狼疮肾炎患者肾组织中Toll样受体9的表达

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(2010 06 30收稿 责任编辑李沛寰)

狼疮肾炎患者肾组织中Toll样受体9的表达

史晓飞1),赵占正2)#,刘升云2),高冠民2)

1)河南科技大学第一附属医院风湿免疫科洛阳471003 2)郑州大学第一附属医院肾病风湿科郑州450052

#通讯作者,男,1970年10月生,博士,副主任医师,研究方向:慢性肾功能衰竭的防治,E m ai:l zhanzheng@m ed m a i.l https://www.wendangku.net/doc/d418941867.html,

关键词 T o ll样受体9;狼疮肾炎;CpG DNA;系统性红斑狼疮

中图分类号 R593.2

摘要 目的:探讨T o ll样受体9(TLR9)在狼疮肾炎(LN)患者肾组织的表达及其临床意义。方法:选取57例LN患者(病理分型: 型8例,型12例,!型20例,?型17例)和11例正常对照的肾组织,应用免疫组织化学SP法检测TLR9表达情况,并对LN患者肾组织TLR9与肾脏病理和临床实验室指标相关性进行分析。结果:各型LN患者肾组织中肾小球、肾小管间质TLR9表达与正常肾组织比较差异均有统计学意义(F=19.016和17.731, P<0.001)。LN患者肾小球TLR9表达水平与肾脏病理活动指数(A I)、肾小球细胞增殖程度、24h尿蛋白定量呈正相关(r/r

s

=0.891、0.563和0.417,P均<0.001),与肾小球滤过率(e G FR)呈负相关(r=-0.525,P<0.001);肾

小管间质TLR9表达水平与A I、肾小管间质损害程度、24h尿蛋白定量呈正相关(r/r

s

=0.726、0.609和0.354,P 均<0.001),与eGFR呈负相关(r=-0.515,P<0.001)。结论:LN患者肾小球和肾小管间质中TLR9表达增高,并与肾脏病理活动程度相关。

Expressi on of Toll li k e recept or9i n renal ti ssue of patients w ith l upus nephritis

SH I X iaofei1),Z HAO Zhanzheng2),LIU Shengyun2),GAO Guanm in2)

1)D e part m ent o f Rheum atology,the F irstAffiliated H os p ital,H enan University of Science and Technology,

Luoyang471003 2)D epart m ent of N ephrology and R heu m ato logy,t h e F irst Affiliated H os p ital,Zheng zhou Un i v ersit y,Zhengzhou450052

K ey word s T oll li ke recepto r9;l upus nephritis;Cp G DNA;system i c l upus erythe m atosus

Abstract A m i:To i nvestigate the expressi on o fT o ll li ke receptor9(TLR9)i n renal tissue o f pati ents w ith l upus ne phr iti s(LN)and its cli n i ca l si gn ificance.M ethods:The express i on o f TLR9was exam ined in t he rena l tissue o f57LN pa ti ents and11hea lthy contro l s by i m m unoh istochem istry.T he re lati onshi p bet w een t he expressi on of TLR9and t he rena l patho log ica l i ndexes and t he c li n ica l para m eters w as ana l y zed.Resu lt s:In renal tissue of LN pati ents,the expression o f TLR9w as h i gher i n g l o m e rular and tubulo i ntersti tia l than i n healthy contro l s(F=19.016and17.731,P<0.001).M o reo ver,the expressi on of TLR9i n g lo m eru li show ed pos i tive co rre l a ti on w it h the h i stopa t ho l ogy acti v ity i ndex(A I)o f renal tis

sue,g lo m erular cell ular pro lifera tion and24 h ur i nary prote i n(r/r

s

=0.891,0.563and0.417,P<0.001),and negati v e

co rre l a ti on w it h t he esti m a ted g l om erular filtrati on ra te(eGFR)(r=-0.525,P<0.001).T he expressi on of TLR9i n tubu lo i nterstitial showed positi v e co rre lati on w ith A I,the deg ree of t ubu l o i nterstiti a l da m age and24 h uri nary prote i n(r/r

s

= 0.726,0.609and0.354,P<0.001),and negati ve corre lati on w it h the e G FR(r=-0.515,P<0.001).Conclusion: T he expressi on of TLR9increases i n g l ome rular and i nterstiti a l o f LN pa tients,w hich i s co rre l a ted w ith prog ress o f rena l his tolog i ca l da m age.

