取小鼠脑组织培训课件

丁香园上面总结的方法，排版有点乱。

其实过程与大鼠近似，我的经验是：

1.材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等；

2.步骤：处死小鼠，取头颅；

剪开皮肤，漏出颅骨；

用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线；

再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨；

当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管；

然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。

3.注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部；

用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部；

去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑；

取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高；

若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。

做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。先麻醉小鼠

剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳

先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了

再改用固定液（一般是4%多聚甲醛）灌注至小鼠四肢僵硬

小鼠只需要用注射器就行了，我做的25～35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h后包埋切片即可。

具体操作如下：

实验操作步骤：

1)小鼠称重，以每克小鼠0.0025ml 4%戊巴比妥钠剂量的实施腹腔麻醉。也可以用10%的水合氯醛，3-5ul/g腹腔注射麻醉。

2)将麻醉的小鼠仰放在操作台上，去毛。

3)解剖小鼠，暴露心脏。

4)找到心尖部，左手用镊子提起心尖部，右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约0.5cm（最好是用小点的针头，用止血钳固定针尖，剪开右心耳。

5)将灌流器的导管部开口放到生理盐水中里，打开灌流器灌流，直到从右心耳流出的液体为无色，同时小鼠肝脏色淡，肠管肿胀为止，停止灌流。没有灌流器的用注射器或者吊瓶都可以。

6)将灌流器的导管小心的移至4%多聚甲醛或2.5%戊二醛中，注意不要产生气泡，开始灌流。此时如果看到小鼠四肢突然紧张，尾部卷曲，说明达到固定效果。

7)灌流大约5分钟，灌流液用量约150毫升左右结束。（小鼠的用量没这么多）

8）取材。取实验所需的标本。

9）将取出的材料放到事先准备的多聚甲醛（戊二醛）中固定2——4小时后移至30%蔗糖中4度冰箱保存过夜。

我们实验室鼠脑冰冻切片采用4%的多聚甲醛固定，小鼠直接灌注saline20ml，4%多聚甲醛20ml经左心室固定然后取材在4度4%多聚甲醛后固定4-6h，浸20%-30%糖沉底，就可以切片，切片首先需要冰冻切片机，我们的leica1900的，不知道lz那里有没有这个机子，还有一种原始的自己刷冻台的那种，比较麻烦，切片厚度大概选择20-40um差不多

开胸时要把肋骨提起，大U字剪开左右肋弓后掀起，血管钳固定一下（以免挡遮视野）；平头针插入后稍许打开输液器开关并迅速剪开充盈的右心耳（可见血涌出），用血管钳将心室和平头针一起钳夹固定再推（但滴速也不能太快以免血管被冲破，使灌流液流进肺里）。另：开胸时动作尽量要快；针头可以不插入主动脉，留置于左室也行。

试剂名称：4%多聚甲醛-磷酸二氢钠/氢氧化钠

所需药品及剂量：A液：多聚甲醛40g

蒸馏水400ml

B液：Na2HPO4·2H2O 6.88g

蒸馏水300ml

C液：NaOH 3.86g

蒸馏水200m

操作过程：A液最好在500ml的三角烧瓶中配制，至多聚甲醛完全溶解后冷却待用。注意，在溶解多聚甲醛时，要尽量避免吸入气体或溅入眼内。B液和C液配制好后，将B液倒入C 液中，混合后再加入A液，以1n NaOH或1N HCl 将pH调至7.2～7.4，最后，补充蒸馏水至1000ml充分混合

应用范围：光镜和电镜免疫细胞化学研究，用于免疫电镜时，最好加入少量新鲜配制的戊二醛

保存期限及温度：4℃冰箱保存备用，长期保存

我在很多方面是个新手，经常在园子里逛，学到了很多东西，但同时也看到了关于同一个问题有很多不同的回答，我想结合自己的实验，希望各位老师能就我提出的问题说说自己的经验看法，给我启示，因为很多自己未做过，怕自己哪里操作不恰当而影响实验结果，非常感谢各位老师的不啻赐教！

首先，我做的是大鼠（体重约230-250g），模型是大脑中动脉栓塞，在不同的时间点取脑标本，准备做荧光实时定量PCR、Western blot和冰冻切片，我提的问题主要是在于脑标本的取和存方面。

问题如下：

荧光实时定量PCR方面：

1、标本需要灌注么，有战友说不需要，你是怎么做的，有灌注的话什么溶液灌注，温度？

2、标本取下后液氮速冻，然后转-80度冰箱，这样保存一般可以多久？

3、抽提后的中RNA放-80度冰箱会很容易降解么，还是说要放液氮？

Western blot方面：

4、标本用什么溶液灌注，温度？

5、同一个标本可以同时用于RT-PCR和Western blot检测么？（如果灌注手段一样的话）

冰冻切片方面：

6、灌注冲血用什么溶液，温度？

7、4%多聚甲醛灌注固定一般灌注多常时间？多少毫升？

8、4%多聚甲醛后固定时间是多久为宜？

9、蔗糖梯度脱水，蔗糖是用什么配置的，PBS还是PB，浓度是多大的？蔗糖梯度是15%到20%再30%么？在每种浓度里沉底后就换另一种还是？

10、我试做过一次，做法为：常规多聚甲醛灌注固定后，再多聚甲醛后固定过夜，然后30%的蔗糖脱水，这些都是用0.1M的PBS配的，结果发现蔗糖脱水3天了都还没沉底（中间换过一次蔗糖溶液）。有战友提议可以切几块后脱水效果会更好，如果你有跟我做一样的模型标本，你是怎么处理的，如何切？

