本低。CE-MS在微生物代谢组领域发

挥着越来越重要的作用。Ohashi等[22]通过CE-TOF-MS对大肠杆菌的阴离子和阳离子代谢产物进行了全面分析和定量,鉴别出主要代谢物中的375个亲水性中间体,并对其中的198个代谢物进行了定量。Harada等[23]运用反相电渗流(EOF)CE-MS高效分离了辅酶A、有机酸、核苷酸和磷酸糖。Soga等[24]用CE-MS系统研究了枯草杆菌在芽孢发生过程中的代谢谱的变化过程,识别出1692种代谢物,并鉴别出其中的150种。

2.2核磁共振技术NMR没有偏向性,对所有化合物的灵敏度是一样的。其次,NMR无损伤性,不破坏样品的结构和性质,可在接近生理条件下进行试验,可在一定的温度和缓冲液范围内选择试验条件,可以进行实时和动态的检测。目前常用的有氢谱(1H-NMR)、氟谱(19F-NMR)、碳谱(13C-NMR)和磷谱(31P-NMR)。Majors等[25]利用1H-NMR-MS原位监测厌氧真杆菌(Eubacterium aggregans)的糖利用和产物的生成,首次发现其代谢会产生一定浓度的乳酸。Boersma等[26]通过19F-NMR发现了微生物中氟苯异苯酚和羟基苯的代谢路径,并推测该路径可能与代谢型的表达相联系。Rager等[27]在观察类志贺邻单胞菌代谢甘露糖的过程中用31P-NMR和13C-NMR分析细胞成分,研究发现在含甘露糖的培养基中该菌生长缓慢,是因为6-磷酸甘露糖的毒性而非能量的逐渐消耗。

3数据分析策略

在代谢组学研究中,大多数是从检测到的代谢产物信息中进行两类(如基因突变前后的响应)或多类(如不同表型间代谢产物)的判别分类以及生物标记物的发现[28]。由于生物样品的组成复杂,在得到分析对象的原始谱图后,首先需要对数据进行预处理(归一化和滤噪),消除干扰因素,保留有用信息。数据的解析可分为如下3个基本步骤[29]:(1)提取出色谱分离(如GC-MS)后未能有效分开的代谢物峰并得出其相应浓度;(2)根据其保留时间及质谱图等信息鉴别有效峰所代表的化合物;(3)根据代谢数据建立代谢网络模型。

代谢组学分析得到的是信息含量丰富的多维数据。为了充分挖掘出其中的有用信息,需要运用化学计量学理论和多元统计分析新方法。解决复杂体系中归类问题和标记物鉴别的主要手段是模式识别,通常包括监督和非监督2种分类方法。非监督方法不需要有关样品分类的任何背景信息,而监督分类可以由已知推测未知。目前常用的是非监督分类方

法中的主成分分析(PCA)、非线性影射(NLM)以及监督分类方法中的偏最小二乘法(PLS)和神经网络(NN)。Elmroth等[15]就是结合化学计量学方法分析了肠系膜明串珠菌发酵过程中的微生物污染问题。van der Werf等[30]对生长于不同碳源条件下的恶臭假单胞菌代谢组进行了全面分析,应用PCA鉴别特殊代谢产物,发现其在生长于不同碳源条件下的细胞中的含量明显不同。

由于代谢组学分析技术和操作条件的多样化,致使大量的数据缺乏规范性,从而造成代谢组学数据的采集、存储、查询、比较和共享等的诸多不便。现今,已有一些生化数据库可供未知代谢物的结构鉴定或用于已知代谢物的生物功能解释,如KEGG[31]、EcoCyc[32]、UM-BBD[33]和WIT[34]。但是,与基因组学和蛋白组学已有较完善的数据库供搜索使用相比,目前代谢组学研究尚无类似的功能完备数据库。

4问题与展望

由于微生物种类以及代谢物的复杂多样,微生物代谢组学研究的每个步骤都涉及特殊的挑战。迄今,在微生物淬灭和提取工艺中尚无普适的方法,微生物代谢组学目前和相当一段时间内的目标仍是多种提取方法互补。在分析技术方面,微生物样本的复杂性使得代谢组学研究对分析技术的灵敏度、分辨率、动态范围和通量提出了更高的要求。采用多种技术相结合,从多个角度、多个层次进行全组分研究,设法展现并解析所有谱峰,应该是微生物代谢组学分析技术发展的方向。在数据分析方面,如何从大量的代谢产物中找出特异性的生物标记物(特别是低丰度的标记物)成为重点和难点。同时缺乏标准的可通用的数据库,这从一定程度上制约了各种分析技术在代谢组学中的应用,功能完善的代谢产物数据库的构建及代谢组学研究的标准化等问题越来越受到关注。

