固定化糖化酶活力的测定

实验2 固定化糖化酶活力的测定

1 实验目的

（1）学习固定化糖化酶活力的测定方法。

（2）了解糖化型淀粉酶活力大小对工艺生产的指导意义。

2 实验原理

糖化型淀粉酶是一类酶的总称。共同特点是可以将淀粉水解成麦芽糖或葡萄糖，包括淀粉β-1，4-麦芽糖苷酶（β-淀粉酶）、淀粉α-1，4-葡萄糖糖苷酶（糖化酶）和淀粉β-1，6-葡萄糖苷酶（异淀粉酶）。本实验的研究对象是淀粉α-1，4-葡萄糖苷酶，它有催化淀粉水解的作用，从淀粉分子非还原性末端开始，分解α-1，4-糖苷键生成葡萄糖，反应生成的葡萄糖用碘量法定量测定，以表示糖化性淀粉酶的活力。

碘量法原理：淀粉经糖化酶水解生成葡萄糖，葡萄糖具有还原性，其醛基易被弱氧化剂次碘酸盐所氧化。

I2+2NaOH→NaIO+NaI+H2O

NaIO+CH2OH(CHOH)4CHO→CH2OH(CHOH)4COOH+ NaI

体系中加入过量的碘，氧化反应完成用硫代硫酸钠标准溶液滴定过量的碘，则可计算出酶的活力。

I2+2Na2S2O3→Na2S4O6+2NaI

3 仪器和试剂

3.1 主要仪器

吸管（25ml、10ml、5ml、2ml）、定碘瓶、碱式滴定管、恒温水浴锅、分析天平。

3.2 试剂

（1）2%可溶性淀粉

称取可溶性淀粉2g（预先100℃烘干约2h至恒重），用少量蒸馏水调匀，徐徐倾入已沸的蒸馏水中，煮沸至透明，冷却定容至l00ml，此溶液需当天配制。

（2）0.2mol/L pH4.6醋酸钠缓冲液

称取醋酸钠(CH3COONa·3H2O)2.72g，用蒸馏水溶解，定容至100m1。

冰醋酸(CH3COOH)1.17m1定容至100ml。分别取醋酸钠49ml和醋酸51ml 混匀。缓冲液以酸度计或精密试纸校正pH。

（3）20%氢氧化钠溶液

（4）0.1mol/L碘液

称取碘化钾35g和碘13g溶解在100m1蒸馏水中，定容至1000ml贮存于棕色瓶中。

（5）0.1mo1/L氢氧化钠溶液

称取4g氢氧化钠加蒸馏水溶解，定容至1000ml。

（6）1mol/L硫酸溶液

量取浓硫酸 5.6ml，慢慢加入于80 m1蒸馏水中，冷却后定容至l00ml，摇匀。

（7）0.1mol/L硫代硫酸钠溶液

配制：称取结晶硫代硫酸钠(Na2S2O3·5H2O)24.82g和碳酸钠约0.2g（硫代硫酸钠溶液在pH9-10时最稳定）溶于煮沸后冷却的蒸馏水中（无CO2），定容至1000ml，即得0.1 mol/L硫代硫酸钠溶液。贮于棕色瓶中密封保存，配制后应放置一星期标定使用。

4 实验方法步骤

（1）固定化糖化酶的称量

称取实验一所得固定化糖化酶重量的2/15(相当于原酶液2mL)，待用。

（2）酶活力的测定

于甲、乙、丙三个三角瓶中，分别加入2%可溶性淀粉溶液25m1及0.2mol/L pH4.6的乙酸缓冲液5ml ，摇匀，在40℃的恒温水浴中预热5-10min ，在甲管中加入已经称量好的固定化酶（方法一），乙管中加入已经称量好的固定化酶（方法二），丙管加2ml 蒸馏水作对照，摇匀，立即记时。准确反应1h 后（加固定化酶的三角瓶在反应过程中应不断搅拌），取出各加20%NaOH 溶液0.2m1终止酶反应，冷却至室温。

取上述反应液5m1放入碘量瓶中，准确加入0.1mol/L 碘液10ml ，再加入0.1mol/L 氢氧化钠15ml ，摇匀后暗处放置15min 。加入1mol/L 硫酸2m1，用0.05mol/L 硫代硫酸钠滴定至无色为终点。