11、还有什么需要注意的地方或tips。

灌注冲血用什么溶液，温度？

用的是含有肝素钠的生理盐水。每瓶500ml的生理盐水加入80mg的肝素钠，肝素钠要避光保存，而且必须使用前临时加入到生理盐水中。肝素钠生理盐水需要用4度预冷。我们用注射器推，大概推100ml，10min。就可以将血液冲干净。速度要自己掌握。

每支肝素钠每亳升含12500U，相当于100mg，用20ml生理盐水稀释，分装成40支，消毒备用（4℃贮存）。临用时，注射器吸取肝素钠溶液一支，而后将肝素液来回抽动，使针筒局部湿润，多余肝素液全部排出弃之，注射器内死腔残留的肝素液即可抗凝。

纯的肝素10 mg能抗凝100 ml血液（按1mg等于100个国际单位，10个国际单位能抗凝1ml血液计）。如果肝素的纯度不高，或过期，所用的剂量应增大2～3倍。用于试管内抗凝时，一般可配成1%肝素生理盐水溶液，取0.1ml加入试管内，加热80℃烘干，每管能使5～10 ml血液不凝固。作全身抗凝时，一般剂量为：大鼠2.5～3 mg·(200～300g体重)-1,兔或猫10 mg·kg-1,狗5～10 mg·kg-1。如果肝素的纯度不高，或过期，所用的剂量应增大2～3倍。

7、4%多聚甲醛灌注固定一般灌注多常时间？多少毫升？

一般多聚甲醛灌注20min，100ml。标准是动物的尾巴会甩动，全身四肢收缩（这是因为蛋白变性所致），一般看起来像动物活过来了一样。随后就可以将动物的头断掉，来取脑了。

8、4%多聚甲醛后固定时间是多久为宜？

这个不一定。对于石蜡切片，可以固定很久。但是对于冰冻切片，估计是隔夜或者24h。但是先固定一晚上后再取出来，将不需要的大脑组织切掉，比如脑干、小脑等等。擦干，放在蔗糖溶液里。

9、蔗糖梯度脱水，蔗糖是用什么配置的，PBS还是PB，浓度是多大的？蔗糖梯度是15%到20%再30%么？在每种浓度里沉底后就换另一种还是？

蔗糖用0.1M的PB配置。我一般配20%和30%两个浓度。我个人感觉每个浓度需要沉糖48h。

取小鼠脑组织

丁香园上面总结的方法，排版有点乱。 其实过程与大鼠近似，我的经验是： 1. 材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等； 2. 步骤：处死小鼠，取头颅； 剪开皮肤，漏出颅骨； 用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线； 再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨； 当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管； 然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。 3. 注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部； 用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部； 去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑； 取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高； 若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。 做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。先麻醉小鼠 剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳 先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了 再改用固定液（一般是4%多聚甲醛）灌注至小鼠四肢僵硬 小鼠只需要用注射器就行了，我做的25～35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h后包埋切片即可。 具体操作如下： 实验操作步骤： 1) 小鼠称重，以每克小鼠0.0025ml 4%戊巴比妥钠剂量的实施腹腔麻醉。也可以用10%的水合氯醛，3-5ul/g腹腔注射麻醉。 2) 将麻醉的小鼠仰放在操作台上，去毛。 3) 解剖小鼠，暴露心脏。 4) 找到心尖部，左手用镊子提起心尖部，右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约0.5cm（最好是用小点的针头，用止血钳固定针尖，剪开右心耳。 5) 将灌流器的导管部开口放到生理盐水中里，打开灌流器灌流，直到从右心耳流出的液体为无色，同时小鼠肝脏色淡，肠管肿胀为止，停止灌流。没有灌流器的用注射器或者吊瓶都可以。

小鼠解剖图完整版

图Ⅸ-1 整体骨骼侧面观The skeleton. Lateral view 图Ⅸ-2 整体骨骼背面观The skeleton. Dorsal view 1 背肋dorsal rib 2 胸椎thoracic vertebra 3 颈椎cerical vertebra 4 顶间骨interparietal bone 5 顶骨parietal bone 6 额骨frontal bone 7 鼻骨nasal bone 8 锁骨clavicle 9 肩胛骨scapula 10 肱骨hemerus 11 髌骨patella 12 腰椎lumbar vertebra 13 荐椎sacral vertebra 14 尾椎caudal vertebra 15 坐骨ischium 16 髂骨ilium 17 股骨femur 18 腓骨fibula 19 胫骨tibia 20 跖骨metatarsal bone 21 趾骨digital bone 22 胸肋sternal rib 23 头骨skull 24 指骨digital bone 25 桡骨radius

图Ⅸ-3 背柱背面The vertebral column. Dorsal aspect 1 枢椎axis 2 胸椎thoracic vertebra 3 第II 胸椎I Ith thoraac vertebra 4 第1 腰椎I st lumbar vertebra 5 第 6 腰椎6th lumbar vertebra 6 耻骨pubis 7 闭孔obturator foramen 8 寰椎atlas 9 第7 颈椎seventh cervical vertebra 10 胸肋sternal rib 1l 背肋dorsal rib 12 第4 腰椎4th lumbar 13 髂骨ilium 14 荐椎sacral vertebra 15 坐骨ischimn 16 尾椎caudal vertebra

大鼠和小鼠解剖图谱(照片版)

图Ⅷ-1整体骨骼侧面观The skeleton. Lateral View 图Ⅷ-2整体骨骼左前面观The skeleton. Left anterior view 1肋骨rib 2胸椎thoracic vertebra 3颈椎cervical vertebra 4颅骨cranium 5肩胛骨scapula 6肱骨hiimeius 7桡骨radius 8尺骨ulna 9掌骨metacarpal bone 10指骨digital bone 11腰椎lumbar vertebra 12髂骨ilium 13尾骨coccyx 14股骨femur 15髌骨patella 16腓骨fubula 17胫骨tibia 18跖骨metatarsal bone 19趾骨digital bone

