质粒的转化(热激法)

实验四质粒的转化

质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。可以采用多种方法筛选和鉴定目的克隆。

实验目的：掌握热激法或电转化法转化大肠杆菌感受态细胞及转化子的鉴定方法。

实验材料：外源片段与载体的连接产物；大肠杆菌感受态细胞。

实验原理：（1）热激法：大肠杆菌在0℃ CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子。

（2）电转化法：外加于细胞膜上的电场造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，不仅有利于离子和水进入细菌细胞，也有利于孔DNA等大分子进入。同时DNA在电场中形成的极性对于它运输进细胞也是非常重要的。

热激法转化实验步骤：

1．制备选择性培养基平板：在融化的250ml LB固体培养基中（冷却止55摄氏度以下）加入Amp至终浓度50μg/ml，混匀后倒入灭菌培养皿中；

2．取出1管制备好的感受态细胞，放在冰上融化；

3．每100μl感受态细胞加入约20ng质粒DNA，轻轻混匀，在冰上放置30分钟；

4．热击：将离心管放置42℃水浴，热击90秒，注意：勿摇动离心管；

5．冰镇：快速将离心管转移至冰浴，放置1－2分钟；

6．复苏：每管加400 μl LB培养基，在37℃摇床温和摇动温育45分钟，使细菌复苏；

7．布皿：取适当体积均匀涂布于含有、抗生素（Amp）的LB平板；

8．培养：倒置培养皿，于37℃培养12－16小时即可观察到白色的菌落，即为转化子。

一种用质粒DNA转化大肠杆菌感受态细胞的实用操作技巧

生物技术通报 BIOTECHNOLOGY BULLETIN ·研究报告· 2009年增刊 收稿日期:2009-04-29 基金项目:西安市科技局科技攻关项目(GG06078) 作者简介:陈洪栋(1986-),女,硕士研究生,研究方向:西北大学生命科学学院细胞生物学方向;E-mail:huijie1022110@https://www.wendangku.net/doc/e04417450.html, 通讯作者:李红民,E-mail :lihm2006@https://www.wendangku.net/doc/e04417450.html, 引言 质粒DNA 成功转化大肠杆菌(Escherichia coli, E.coli )由Cohen 等首次报道[1].此后,多位研究者对 影响质粒转化E.coli 的条件如温度、离子强度和种类、质粒分子质量大小等进行了优化和改进[2] ,最 终形成一致认可的转化程序:. 细胞与DNA 在 氯化钙存在下于0~4℃作用一定时间后于42℃短暂热激2~3min,冰浴2~3min ,随后在不含抗生素 的液体培养基中于37℃恢复培养30~60min 后涂 布选择性平板[3]。该方法被称为是E.coli 细胞的标准转化方法,在世界范围内的分子生物学实验室中 广泛应用并不断被完善,最高转化效率可达107~ 109克隆/μg 质粒DNA [4]。然而,利用该方法完成质粒DNA 对大肠杆菌的转化,至少需要约2.5h ,对于一般的质粒转化实验而言,比较费时费力。文章作者尝试对这一标准转化程序进行简化,获得一种用质粒DNA 转化大肠杆菌感受态细胞的 实用操作技巧 陈洪栋董文博李红民 （西部资源生物与现代生物技术教育部重点实验室植物生物技术研究室西北大学生命科学学院，西安710069） 摘要:目的是建立一种简化、实用的用质粒DNA 转化大肠杆菌的操作方法。采用氯化钙法制备大肠杆菌感受态细胞。 以质粒pUC18,pCSN44,pAN52-1Not,pETts,pANth 和植物双元表达载体pCAMBIA1301分别转化用于质粒扩增与保存的常用大肠杆菌菌株Top10和DH5α以及用于原核表达的常用大肠杆菌菌株BL21(DE3)和TB1。质粒与感受态细胞的混合液置冰上作用一定时间后，直接涂布含有筛选抗生素的LB 平板，于37℃培养12~16h 。结果表明，用不同大小的质粒DNA 转化不同的大肠杆菌菌株，都可以获得满足实验要求，转化效率可高达103~4阳性克隆/μg 。该方法较标准的转化流程更加简便、省时、实用。 关键词：Escherichia coli 转化方法质粒 Doohickey for the Standard Transformation Protocol of Plasmids DNA Transfer into Competent Chen Hongdong Dong Wenbo Li Hongmin (Plant Biotechnology Research Unit,Key Laboratory of Resource Biology Biotechnology in Western China,Ministry of Education School of Life Science Northwest University,Xi ’an 710069) Abstract: The aim of this study was to introduce a doohickey for the transformation of competent cells with plasmid DNA. The competent cells of Escherichia coli strains were previously made using the calcium chloride method.The plasmids,pUC18,pCSN44,pAN52-1Not,pETts,pANth and pCAMBIA1301,were employed to transform the different E.coli strains Top10,DH5α,BL21(DE3)and TB1.The mixture of plasmid and competent cell was laid on ice for definite time before being cultured at 37℃degree on selected LB plate with relevant antibiotic for 12~16h.Perfect transformation rate up to 103~4colonies/μg plasmid DNA was obtained. Key words:Escherichia coli Transformation method Plasmid