5 结果计算

5.1 计算两种方法所得固定化糖化酶的活力

糖化酶活力单位的定义：在40℃、pH4.6的条件下，1小时水解可溶性淀粉产生1毫克葡萄糖所需的酶量为一个糖化酶活力单位。

酶活力单位=（A-B)N ×90.05 ×（1/2） ×（32.2/5）

式中 A ——空白所消耗硫代硫酸钠体积（ml ）；

B ——样品所消耗硫代硫酸钠体积（ml ）；

N ——硫代硫酸钠浓度（0.1mol/L ）；

90.05 ——1ml l mol/L 硫代硫酸钠所相当的葡萄糖质量（mg ）；

1/2 ——折算成1m1酶液的量

32.2——反应液总体积（ml ）

5 ——吸取反应液样品的体积（ml ）；

5.2 计算固定化酶的活力回收率

固定化酶活力回收率=

6 思考题

（1）该实验中影响糖化酶活力单位测定值的因素主要有哪些？

（2）比较分析两种糖化酶固定化方法对其酶活性的影响？

固定化酶总活力

用于固定化的酶的总活力 × 100%

固定化酶的研究进展

固定化酶的研究进展 固定化酶是20世纪60年代发展起来的一项新技术。最初主要是将水溶性酶与不溶性体结合起来，成为不溶于水的酶衍生物，所以曾叫过“水不溶酶”和“固相酶”。但是，后来发现，也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中，高分子底物与酶在超滤膜一边，而反应产物可以透过膜逸出。在这种情况下，酶本身仍是可溶的，只不过被固定在一个有限的空间内不能再自由流动。因此，用水不溶酶或固相酶的名称就不再恰当。在1971年第一届国际酶工程会议上，正式建议采用“固定化酶”的名称[1]。 一固定化酶的发展历程[1] 酶参与体内各种代谢反应，而且反应后其数量和性质不发生变换。作为一种生物催化剂，酶可以在常温常压等温和条件下高效地催化反应，一些难以进行的化学反应在酶的催化作用下也可顺利地进行反应，而且反应底物专一性强、副反应少等优点大大促进了人们对酶的应用和酶技术的研究。近年来，酶被人们广泛应用于食品生产与检测、生物传感器、医药工程、环保技术、生物技术等领域。 1916年美国科学家NELSON和GRIFFIN最先发现了酶的固定化现象；直到20世纪50年代，酶固定化技术的研究才真正有效地开展；1953年，德国科学家GRUB-HOFER 和SCHLEITH首先将聚氨基苯乙烯树脂重氮化，然后将淀粉酶、胃蛋白酶、羧肽酶和核糖核酸酶等与上述载体结合制备固定化酶；到20世纪60年代，固定化技术迅速发展；1969年日本千畑一郎利用固定化氨基酰胺酶从DL-氨基酸生产L-氨基酸，是世界上固定化酶大规模应用的首例；在1971年的第一届国际酶工程会议上，正式建议使用固定化酶(mimobilizedenzyme)这个名称。我国的固定化酶研究开始于1970年，首先是中国科学院微生物所和上海生化所的酶学工作者同时开始了固定化酶的研究工作 二固定化酶的特点[2] [3] 固定化酶具有许多优点：极易将固定化酶与底物、产物分开；可以在较长时间内进行分批反应和装柱连续反应；在大多数情况下，可以提高酶的稳定性；酶反应过程能够加以严格控制；产物溶液中没有酶的残留，简化了提取工艺；较水溶性酶更适合于多酶反应；可以增加产物的收率,提高产物的质量；酶的使用效率提高，成本降低。但是，固定化酶也有其不足之处，如固定化时，酶活力有损失；增加了固定化的成本，工厂开始投资大；只能用于水溶性底物，而且较适用于小分子。 三固定化酶固定化方法[3] [4] 由于所固定的酶或细胞的不同，或者固定的目的及固定用的载体的不同，使固定化方法大相径庭。根据固定的一般机理，可将之分为如下几种方法。酶的固定化方法有：

酸性磷酸酯酶的固定化研究 开题报告

酸性磷酸酯酶的固定化研究 指导老师：罗少华 化学与生命科学学院 1 课题来源 化学与生命科学学院安排生物工程专业综合与创新实验课题。 2 研究的目的和意义 3 阅读的主要文献、资料 [1] 韩文静. 固定化酶的新型制备方法及其在食品工业中的应用[J]. 食品工业科 技,2009,30(02):345-347. [2] 张茜,刘涛,侯红萍. 提高固定化酶活力方法的研究进展[J]. 酿酒,2008,35(1):15-17. [3] 周桓,张秋禹. 新型固定化酶载体的合成及其功能[J]. 化工进展,2009,28(3):462. [4] [5] [6]蒋中华，张津辉. 生物分子固定化技术及应用[M]. 北京:化学工业出版社，1998.178. [7]丁明,孙虹,康玲. 壳聚糖微球的制备研究[J] . 合肥联合大学学报,1998 ,2 :7211. [8] A.怀斯曼.酶生物技术手册，科学技术出版社，1989. [9] [10] 肖海军，赫筱蓉.固定化酶及其应用研究进展，生物学通报，2001，36(7)：9-10. [11] 卓仁禧，罗毅，陶国良.固定化酶技术及其进展，离子交换与吸附，1994，(5)：447-452 [12] 罗九甫. 酶和酶工程，上海交通大学出版社，1996年. [13] 熊振平，等. 酶工程，化学工业出版社，1989年. [14] [15] 王长生，田玉国. 酶的固定化技术[J]. 中国调味品，1994，12：7-9. [16] 沈斌. 木瓜蛋白酶的柔性固定化研究[J]. 南京工业大学硕士学位论文，2005 [17] 魏荣卿，沈斌，等. 壳聚糖载体柔性固定化木瓜蛋白酶[J], 过程工程学报, 2005,5(2):183-187.

酶固定化技术及其应用

酶固定化技术及其应用 摘要： 酶因其优良的催化性能而被广泛应用，但游离酶应用过程中有许多缺点，固定 化酶技术因此而产生，并且迅速发展。本文主要介绍传统的固定化酶技术、新 型固定化酶技术、新型载体材料及固定化酶技术的应用。 关键词：酶固定化；载体；应用 The enzyme is widely applied because of its fine catalyzed performance, but in the dissociation enzyme application process has many shortcomings, the fossilization enzyme technology therefore produces, and develops rapidly. This article main introduction traditional fossilization enzyme technology, new fossilization enzyme technology, new carrier material and fossilization enzyme technology application. 一、前言 酶的本质是一类具有催化功能的蛋白质，与化学催化剂相比具有反应速度快、反应条件温和、底物专一性强,可在水溶液和中性pH 下操作等优点。但其 高级结构对环境十分敏感，物理因素、化学因素和生物因素均可使没丧失活力。 而且，随着反应过程的进行，反应速率会下降。此外，游离酶在反应液中和产 物在一起，反应后酶不能回收重复利用，也使得产物的分离纯化更为复杂。以 上的这些因素使得酶在工业中的应用受到了极大的限制，找到解决这些问题得 方法十分迫切。 可喜的是，经过专家学者的不断努力，发现将酶用特殊的载体固定，酶仍能与底物有效的进行反应。这中酶的出现，使得酶与产物在反应液中相互分离，具有可回收、重复利用等优点，从而使生产工艺可以实现连续化、自动化。 酶的固定化是指将酶限制或固定在某一局部空间或特定的固体载体上进行其特有的催化反应，并可回收及重复利用的技术，在催化反应中以固相状态作 用于底物。近年来，固定化酶的研究得到了人们极大的关注，并取得了许多重 要成果。下面以酶的固定化方法为核心,介绍一些有关酶固定化技术的应用及研 究新进展。 二、传统酶固定化技术