图Ⅷ-4头骨侧面The skull. Lateral aspect

图Ⅷ-6下颌骨侧面The mandible. Lateral aspect

1枕骨occipital bone 2顶间骨interparietal bone 3矢状缝sagittal suture 4颧骨malar bone 5上颌骨maxillary bone 6前颌骨premaxillary bone 7枕外嵴external occipital creat 8顶骨parietal bone 9额骨frontal bone 10鼻骨nasal bone 11鼻间缝internasal suture 12前筛孔preethmoid pore 13蝶腭孔sphenopalatine foramen 14门齿 incisor tooth 15下颌骨mandible 16视神经孔optic foramen 17枕骨occipital bone 18茎突styloid process 19外耳道external acoustic meatus 20颞骨temporal bone 21 腭裂patoschisis 22臼齿molar tooth 23腭骨palatine bone 24翼孔pterygoid apertures 25破裂孔foramen lacerum 26枕大孔foramen magnum 27腭后孔posterior palatine foramen 28鼻后孔posterior nasal apertures 29卵圆孔foramen ovale 30鼓骨tympanic bone 31舌下神经孔hypoglossal foramen 32下颌联合mandibular symphysis 33颏孔mental foramen 34冠状突coronoid process 35下颌支ramus of mandible 36角状突process of horn 37下颌孔mandibular foramen 38翼肌窝pterygoid fossa 39髁突condylar process

小鼠解剖图谱

图Ⅸ-1整体骨骼侧面观The https://www.wendangku.net/doc/e011817036.html,teral view 图Ⅸ-2整体骨骼背面观The skeleton.Dorsal view 1背肋dorsal rib 2胸椎thoracic vertebra 3颈椎cerical vertebra 4顶间骨interparietal bone 5顶骨parietal bone 6额骨frontal bone 7鼻骨nasal bone 8锁骨clavicle9肩胛骨scapula10肱骨hemerus11髌骨patella12腰椎lumbar vertebra 13荐椎sacral vertebra14尾椎caudal vertebra15坐骨ischium16髂骨ilium17股骨femur18腓骨fibula19胫骨tibia20跖骨metatarsal bone21趾骨digital bone22胸肋sternal rib23头骨skull24指骨digital bone25桡骨radius

图Ⅸ-3背柱背面The vertebral column.Dorsal aspect 1枢椎axis2胸椎thoracic vertebra3第II胸椎I Ith thoraac vertebra4第1腰椎I st lumbar vertebra5第6腰椎6th lumbar vertebra6耻骨pubis7闭孔obturator foramen8寰椎atlas9第7颈椎seventh cervical vertebra10胸肋sternal rib1l背肋dorsal rib12第4腰椎4th lumbar13髂骨ilium14荐椎sacral vertebra15坐骨ischimn16尾椎caudal vertebra

大鼠解剖方面的资料

1. 外观大鼠外观与小鼠相似,但个体较大。一般成年大鼠体长不小于18-20cm。尾上覆有短毛和环状角质鳞片，数量多于200片。上下颌各有两个切齿和六个臼齿，共16颗牙齿。齿式为（1003/1003）×2。 2. 大鼠骨骼约105-108块，大鼠的生长发育期长,长骨长期有骨骺存在，不骨化。切齿终生不断生长，大鼠需不断啃咬磨牙以维持其长度恒定，故垫料中应有部分小木块供其啃咬。 3. 大鼠唾液腺包括腮腺、颌下腺和舌下腺。分别位于下颌骨后缘至锁骨的腹外侧、下颌骨后缘和胸腔入口的腹侧、颌下腺口侧。颈区肩胛部间沉积的脂肪组织呈腺体状，称为冬眠腺，在产热中起着重要作用。 4. 胃由前后两部分组成，前胃为无腺区，后胃为有腺区，前后两部分由一个界限嵴分开，食管通过界限嵴的一个褶进入胃小弯，此褶是大鼠不能呕吐的原因。 5. 肠道分为十二指肠、空肠、回肠、盲肠、结肠、直肠。其中小肠最长，约114cm（102-126），盲肠较长，约6-8cm。 6. 肝脏呈紫红色，占体重的比例大，约为体重的1/25，由四叶组成（右侧叶、中叶、左叶和尾叶）。肝脏的再生能力强,经部分肝切除术后仍可再生。成年大鼠切除肝2/3，在一周内肝脏生长最快，三周内肝脏重量可恢复到接近正常。大鼠无胆囊，各肝叶的胆管会合成胆总管，开口于十二指肠。胰脏位于胃和十二指肠的弯曲处，呈淡粉色，形状不规则，似脂肪。 7. 心脏重量约占体重的1/30-1/20，由左心房、左心室、右心房、

右心室组成。左心室发出主动脉弓，由此分出无名动脉、左颈总动脉、左锁骨下动脉。无名动脉又分出右颈总动脉和右锁骨下动脉。主动脉弓到心脏背侧沿脊柱下行，形成背主动脉，背主动脉再分支到髂部和四肢。 8. 肺脏为海绵状，淡粉色,位于胸腔中部,分为左、右两部分。左肺为一个大叶，右肺分为4叶（前叶、中叶、副叶、后叶）。 9. 肾脏呈暗红色、蚕豆状，位于腹腔背侧脊柱两侧。每侧肾都和一条白色细长的输尿管相连，输尿管下接膀胱。 10. 大鼠的神经系统与人类相似，亦包括中枢神经系统和周围神经系统两部分。中枢神经包括脑和脊髓，周围神经包括脑神经、脊神经、植物神经。脑分为大脑、间脑、中脑、小脑和延脑，大鼠的大脑很发达，中脑较小。由脑发出的神经叫脑神经，共12对。脊神经和植物神经和其它动物相似。 实验用大鼠解剖生理学 一、概述 每年约使用3千5百万只鼠应用于研究和测试。使用实验大鼠进行的研究包括老化，肿瘤neoplasia，药效与毒性，含特定菌之动物gnotobiology，龋齿的研究，脂质新陈代谢，维他命之作用，行为，酒精中毒和肝脏硬化，关节炎，苯酮尿症(phenylketonuria)，黄疸，果糖不耐症，高血压、胚胎学，畸胎畸形学，肾性尿崩症及传染性疾病等皆可使用大鼠进行研究。 二、解剖构造