农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法

农杆菌侵染拟南芥花序的转化方法 制备转化用的农杆菌菌液 准备： 1．灭菌试管 400毫升细长烧杯2瓶，离心瓶4-6个（250ml）。 2．试剂：YEP 1200ml（每瓶300ml 共4瓶）+Kan 1;1000，Rif1:500。 1/2MS+2%蔗糖（灭菌115度20分钟），Silwet在-20℃贮存。 3．步骤： 共转化农杆菌：于中午12点接菌于有YEP培养液的试管中10ul：10ml接种。28℃，3000rpm摇过夜，约30小时，次日下午6点将已摇活的菌按（1：400）及750ul菌液转至汉300毫升YEP+K50+Rif中培养28℃，300rpm约14小时，次日上午8点测OD值，用YEP+Rif作为空白对照，当菌液达到OD600为1.5~3.0之内时，可收集菌体于250ml离心瓶（灭菌）,4℃，4000g 离心10min 。用10%蔗糖（含0.02%silwet）稀释至OD600 约为0.8-- 1.0左右即，用10%蔗糖作对照。转化时将花在溶液中浸泡50s左右，于弱光下生长。 4．浇水：转化前一天将需要做转化的野生型拟南芥苗子浇水浇透。 （注意：选取上述配好的溶液2ml，充分打碎管底部的菌体，在将混匀的菌体溶入600ml溶液中，混匀后再加入Silwet(100%)120ul终浓度为0.02%）。 2．先将浇透水用于转化的苗子的夹全部剪掉，再用宽胶带把花盆的土封好。3．转化的准备工作：2个400细长烧杯，宽胶带，记号笔，表等。 4．转化过程略，视苗的长势弱 0.8 Pa 3`，长势好的0.8 Pa 5`。 5．标记好，将转化好的苗平放于盒子内，上盖封口膜封好，避光培养24hrs 2天后，将植株立起正常培养，浇水，3天1次。 花序浸泡(flower-dipping)法转化拟南芥

转染步骤及经验(精华)

转染步骤及经验（精华） 一、基础理论 转染是将外源性基因导入细胞内的一种专门技术。分类：物理介导方法：电穿孔法、显微注射和基因枪；化学介导方法：如经典的磷酸钙共沉淀法、脂质体转染方法、和多种阳离子物质介导的技术；生物介导方法：有较为原始的原生质体转染，和现在比较多见的各种病毒介导的转染技术。理想细胞转染方法，应该具有转染效率高、细胞毒性小等优点。病毒介导的转染技术，是目前转染效率最高的方法，同时具有细胞毒性很低的优势。但是，病毒转染方法的准备程序复杂，常常对细胞类型有很强的选择性，在一般实验室中很难普及。其它物理和化学介导的转染方法，则各有其特点。需要指出的一点，无论采用哪种转染技术，要获得最优的转染结果，可能都需要对转染条件进行优化。影响转染效率的因素很多，从细胞类型、细胞培养条件和细胞生长状态到转染方法的操作细节（见后文）。 二、转染操作流程（以常用的6孔板为例） (1) 细胞培养： 取6孔培养板，以3x104/cm2密度铺板，37℃5%CO2培养箱中培养至70%～90%汇合。(不同细胞略有不同，根据实验室优化的条件进行，汇合过分，转染后不利筛选细胞)。 (2) 转染液制备： 在EP管中制备以下两液(为转染每一个孔细胞所用的量) A液：用不含血清培养基稀释1-10μg DNA，终量100μL， B液：用不含血清培养基稀释对应量的转染试剂，终量100μL； 轻轻混合A、B液（1:1混匀），室温中置15分钟，稍后会出现微浊现象，但并不妨碍转染。 (3) 转染准备：用2mL不含血清培养液漂洗两次，再加入2mL不含血清及PS的培养液。 (4) 转染：把A/B复合物缓缓加入培养液中（缓慢滴加），轻轻摇匀，37℃温箱置6～8小时，吸除无血清转染液，换入正常培养液继续培养。 三、转染注意事项 1. 血清 A. DNA-阳离子脂质体复合物形成时不能含血清，因为血清会影响复合物的形成。 B．一般细胞对无血清培养可以耐受几个小时没问题，转染用的培养液可以含血清也可以不加，但血清一度曾被认为会降低转染效率，转染培养基中加入血清需要对条件进行优化。 C. 对于对血清缺乏比较敏感的细胞，可以使用一种营养丰富的无血清培养基OPTI-MEMⅠ培养基， 或者在转染培养基中使用血清。对血清缺乏比较敏感的贴壁细胞，建议使用LIPOFECTAMINE 2000。无血清培养基OPTI-MEM(GIBICO)很好用，有条件的话，就用它代替PBS洗细胞两遍，注意洗的时候要轻，靠边缘缓缓加入液体，然后不要吹吸细胞，而是转动培养板让液体滚动在细胞表面。如果洗的太厉害，细胞又损失一部分，加了脂质体后，细胞受影响就更大了，死亡细胞会增多。 2.抗生素（PS） 抗生素，比如青霉素和链霉素，是影响转染的培养基添加物。这些抗生素一般对于真核细胞无毒，但阳离子脂质体试剂增加了细胞的通透性，使抗生素可以进入细胞。这降低了细胞的活性，导致转染效率低。所以，在转染培养基中不能使用抗生素，甚至在准备转染前进行细胞铺板时也要避免使用抗生素。这样，在转染前也不必润洗细胞。对于稳定转染，不要在选择性培养基中使用青霉素和链霉素，因为这些抗生素是GENETICIN选择性抗生素的竞争性抑制剂。另外，为了保证无血