实验六十二固定化酶制备及酶活力测定

实验六十二固定化酶制备及酶活力测定 实验项目性质：综合性 所涉及的知识点：酶固定化、酶活测定 计划学时：6学时 一、实验目的 1.掌握包埋法固定化酶的操作技术。 2.掌握测定碱性蛋白酶活力的原理和酶活力的计算方法。 3.学习测定酶促反应速度的方法和基本操作。 二、实验原理 酶活力是指酶催化某些化学反应的能力。酶活力的大小可以用在一定条件下它所催化的某一化学反应的速度来表示。测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。 酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。 碱性蛋白酶在碱性条件下，可以催化酪蛋白水解生成酪氨酸。酪氨酸为含有酚羟基的氨基酸，可与福林试剂（磷钨酸与磷钼酸的混合物）发生福林酚反应。（福林酚反应：福林试剂在碱性条件下极其不稳定，容易定量地被酚类化合物还原，生成钨蓝和钼蓝的混合物，而呈现出不同深浅的蓝色。）利用比色法即可测定酪氨酸的生成量，用碱性蛋白酶在单位时间内水解酪蛋白产生的酪氨酸的量来表示酶活力。 所谓固定化酶，就是用物理或化学方法处理水溶性的酶使之变成不溶于水或固定于固相载体的但仍具有酶活性的酶衍生物。在催化反应中,它以固相状态作用于底物，反应完成后,容易与水溶性反应物分离，可反复使用。固定化酶不但仍具有酶的高度专一性和高催化效率的特点，且比水溶性酶稳定，可较长期使用，具有较高的经济效益。将酶制成固定化酶，作为生物体内的酶的模拟，可有助于了解微环境对酶功能的影响。 酶的固定化方法大致可分为载体结合法、交联法和包埋法（图1-1-1）等。 载体结合法：将酶结合到非水溶性的载体上。一般来讲,载体的亲水性基团越多，表面积越大，单位载体结合的酶量也越大。最常用的是共价结合法，此外还有离子结合法、物理吸附法。 交联法：利用双官能团或多官能团试剂与酶之间发生分子交联来把酶固定化的方法。常用的试剂有戊二醛、亚乙基二异氰酸酯、双重氮联苯胺和乙烯- 马来酸酐共聚物等。参与此反应的酶蛋白中的官能团有N末端的α-氨基、赖氨酸的ε-氨基、酪氨酸的酚基和半胱氨酸的巯基等。交联法反应比较激烈，固定化酶的活力，在多数情况下都较脆弱。 包埋法：将酶包裹于凝胶网格或聚合物的半透膜微中,使酶固定化。所用的凝胶有琼脂、海藻酸盐以及聚丙烯酰胺凝胶等；用于制备微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。将酶包埋在聚合物内是一种反应条件温和，很少改变酶蛋白结构的固定化方法，此法对大多数酶、粗酶制剂、甚至完整的微生物细胞都适用。但此法较适合于小分子底物和产物的反应，因为在凝胶网格和微囊中存在有分子扩散效应。加大凝胶网格，有利于分子扩散，但使凝胶的机械强度降低。

固定化酶的生产

酶的固定化技术 摘要：固定化酶（Immobilized Enzyme）是20世纪60年代发展起来的一项新技术。它是通过物理的或化学的手段，将酶束缚于水不溶的载体，或将酶束缚在一定的空间内，限制酶分子的自由流动，但能使酶充分发挥催化作用。这么好的酶是如何生产的以及它的应用前景是怎样的，本篇文章就对这些问题进行一些论述。 关键字：固定化、束缚、生物技术、固定化细胞 Abstract:Immobilized Enzyme was a new technology of developing from sixty years of twenty century.It depends on physical or chemical means to bound enzymes on carriers which are not dissolved into water or in a certain space. It can limit the free flow of enzymes molecule, but the catalysis can be come into play fully. So, this passage will discuss how to produce such a good enzyme and what is the applied in future. Keywords:Immobilized, bounded, biotechnology, Immoilized cell 前言：固定化酶是指经过一定改造后被限制在一定的空间内，能模拟体内酶的作用方式，并可反复连续地进行有效催化反应的酶。固定化酶又称固相酶。在理论研究上，固定化酶可以作为探讨酶在体内作用的模型;在实际使用中,可使生产工艺自动化和连续化，提高酶的使用效率。

酶固定化技术研究进展

酶固定化技术研究进展 选题说明 酶作为一种生物催化剂，具有高催化效率，高选择性，催化反应条件温和，清洁无污染等特点，其卓越的催化效能，令普通无机催化剂难以望其项背，因此酶的工业化使用一直是广受社会关注的课题，但天然酶稳定性差、易失活、不能重复使用，并且反应后混入产品，纯化困难，使其难以在工业中更为广泛的应用。此外，分离和提纯酶以及其一次性使用也大大增加了其作为催化剂的成本，严重限制了酶的工业推广。在此条件下，固定化酶的概念和技术得以提出和发展，并成为近些年酶工程研究的重点。酶的固定化，是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应，并可回收及重复使用的一类技术。通过固定化，可以解决天然酶的局限性，实现酶的广泛运用。 基于对于酶的工业化使用和固定化酶的兴趣，我通过互联网和数据库信息检索的方式对酶的固定化技术发展状况进行了初步探索，并对目前的研究成果进行了简要的概括。希望能使大家对这一领域有所认识。 检索过程说明 1，检索工具和数据库 1.1，百度搜索引擎 1.2，Google搜索引擎 1.3，中国期刊全文数据库 1.4，万方数据系统 1.5，重庆维普中文科技期刊数据库 2，检索过程简述

首先，我选择了使用百度和Google搜索引擎进行关键词检索，都得到了浩繁的搜索结果，所的信息主要是百科简介和企业广告信息，介绍较为浅显陈旧，可利用性较差，但可以用于简单的信息了解，在搜素过程中，尝试使用了布尔检索规则如“固定化酶and应用”、高级检索和结果中检索的检索方式，以减小数据量。也尝试了Google学术搜索，得到了很多有用信息。运用维普中文科技期刊数据库搜素“题名或关键词”为“固定化酶”的相关资料得到655条，搜素“题名或关键词”为“固定化酶应用”的相关资料得到72条，检索关键词搜素“题名或关键词”为“固定化酶研究”的相关资料得到4条. 万方数据系统搜索主题词"固定化酶",得到相关资料1024条，搜索“固定化酶技术应用”得到相关资料23条.。中国期刊全文数据库中检索“固定化酶技术”得到相关资料2604条，搜索“固定化酶技术应用”得到相关资料742条 关键词 酶固定化载体制备研究应用 酶固定化技术研究进展 提要： 固定化酶有许多优点，尤其是稳定性和可重复使用性使其在许多领域得到广泛应用。固定化酶技术是一门交叉学科技术。目前已得到长足的发展。本文重点介绍了固定化酶制备的传统方法和近些年出现的一些新方法，同时对酶在一些性能优良的栽体上的固定进行了综述。 正文： 一，传统的酶固定化方法

