加味白头翁汤对肉仔鸡免疫功能的影响

动物医学进展,2011,32(2):37 41

Pr ogress in Veterinary Medicine

加味白头翁汤对肉仔鸡免疫功能的影响*

鲁改儒,弓素梅,刘荣欣

(河北农业大学中兽医学院,河北定州073000)

摘 要:将120只1日龄肉仔鸡,随机分为4组, 组和 组分别按中(正常采食量的0.75%)和高(正常采食量的1%)剂量给予加味白头翁汤煎剂, 组饮用硫酸庆大霉素注射液每次2000单位/只,2次/d,连续6d, 组为正常对照组。各组分别于用药后0、3、6d采血,测定鸡外周血T、B细胞活化情况、红细胞C3b 受体(E C3bRR)花环形成率、Ea玫瑰花环形成率。结果表明,中剂量组白头翁汤能显著提高T细胞的转化率(P<0.01)、Ea玫瑰花环形成率(P<0.01)和C3b受体花环形成率(P<0.01)。高剂量白头翁汤在各时间点均低于中剂量。提示加味白头翁汤能有效提高肉仔鸡的特异性免疫和非特异性免疫功能。

关键词:加味白头翁汤;肉仔鸡;免疫功能

中图分类号:S859.7文献标识码:A文章编号:1007 5038(2011)02 0057 05

近年来免疫学理论和方法被广泛应用于中药研究领域,大量研究证实中药在提高畜禽机体免疫力、防治疾病等方面,具有独特作用[1]。有些中药不但具有抑杀细菌、病毒的作用,而且能够调节机体的免疫功能,具有非特异性的抗病毒功能。中药中含有的苷类、生物碱、有机酸、挥发油等免疫活性物质,能活化机体的免疫系统,对正常或异常机体的细胞免疫和体液免疫功能具有增强或调节作用[2]。此外,中药对处于不同免疫状态下的动物可产生双向调节作用。加味白头翁汤依据中兽医学辨证施治的理论组方,体现了清热燥湿、健脾止泻的组方原则。前期的试验研究表明,加味白头翁汤对大肠埃希菌诱发的腹泻性疾病有显著的预防和保护作用。本试验通过测定外周血T、B淋巴细胞活化情况、红细胞C3b 受体(E C3bRR)花环形成率、Ea玫瑰花环形成率,分析加味白头翁汤对肉仔鸡的特异性免疫以及非特异性免疫功能的影响,旨在为开发优质高效的中药免疫增强剂提供参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验鸡 1日龄罗斯308肉仔鸡,廊坊大城肉鸡孵化场提供。

1.1.2 饲料 不含任何抗菌药物的肉用仔鸡全价颗粒料,石家庄希望饲料责任有限公司提供。

1.1.3 药物与试剂 加味白头翁汤方剂(由白头翁30g、黄连15g、黄柏20g、秦皮20g、木香15g、石榴皮15g、黄芪20g、葛根20g、车前子15g九味中药组成,均购于定州市恒安大药房);硫酸庆大霉素注射液(2mL:8万单位/支,批号:068090831,石药集团欧意药业有限公司生产);肝素钠(天津市生物化学制药厂,批号:20090907);淋巴细胞分离液为北京利科生化科贸有限公司产品;新生牛血清为北京元亨圣马生物技术研究所产品,批号:090608;

H ank s平衡盐溶液(H BSS)(10倍浓缩液);RPMI 1640溶液(由GIBCOBRL生产,批号1099213),按说明配制;完全RPM I1640培养液(CM),70%基础培养液中加入300mL/L犊牛血清;噻唑蓝(M TT),Sigm a M 2128分装;台盼蓝,为北京利科生化科贸有限公司产品;酵母多糖试剂(上海长海医院免疫室产品);大肠埃希菌脂多糖(LPS),Sig m aL2880分装;伴刀豆球蛋白(ConA),BDH44203分装;瑞氏 姬姆萨染色液,河北农大微生物试验室提供;戊二醛溶液。

1.2 方法

1.2.1 中药煎制 加味白头翁药方用10倍的水浸泡20min,煎煮20min,倒出药液,加水再煎20min, 2次药液合并、浓缩、离心后定容至生药浓度为1g/m L,高压灭菌后于4 冰箱中保存,备用[5]。