系统性红斑狼疮(syste m ic lupus er y the m atosus, SLE)是一种常见的自身免疫性疾病,累及多个脏器,几乎所有患者均可出现肾脏受累,其严重程度是决定SLE预后的重要因素之一[1]。目前狼疮肾炎(lupus nephritis,LN)发病机制尚不明确,普遍认为多种因素作用下体内B细胞多克隆激活,导致大量自身抗体产生,免疫复合物增多,循环免疫复合物沉着和原位免疫复合物在肾脏不同部位沉积导致肾脏损害是LN发生发展的关键环节。研究[2]发现TLR 样受体9(Toll li k e receptor9,TLR9)能够特异性识别内源或外源DNA中非甲基化的CpG DNA基序,启动炎性应答信号通路,活化自身反应性T、B细胞并诱导自身抗体、炎性分子产生,引发炎症反应和免疫效应。作者采用免疫组织化学SP法检测人LN 肾组织中TLR9的表达情况,并分析其与肾脏病理改变和实验室指标的关系,为阐述TLR9在LN中的潜在作用和临床意义提供新的理论依据。

1 材料与方法

1.1 标本来源 57例LN为郑州大学第一附属医院住院患者,诊断符合1997年美国风湿病学院修订的SLE分类标准[3],经肾穿刺活检后确定为LN。

I SN/RPS病理分型 型8例、型12例、!型20例和?型17例,未发现+?和!+?混合型。57例LN中男5例,女52例,年龄16.0~54.0(29.0?9.1)岁,病程1~59个月。所有LN患者肾穿刺活检前1个月内无感染史,未接受大剂量糖皮质激素或环磷酰胺等免疫抑制剂强化治疗。对照组肾组织标本11例,来自同期外科肾肿瘤切除时远离肾肿瘤的边缘正常肾和肾移植配型不合供肾,均经光镜证实肾组织正常,其中男2例,女7例,年龄17.0~ 24.0(27.3?10.2)岁,病程2~60个月。

1.2 LN肾组织病理学检测 %根据肾小球细胞高度增多、白细胞浸润、核碎裂/纤维素样坏死、细胞性新月体、白金耳样结构、微血栓形成和小管间质炎症,按无、轻、中和重分别评为0、1、2和3分(核碎裂/纤维素样坏死及细胞性新月体记分再乘以2),各项相加得LN肾脏肾组织病理活动指数(A I)[4]。&计算平均每个肾小球横切面中细胞数目,进行肾小球细胞增殖程度半定量分级[5],分为0、1、2和3级。?根据皮质区的肾间质炎症细胞浸润、肾小管萎缩和间质纤维化状态,对肾间质小管损害程度进行半定量分级[6],分为0、1、2和3级。