酶的固定化技术及其应用

酶工程课程论文 题目：酶的固定化技术及其应用 学院：食品学院 专业：食品科学与工程 班级：食品101（35） 2012-11-21

酶的固定化技术及其应用 摘要：酶的固定化技术是酶工程研究领域的一项重点和热点技术之一，酶的固定化技术可以显著提高酶的利用率，降低酶生产的成本。本文主要研究酶的固定化技术，酶固定化的优缺点，以及在食品，医药，环境中的应用。并对其研究的前景进行了简洁的预测。 关键字：酶固定化技术应用 酶作为一种生物催化剂，因其催化作用具有高度专一性、催化条件温和、无污染等特点，广泛应用于食品加工、医药和精细化工等行业。但在使用过程中，人们也注意到酶的一些不足之处，如酶稳定性差、不能重复使用，并且反应后混入产品，纯化困难，使其难以在工业中更为广泛的应用。因此为适应工业化生产的需要，人们模仿人体酶的作用方式，通过固定化技术对酶加以固定改造，来克服游离酶在使用过程中的一些缺陷。 固定化酶，是指在一定的空间范围内起催化作用，并能反复和连续使用的酶。与传统的酶相比，固定化酶具有游离酶所不可比拟的优点.同一批固定化酶能在工艺流程中重复多次地使用；固定化后，和反应物分开，有利于控制生产过程，同时也省去了热处理使酶失活的步骤；稳定性显著提高；可长期使用，并可预测衰变的速度；提供了研究酶动力学的良好模型等一系列的优点。 用于固定化的酶，起初都是采用经提取和分离纯化后的酶，随着固定化技术的发展，也可采用含酶细胞或 细胞碎片进行固定化，直接应用细胞或细胞碎片中的酶或酶系进行催化反应．由于微生物细胞可直接作为酶源，所以逐渐产生了固定化细胞技术． 固定化细胞的优点是： (1)省去了酶分离纯化的时间和费用； (2)可进行多酶反应； (3)保持了酶的原始状态，从而增加了酶的稳定性． 但固定化细胞与固定化酶相比，也存在一些不足 之处： (1)因为产生副反应和所需生化产物的进一步代 谢，使固定化完整细胞生产的产物纯度可能比固定化酶低； (2)细胞使用相当长的时间后，常常会发生自溶，尤 其是在细胞有可能进行增殖时，细胞的漏出就特别 明显： (3)单位体积反应器内固定化细胞的活性总是比相 应的固定化酶活性低．

固定化酶的制备

固定化酶制备及酶活力测定 实验者：张玲玲绿药1班 201330360126 同组者：金雨馨、管青青 实验日期：2015/3/13 报告完成日期：2015/3/20 实验指导：易喻 摘要：酶的固定化技术是用固定材料将酶束缚或限制于一定区域内，酶仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复利用的一类技术。酶活力的测定实质是测定被酶所催化的化学反应速度。本文通过包埋法对酶进行固定化，并利用福林酚反应测定碱性蛋白酶的酶活力。结果表明：固定酶能够增强酶的稳定性，多次使用，但会造成酶活力的降低。 关键词：固定化酶酶活力包埋法 Abstract：Enzyme immobilization is a kind of technology that confine enzyme to a certain area by fixed material and the enzyme can still carry out its unique catalytic reaction .Determination of enzyme activity is essentially determination of enzyme-catalyzed chemical reaction rate. In this article, we fixed enzyme by embedding and determinated enzyme by Folin phenol reaction. The result showed that enzyme immobilization can enhance the stability of the enzyme, but will reduce the enzyme activity. 前言：酶的固定化（Immobiiization of enzymes）是用固体材料将酶束缚或限制于一定区域内，仍能进行其特有的催化反应、并可回收及重复使用的一类技术。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效、专一及温和的酶催化反应特性的同时，还呈现贮存稳定性高、分离回收容易、可多次重复使用、操作连续及可控、工艺简便等一系列优点。依据酶的性质及用途，可通过包埋法、交联法、吸附法及共价结合法来实现酶的固定化。其中包埋法是将酶包裹于凝胶网格或聚合物的半透膜微中,使酶固定化。所用的凝胶有琼脂、海藻酸盐以及聚丙烯酰胺凝胶等；用于制备微囊的材料有聚酰胺、聚脲、聚酯等。分为网格型和微囊型两类，其制备工艺简便且条件较为温和、可获得较高的酶活力回收。 测定酶活力实际就是测定被酶所催化的化学反应的速度。酶促反应的速度可以用单位时间内反应底物的减少量或产物的增加量来表示，为了灵敏起见，通常是测定单位时间内产物的生成量。由于酶促反应速度可随时间的推移而逐渐降低其增加值，所以，为了正确测得酶活力，就必须测定酶促反应的初速度。福林—酚试剂是磷铂酸盐与磷钨酸盐的混合物。它在碱性条件下不稳定，能被酪氨酸中的酚基还原，生成铂蓝、钨蓝的混合物。酪蛋白在蛋白酶作用后产生的酪氨酸可与福林—酚试剂反应，所生成的蓝色化合物可用比色法测定。 正文： 1.实验过程 1.1试剂与仪器 1.1.1试剂 ①海藻酸钠、3.0%氯化钙 ②碱性蛋白酶（1.0mg/mL） ③福林试剂

固定化酶制备方法研究进展_曹树祥

专论与综述 固定化酶制备方法研究进展 曹树祥　黎苇 (九江职业大学,九江332000) 摘要　对固定化酶的主要制备方法进行了系统的阐述,根据作者本人的试验经验对 目前应用和研究得较多的方法作了详细的说明,对所阐述的各种固定化酶的制备方 法的优缺点进行了比较。 关键词　固定化酶　吸附　包埋　共价键结合　肽键结合　交联 本世纪60年代,一项新的技术——固定化酶技术开始发展起来。最初主要是将水溶性酶与不溶性载体结合起来,成为不溶于水的酶的衍生物,称为“水不溶酶”或“固相酶”。后来发现,也可以将酶包埋在凝胶内或置于超滤装置中。将酶置于超滤装置中时,高分子底物与酶被截留在超滤膜一侧,而反应物可以透过膜流出,在这种情况下,酶本身仍是可溶的,只不过被固定在一个很有限的空间内,因此用水不溶酶和固相酶的名称不恰当。1997年第1届国际酶工程会议正式建议采用“固定化酶”的名称。 从60年代起,固定化酶的研究迅速发展,固定化方法目前已超过200种以上。近来研究较多且应用最广的两种方法分别为卡拉胶聚糖包埋法和海藻酸钙凝胶包埋法。本文依据国内外有关文献及作者在这一领域的试验与体会就固定化酶的主要制备方法作简要介绍与评述。 1　固定化酶制备方法的分类 固定化酶的制备方法可分为如下几类: (1)吸附法:物理吸附法、离子吸附法等。 (2)包埋法:聚丙烯酰胺凝胶包埋法、辐射包埋法、卡拉胶包埋法和微囊法等。 (3)共价键结合法:重氮化法、烷基化和芳基化法、戊二醛处理法、钛螯合法、硫醇-二硫化物互换反应法和四组分缩合反应法等。 (4)肽键结合法:酰基迭氮衍生物法、溴化氰活化的多糖法、碳酸纤维素衍生物法、马来酐衍生物法、异氰衍生物法和硫酰胺结合法等。 (5)交联法。 2　吸附法 2.1　物理吸附法[1] 使酶直接吸附在载体上的方法称为物理吸附法。常用的载体有:(1)有机载体,如面筋、淀粉等;(2)无机载体,如氧化铝、活性炭、皂土、白土、高岭土、多孔玻璃、硅胶、二氧化钛等。用此法制成的固定化酶,活力损失少,但酶与载体的结合不牢固,易于脱落,很少有实用价值。 2.2　离子吸附法[1] 此法是将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体结合,酶吸附于载体上较为牢固。此法在工业上应用较广泛,常用的载体有:(1)阴离子交换剂,如二乙氨基乙基(DEAE)-纤维素、混合胺类(ECTEOLA)-纤维素、四乙氨基乙基(TEAE)-纤维素、DEAE-葡聚糖凝胶、Amberlite IRA-93、IRA-410、IRA-900等;(2)阳离子交换剂,如羧甲基(CM)-纤维素、纤维素-柠檬酸盐、Amberlite CG-50、IRC-50、IR-120、IR-200、Dowex-50等。 1999-01-12收到初稿,1999-05-30收到修改稿。