1.2.2 动物分组及处理 将120只1日龄健康肉仔鸡随机分成4组,每组30只。 组为加味白头翁

*收稿日期:2010 09 21

基金项目:河北省畜牧兽医局科技项目(2009 1 08)

作者简介:鲁改儒(1966-),女,河北人,高级讲师,硕士研究生,主要从事畜禽微生物学、药理学研究。

汤中剂量组(正常采食量的0.75%); 组为加味白头翁汤高剂量组(正常采食量的1%); 组为硫酸庆大霉素组; 组为正常对照组。由于低剂量组在前期试验中抗感染能力过低,因此本次试验将不再设此剂量组。1日龄雏鸡常规饲养预饲3d后(第4天), 、 组将中药制剂分别按正常采食量0.75%、1%的比例混入饮水中,分上、下午2次给药,连续饮用6d。 组混饮庆大霉素注射液每次2000单位/只,2次/d,连续饮用6d。 组常规饲养。

1.2.3 鸡外周血T、B淋巴细胞活化情况测定

1.2.3.1 鸡外周血单个核细胞(PBM C)的制备 于用药后0(用药前1d)、3、6d从4组试验鸡分别随机抽取5只,无菌心脏采集抗凝血,按文献[6 7]方法,分离外周血单个核细胞(PBM C),并进行淋巴细胞功能测定,采用丝裂原或抗原刺激的淋巴细胞增殖反应,测定T淋巴细胞、B淋巴细胞的活化情况。

1.2.3.2 鸡外周血T、B淋巴细胞活化试验 参照文献[7],将分离到的 、 、 和 组单个核细胞以完全RPM I1640培养液调至1 106个/m L,按下述方法进行活化试验:96孔培养板上,每组6孔,每孔加相应的单个核细胞100 L,每组前3孔再加伴刀豆球蛋白应用液25 L,单个核细胞75 L;后3孔加大肠埃希菌脂多糖应用液50 L,单个核细胞50 L。阴性对照组:每孔加正常对照组的单个核细胞100 L,完全RPM I1640培养液100 L。空白对照组:每孔加完全RPM I1640培养液200 L。最后每孔总量为200 L。置96孔细胞培养板于水饱和恒温培养箱37 培养72h。培养38h时,每孔轻轻吸去上清液100 L,补加50 L不含小牛血清的RPM I1640培养液,同时加入5mg/mL的噻唑蓝溶液50 L,于震荡器上混匀约1min,置37 恒温培养箱继续培养4h。培养结束后,取出培养板,吸取各孔上清液移入相应试管,每管加入1.5mL二甲基亚砜,吹打混匀后置4 冰箱过夜。取上清液于1m L比色杯中,于756分光光度计570nm波长处以空白对照孔调 0 值,测OD值,计算刺激指数(stimulatio n index,SI)。SI=试验孔OD值/阴性对照孔OD值

1.2.4 Ea 玫瑰花环形成率的影响

1.2.4.1 绵羊红细胞悬液的制备 取绵羊脱纤血,用H ank s液洗涤3次(1500r/min离心10min)。取压积红细胞用H ank s液配成10m L/L绵羊红细胞悬液。1.2.4.2 Ea 玫瑰花环的形成 取上述单个核细胞0.2mL,加绵羊红细胞悬液0.2mL,和吸取灭活的小牛血清0.1mL混匀,500r/min离心5m in,弃上清,留下约0.1mL液体,立即沿管壁加入1滴8m L/L戊二醛溶液,5min后取1滴涂片,经瑞特染色液染色,高倍镜下计数。凡淋巴细胞周围吸附3个或3个以上红细胞者,即为E玫瑰花环形成细胞,计数200个淋巴细胞,计算E玫瑰花环形成细胞百分数。