水热法合成二氧化钛及研究进展

水热法合成二氧化钛及研究进展 摘要：水热法合成了不同晶型、形貌、大小和研定形貌的二氧化钛。究了pH值、水热反应温度和水热反应时间对纳米二氧化钛晶型、形貌和晶粒尺寸的影响，对TiO2晶形影响光催化活性的原因进行了探讨。同时从二氧化钛水解制氢、废水处理、空气净化、抗菌、除臭方面介绍了纳米二氧化钛在环境治理方面的应用和发展趋势，并对纳米二氧化钛的制备方法与应用作出展望。 关键词：二氧化钛；晶型；水热法；光催化；制备；应用 纳米二氧化钛(TiO2)具有比表面积大、磁性强、光吸收性好、表面活性大、热导性好、分散性好等性能。纳米TiO2是一种重要的无机功能材料, 可应用于随角异色涂料、屏蔽紫外线、光电转换、光催化等领域，在光催化领域环境治理方面具有举足轻重的地位，可应用在环保中的各个领域，它在环境污染治理中将日益受到人们的重视，具有广阔的应用前景，因此制备高光催化性能的纳米TiO2，拓展纳米二氧化钛的应用也是学者研究的重点。水热法合成纳米TiO2粉体具有晶粒发育完整、粒径分布均匀、不需作高温煅烧处理、颗粒团聚程度较轻的特点。 1.TiO2的制备方法、材料的性能 1.1不同晶型纳米二氧化钛的水热合成 1.1.1实验方法 边搅拌边将2mol·L- 1的四氯化钛水溶液缓慢滴加到115mol·L- 1的氢氧化钠水溶液中，保持30℃反应，生成纳米TiO2前驱体，反应终点的pH值分别控制为110、310、510、810、1110、1210。把纳米TiO2前驱体装入内衬聚四氟乙烯的不锈钢反应釜中进行水热反应，120℃～200℃反应1h～48h，反应结束后，冷却至室温，产物经过滤和蒸馏水洗至滤液中无Cl-，在100℃下鼓风干燥10h，粉碎后得到不同结构的纳米TiO2 粉体。选择不同的特征峰(金红石型选110面、锐钛矿型选101面，板钛矿型选121面)，根据特征衍射峰的半高宽，利用Scherrer 公式展宽法估算出其晶粒尺寸。 1.1.2研究与开发 1.1. 2.1pH值对纳米TiO2晶型和形貌的影响 在水热反应温度为200 ℃和水热反应时间24 h的条件下。当pH = 1.0时，产

氯化钙法质粒转化

氯化钙法进行质粒转化 利用冰冷的CaCl2 制备competent cells,以传统方法进行质体的转形。 仪器用具：37℃培养箱；42℃水浴；冰浴 药品试剂： 0.1 M CaCl2置冰浴中 2 M glucose： 取18 g glucose溶于水中，并调体积至50 mL，无菌过滤，分装后置-20℃贮存。 2 M Mg2+： 取20.3 g MgCl2·6H2O及24.65 g MgSO4·7H2O溶于水中，并调体积至100mL，无菌过滤的，分装小瓶置-20℃贮存。亦可以MgCl2完全取代MgSO4. SOB 液体培养基： 32 Methods in Biotechnology Vol 1 2% Bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl,高压灭菌，使用前加入2 M Mg2+，使最终浓度为10 mM. SOB 固体培养基：

2% Bacto tryptone, 0.5% yeast extract, 10 mM NaCl, 2.5 mM KCl, 1. 5% Bactoagar,高压灭菌，倒plate前加入2 M Mg2+ 使最终浓度为10 mM. SOC/Amp 固体培养基： SOB 中另外添加20 mM glucose 及100 μg/mL ampicillin. SOC 液体培养基：SOB 中加入20 mM glucose （使用前加入）。 大肠杆菌菌株：JM109 #1~#5 接合反应液 方法步骤： 1）进行转形实验前16~20 h,自-70℃取出贮存的菌种，以划单一菌落方式将菌株JM109 接种在SOB固体培养基上，在37℃培养。 2）取40 mL SOB培养基装入125 mL已灭过菌的三角瓶（请记得加入Mg 2+）。另取1 mL SOB加于微量离心管中。由SOB固体培养基上选4~6 个约2~3 mm大小的单一菌落接入1 mL SOB中，震荡将菌体打散后，加入40 mL S OB中，于37℃震荡培养约2~3 h,直至细胞数约为4~7×107/mL. 可于接菌2 h后每隔20~30 min测A600估计 3）收集菌液于离心管中，置冰浴中10~15 min. 4）以750~1,000 g 离心12~15 min （4℃）。