2017-2018学年人教版高中生物选修一专题4 酶的研究与应用 课题3 酵母细胞的固定化 Word版含答案

课题3酵母细胞的固定化 1．概念 利用物理或化学方法将酶或细胞固定在一定空间内的技术。 2．方法 (1)包埋法：多适于细胞的固定化； (2) }化学结合法物理吸附法多适于酶的固定化。 3．载体 包埋法固定化细胞常用的是不溶于水的多孔性载体材料，如明胶、琼脂糖、海藻酸钠、醋酸纤维素和聚丙烯酰胺等。 4．优点 (1)固定化酶既能与反应物接触，又能与产物分离，可以反复利用。 (2)固定化细胞技术制备的成本低，操作容易。 5．实例——高果糖浆的生产 (1)原理：葡萄糖―――――→葡萄糖异构酶果糖。 (2)生产过程： ①将葡萄糖溶液从反应柱的上端注入。 ②使葡萄糖溶液流过反应柱，与固定化葡萄糖异构酶接触。 ③转化成的果糖，从反应柱的下端流出。 1．固定化酶常采用化学结合法和物理吸附法，而 固定化细胞则常采用包埋法。 2．制备固定化酵母细胞的基本步骤是：酵母细胞 的活化―→配制CaCl 2溶液―→配制海藻酸钠溶 液―→海藻酸钠与酵母细胞混合―→固定化酵 母细胞。 3．配制海藻酸钠溶液浓度过高，则难以形成凝胶 珠；若浓度过低，则固定的酵母细胞少，影响 实验效果。 4．配制海藻酸钠溶液应小火加热或间断加热。 5．固定化酶和固定化细胞技术既实现了对酶的重 复利用，降低了成本，又提高了产品质量。

(3)反应柱：酶固定在一种颗粒状的载体上，再将其装入反应柱内，柱子底端装上分布着许多小孔的筛板。酶颗粒无法通过筛板上的小孔，而反应溶液却可以自由通过。 (4)优点：反应柱能连续使用半年，大大降低了生产成本，提高了果糖的产量和质量。 1．酶能加快化学反应速率，但溶液中的酶难以回收，不能利用。要想既降低生产成本，又不影响产品质量，该如何解决这一问题？ 提示：将酶固定于不溶于水的载体上，使酶既能与反应物接触，又能与反应物分离，还可重复利用。 2．固定化酶和固定化细胞一般采用什么方法？为什么？ 提示：固定化酶常用化学结合法或物理吸附法。因酶分子小，易从包埋材料中漏出，故一般不用包埋法进行固定。固定化细胞常用包埋法，因个大的细胞难以被吸附或结合。 3．从操作角度来考虑，你认为固定化酶技术与固定化细胞技术哪一种方法更容易？哪一种方法对酶活性的影响更小？ 提示：固定化细胞技术。固定化细胞技术。 4．固定化细胞固定的是一种酶还是一系列酶？如果想将微生物的发酵过程变成连续的酶反应，应该选择哪种方法？ 提示：一系列酶；固定化细胞技术。 5．如果反应物是大分子物质，又应该采用哪种方法？为什么？ 提示：固定化酶技术。因为大分子物质不容易进入细胞内，如果采用固定化细胞技术会使反应效率下降。 [跟随名师·解疑难] 直接使用酶、固定化酶和固定化细胞的比较

【CN110004138A】固定化酶及其制备方法【专利】

(19)中华人民共和国国家知识产权局 (12)发明专利申请 (10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 201910354520.5 (22)申请日 2019.04.29 (71)申请人 中国检验检疫科学研究院 地址 100176 北京市大兴区北京市亦庄经 济开发区荣华南路11号 (72)发明人 张峰　姚桂红　凌云　杨敏莉　 (74)专利代理机构 北京正鼎专利代理事务所 (普通合伙) 11495 代理人 岳亚 (51)Int.Cl. C12N 11/14(2006.01) C12N 11/08(2006.01) (54)发明名称固定化酶及其制备方法(57)摘要本发明公开了制备固定化酶及其制备方法。其中，该制备固定化酶的方法包括：将四氧化三铁溶于第一缓冲液中获得基材溶液，并加入多巴胺盐进行包覆处理，以便得到聚多巴胺包覆的四氧化三铁纳米复合物；将非特异性脂肪酶和sn -1,3专一性脂肪酶溶于第二缓冲液中，以便得到酶缓冲液；将聚多巴胺包覆的四氧化三铁纳米复合物与所述酶缓冲液接触，通过共价固定获得所述固定化双酶。该方法以四氧化三铁纳米复合物为固定载体，将sn -1,3专一性脂肪酶和非特异性脂肪酶经共固定化处理得到固定化双酶。制备过程简单，条件温和，同时，所制备的固定化双酶的稳定性好，催化效果高，且易于分离回收、重复使用效果好， 便于将该酶用于工业生产。权利要求书1页 说明书8页 附图4页CN 110004138 A 2019.07.12 C N 110004138 A

权　利　要　求　书1/1页CN 110004138 A 1.一种制备固定化酶的方法，其特征在于，包括： 将四氧化三铁溶于第一缓冲液中获得基材溶液，并加入多巴胺盐进行包覆处理，以便得到聚多巴胺包覆的四氧化三铁纳米复合物； 将非特异性脂肪酶和sn-1,3专一性脂肪酶溶于第二缓冲液中，以便得到酶缓冲液；以及 将所述聚多巴胺包覆的四氧化三铁纳米复合物与所述酶缓冲液接触，通过共价固定获得所述固定化双酶。 2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述非特异性脂肪酶为皱褶假丝酵母脂肪酶。 3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述sn-1,3专一性脂肪酶为疏棉状嗜热丝孢菌脂肪酶。 4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，所述非特异性脂肪酶与所述sn-1,3专一性脂肪酶的质量比为1:0.2-7。 5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述酶缓冲液中的所述非特异性脂肪酶和所述sn-1,3专一性脂肪酶的总浓度为0.5-3.5mg/mL。 6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述多巴胺盐的添加量为0.5-3mg/mL。 7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第一缓冲液为三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液，优选地，所述三羟甲基氨基甲烷盐酸盐缓冲液的浓度为8-12mM，pH值为7.0-12.0。 8.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述四氧化三铁的添加量为1-6mg/mL。 9.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述第二缓冲液为PBS缓冲液，优选地，所述PBS缓冲液的浓度为8-12mM，pH值为4.0-9.0。 10.一种固定化酶，其特征在于，所述固定化酶是利用权利要求1-9任一项所述的方法制备的。 2