1.3 肾组织中TLR9蛋白测定 应用免疫组织化学染色SP法。鼠抗人TLR9单克隆抗体购自美国A lex is公司;SP免疫组织化学试剂盒和DAB显色剂购自福建迈新生物公司。石蜡组织切片厚4 m,常规脱蜡、脱水;PBS冲洗,抗原修复液微波修复;冷却后PBS冲洗3(5m i n,体积分数3%过氧化氢液孵育20m i n,清除内源性过氧化物酶;PBS冲洗3(5 m i n,滴加羊血清封闭20m i n;倾去血清,加入TLR9一抗(工作浓度1 100),湿盒内4)过夜;PBS冲洗3(5m in,加试剂二抗,湿盒内室温孵育20m i n; PBS冲洗3(5m i n,加试剂三抗,湿盒内室温孵育20m i n;PBS冲洗,DAB溶液显色;苏木素复染,中性树胶封片。以正常羊血清代替一抗作阴性对照。结果判断标准[7]:染色强度根据胞质着色深浅分为,无着色为0分;浅黄色为1分;深黄色为2分;棕黄色为3分。应用H PI A S 1000高清晰病理图文分析系统分别计算肾小球和小管间质中阳性目标面积/统计场面积比,染色面积<5%为0分,~20%为1分,~40%为2分,>40%为3分。总分=染色面积(染色强度。

1.4 24h尿蛋白定量,血肌酐水平和补体C3检测LN患者肾脏穿刺活检前1~3d进行24h尿蛋白定量、血肌酐水平、补体C3等实验室指标采集。根据血肌酐水平采用Cockcroft Gau lt公式[8]计算估计的肾小球滤过率(esti m ated g lo m er u lar filtration rate,

e GFR)。

1.5 统计学处理 采用SPSS10.0进行分析。各组肾组织TLR9表达的比较采用单因素方差分析; LN患者肾组织中TLR9表达与A I、24h尿蛋白定量、e GFR、补体C3的关系采用P earson相关分析,与肾小球细胞增殖程度、肾小管间质损害程度的相关性用Spear man等级相关分析。检验水准=0.05。

2 结果

2.1 各组肾组织中TLR9蛋白的表达 见图1和

表1。正常肾组织中肾小球内无或有极少量TLR9表达,肾间质中仅有少量细胞表达,肾小管上皮细胞弱表达TLR9。各型LN 肾组织中肾小球TLR9表达均增高,肾小球!型LN TLR9表达最高。肾小球阳性着色主要在系膜区,肾小球囊细胞新月体部位

TLR9表达呈强阳性。各型L N 肾小管间质TLR9表达也高于正常组织,肾小管TLR9蛋白染色阳性细

胞主要见于大量炎性细胞浸润的部位和部分血管内

皮细胞及血管周围。

图1 各组肾组织中TLR 9的表达(SP ,(400)

A:正常组织;B :ISN /RPS 型LN 肾小球;C :ISN /R PS !型LN 肾小球;D:LN 肾小管上皮细胞和间质。表1 各组肾组织中TLR 9的表达

组别n 肾小球肾小管间质正常组

110.55?0.450.78?0.33LN 组 型82.94?1.63

*

2.90?1.42

*

型124.78?2.10*

5.57?1.95* !型20

6.76?1.58*6.74?1.41* ?型17

3.51?1.75*

3.76?1.69*

F 19.01617.731P

<0.001

<0.001

*与正常组比较,P <0.05。

2.2 LN 患者肾组织中TLR 9的表达与肾脏临床指标的相关分析 LN 患者A I 为(7.745?4.386),肾小球细胞增殖程度为(1.762?0.942),24h 尿蛋白定量为(2.542?1.860)g ,e GFR 为(6

3.774?

23.682)mL /(m in #1.73m 2

),肾小管间质损害程度为(2.495?1.073),补体C3为(0.458?0.162)。相关分析结果见表2。

表2 LN 患者肾组织中TLR 9的表达与临床指标的相关关系

指标肾小球TLR9表达肾小管间质TLR9表达r /r s P r /r s P A I

0.891<0.0010.726<0.001肾小球细胞增殖*0.563<0.001--肾小管间质损害

*

--0.609<0.001e GFR -0.525<0.001-0.515<0.00124h 尿蛋白定量

0.4170.0030.3540.008补体C3

-0.124

0.874

-0.181

0.776

*表示等级相关分析。

3 讨论

近年来,TLRs 成为自身免疫性疾病研究的热点,其中TLR9因特异性识别非甲基化CpG DNA 序列而在SLE 中的作用也越来越被关注。目前国内外有研究[2,9]