小鼠灌注取脑

成年小鼠心脏灌流及取脑组织步骤 实验步骤： 1、小鼠麻醉后立即将其用针头固定在泡沫板上（用针头插住四肢）。用镊子扯起胸部皮肤，另一只手用剪刀剪开胸腔的皮肤和肋骨，暴露出心脏和肝脏。 2、将注射针头插入小鼠左心室，同时将小鼠肝脏减掉，以使血液流出。灌注生理盐水，时间维持在1min（10~20ml）灌注液左右，血液排除后四肢、肝脏和舌头会变白。 3、待小鼠四肢、肝脏和舌头变白之后，用4%PFA灌流固定，当PFA 流至大脑处可能会使小鼠尾巴略有反射现象（有时可能没有），此时可将灌流速度下调，以使固定更加充分。整个PFA灌流时间约为5min。（固定原理：多聚甲醛可以使蛋白质交联） 4、将导管始端从PFA中拿出，待管中液体流尽后，将心脏上的针头拔下，如果固定的较好，可发现小鼠眼球呈现白色。将托盘中的血液倒至废液桶内，并准备下一步的取脑操作。 取脑及脱水：

1、剪开头部皮肤，露出白色头盖骨。将延髓上包被的软骨剪开，除去多余的结缔组织。需要注意的时，眼睛要由剪刀剪下，不能够直接扯下来，因为眼睛后部连着视神经，如果扯的话有可能会损坏视交叉上核等其他脑部组织。 2、将头盖骨小心剥开，露出白色的脑部，在剥嗅球部位时要格外小心，必要的话可以先将嗅球前部的碎骨留着待进一步固定之后再去除。 3、将头盖骨剥开后，将脑下部连接的神经逐条剪短（可看到视神经交叉），待全部剪断后将脑整个剥离出来。 4、将剥离出来的脑浸泡在4%PFA中，过夜固定。 5、将PFA液换为30%蔗糖进行脱水（防止冷冻切片时形成冰晶和孔洞），初始脱水时脑会浮在蔗糖上面，待完全脱水后脑会沉底。此时可将脑取出进行冷冻切片。

取小鼠脑组织

丁香园上面总结得方法,排版有点乱、 其实过程与大鼠近似,我得经验就是:?1。材料准备;大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等;?2。步骤:处死小鼠,取头颅; 剪开皮肤,漏出颅骨;?用大尖镊子夹住两侧眼眶,用眼科剪稍剪除颅骨中线;?再 用眼科镊夹住颅骨从内向外夹,从下向上逐步去除颅骨; 当全脑露出时,再用眼科镊去除脑膜与血管;?然后用竹签从嗅球处向下取出全脑,即可。 3。注意事项:用力轻柔,否则容易弄破脑部;?用剪刀剪颅骨时,一定要贴壁向上剪,否则容易剪破脑部;?去除脑膜时,不能硬拉,否则容易弄破大脑;?取出全脑时应把头顶朝下,用竹签轻轻取出,离桌面也不要太远、高;?若留病理,建议一定要取完整无损得大脑。 做免疫组化得话,稍微麻烦一点儿,因为脑组织含水量多,要固定得好,就需要先灌注。?先麻醉小鼠?剪开胸腔,找到心脏,从心尖入针,剪开右心耳 先用生理盐水灌注直到从心耳流出来得水清亮了?再改用固定液(一般就是４%多聚甲醛)灌注至小鼠四肢僵硬 小鼠只需要用注射器就行了,我做得25～3５g得小鼠一般用50mLNＳ+3０mL多聚甲醛。具体步骤:常规麻醉小鼠,将其固定,用剪刀剪开胸部皮肤,暴露出皮下组织,剪开时注意钝性分离,以免误伤。然后用镊子提起剑突,用剪刀剪开胸腔,剪断两侧肋骨,暴露整个胸腔,小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜,暴露心脏,用眼科剪剪开右心耳,然后提起心尖将准备好得生理盐水注射器插入左心室,注射,注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺与肝得颜色都变成灰白色即可、然后用多聚甲醛灌流,针孔最好就是同一个,多聚灌流时小鼠四肢会抽搐,待抽搐结束,小鼠僵硬即可。取下小鼠,用剪刀在颈部离断头颅,用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀,将两边皮肤向下翻用手捏住,暴露整个颅骨,用眼科剪从脊髓端插入椎孔,沿着颅正中线剪开颅骨,注意剪刀向上翘一些,以免误伤脑组织,剪开后用弯眼科镊分离颅骨,小心分离,直至暴露整个大脑,然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经,就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h后包埋切片即可。 具体操作如下:?实验操作步骤:?1) 小鼠称重,以每克小鼠０、00２5ｍl 4％戊巴比妥钠剂量得实施腹腔麻醉、也可以用10％得水合氯醛,3－5ｕl/g腹腔注射麻醉。?２) 将麻醉得小鼠仰放在操作台上,去毛、 3) 解剖小鼠,暴露心脏。 4) 找到心尖部,左手用镊子提起心尖部,右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约 0.5cｍ(最好就是用小点得针头,用止血钳固定针尖,剪开右心耳、? ５) 将灌流器得导管部开口放到生理盐水中里,打开灌流器灌流,直到从右心耳流出得液体为无色,同时小鼠肝脏色淡,肠管肿胀为止,停止灌流。没有灌流器得用注射器或者吊瓶都可以。?6) 将灌流器得导管小心得移至4%多聚甲醛或２、5%戊二醛中,注意不要产生气泡,开始灌流。此时如果瞧到小鼠四肢突然紧张,尾部卷曲,说明达到固定效果。 7) 灌流大约5分钟,灌流液用量约150毫升左右结束、(小鼠得用量没这么多)?８) 取材、取实验所需得标本、 ９) 将取出得材料放到事先准备得多聚甲醛(戊二醛)中固定2—-4小时后移至3０%蔗糖中4度冰箱保存过夜。