固定化酶技术及应用的研究进展

固定化技术研究进展 摘要：固定化酶技术作为一门交叉学科技术，在生命科学、生物医学、食品科学、化学化工及环境科学领域得到了广泛应用。新型载体材料的合成是今后固定化酶发展的一个非常重要的研究领域。本文主要介绍了固定化酶的载体，固定化技术以及在不同行业的应用，主要介绍了在污水处理和医疗行业的应用和发展趋势。 关键词：固定化载体污水医疗应用 酶是重要的生物催化剂，具有专一性强、催化效率高、无污染、反应条件温和等特点，在制药、食品、环保、酿造、能源等领域都得到了广泛的应用。但在实际应用中，酶也存在许多不足，如大多数的酶在高温、强酸、强碱和重金属离子等外界因素影响下，都容易变性失活，不够稳定；与底物和产物混在一起，反应结束后，即使酶仍有很高的活力，也难于回收利用，这种一次性使用酶的方式，不仅使生产成本提高，而且难于连续化生产；并且分离纯化困难，也会导致生产成本的提高等。固定化酶技术(Immobilized enzyme technology)克服了酶的上述不足。酶的固定化是指采用有机或无机固体材料作为载体，将酶包埋起来或束缚、限制于载体的表面和微孔中，使其仍具有催化活性，并可回收及重复使用的酶化学方法与技术。 1.传统酶固定化技术 传统酶的固定化方法可分为吸附法、共价偶联法、交联法和包埋法等4 种。吸附法是指通过载体表面和酶表面间的次级键相互作用而达到酶固定化的方法，根据吸附剂的特点又可分为物理吸附和离子交换吸附。该法具有操作简便、条件温和及吸附剂可反复使用等优点，但也存在吸附力弱，易在不适pH、高盐浓度、高底物浓度及高温条件下解吸脱落的缺点。共价偶联法是将酶的活性非必须侧链基团与载体的功能基通过共价键结合，故表现出良好的稳定性，有利于酶的连续使用，是目前应用和研究最为活跃的一类酶固定化方法，但共价偶联反应容易使酶变性而失活。交联法是利用双功能或多功能基团试剂在酶分子之间交联架桥固定化酶的方法，其更易使酶失活。包埋法包括网格包埋、微囊型包埋和脂质体包埋等，包埋法中因酶本身不参与化学结合反应，故可获得较高的酶活力回收，其

固定化酶技术与应用

固定化酶技术与应用 姓名：高强 专业：生物科学 学号：2004083011 日期：2013年5月

固定化酶技术及应用 摘要：近年来由于固定化酶技术的发展，对固定化酶载体的研究非常活跃。本文对固定化酶载体,固定化酶的应用生产,酶传感器，固定化细胞技术进行简单介绍。 关键词：固定化酶载体应用固定化细胞 引言 固定化技术的应用可追溯到20世纪50年代，最初是将水溶性酶与不溶性载体结合起来，成为不溶于水的酶的衍生物。1971年第一届国际酶工程会议上正式建议采用“固定化酶”的名称。所谓固定化酶，即在一定空间内呈闭锁状态存在的酶，能连续地进行反应，反应后的酶可以回收重复使用。固定化酶属于修饰酶，其具有以下优点：1极易将固定化酶与底物，产物分开；2可以在较长时间内进行反复分批反应和装柱连续反应；3在大多数情况下，能够提高酶的稳定性；4反应过程能够加以严格控制；5产物溶液中没有酶的残留，简化了提纯工艺；6较游离酶更适合于多酶反应；7可以增加产物的收率，提高产物的质量；8酶的使用效率提高，成本降低。鉴于固定化酶的优点，本文从固定化酶载体的研究进展,固定化酶的应用，固定化酶的生产，在食品加工中的使用，固定化细胞技术等方面进行介绍。 固定化酶载体研究进展 载体材料的选择是决定酶能否成功固定化以及固定化酶活力高低的重要因素。酶蛋白的活性中心是酶催化活性所必需的，酶蛋白的空间结构也与酶活力密切相关，因而．在固定化的过程中，必须注意酶活性中心的氨基酸残基不受到载体的影响．而且要避免酶蛋白高级结构的破坏[1]。 甲壳素及壳聚糖作为载体的固定化方法报道较多的有吸附法、通过双功能试剂交联的共价结合法。目前，使用较多的是用戊二醛作交联剂的共价结合法。载体的形态有片状、球状、膜状、无定形等。1982年．John Wiley 利用甲壳素、壳聚糖的吸附作用固定化胰蛋白酶，把甲壳素、壳聚糖固态混合研磨40h，加入粉末状胰蛋白酶混合研磨进行固定化，另一对照样加入酶液进行固定化。结果表明胰蛋白酶以粉末状进行固定化时效果更好，且研磨时间越长，固定化效果越好。得出结论：甲壳素、壳聚糖表面积的增加有利于胰蛋白酶的固定化溶液酶在数天内几乎失去全部活力，而固定化酶在室温或高于室温的条件下仍保持其活力。 纳米粒子作为酶固定化的载体，当其具有磁性时，制备的固定化酶易从反应体系中分离和回收，操作简便；并且利用外部磁场可以控制磁性材料固定化酶的运动方式和方向，替代传统的机械搅拌方式，提高固定化酶的催化效率。在众多纳米材料中，氧化铁因其在磁性、催化等多方面的良好特性而备受瞩目[2]。 微胶囊是一种采用高分子聚合物或其他成膜材料将物质的微粒或微滴包覆所形成的微小容器，其粒径一般在微米至毫米级范围，通常为5～400μm。将酶用微胶囊包覆后形成的微胶囊固定化酶，由于被催化物质和产物可自由通过囊壁,因而能起到酶催化剂的作用[3]。酶经过微胶囊固化后,还使酶具有如下的优点：①提高了酶的稳定性,使其可以在恶劣的条件下存活。微胶囊囊壁可将对酶活性和稳定性有影响的抑制因子、有害因子等排除在外，同时还可与一定量的稳定剂、整合剂等一起包埋，进一步增加其耐极端条件的能力；②通过选择合适的胶囊，可控制酶的释放时间。这对于多阶段加工过程中酶的活力要在后一阶段发挥的情况