1.2.5 红细胞C3b受体(E C3bRR)花环形成率的影响 参照文献[8]进行。

1.2.5.1 红细胞悬液制备 取15 L上述淋巴细胞分离液分层的下层红细胞,加适量生理盐水充分混匀,调整红细胞浓度约为1.25 107个/mL备用。

1.2.5.2 C3b致敏酵母悬液制备 将新鲜酵母菌液用生理盐水洗涤2次(1000r/min,离心10m in),煮沸,加适量生理盐水充分混匀,调整酵母菌浓度约2 108个/mL,然后加等量新鲜兔血清,混匀,37 水浴20min,即得2 108个/m L的C3b致敏酵母悬浮液。

1.2.5.3 E C3bRR花环形成 分别取50 L C3b 致敏酵母悬浮液和50 L各组红细胞悬液于同一试管中,混匀,于37 水浴中感作40min后取出,轻轻摇起,加100 L生理盐水稀释混匀,加2.5mL/L 戊二醛20 L固定,涂片,冷风吹干,用瑞氏 姬姆萨液染色4min,蒸馏水冲洗,干后镜检。在每张片子上数200个红细胞,1个红细胞上黏附2个或2个以上酵母菌为1个花环,重复阅片2次,以两次平均值记录E C3bRR。

1.2.6 数据分析与处理 试验数据用SPSS13.0分析软件进行处理,以单变量方差分析(one w ay ANO VA)进行统计学分析,测定结果以平均数 标准差( X SD)形式表示,P<0.05表示差异显著, P<0.01表示差异极显著。

2 结果

2.1 鸡外周血T、B淋巴细胞活化试验

2.1.1 鸡外周血T淋巴细胞体内活化动态变化 从表1可以看出,中药中剂量组、高剂量组的T细胞对伴刀豆球蛋白(ConA)刺激反应在药物添加6d 内呈现先升高后降低趋势,庆大霉素组与正常对照组呈现下降趋势,正常对照组尤其明显。用药前各试验组与对照组之间SI值差异均不显著(P> 0.05);用药后3d,各用药组与正常对照组的T细胞对伴刀豆球蛋白(ConA)刺激反应差异极显著(P <0.01);不同药物添加后6d,各用药组与正常对照

38动物医学进展 2011年 第32卷 第2期(总第212期)

组的T细胞对伴刀豆球蛋白ConA刺激反应差异极显著(P<0.01),中药中剂量组在各时间点均高于高剂量组,差异显著(P<0.05)。中药高剂量组与庆大霉素组差异不显著(P>0.05)。

表1 各组鸡外周血T淋巴细胞活化结果

T able1 Th e resu lts of peripheral T lym phocyte activation in broils in each group

组别Groups

用药后0d

0d after adminis tration

用药后3d

3d after adm inistration

用药后6d

6d after administration

1.18 0.09

2.15 0.14** 1.06 0.06**

1.16 0.12 1.57 0.05**0.88 0.11**

1.23 0.08 1.12 0.06**0.74 0.02**

1.08 0.040.54 0.030.52 0.07 注:*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01)。

Note:*show s significant difference(P<0.05),**show very significant difference(P<0.01).

2.1.2 鸡外周血B淋巴细胞体内活化动态变化 从表2可以看出:用药后0d时,各用药组B淋巴细胞转化率差异不显著(P>0.05),3d、6d时各组间鸡外周血B淋巴细胞转化率差异也不显著(P>0.05)。随着日龄的增加,大肠埃希菌脂多糖(LPS)刺激下B淋巴细胞的转化率呈现明显下降趋势。说明加味白头翁汤不能提高鸡体的体液免疫水平。

表2 各组鸡外周血B淋巴细胞活化结果

T able2 T he results of p eriph eral B lymp hocyte activation in b roils in each group

组别Groups

用药后0d

0d after adminis tration

用药后3d

3d after adm inistration

用药后6d

6d after administration

3.68 0.21 1.18 0.15 1.13 0.39

3.41 0.34 1.04 0.330.91 0.14

3.42 0.17 1.43 0.38 1.06 0.23

3.39 0.29 1.06 0.27 1.11 0.26 注:*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01)。

Note:*show s significant difference(P<0.05),**show s very significant difference(P<0.01).