小鼠解剖图

图Ⅸ-1整体骨骼侧面观The skeleton. Lateral view 图Ⅸ-2整体骨骼背面观The skeleton. Dorsal view 1背肋dorsal rib 2胸椎thoracic vertebra 3颈椎cerical vertebra 4顶间骨interparietal bone 5顶骨parietal bone 6额骨frontal bone 7鼻骨nasal bone 8锁骨clavicle 9肩胛骨scapula 10肱骨hemerus 11髌骨patella 12腰椎lumbar vertebra 13荐椎sacral vertebra 14尾椎caudal vertebra 15坐骨ischium 16髂骨ilium 17股骨femur 18腓骨fibula 19胫骨tibia 20跖骨metatarsal bone 21趾骨digital bone 22胸肋sternal rib 23头骨skull 24指骨digital bone 25桡骨radius

图Ⅸ-3背柱背面The vertebral column. Dorsal aspect

图Ⅸ-4胸廓背面The thorax．Dorsal aspect

图Ⅸ -5前肢骨内侧面The bone of 图Ⅸ-6后肢骨外侧面The bone of anterior Iimb.Medial aspect posterior https://www.wendangku.net/doc/e011817036.html,teral aspect 1枢椎axis 2胸椎thoracic vertebra 3第II 胸椎I Ith thoraac vertebra 4第1腰椎I st lumbar vertebra 5第6腰椎6th lumbar vertebra 6耻骨pubis 7闭孔obturator foramen 8寰椎atlas 9第7颈椎seventh cervical vertebra 10胸肋sternal rib 1l 背肋dorsal rib 12第4腰椎4th lumbar 13髂骨ilium 14荐椎sacral vertebra 15坐骨ischimn 16尾椎caudal vertebra 17指骨digital bone 18掌骨metacarp at bone 19腕骨carpal bone 20桡骨radius 21尺骨ulna 22三角突起deltoid process 23鼻骨nasal bone 24额骨frontal bone 25顶骨parietal bone 26顶间骨interparietal bone 27肱骨hemerus 28肩胛骨scapula 29肱骨头head of humerus 30肘突elbow process 31肩胛冈spine of scapula 32肩带pectoral girdle 33大转子greater trochanter 34 股骨 femur 35胫侧髁tibiale condyle 36髌骨 patella 37胫骨tibia 38跖骨metatarsal bone 39股骨头head of femur 40腓骨fibula 41跟骨calcaneus 42跗骨 tarsal bone 43趾骨digital bone

取小鼠脑组织0001

丁香园上面总结的方法，排版有点乱。其实过程与大鼠近似，我的经验是： 1. 材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等； 2. 步骤：处死小鼠，取头颅； 剪开皮肤，漏出颅骨；用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线；再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨；当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管；然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。 3. 注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部；用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部；去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑；取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高；若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。 做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。 先麻醉小鼠剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了再改用固定液(一般是4%多聚甲醛)灌注至小鼠四肢僵硬 小鼠只需要用注射器就行了，我做的25?35g的小鼠一般用50mLNS+30m多聚甲醛。具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h 后包埋切片即可。 具体操作如下： 实验操作步骤： 1) 小鼠称重，以每克小鼠0.0025ml 4%戊巴比妥钠剂量的实施腹腔麻醉。也可以用10%的水合氯醛，3-5ul/g 腹腔注射麻醉。 2) 将麻醉的小鼠仰放在操作台上，去毛。 3) 解剖小鼠，暴露心脏。 4) 找到心尖部，左手用镊子提起心尖部，右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约0.5cm （最好是用小点的针头，用止血钳固定针尖，剪开右心耳。 5）将灌流器的导管部开口放到生理盐水中里，打开灌流器灌流，直到从右心耳流出的液体为无色，同时小鼠肝脏色淡，肠管肿胀为止，停止灌流。没有灌流器的用注射器或者吊瓶都可以。 6）将灌流器的导管小心的移至4%多聚甲醛或2.5%戊二醛中，注意不要产生气泡，开始灌流。此时如果看到小鼠四肢突然紧张，尾部卷曲，说明达到固定效果。 7）灌流大约5 分钟，灌流液用量约150毫升左右结束。（小鼠的用量没这么多） 8）取材。取实验所需的标本。 9）将取出的材料放到事先准备的多聚甲醛（戊二醛）中固定2——4 小时后移至30%蔗糖中4 度冰箱保存过夜。

大鼠和小鼠解剖图谱

大鼠和小鼠解剖图谱

图Ⅷ-1整体骨骼侧面观The skeleton. Lateral View 图Ⅷ-2整体骨骼左前面观The skeleton. Left anterior view 1肋骨rib 2胸椎thoracic vertebra 3颈椎cervical vertebra 4颅骨cranium 5肩胛骨scapula 6肱骨hiimeius 7桡骨radius 8尺骨ulna 9掌骨metacarpal bone 10指骨digital bone 11腰椎lumbar vertebra 12髂骨ilium 13尾骨coccyx 14股骨femur 15髌骨patella 16腓骨fubula 17胫骨tibia 18跖骨metatarsal bone 19趾骨digital bone