水热法制备纳米氧化锌及其光催化性质的研究

水热法制备纳米氧化锌及其光催化性质的研究 纳米氧化锌因其很小的微粒尺寸，其比表面积较一般氧化锌粒子要大很多，具有其块状物料没有的表面与界面效应，小尺寸效应，量子尺寸效应，宏观量子隧道效应等。使其在很多领域都有非常重要的应用价值。本文通过水热法加入不同配比和不同类别的表面活性剂和掺杂钠钾离子，和对反应体系的某些条件来控制合成纳米氧化锌的微观形貌，并且对改变条件和表面活性剂的不同的纳米氧化锌对次甲基蓝的水溶液的光催化活性进行了初步的研究和探讨。在实验中我们发现，添加不同表面活性剂、掺杂有不同金属离子的纳米氧化锌的光催化的活性不同。 本文主要内容如下：首先简单介绍了纳米材料及纳米氧化锌的性能，制备，应用和表征的手段，并且对表面活性剂的类别和应用做了概述。 二、以尿素、乙酸锌、草酸钠和草酸钾为原料，用水热法通过改变不同的焙烧温度制备纳米氧化锌。所得的样品使用X射线粉末衍射仪（XRD）、傅里叶红外光谱仪（FT-IR）、扫描电子显微镜（SEM）、高分辨率透射电镜（HRTEM）、透射电子显微镜（TEM）对其进行了表征，得出结果，掺杂不同主族金属钠、钾离子的纳米氧化锌其形貌和粒径分布大不相同。其中，焙烧温度为600℃制备的掺杂有金属钠、钾离子的纳米氧化锌具有较小的粒径和分散性。 三、以尿素和乙酸锌为原料，通过水热法成功制备了只添加单一表面活性剂SDS(十二烷基硫酸钠)，非离子表面活性剂：PEG6000（聚乙二醇6000）表面改性的纳米氧化锌和通过添加比例不同的两种表面活性剂表面改性的纳米氧化锌。发现使用不同比例以及不同种类的表面活性剂合成的纳米氧化锌具有不同的形貌和粒径，并用XRD、FT-IR、SEM、TEM、HRTEM对产品进行了表征。根据其表征结果发现，应用不同种类和不同配比的表面活性剂合成的纳米氧化锌对产品的尺寸和形貌有较大的影响。 四、自制的上述纳米氧化锌对水溶性有机染料次甲基蓝作为模拟污染物的水溶液进行了光的催化降解实验，并根据实验结果探讨了制备的纳米氧化锌的结构和形貌对其光催化活性的影响。其中，掺杂有钠或钾金属离子的纳米氧化锌600℃焙烧的样品比在400℃和800℃焙烧的样品的光催化活性更好。通过加入不同种类和配比的表面活性剂制备的纳米氧化锌的所有产品中，加入PEG6000和SDS(十二烷基硫酸钠)比例为1:3的光催化性能最好。通过实验数据发现光催化活性是与产品的形貌，粒子的尺寸大小等多种因素有关。

20170803 热激法转化质粒

20170803 热激法转化质粒 武汉大学Angelo 实验原理： 质粒的转化是指将质粒或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。将连接产物转化到感受态细胞中，实现重组克隆的增殖，便于后续分子操作。热激法：大肠杆菌在0℃、CaCl2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形，与转化混合物中的DNA形成抗DNase的羟基－钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热冲击处理，促进细胞吸收DNA复合物，在丰富培养基上生长数小时后，球状细胞复原并分裂增殖。在被转化的细胞中，重组子基因得到表达，在选择性培养基平板上可挑选所需的转化子 实验步骤： （1）从-80 ℃冰箱内取一管冻存的感受态大肠杆菌DH-5α于冰浴上融化复苏10min； （2）加入待转化的质粒0.5μL-1.5μL，轻轻吹打混匀，冰浴30 min； （3）在42 ℃恒温水浴锅中严格操作热激90 s，然后立即冰浴静置2 min； （4）在无菌操作台内，向感受态大肠杆菌中加入600 μL-1000μLLB液体培养基，在200 r/min 、37 ℃恒温摇床内摇30min-1 h 进行活化；

（5）在活化的时候，从4℃拿出含抗生素的固体细菌培养板放到37℃恒温培养箱中回温十分钟。 （6）活化结束后，在无菌操作台内，吸取菌液20μL-40μL涂板到含抗生素（50 mg/ml）的固体细菌培养板上； （7）置于37 ℃恒温培养箱内过夜培养（12h-16h）。 要点： 1，固体培养板的抗生素抗性（Amp，Kana） 2，转化质粒的量根据质粒浓度进行添加 3，涂板菌液的量根据活化加培养基的量进行选择 4，注意每项工作前都要进行充分准备，比如涂板棒进行灭菌，移液枪进行消毒等。 5，对刚连接的质粒进行转化，不同之处在于活化时间为1-2h。 活化后，将菌液2500 -3500rpm离心3 min，留下沉淀和200 μL菌液，充分混匀，涂板到含抗生素的固体培养基上。