2.2 中草药对肉仔鸡Ea一玫瑰花环形成率的影响 由表3可知,用药后0d各组Ea玫瑰花环率差异不显著(P>0.05),用药后3d中药中剂量组Ea 玫瑰花环率较高,与对照组相比,差异显著(P< 0.05),与中药高剂量组比较,差异不显著(P>0.05)。在用药后6d,中药高剂量组和中剂量组Ea 玫瑰花环率均较高,与对照组相比,差异显著(P< 0.05),中药中剂量组Ea玫瑰花环率在用药后各时间点均高于高剂量组。

表3 不同药物对肉仔鸡Ea 玫瑰花环形成率的影响

T able3 Effect of different dru gs on Ea rosette formation rate in broilers%

组别Groups

用药后0d

0d after adminis tration

用药后3d

3d after adm inistration

用药后6d

6d after administration

20.13 1.7823.89 1.08*26.40 2.35*

20.21 1.2822.64 2.1226.37 1.67*

20.41 2.5321.63 1.6622.39 1.53

20.35 2.3721.35 1.1922.48 2.52 注:*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01)。

Note:*show s significant difference(P<0.05),**show s very significant difference(P<0.01).

2.3 中药对肉仔鸡红细胞C3b受体花环形成率的影响

从表4可知,用药前各试验组与正常对照组之间红细胞C3b受体花环形成率(E C3bRR)无显著差异(P>0.05);用药后3d,各用药组均可提高C3b 受体花环形成率,中药中剂量组C3b受体花环形成率显著高于其他3组,差异极显著(P<0.01);用药后6d,中药中剂量组、高剂量组与正常对照组相比,差异仍极显著(P<0.01),同时中药中剂量组与高剂量组,庆大霉素组与正常对照组差异不显著(P> 0.05),但中药中剂量组C3b受体花环形成率在各时间点均高于高剂量组。

39

鲁改儒等:加味白头翁汤对肉仔鸡免疫功能的影响

表4 不同药物对肉仔鸡红细胞C3b受体花环形成率的影响

Table4 E ffect of different drugs on RBC C3bR formation rate in broilers%

组别Groups

用药后0d

0d after adminis tration

用药后3d

3d after adm inistration

用药后6d

6d after administration

2.15 0.75 4.97 0.92** 4.98 0.48**

2.20 0.82

3.16 0.41

4.35 0.69**

2.18 0.69 2.48 0.73

3.31 0.76

2.31 0.55 2.52 0.53

3.02 0.43 注:*表示差异显著(P<0.05),**表示差异极显著(P<0.01)。

Note:*show s significant difference(P<0.05),**show s very significant difference(P<0.01).

3 讨论

3.1 中药对鸡外周血T、B淋巴细胞活化的影响

淋巴细胞的增殖和活化是机体免疫系统发挥免疫应答作用的先导阶段。当T、B细胞受到有丝分裂原或抗原刺激时均可发生增殖和分化,但各种亚群淋巴细胞对外来刺激物的敏感性不同,T细胞对植物血凝素(PH A)、伴刀豆球蛋白(ConA)等比较敏感,B细胞对大肠埃希菌脂多糖(LPS)敏感。T细胞在体外经某种物质(如PH A、PWM、黄豆凝集素、花生凝集素)刺激,发生一系列增殖变化,转化为淋巴母细胞。转化率高低,可反映机体的免疫功能状态。本试验结果显示,加味白头翁汤中、高剂量组作为饲料添加剂添加3、6d后,与对照组、西药组相比,能明显提高肉仔鸡T细胞对伴刀豆球蛋白刺激的增殖效应,表明机体的免疫水平在药物添加期内维持在高水平,动物的免疫力增强,起到防病、抗病作用。同时本研究表明,加味白头翁汤中剂量组的T细胞增殖能力高于高剂量组,推测这可能是前期感染试验中,加味白头翁汤中剂量组抗大肠埃希菌感染能力高于高剂量组的原因所在。白头翁具有增强免疫功能的作用[9 10],黄芪多糖具有增强机体免疫功能,刺激T、B细胞功能[11],增强NK细胞活性,并可诱导机体产生干扰素的作用。本本试验中 加味白头翁汤 以白头翁为主药,以黄芪作为加味药,整个方剂表现出使机体T细胞的增殖能力增强,推测可能是通过白头翁和黄芪多糖的作用而提高机体的细胞免疫水平,同时这也可能是白头翁汤抗感染性强的分子机制所在。