图Ⅷ-4头骨侧面The skull. Lateral aspect

图Ⅷ-6下颌骨侧面The mandible. Lateral aspect

1枕骨occipital bone 2顶间骨interparietal bone 3矢状缝sagittal suture 4颧骨malar bone 5上颌骨maxillary bone 6前颌骨premaxillary bone 7枕外嵴external occipital creat 8顶骨parietal bone 9额骨frontal bone 10鼻骨nasal bone 11鼻间缝internasal suture 12前筛孔preethmoid pore 13蝶腭孔sphenopalatine foramen 14门齿 incisor tooth 15下颌骨mandible 16视神经孔optic foramen 17枕骨occipital bone 18茎突styloid process 19外耳道external acoustic meatus 20颞骨temporal bone 21 腭裂patoschisis 22臼齿molar tooth 23腭骨palatine bone 24翼孔pterygoid apertures 25破裂孔foramen lacerum 26枕大孔foramen magnum 27腭后孔posterior palatine foramen 28鼻后孔posterior nasal apertures 29卵圆孔foramen ovale 30鼓骨tympanic bone 31舌下神经孔hypoglossal foramen 32下颌联合mandibular symphysis 33颏孔mental foramen 34冠状突coronoid process 35下颌支ramus of mandible 36角状突process of horn 37下颌孔mandibular foramen 38翼肌窝pterygoid fossa 39髁突condylar process

石蜡包埋(小鼠脑组织)

石蜡包埋 放入4%的多聚甲醛中过夜（12h）； 12小时（注意水流不需要太大，不可将水流直接冲击组织） 60%酒精4h白天（或者60%酒精4℃过夜12h）→ 第三天：→70%酒精4h→80%酒精4h→90%酒精4h→95%酒精4℃过夜(不一定12小时) → 第四天：→100%酒精Ⅰ2h→100%酒精Ⅱ2h→100%酒精Ⅲ2h→ 5+3 min→二甲苯Ⅱ5+3 min→二甲苯Ⅲ 5+3 min→二甲苯Ⅳ 3+2 min→ （此处注意，在透明过程进行到此处时，应在浸完后拿出脑组织观察一下透明是否彻底，一般来说透明完全的脑组织是呈现为一个通体琥珀状，如果是发现脑组织内部仍呈现不通透的白色则继续酌情追加浸泡（透明）时间） 2h→软蜡Ⅱ2h→软蜡Ⅲ 2h→ 备注：1、软蜡是指熔点48-50℃的石蜡，中蜡是指熔点58—60℃的石蜡。在包埋前应该提前将各种蜡准备好，放在对应的蜡缸里融好，注意不要加热太长时间。待蜡完全融好后关

上煤气，冷却至烧杯上沿不是太烫手且蜡也未凝固是将蜡挪到６０℃温箱里备用。在融蜡时要注意通风橱使用规范。 2、包埋组织块时要注意动作熟练紧凑，时间过长就会导致蜡温不够，影响包蜡质量。放组织块时要注意切面一定要放正确，待切的面朝向包埋铁框面。包埋时勿将气泡带入。可以稍微倾斜一些放置塑料包埋框。 3、酒精串缸结束后，可以将组织拿出一部分出来观察一下是否切面平整，是否厚薄一致，以免影响透明的整齐度，导致组织透明的时间不一致。 ４、酒精串缸结束后，把包埋盒用滤纸尽量弄干，然后再往二甲苯中放。 5蜡块包埋完成后不要急于挪动，待蜡块凝固后再将蜡块放到－２０℃冰箱里冷藏10ｍｉｎ，以利于将铁框和包埋盒分离。

取小鼠脑组织完整版

取小鼠脑组织 HEN system office room 【HEN16H-HENS2AHENS8Q8-HENH1688】

丁香园上面总结的方法，排版有点乱。 其实过程与大鼠近似，我的经验是： 1.?材料准备；大剪刀、眼科剪、眼科镊、大镊子、滤纸、竹签等； 2.?步骤：处死小鼠，取头颅； 剪开皮肤，漏出颅骨； 用大尖镊子夹住两侧眼眶，用眼科剪稍剪除颅骨中线； 再用眼科镊夹住颅骨从内向外夹，从下向上逐步去除颅骨； 当全脑露出时，再用眼科镊去除脑膜和血管； 然后用竹签从嗅球处向下取出全脑，即可。 3.?注意事项：用力轻柔，否则容易弄破脑部； 用剪刀剪颅骨时，一定要贴壁向上剪，否则容易剪破脑部； 去除脑膜时，不能硬拉，否则容易弄破大脑； 取出全脑时应把头顶朝下，用竹签轻轻取出，离桌面也不要太远、高； 若留病理，建议一定要取完整无损的大脑。 做免疫组化的话，稍微麻烦一点儿，因为脑组织含水量多，要固定的好，就需要先灌注。 先麻醉小鼠 剪开胸腔，找到心脏，从心尖入针，剪开右心耳 先用生理盐水灌注直到从心耳流出来的水清亮了 再改用固定液（一般是4%多聚甲醛）灌注至小鼠四肢僵硬 小鼠只需要用注射器就行了，我做的25～35g的小鼠一般用50mLNS+30mL多聚甲醛。具体步骤：常规麻醉小鼠，将其固定，用剪刀剪开胸部皮肤，暴露出皮下组织，剪开时注意钝性分离，以免误伤。然后用镊子提起剑突，用剪刀剪开胸腔，剪断两侧肋骨，暴露整个胸腔，小心误伤肺及心脏、大血管。用镊子撕开心包膜，暴露心脏，用眼科剪剪开右心耳，然后提起心尖将准备好的生理盐水注射器插入左心室，注射，注射时小心针头滑脱。生理盐水灌流至肺和肝的颜色都变成灰白色即可。然后用多聚甲醛灌流，针孔最好是同一个，多聚灌流时小鼠四肢会抽搐，待抽搐结束，小鼠僵硬即可。取下小鼠，用剪刀在颈部离断头颅，用剪刀在小鼠头颅中间皮肤剪一刀，将两边皮肤向下翻用手捏住，暴露整个颅骨，用眼科剪从脊髓端插入椎孔，沿着颅正中线剪开颅骨，注意剪刀向上翘一些，以免误伤脑组织，剪开后用弯眼科镊分离颅骨，小心分离，直至暴露整个大脑，然后用弯镊伸入颅底离断颅底神经，就可以取出整个脑子了。放多聚里固定24h后包埋切片即可。 具体操作如下： 实验操作步骤： 1)??小鼠称重，以每克小鼠 4%戊巴比妥钠剂量的实施腹腔麻醉。也可以用10%的水合氯醛，3-5ul/g腹腔注射麻醉。 2)??将麻醉的小鼠仰放在操作台上，去毛。 3)??解剖小鼠，暴露心脏。 4)??找到心尖部，左手用镊子提起心尖部，右手或左手将灌流针刺破心尖部进针约（最好是用小点的针头，用止血钳固定针尖，剪开右心耳。