水稻农杆菌转化方法

方法1 NB基本培养基(右边的为N6,大量相同,加glycine甘氨酸2 mg/L) KNO3 2830 mg/L (NH4)2SO4 463 mg/L KH2PO4 400 mg/L MgSO4.7H2O 185 mg/L CaCl2.2H2O166 mg/L FeSO4.7H2O 27.8mg/L 5.6 Na2EDTA 37. 5 mg/L 7.5 MnSO4.4H2O 10 mg/L 27.8 H3BO3 3 mg/L 1.6 ZnSO4.7H2O 2 mg/L 1.5 Na2MoO4.2H2O 0.25 mg/L 0.25 CuSO4.5H2O 0.025 mg/L 0.025 CoCl2.6H2O 0.025 mg/L 0.025 KI 0.75 mg/L 0.8 盐酸硫胺素thiamine CHL VB1 10 mg/L 0.1 盐酸吡哆醇pyridoxine-CHL VB6 1 mg/L 0.5 烟酸nicotinic acid 1 mg/L 0.5 肌醇myo-inositol 100 mg/L 100 水解酪蛋白300 mg/L 谷氨酰胺500 mg/L 脯氨酸500 mg/L 蔗糖30,000 mg/L PHytagel 2.6 mg/L pH 5.8 Basic培养基 B N6（大量）50ml （20倍） A Ms-Fe盐10-20ml（100倍）CH 0.3g/L S B5 macro 10ml （100倍）phytogel 4g/L或agar 8g/L I B5 vita 10ml （100倍）sucrose 30g/L C proline 0.5g/L glutamine 0.5g/L N6 (大量梗稻种子) 终浓度母液(20倍) 终浓度母液(20倍)培KNO32830mg/L56.6g/L Mg SO4.7H2O185 mg/L 3.7 g/L 养(NH4)2SO4463 mg/L9.26 g/L CaCl2.2H2O 166 mg/L 3.32 g/L 基KH2PO4400 mg/L8.00 g/L 制备1 KNO3, (NH4)2SO4, KH2PO4同时倒入烧杯,加水搅拌, 使之完全溶解.

农杆菌转化法原理

农杆菌转化法原理 This manuscript was revised on November 28, 2020

农杆菌转化法原理： 农杆菌是普遍存在于土壤中的一种革兰氏阴性细菌，它能在自然条件下趋化性地感染大多数双子叶植物的受伤部位(受伤处的细胞会分泌大量酚类化合物,从而使农杆菌移向这些细胞)，并诱导产生冠瘿瘤或发状根。 根癌农杆菌和发根农杆菌中细胞中分别含有Ti质粒和Ri质粒，其上有一段T-DNA，农杆菌通过侵染植物伤口进入细胞后，可将T-DNA插入到植物基因组中,并且可以通过减速分裂稳定的遗传给后代，这一特性成为农杆菌介导法植物转基因的理论基础。 人们将目的基因插入到经过改造的T-DNA区，借助农杆菌的感染实现外源基因向植物细胞的转移与整合，然后通过细胞和组织培养技术，再生出转基因植株。农杆菌介导法起初只被用于双子叶植物中，近年来，农杆菌介导转化在一些单子叶植物（尤其是水稻）中也得到了广泛应用。 农杆菌转化植物细胞涉及一系列复杂的反应，主要包括：①受伤的植物细胞为修复创伤部位，释放一些糖类、酚类等信号分子。②在信号分子的诱导下，农杆菌向受伤组织集中，并吸附在细胞表面。③转移DNA上的毒粒基因被激活并表达，同时形成转移DNA的中间体。④转移DNA进入植物细胞，并整合到植物细胞基因组中。 方法：（根据不同受体环境基因要求而不同） 1．农杆菌准备 2．外植体的准备（愈伤组织、悬浮细胞系、幼嫩茎段或叶片）; 3．用 MS-AS液体培养基稀释原菌液15倍（1.5ml / 20ml）或离心后稀释3倍; 4．外植体与菌液共培养20 分钟; 5．放置在带滤纸的培养皿上（注意充分吸干多余的菌液）; 6．将外植体接种到MS-AS固体诱导培养基，培养2－3天 ; 7．移至含卡那霉素（Kan）300mg/L和羧苄青霉素（Cb 300mg/L）的固体筛选培养基上进行Kan抗性愈伤组织的筛选; 8．隔20天，进行第二次筛选； 9．抗性愈伤组织在固体筛选培养基上分化成苗； 10 在生根培养基上生根，获得完整的再分化植株。