表明TLR9介导的信号转导途径参与

SLE 的发生发展过程,可能与狼疮活动和SLE 器官功能损害存在一定相关性,但其在人LN 发病过程及肾脏损害中的作用鲜见报道。

罗萍等

[10]发现有肾炎表现的狼疮鼠肾组织

TLR9表达增加;Anders 等

[11]

发现TLR9活化与有

狼疮倾向的M RL 和NZB /W 鼠疾病进展有关。相

反,某些TLR9基因缺失或敲除狼疮鼠模型中发现其表现型与野生型小鼠无差异

[12]

;甚至W u 等

[13]

认为TLR9对MRL 狼疮鼠模型具有保护作用,这些结果差异也许与选用狼疮鼠品系不同有关,尚需进一步证实。此外,最近Benign i 等

[14]

研究首次证实

NZB /W 鼠小管上皮细胞TLR9表达与正常鼠对比呈强阳性,这与LN 不同发展阶段蛋白尿和间质小管的损害程度密切相关。

作者的研究结果显示LN 患者肾组织中肾小球、肾小管间质TLR9表达均较正常肾组织显著增高,多为胞浆染色,肾小球囊出现细胞新月体部位TLR9表达呈强阳性。此外,TLR9表达与肾脏病理类型的严重程度有关,其中ISN /RPS 病理分型的!型LN 肾组织TLR9表达最为显著,该型亦可见明显的肾小球系膜细胞及基质增生、细胞浸润、免疫复合物沉积,肾间质也有大量淋巴、单核细胞浸润,病理

改变严重。该实验结果与Anders等[11]和Ben i g ni 等[14]在动物实验中观察到TLR9的表达部位具有相似之处,而这些阳性细胞在以上实验研究中被证实主要是肾组织浸润的巨噬细胞,该实验仅利用免疫组化的方法尚不能对肾组织中阳性表达细胞进行明确分类,有待更深一步研究。

作者还发现L N患者肾小球和肾小管间质中TLR9的表达与LN肾脏病理A I、肾小球细胞增殖程度或肾间质小管损害程度呈正关联,并且LN病理类型越严重其表达量也越高。由于A I升高往往反映LN处于活动期,因此TLR9可能参与了L N肾脏损伤过程,肾组织中TLR9表达水平能够反映肾脏病理损害严重程度,并且可以作为观察LN活动情况的参考指标之一。而LN肾小管间质损害程度也是影响肾脏病理进程和肾功能损害程度的重要因素[15],单核/巨噬细胞在小管间质的浸润聚集对其病变有重要作用,研究发现TLR9介导了局部炎症细胞浸润,故TLR9可能也参与了肾小管间质损害过程,提示肾组织TLR9的检测也可以作为肾功能预测指标之一。此外,肾组织中TLR9的表达与实验室指标eGFR呈负相关、24h尿蛋白定量呈正相关,而两者均是临床中反映肾脏损害和肾功能恶化的重要指标,也是提示疾病进展为肾功能衰竭的危险因素;但其与补体C3水平并无明显相关性,可能是TLR9不影响补体系统激活途径或者与样本量有关。

综上所述,TLR9在LN的发生发展过程中扮演重要的角色,提示肾组织TLR9的检测可以作为评价肾脏病理损伤、肾功能损害程度和临床预后的参考指标之一。

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(2009 02 01收稿 责任编辑李沛寰)

皮肤恶性黑色素瘤组织中Runx3与S mad4蛋白的表达

陈旻静?

,张 娟,陈建华

郑州大学第一附属医院整形外科郑州450052

?女,1967年10月生,硕士,主任医师,研究方向:体表肿瘤及瘢痕,E m ai:l chen m j67@https://www.wendangku.net/doc/d418941867.html, 关键词 皮肤恶性黑色素瘤;R unx3;Smad4;信号传导