糖化酶发酵、提取及活力测定

SHANDONGＵＮＩＶＥＲＳＩＴＹＯＦＴＥＣＨＮＯＬＯＧＹ 发酵工艺学实验报告 糖化酶发酵、提取及活力测定实验 学院：生命科学学院 专业班级：生物工程1602 项目组成员：刘松良、张金中、蔡超、何建雨、周钻钻 指导教师：王丽娟 2018年6月

糖化酶发酵、提取及活力测定实验 何健雨王丽娟 生命科学学院生工1602班 1. 实验目的 (1)了解黑曲霉生长特性,学习糖化酶发酵工艺； (2)了解黑曲霉生长特性,学习糖化酶发酵工艺。 (3)学习并掌握糖化酶活力测定方法 2. 实验原理 葡萄糖淀粉酶( glucoamylase,EC.3.3.13)系统名为淀粉a-1,4-葡聚糖葡萄糖水解酶,俗称糖化酶,是国内酶制剂中产量最大的品种。糖化酶对淀粉分子的作用是从非还原性末端切开a-1,4键,也能切开a-1,3键和a-1,6键,生成葡萄糖。 生产糖化酶常用的菌种是黑曲霉,将活化好的黑曲霉制成孢子悬浮液,转接接到三角瓶直接进行发酵,或转接到三角瓶作为种子,进行一次扩大培养后,再转接到发酵罐进行糖化酶发酵。 黑曲霉糖化酶是一种胞外酶。首先采用过滤法将菌体等杂质除去,继而对滤液进行浓缩,最后用有机溶剂如乙醇将酶沉淀出来,对沉淀物进行干燥,加工成成品。 糖化酶有催化淀粉水解的作用,能从淀粉分子非还原性末端开始,分解a-1,4键,生成葡萄糖。葡萄糖分子中含有的醛基能被次碘酸钠氧化,过量的次碘酸钠钠,酸化后析出碘,再用硫代硫酸钠标准溶液标定,计算酶活力。 酶活力定义:1g固体酶粉(或1mL液体酶),于559CpH4.6的条件下,1h分解可溶性淀粉产生1mg葡萄糖,即为一个酶活力单位,以U/mL(U/g)表示。 3. 实验材料 优质大麦芽粉、大米粉、酒花；耐高温-α淀粉酶、糖化酶；乳酸（磷酸）； 0.025 mol/L碘液；温度计（100℃）、恒温水浴锅、糖度计、布氏漏斗、分析天平、纱布、玻璃仪器。 4. 方法步骤

固定化酶的四种方法

1吸附法:利用各种吸附剂将酶或含酶菌体吸附在其表面上而使酶固定的方法。通常有物理吸附法和离子吸附法。常用吸附剂有活性炭、氧化铝、硅藻土、多孔陶瓷、多孔玻璃等。 采用吸附法固定酶，其操作简便、条件温和，不会引起酶变性或失活，且载体廉价易得，可反复使用。该方法最显著的优点是操作简便，但酶与载体结合不牢，极易脱落，所以它的使用受到一定的限制。因此，人们不断尝试使用新的载体来解决这易脱落的问题。通常，吸附法分为物理吸附法和离子吸附法。 物理吸附法:酶被载体吸附而固定的方法称为物理吸附法。从载体对酶的适应性来看，这个方法效果是好的，酶蛋白的活性中心不易受破坏，酶的高级结构变化也不明显，但其缺点是酶与载体的相互作用较弱，被吸附的酶极易从载体表面上脱落下来，不能获得较高活力的固定化酶。该方法常用的载体有活性炭、多孔陶瓷、纤维素及其衍生物、甲壳素及其衍生物等。离子吸附法:将酶与含有离子交换基团的水不溶性载体以静电作用力相结合的固定化方法。该方法的处理条件温和，且酶的高级结构和活性中心的氨基酸很少发生变化，因而可 以得到较高活性的固定化酶。采用此法固定的酶有葡萄糖异构酶、糖化酶、B一淀粉酶、纤维素酶等。 2交联法是用双功能试剂或多功能试剂进行酶分子之间的交联，使酶分子和双功能试剂或多功能试剂之间形成共价键。常用的交联剂是戊二醛，但单用戊二醛等试剂交联制备的固定化酶活力较低，因此常将此法与吸附法、包埋法结合使用，可以达到既提高固定化酶的活力，又起到加固的效果.酶蛋白的游离氨基、酚基、咪唑基及巯基均可参与交联反应。 3载体结合法 最常用的是共价结合法，即酶蛋白的非必需基团通过共价键和载体形成不可逆的连接。在温和的条件下能偶联的蛋白质基团包括：氨基、羧基、半胱氨酸的巯基、组氨酸的咪唑基、酪氨酸的酚基、丝氨酸和苏氨酸的羟基。参加和载体共价结合的基团，不能是酶表现活力所必需的基团。此法曾先后用于3′-核糖核酸酶、5′-磷酸二酯酶和葡萄糖淀粉酶等的固定化。此外酶通过物理吸附或离子吸附于载体制备固定化酶也是常用的方法。共价键结合法:共价键结合法是将酶与水不溶性载体以共价键结合的一种方法。此法研究较为成熟，其优点是酶与载体问连接牢固，即使用高浓度底物或离子强度的溶液进行反应，也不会导致酶和载体的分离，因此具有良好的稳定性及重复使用性。缺点是反应条件比较苛刻，常常会引起酶蛋白高级结构发生改变，导致酶的活性中心受损。 4包埋法是将聚合物的单体与酶溶液混合，再借助于聚合助进剂的作用进行聚合，酶被包埋在聚合物中以达到固定化。包埋法一般不需要与酶蛋白的氨基酸残基进行结合反应，很少改变酶的空间构象，酶活回收率较高，因此可以应用于许多酶的固定化。但是此法只适用于小分子底物和产物的酶催化反应，因为只有小分子反应底物或产物，才可以通过高分子聚合物进行扩散。包埋法制备固定化酶除包埋水溶性酶外还常包埋细胞，制成固定化细胞，例如可用明胶及戊二醛包埋具有青霉素酰化酶活力的菌体，可连续水解帤基青霉素，工业生产6-氨基青霉烷酸。 酶经过固定化后，比较能耐受温度及pH的变化，最适pH往往稍有移位，对底物专一性没有任何改变，实际使用效率提高几十倍（如5′-磷酸二酯酶的工业应用）甚至几百倍（如青霉素酰化酶的工业应用）。本实验中为什么选用石英砂来固定化酶？ 本实验中为什么选用石英砂来固定化酶？答：固定化酶有许多方法，本实验中采用的是吸附法。吸附法有物理交换法和离子交换法两种。其中本实验采用的又是物理交换法。该方法是将酶蛋白的分子吸附在惰性载体上，但要选择不引起变性且能保持一定酶活力的载体，且对蛋白质要有高度吸附能力。自然界中有机硅胶、活性炭和石英砂等都可以被用于做载体。现已了解其中石英砂对固定化α-淀粉酶、胰蛋白酶作用较好。