质粒DNA的转化实验原理、仪器试剂和操作步骤

质粒DNA的转化实验原理、仪器试剂和操作步骤 【原理】 转化是将外源DNA 分子导入到受体细胞，使之获得新的遗传特性的一种方法。转化所用的受体细胞一般是限制- 修饰系统缺陷变异株，即不含限制性内切酶和甲基化酶（R- ，M- ）。将对数生长期的细菌（受体细胞）经理化方法处理后，细胞膜、的通透性发生暂时性改变，成为能允许外源DNA 分子进入的感受态细胞。进入受体细胞的DNA 分子通过复制和表达实现信息的转移，使受体细胞具有了新的遗传性状。将经过转化的细胞在筛选培养基上培养，即可筛选出转化子（带有异源DNA 分子的细胞）。 本实验采用CaCl2 法制备感受态细胞。其原理是细胞处于0 ～4 ℃，CaCl2 低渗溶液中，大肠杆菌细胞膨胀成球状。转化混合物中的DNA 形成抗DNA 酶的羟基- 钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42 ℃90 秒热激处理，促进细胞吸收DNA 得合物。将细菌放置在非选择性培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型，如氨苄青霉素耐药（Amp r ）得到表达，然后将此细菌培养物涂在含Amp 的选择性培养基上，倒置培养过夜，即可获得细菌菌落。 本实验是将人Bcl-2 重组质粒转化DH5 α扩增菌，转化后在含Amp 的培养基上进行筛选，生长的菌落即为含重组质粒的工程菌。 含人Bcl-2 重组质粒的DH5 α菌用于质粒DNA 的扩增，获得的质粒将作为限制性内切酶的酶切底物DNA 。 【试剂与器材】 1 ．LB 液体培养基10g 胰蛋白胨、5g 酵母提取物、10gNaCl 加水至1L ，高压灭菌消毒。 2 ．LB 固体培养基LB 液体培养基中加1.5% 琼脂粉，高压灭菌消毒，待泠却至不烫手背时铺培养皿。 3 ．0.1mol/L CaCl2 高压灭菌消毒或过滤除菌。 4 ．氨苄青霉素用无菌水或生理盐水配制成100mg/ml 溶液，置-20 ℃保存。 5 ．人Bcl-2 重组质粒它是Eco R Ⅰ单酶切的pBluescript ⅡKS(-) 载体与EcoR Ⅰ单酶切的人Bcl-2 cDNA 重组而成的，大小为4 861bp ，前者是一种由pUC19 质粒衍生而来的具有 2 961bp 的质粒载体。因此用Eco R Ⅰ酶切则应到空载pBluescript ⅡKS(-) 载体(2.96kb) 和人Bcl-2 cDNA 片段(1.9kb) 。配制成2g/1 μl 。 6 ．大肠杆菌DH5 α此为DNA 扩增菌 7 ．恒温水浴箱

实验七 感受态细胞的制备和重组质粒的转化

实验七感受态细胞的制备和重组质粒的转化 【实验目的】 1.掌握用CaCl2法制备感受态细胞的原理和方法。 2.学习和掌握质粒DNA的转化和重组质粒的筛选方法。 【实验原理】 质粒在不同的细菌之间转移是微生物世界中一种普遍的现象，一个细菌品系通过吸收另一个细菌品系的质粒DNA而发生了遗传性状的改变，这种现象叫做转化，获得了外源DNA的细胞称为转化子。 在基因克隆技术中，所谓转化是指质粒或重组质粒被导入受体细胞，表达相应的选择标记基因，并在一定的培养条件下，在选择性培养基上长出转化子的过程。质粒必须通过转化进入细菌细胞内，才能进行扩增和表达，从而获得大量的克隆基因,使我们能够进行进一步的DNA操作，如亚克隆等；或者获得其表达产物。转化效率的高低与受体菌的生理状态有关。细菌吸收外源DNA的能力最高时的状态被称为感受态细胞（competent cell）。有些种类的细菌在其生长的任一阶段都处于感受态，而另一些细菌只有处于某个生长时期时（一般为对数生长早、中期），才会处于感受态,如本实验所用的大肠杆菌。用一定浓度的CaCl2 处理对数生长早中期的细菌可以大大提高细菌吸收周围环境中的DNA分子的能力。对这种现象的一种解释是CaCl2能使细菌细胞壁的通透性增强，从而提高转化率。这种转化方法称为“化学法”。目前还可以使用电激的方法，通过瞬间的高压电流，在细胞上形成孔洞，使外源DNA进入胞内，从而实现细胞的转化。电激转化的效率往往比化学法高出1到2个数量级，达到1 x 108转化子/μg DNA，甚至1 x 109转化子/μg DNA，所以常用于文库构建时的转化或遗传筛选。 微生物转化是基因工程的常用技术，大肠杆菌是基因工程中最常用的受体菌，本实验即是用前面实验获得的重组质粒转化大肠杆菌细胞。 【试剂与器材】 〈一〉试剂 1．LB液体培养基: 参见附录 每组配200mL, 其中100mL分装于500mL三角瓶中，另各取3mL装于2只大试管中，其余装于装于500mL三角瓶中，121℃高压蒸汽灭菌20分钟。 2．LB/Amp/IPTG/X-Gal平板（1）: 配1L LB液体培养基，加入20g琼脂粉和1支搅拌棒，同上高压灭菌，趁热取出置搅拌器上冷却，待冷至55℃左右, 加氨苄青霉素(Ampicillin)至终浓度100μg/ml (Amp储存液一般为100mg/mL), 倒平板，每皿倒约15 mL，室温放置过夜至冷凝水挥发干净。使用前半小时在培养基表面加20μL 50mg/mL X-gal 和100μL 0.1mol/L IPTG，涂匀，待这两种化合物渗入琼脂后，即可用于转化菌的涂布。 每组制备LB平板2个，LB/Amp 平板5个，LB/Amp/IPTG/X-Gal平板6个。 3．IPTG储存液(0.1mol/L)：1.2g IPTG加水至50ml，过滤除菌，4℃储存。 4．X-gal储存液：50mg/ml溶于二甲基甲酰胺溶剂中，过滤除菌，4℃储存。 5．1 mol/L CaCl2储存液，使用浓度为0.1mol/L，CaCl2应使用分析纯，配100mL，高压灭菌，全班用。6．甘油(灭菌)，全班50mL，同上高压灭菌。 7．酸洗无菌玻璃珠，涂布平板用，用50mL三角瓶分装，同上高压灭菌，烘干备用。 〈二〉器材 1. 37℃温箱、水浴锅、恒温振荡器等 2. 高速冷冻离心机 3. 微量移液器等