B细胞一般被认为是介导机体的体液免疫。本试验中加味白头翁汤中、高剂量组、庆大霉素组均不能提高机体B细胞对LPS刺激的效应,且随着日龄的增长,机体的B细胞对LPS的刺激反应呈明显下降趋势。表明加味白头翁汤对肉仔鸡体液免疫功能的调节作用不明显。

3.2 中药对肉仔鸡Ea 玫瑰花环形成率的影响

早期玫瑰花环形成的T细胞是对SRBC(绵羊的红细胞)具有高度亲和力的T细胞亚群,它与T 细胞的体内外功能活动密切相关,能更敏感地反映机体细胞免疫的水平和动态变化,是目前检测细胞免疫水平更为简便快速的方法之一。本试验结果表明,应用加味白头翁汤能增加Ea玫瑰花环率,说明加味白头翁汤在促进淋巴细胞分化、调节细胞免疫功能上具有一定的功效。

3.3 中药对肉仔鸡红细胞C3b受体花环形成率的影响

自从Siege提出了 红细胞免疫系统(RCIS) 概念以来,国内外学者对多种动物红细胞(RBC)免疫功能进行了测试,并将其作为反映机体免疫机能状态的指标之一[12]。红细胞具有识别、黏附、杀伤抗原、清除免疫复合物、而且参与机体免疫调控,其本身还存在有完整的自我调控系统,是机体完整免疫系统中的一个子系统。C3b受体花环率是判定红细胞免疫功能的主要指标。在本试验中,加味白头翁汤中、高剂量组与其他试验组相比E C3bRR表现为不同程度的升高。这说明加味白头翁汤刺激了鸡红细胞膜表面的C3b受体,使红细胞膜表面游离状态的C3b受体活性增强,从而使RBC、C3bRR(红细胞C3b受体花环率)增高。进而增强了红细胞的免疫黏附功能。结合前期人工感染试验死亡率来看,说明红细胞免疫功能的破坏直接或间接影响机体免疫功能的协调,机体红细胞免疫功能的降低可能是继发感染的免疫学理论依据,若 加味白头翁汤 作为饲料添加剂合理添加,可防止继发感染,从而减少发病率和死亡率。

综上所述,加味白头翁汤能有效提高机体的免疫功能。在试验所选取的范围内,中剂量组免疫增强效果最好,对肉仔鸡的特异性免疫以及非特异性免疫均有增强作用,这为进一步开发优质高效的中药免疫增强剂提供了理论依据。

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Effects of Modified Baitouweng Decoction on Immune Function in Broils

LU Gai ru,GONG Su m ei,LIU Ro ng x in

(Colleg e of T rad itional Ch inese Vete rinary M ed icine ,A g ricultur al Univ er sity of H ebe i,Din gz hou,H ebei,073000,Ch ina)

Abstract:T o study the effect of mo dified Baitouw eng decoction on im mune function in bro ils,120one day old broilers w ere randomly div ided into 4gr oups,group and w er e fed w ith middle(0.75%of nor mal intake)and high (1%of normal intake)dose of medicine,g roup w ith gentam icin sulfate 2000IU of each,2tim es one day,continuo us six day,g roup is healthy contr ol.T he per ipheral bloo d T,B ly mpho cyte activatio n,red blood cell C3b receptor s (E C3bRR)ro sette for matio n rate,Ea rosette formation r ate w ere determ inated after tr eatment 0,3,6d.T he results show ed that the middle dose o f Pulsatilla decoc tion could sig nificantly increase the T cell conversion rate (P <0.01),Ea rosette formation rate (P <0.01)and C3b receptor rosette formation rate (P <0.01).The effect o f Pulsatilla decoctio n hig h do se w ere low er than that of the middle dose.M odified Baitouw eng decoction can improv e the specific and no n specific immune functions in bro ilers.

Key words:Modified Baitouw eng decoctio n;bro iler;im mune functio n

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鲁改儒等:加味白头翁汤对肉仔鸡免疫功能的影响