目前,代谢组学正处于快速发展阶段,日益成为研究的热点。随着研究的深入,代谢组学必将在微生物领域中发挥更大的作用,帮助人们更深地了解微生物生态系中各种复杂的相互作用,微生物细胞对环境和基因变化的响应,为人们提供一个了解微生物表型的独特途径。而高通量、高分辨率的分析技术与生物信息学相整合,从研究微生物代谢层面上提供了了解微生物体的独特视角。同时,将微生物代谢组学、基因组学、转录组学和蛋白质组学整合,并相互呼应验证,将是微生物代谢组学发展的方向。

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中草药防治鸡球虫病研究进展

廖佩章福州金和生物科技有限公司福州350002

文献标识码:A文章编号:1003-4331(2009)03-0033-03

鸡球虫病是由艾美耳属的多种球虫寄生在鸡的肠道引起,其危害极大,不仅给养鸡业造成巨大的经济损失,同时还严重影响人类的食品来源和健康。虽然国内外专家学者对鸡球虫病疫苗的研究有了一定进展,但仍存在诸多问题,短期内难以推广应用,所以,药物防治仍是主要手段[1]。可是持续使用高剂量西药易产生毒副作用、抗药性、药物残留,对鸡肉、蛋和公共卫生的危害越来越严重。中草药在防治鸡球虫病方面显示出良好势头,具有很好的发展前景。另外,中草药添加剂的应用为药物预防鸡球虫病开辟了一条新途径。

1药物及制剂

1.1驱虫类它是指能够直接杀死虫体或抑制虫卵、虫体生长发育的一类药,是防治鸡球虫病的常用药。常见药有常山、鸦胆子、仙鹤草根芽、苦楝皮、百部、冰片、雄黄等,其中以常山最为常见。

1.2清热燥湿类球虫病按中医学辨证为湿症,故治疗上以清热燥湿为主。较为常见药有黄连、黄芩、黄柏、白头翁、秦皮、苦参等。

1.3清热解毒类具有清热、解毒、利湿的药物。常用药物有青蒿、马齿苋、柴胡、白茅根、蒲公英、地锦草、穿心莲、败酱草等[2]。

1.4补益气血类用以提高机体抵抗力,增强机体杀虫、驱虫作用的一类药物。如党参、当归、熟地、黄芪等。

1.5活血止血类用以对症治疗球虫病的出血,如丹参、桃仁、地榆炭、仙鹤草、白及等[2]。

1.6临床上常用制剂常用的复方制剂仍以临床上验证的为主,常见的有:球虫净(常山、柴胡加水煎煮而成)、驱球散[3](由常山、柴胡、苦参、青蒿等中药组成)、白头翁苦参散[4](白头翁、苦参、鸦胆子各等份)、藿香正气散(由藿香、紫苏、茯苓、白芷、白术、厚朴、常山、地榆、玄参、地锦草等中药组成),另外还有百球威克冲剂[5](主要由常山、地榆、仙鹤草、苦参等中药组成)、净球散[6](由常山、苦参、黄芪等组成)、球虫散[7](由常山和柴胡等7味中药组成)、鸡球康Ⅲ[8](由苦参、白芍、山楂、五味子、大黄、白头翁、甘草等中药组成)以及由中草药和西药组成的复方制剂,如李蕴玉等[9]用中药(白头翁、苦参、地榆、黄柏、青蒿等8味中药按比例混合而成)和地克珠利联合进行抗球虫试验,发现地克珠利0.5mg/kg+中药5.0g/kg组和地克珠利1.0mg/kg+中药5.0g/kg组的抗球虫指数分别达20

2.4与202.8,比单独使用地克珠利和中药分别提高了11.89、12.11和2

3.34、23.58,与不感染不给药组比较差异不显著(P>0.05),李佩国等[10]用中药(白头翁、苦参、地榆、甘草等10味中药组成)5.0g/kg和西药(环丙沙星)10mg/kg联合抗球虫发现,该组抗球虫指数达188.76,比马杜霉素组和中药组分别高6.49%、9.43%。吴仕华[11]运用西药(氨丙啉、克球粉、抗球王等驱虫药)结合中药(常山、连翘、柴胡、生石膏按比例混合)在临床上球虫病治愈率达87.8%~96.6%。

2作用及作用机制

我国科学工作者根据中草药的四气五味及归经、主治等理论,合理配伍,制定治则和治法,制成剂型,调整相关脏腑的功能或由疾病所损伤的其他脏腑,从而达到标本兼治扶正祛邪的目的。

生产实践中越来越多的中草药被证实对球虫有一定作用[12]。青蒿、常山、苦参、野菊花、鸦胆子、丁香叶、蛹虫草、地墨等含有抗球虫的生物碱,具有抗球