农杆菌介导转化和再生的杨树

农杆菌介导法转基因杨树 摘要： 杨树品种已发展为一种植物转化和再生系统。叶植，从稳定发芽培养的一个杨树杂交NC - 5339（银白杨标本），被共培养用于农杆菌遗传转化关于一个烟草的看护培养。致瘤的和无防备的农杆菌株隐藏包含一个双元载体，其中包含两个新霉素磷酸转移酶II(NPT II')和细菌5莽草酸3-磷酸合酶（EPSP）（AROA）嵌合基因融合。没有开发芽，叶外植体时，双元缴械拉力的根癌农杆菌菌株共培养。然而，转化的植物，没有野生型的T-DNA获得使用农杆菌株原癌基因的二进制。NPT II '酶的活性检测，Southern印迹法分析和免疫学检测证实了遗传转化成功细菌EPSP合酶Western印迹。这是首次报道成功收回转化植株森林树，也是第一个记录的插入和重要农艺性状的外源基因的表达成木本植物物种。 关键词：白杨；转化；农杆菌 前言 基因工程树种的能力将是特别有用的遗传改良，如大型成熟的植物并长期有性世代倍(Nelson and Haissig 1984; Sederoff and Ledig 1985)。森林树种的应用重组DNA技术的一个先决条件是发展的基因转移系统。方法，例如显微注射(Crossway et al.1986)和直接DNA摄入(Paszkowski et al. 1985; Fromm et al. 1986) 已被用于外源基因引入到草本作物物种，但是，最有效的基因转移的方法，利用自然感染冠瘿病的机制造成的有机体，农杆菌(Bevan et al. 1983 ; Fraley et al. 1983 ; Herrera-Estralla, 1983). 。根癌农杆菌的自然感染周期期间，细菌的T-DNA 整合到宿主植物的染色体，从而导致肿瘤对植物的生产（奇尔顿等人，1980）。可以删除和替换而不影响根癌农杆菌的T-DNA转移到植物（DeGreve等，1982）的能力，由异源基因的肿瘤诱导基因。这些修改后的根癌农杆菌菌株的原生质体，悬浮细胞，外植体组织的共培养，可导致转化植物缺乏致癌基因性状的隔离。因此，我们着手开发一个混合型杨树无性系，银白杨x grandidentata的（NC - 5339 ）作为载体的农杆菌转化体系。 有许多特征能使杨树NC-5339得到理想的转化研究首先，杨树是一个重要的全球森林树种。这是一个快速增长的落叶阔叶树，栽培主要用于纸浆生产。对

多种质粒提取方法

从细菌中分离质粒 DNA 的具体操作 材料、设备及试剂 一、材料 含PBS的E.coliDH5α或JM系列菌株，1.5ml塑料离心管（又称eppendorf管），离心管架。 二、设备 微量取液器（20μl，200μl，1000μl），台式高速离心机，恒温振荡摇床，高压蒸汽消毒器（灭菌锅），涡旋振荡器，电泳仪，琼脂糖平板电泳装置和恒温水浴锅等。 三、试剂 1、LB液体培养基（Luria-Bertani）：称取蛋白胨（Tryptone）10g，酵母提取物（Yeastextract）5g，NaCl10g，溶于800ml去离子水中，用NaOH 调pH至7.5，加去离子水至总体积1升，高压下蒸气灭菌20分钟。 2、LB固体培养基：液体培养基中每升加12g琼脂粉，高压灭菌。 3、氨苄青霉素（Ampicillin，Amp）母液：配成50mg/ml水溶液，-20℃保存备用。 4、溶菌酶溶液：用10mmol/LTris?Cl（pH8.0）溶液配制成10mg/ml，并分装成小份（如1.5ml）保存于-20℃，每一小份一经使用后便予丢弃。 5、3mol/lNaAc（pH5.2）：50ml水中溶解40.81gNaAc?3H2O，用冰醋酸调pH至5.2，加水定容至100ml，分装后高压灭菌，储存于4℃冰箱。 6、溶液1:50mmol/L葡萄糖，25mmol/ L T r i s. Cl（pH8.0）， 10mmol/LEDTA（pH8.0）。溶液Ⅰ可成批配制，每瓶100ml，高压灭菌15分钟，储存于4℃冰箱。 7、溶液Ⅱ：0.2mol/LNaOH（临用前用10mol/LNaOH母液稀释），1％SDS。 8、溶液Ⅲ：5mol/LKAc60ml，冰醋酸11.5ml，H2O28.5ml，定容至100ml，并高压灭菌。溶液终浓度为：K+3mol/L，A cˉ5mol/L。 9、RNA酶A母液：将RNA酶A溶于10mmol/LTris?Cl（pH7.5）， 15mmol/LNaCl中，配成10mg/ml 的溶液，于100℃加热15分钟，使混有的DNA酶失活。冷却后用 1.5mleppendorf管分装成小份保存于-20℃。 10、饱和酚：市售酚中含有醌等氧化物，这些产物可引起磷酸二酯键的断裂及导致RNA和DNA的交联，应在160℃用冷凝管进行重蒸。重蒸酚加入0.1％的8-羟基喹啉（作为抗氧化剂），并用等体积的0.5mol/LTris?Cl （pH8.0）和0.1mol/LTris?Cl（pH8.0）缓冲液反复抽提使之饱和并使其pH值达到7.6以上，因为酸性条件下DNA会分配于有机相。