固定化酶在现代工业中的应用

固定化酶在现代工业中的应用姓名：胡艳芬学号：2008132106 指导教师：张孟 摘要酶是一类有催化功能的蛋白质,具有反应条件温和, 底物专一性强, 可在水溶液和中性pH 下操作等优点。与游离酶相比，固定化酶在保持其高效专一及温和的酶催化反应特性的同时，又克服了游离酶的不足之处。本文简要介绍了固定化酶的概念、制备方法及其在生物、医药、环境保护等方面的广泛应用。重点介绍一些固定化酶在现代工业中的应用，并对其应用前景进行了展望。 关键词固定化酶制备工业应用前景 酶是一类由活细胞产生的具有生物催化功能的分子量适中的蛋白质,具有极高的催化效率、高度的特异性及控制的灵敏性。大多数酶是水溶性的。由于酶催化反应具有底物专一性、催化高效性、反应条件温和等优点,符合绿色化学的要求,从而被大家高度重视,已在许多领域得到广泛的应用[1]。酶的最大缺点是其不稳定性,在酸、碱、热及有机溶剂中易发生变性,活性降低或丧失;而且酶反应后,会在溶液中残留,造成酶反应难以连续化、自动化,同时也不利于终产品的分离提纯,这些都大大阻碍了酶工业的发展,所以有必要采取酶工程技术改善这些缺点。酶工程技术措施较多,其中酶的固定化技术是重要举措之一。酶的固定化是用人工方法把从生物体内提取出来的酶固定在特定的载体上或使酶与酶相交联,酶被限定在一定区域内,但仍保持原有高效、专一、条件温和的催化功能[2]。 已固定化的酶像化学反应所用的固体催化剂那样, 既能发挥它们的催化特性, 又能回收, 并能多次反复使用, 使整个生产工艺可以连续化、自动化。近年来, 国内外科技工作者在固定化酶在工业生产中的应用做了大量研究，并得到了广泛的发展，本文将对这些成就做具体介绍。 1 固定化酶的概念 1916 年Nelson 和Griffin最先发现了酶的固定化现象后, 科学家就开始了固定化酶的研究工作。1969 年日本一家制药公司第1 次将固定化的酰化氨基酸水解酶用来从混合氨基酸中生产L-氨基酸, 开辟了固定化酶工业化应用的新纪元。酶的固定化是用人工方法把从生物体内提取出来的酶固定在特定的载体上或使酶与酶相交联,酶被限定在一定区域内,但仍保持原有高效、专一、条件温和的催化功能。通常酶是游离的,而经过固定化以后,酶被束缚在一定区域内,因而这样的酶被称为固定化酶[ 3, 4 ]。

糖化酶的固定化

糖化酶的固定化及其在葡萄糖生产中的应用工艺 姓名：吴启华 12生物工程1班学号：1214200027 指导老师：柯德森、姚焱；同组者：严少杰，李海毅；时间:2015/11/30---2015/12/14 摘要：利用有关固定化酶的理论和方法，研究固定化糖化酶的效率与糖化酶的浓度的关系。 本实验中测定固定化糖化酶偶联率、相对活力、活力回收来衡量其生产工艺的优劣，并探讨糖化酶的浓度对固定化效果及结合牢固程度的影响和验证固定化糖化酶催化生产葡萄糖的重复使用能力及其效率。制备固定化糖化酶的方法为离子吸附法，并且使用DNS法测定固定化酶的活力。结果显示：在该次实验中，固定化的效果较好；加入20g离子交换剂固定化酶的活力回收为79.1%，偶联率为90.46%，相对活力为82.58%，加入25g离子交换剂固定化酶的活力回收为85.2%，偶联率为92.76%，相对活力为92.54%。重复使用葡萄糖固定化酶的过程中，固定化酶的利用效率降低。酶与载体的浓度比例较高固定化酶葡萄糖生产效率高。 关键词：固定化，糖化酶，葡萄糖，酶活力 1、前言： 糖化酶也称葡萄糖淀粉酶（glucoamylase, EC.3.2.1.3）(淀粉-α-1，4-葡聚糖葡萄糖水解酶)，它能够催化淀粉液化产物---糊精及低聚糖进一步水解成葡萄糖。糖化酶对底物的作用是由非还原端开始，将α-1，4-键和α-1，6键逐一水解，酶作用时糖苷键在C1-6间断裂，所产生的葡萄糖为 构型，几乎100%转变为葡萄糖。工业生产使用的糖化酶主要来自曲霉、根霉及拟内孢霉，它被广泛应用于酿酒、制糖等行业，是非常重要的酶制剂。 酶的固定化方法通常按照用于结合的化学反应的类型进行分类，大致有三种：非共价结合法（结晶法、分散法、物理吸附法及离子结合法）；化学结合法（包括共价结合法及交联法）；包埋法（包括微囊法及网络法）。 本实验利用离子结合法制备固定化糖化酶。离子结合法就是酶通过离子键结合于具有离子交换基的不溶性载体的固定化方法，常用的载体有：葡聚糖凝胶、离子交换树脂、纤维素等。本实验以离子交换树脂为载体，应用离子交换结合法制备固定化酶，该法操作简便，处理条件温和，酶的高级结构和活性中心的氨基酸残基不易被破坏，酶的活性回收率高，可反复连续生产，对稀酶有浓缩作用，载体可再生使用。其缺点是：载体和酶的结合力弱，容易受缓冲液种类或pH的影响，在高离子强度下进行反应时，酶易从载体上脱落。使用共价结合法不会使酶容易脱落，国外研究者已研究出用氧化锆涂层多孔玻璃或多孔陶瓷，然后硅烷化，最后用重氮基、醛基和异硫氰基衍生物偶联糖化酶，结果使酶活较高，并且能连续生产3个酶半衰期。在此次实验中还使用用DNS法测定固定化酶、残留酶、原酶的活力。 2、材料与方法： 2.1材料：（1）糖化酶液，GF-201大孔强碱阴离子交换剂，葡萄糖，可溶性淀粉(20g/L)，CuSO4.5H2O，次甲基兰，酒石酸钾钠，氢氧化钠，亚铁氰化钾，乙酸，乙酸钠(配制pH4.6