小鼠大鼠解剖图谱

大鼠和小鼠解剖图谱 生物秀—专心做生物！ ｗｗｗ．ｂｂｉｏｏ．ｃｏｍ 易生物－领先的生物医药商务平台 ｗｗｗ．ｅｂｉｏｅ．ｃｏｍ 生物秀论坛－学术交流，资源共享，互助社区 ｗｗｗ．ｂｂｉｏｏ．ｃｏｍ／ｂｂｓ／

图Ⅷ-1整体骨骼侧面观The skeleton. Lateral View 图Ⅷ-2整体骨骼左前面观The skeleton. Left anterior view 1肋骨rib 2胸椎thoracic vertebra 3颈椎cervical vertebra 4颅骨cranium 5肩胛骨scapula 6肱骨hiimeius 7桡骨radius 8尺骨ulna 9掌骨metacarpal bone 10指骨digital bone 11腰椎lumbar vertebra 12髂骨ilium 13尾骨coccyx 14股骨femur 15髌骨patella 16腓骨fubula 17胫骨tibia 18跖骨metatarsal bone 19趾骨digital bone

图Ⅷ-4头骨侧面The skull. Lateral aspect

图Ⅷ-6下颌骨侧面The mandible. Lateral aspect

1枕骨occipital bone 2顶间骨interparietal bone 3矢状缝sagittal suture 4颧骨malar bone 5上颌骨maxillary bone 6前颌骨premaxillary bone 7枕外嵴external occipital creat 8顶骨parietal bone 9额骨frontal bone 10鼻骨nasal bone 11鼻间缝internasal suture 12前筛孔preethmoid pore 13蝶腭孔sphenopalatine foramen 14门齿 incisor tooth 15下颌骨mandible 16视神经孔optic foramen 17枕骨occipital bone 18茎突styloid process 19外耳道external acoustic meatus 20颞骨temporal bone 21 腭裂patoschisis 22臼齿molar tooth 23腭骨palatine bone 24翼孔pterygoid apertures 25破裂孔foramen lacerum 26枕大孔foramen magnum 27腭后孔posterior palatine foramen 28鼻后孔posterior nasal apertures 29卵圆孔foramen ovale 30鼓骨tympanic bone 31舌下神经孔hypoglossal foramen 32下颌联合mandibular symphysis 33颏孔mental foramen 34冠状突coronoid process 35下颌支ramus of mandible 36角状突process of horn 37下颌孔mandibular foramen 38翼肌窝pterygoid fossa 39髁突condylar process

神经实验5 小鼠脑片免疫组织化学

实验5 小鼠脑片免疫组织化学（SABC法） 实验 一、实验目的 了解免疫组织化学实验原理，熟练掌握实验 操作步骤。 二、实验原理 免疫组织化学技术（Immunohistochemistry）是指用免疫学原理（从组织细胞水平进行抗原和抗体结合），通过特异的抗原抗体反应标记上可见的显示物系统来检查细胞及组织上原位抗原或抗体成分的方法。一般认为凡具有抗原性或半抗原性物质都可以用免疫细胞化学方法检测并显示出来。在光学显微镜、荧光显微镜或电子显微镜下观察其性质定位，还可以利用细胞分光光度计、图像分析仪、共聚焦显微镜等进行细胞原位半定量测定。免疫组织化学的显著特点是特异性强，因为免疫学的基本原理是抗原与抗体“一对一”的特异结合，所以免疫组织化学从理论上讲也是“一对一”的组织细胞中抗原的特定显示。如角蛋白(keratin)显示上皮成分、LCA显示淋巴细胞成分。只是当组织细胞中存在交叉抗原时才会出现交叉反应。

敏感性高：在应用免疫组化的起始阶段，由于技术上的限制，只有直接法、间接法等敏感性不高的技术，那时的抗体只能稀释几倍、几十倍，现在由ABC法或SP法的出现，使抗体稀释上千倍、上万倍甚至上亿倍乃至可在组织细胞中与抗原结合，这样高敏感性的抗体抗原反应，使免疫组化的方法越来越方便地应用于常规诊断工作中。定位准确、形态与功能相结合：虽然聚合酶链反应(PCR)方法已经广泛地应用于疾病的诊断，但由于不能在组织和细胞内进行明确的定位而限制了PCR在病理组织学上的应用。免疫组化则可在组织和细胞中进行抗原的准确定位，因而可以同时对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，这样就可以进行形态与功能相结合的研究，对于病理学研究的深入是十分有意义。 三、实验器材 略 四、实验步骤 1. 载玻片准备 将新载玻片置于洗涤剂中煮沸30min，先后用清水和蒸馏水冲洗干净，晾干，放入浓硫酸-重铬酸钾洗液中浸泡12小时，流水冲洗后再用蒸馏水清洗，干燥，在95%的酒精中浸泡24h，擦干。盖玻片直接泡酸，其余处理步骤同载玻片。处理后的载玻片用稀释度为

脑组织提取外泌体的方法及详细步骤

组织外泌体提取的详细步骤及方法 外泌体是由细胞内多泡体与细胞膜融合后，释放到细胞外的一种直径约30 ~ 150 nm的膜性囊泡。几乎所有的细胞都会产生外泌体，被分泌出的外泌体会进入各种体液，通过循环系统到达其他细胞与组织，产生远程调控作用。越来越多的研究表明神经系统中的生理功能和病理功能与外泌体密切相关，例如：参与神经发育和神经元活动，参与神经退行性疾病调控等。 相关试剂： 1，Hibernate E Solution （BrainBits, Springfield） 2，木瓜蛋白酶papain（Worthington） 3，Umibio Exosome Isolation Kit 4，PBS 相关设备： 1，匀浆器 2，网状过滤器40-μm 3，注射器过滤器0.2μm 4，高速离心机 5，涡旋振荡器 操作步骤： （一）脑浆液化处理： 1，将新鲜或先前冷冻的小鼠半脑切开，加入Hibernate E溶液(3 mL /半脑)； 2，加入20单位/ mL的木瓜蛋白酶，在37℃水浴15分钟； 3，加入等体积预冷Hibernate E后，轻轻匀浆；匀浆过程中在冰上进行； 4，脑匀浆通过40-μm网状过滤器过滤； 5，滤液再通过0.2-μm过滤器过滤，收集滤液； （二）液化脑浆预处理；

1，离心去碎片：将液化脑浆液转移至离心管中，于4℃以3000 g离心10 min，去除滤液中的碎片；离心后上清液转移到新的离心管中； 2，离心去杂质：转移后的上清液于4℃以10000 g离心20 min，去除样品中杂质，将离心后的上清液转移至新的离心管中； 三）脑浆外泌体的提取； 通过Umibio Exosome Isolation Kit提取外泌体颗粒。 1，上清液预处理：在去除杂质的离心上清液中加入Exosomoe Concentration Solution（ECS试剂），具体的加入剂量如下： 注：其他剂量规格请根据表中的试剂用量等比例换算 2，溶液混合：加入ECS试剂后将离心管盖紧，通过涡旋振荡器混匀1 min，再放置于2℃至8℃静置2 h； 3，沉淀外泌体：取出装有混合液的离心管于4℃以10000 g离心60 min，弃上清，沉淀中富含外泌体颗粒；（注：尽可能吸净上清液） 4，外泌体重悬：取100μL 1×PBS均匀吹打离心沉淀物，待其均匀悬浮在PBS 中后，将重悬液转移至新的1.5 mL离心管中； 5，收获外泌体颗粒：将含有重悬液的1.5 mL离心管于4℃以12000 g离心2 min，保留上清液，该上清液中富含外泌体颗粒。（注：若离心沉淀物肉眼可见，再离心一次） 6，纯化外泌体：将收获的外泌体颗粒粗品转入Exosomoe Purafication Filter （EPF柱）上室中，于4℃以3000 g离心10 min，离心后收集EPF柱管底的液体，此液体即为纯化后的外泌体颗粒； 7，外泌体的保存：纯化后的外泌体以保存于-80℃低温冰箱中，以备后继实验使用。

小鼠大脑皮层神经元原代培养步骤

小鼠大脑皮层神经元原代培养步骤: 1、于无菌条件下切取鼠头并以75%酒精浸泡1min，解剖出完整鼠脑； 2、预冷解剖液中分离去除软膜、血管、取大脑皮质漂洗，用眼科剪将皮质反复剪切成碎块； 3、移入培养皿中，吸除解剖液加入0.25%胰蛋白酶2m1，37℃培养箱中消化30min； 4、将皮层组织碎块移入离心管，弃去剩余消化液，用接种液洗3次，每次洗涤后使组织块充分沉降到试管底，弃去上清液； 5、最后再用接种液1ml混悬，反复吹打（巴氏吸管）混悬液中组织块，力度适中，至浑浊后将上清液移入培养瓶待用； 6、加入1ml接种液后再次吹打，如此反复3-4次，组织块逐渐消化后，弃去最终残块； 7、收集含单细胞悬液的上清液约4-5ml于培养瓶中，以接种液重新悬浮细胞，细胞记数；接种1x107个细胞于6孔培养板中； 8、培养24h至细胞贴壁后，换全培养液（DMEM/F12+2%B27）培养3d，观察神经元生长状况； 9、换用阿糖胞苷培养液(终浓度2.5ug/ml，换半液)培养3d以抑制神经胶质细胞及杂细胞生长，获得单纯培养的原代神经细胞； 10、每隔3d换全培养液1次，每次换半液。 神经元免疫化学鉴定: 1、4%多聚甲醛固定细胞30min，PBS洗涤3次； 2、加入无水甲醇:30%双氧水（5:1）处理30min，PBS洗涤3次； 3、加入5%羊血清封闭20min，弃去多余液体； 4、加入Rabbit Anti-NSE（1:100）（神经元特异性烯醇化酶），培养箱中孵育2-4h，PBS洗涤3次； 5、加入Cy3-羊抗兔IgG（1:50）和20μl抗荧光衰减封片剂，室温放置1h； 6、加入DAPI染液（1:40），室温放置5-10min；PBS洗涤3次。 7、荧光显微镜观察；