水热法

什么叫做超临界水？ 超临界流体 任何物质，随着温度、压力的变化，都会相应地呈现为固态、液态和气态这三种物相状态，即所谓的物质三态。三态之间互相转化的温度和压力值叫做三相点。除了三相点外，每种分子量不太大的稳定的物质都具有一个固定的临界点（Critical point）。严密意义上，临界点由临界温度、临界压力、临界密度构成。当把处于汽液平衡的物质升温升压时，热膨胀引起液体密度减少，而压力的升高又使汽相两相的相界面消失，成为一均相体系，这一点即为临界点。当物质的温度、压力分别高于临界温度和临界压力时就处于超临界状态。在超临界状态下，流体的物理性质处于气体和液体之间，既具有与气体相当的扩散系数和较低的粘度，又具有与液体相近的密度和对物质良好的溶解能力。因此可以说，超临界流体是存在于气、液这两种流体状态以外的第三流体。 近几年，超临界流体技术引起了人们的广泛关注，主要是因为它具有许多诱人的特性。例如，超临界流体分子的扩散系数比一般液体高10～100倍，有利于传质和热交换。超临界流体的另一重要特点是可压缩性，温度或压力较小的变化可引起超临界流体的密度发生较大的变化。大量的研究表明，超临界流体的密度是决定其溶解能力的关键因素，改变超临界流体的密度可以改变超临界流体的溶解能力。 在超临界流体技术应用研究方面，首先要求选择适当的化学物质作为超临界流体。它必须具备以下几个条件：①化学性质稳定，对装置没有腐蚀性；②临界温度接近于室温或者接近于反应操作温度，太低和太高都不合适；③操作温度要低于被萃取物质的分解、变性温度；④临界压力要低，以便减少动力费，使成本尽可能降低；⑤要有较高的选择性，以便能够制得高纯度产品；⑥要有较高的溶解度，以便减少溶解循环量；⑦价格便宜，来源方便。 在环境保护中，常用的超临界流体有水、二氧化碳、氨、乙烯、丙烷、丙烯等，由于水的化学性质稳定，且无毒、无臭、无色、无腐蚀性，因此得到了最为广泛的应用。 （2）超临界水及其特征 在通常条件下，水始终以蒸汽、液态水和冰这三种常见的状态之一存在，且是极性溶剂，可以溶解包括盐类在内的大多数电解质，对气体和大多数有机物则微溶或不溶，水的密度几乎不随压力而改变。但是如果将水的温度和压力升高到临界点（Tc＝374.3℃，pc＝22.05Mpa）以上，则就会处于一种既不同于气态也不同于液态和固态的新的流体态--超临界态，该状态的水即称之为超临界水。水的存在状态如图11-4所示。在超临界条件下，水的性质发生了极大的变化，其

(完整word版)农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素

二、农杆菌介导植物转化的机制及影响转化效率的因素 转化机制： 与植物基因转化有关的农杆菌有两种类型：根癌农杆菌（Agrobacterium tumefaciens）和发根农杆菌（Agrobacterium rhizogenes）。根癌农杆菌含有Ti 质粒。发根农杆菌含有Ri 质粒。根癌农杆菌的Ti 质粒和发根农杆菌Ri 质粒都具有一段转移DNA (transfer DNA，又称T-DNA)，在农杆菌侵染植物时，T-DNA 可以插入到植物基因组中，使其携带的基因在植物中得以表达。由于T-DNA 能够进行高频率的转移，而且Ti 质粒和Ri 质粒上可插入大到甚至150kb 的外源基因，因此，Ti 质粒和Ri 质粒成为植物基因转化中的理想载体系统。 1 与农杆菌转化相关的基因 与转化相关的基因主要包括农杆菌染色体上的基因和Ti 质粒上T-DNA 以外Vir 区的基因。染色体基因包括chvA、chvB、att、pscA、chvD 以及chvB。它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。ChvD 蛋白可能在低pH 和磷酸饥饿情况下提高VirG 蛋白的合成水平。ChvE 与VirA 蛋白共同对virG 起激活作用。 原始的Ti质粒根据其功能的不同，可分为4个区： （1）T-DNA区：是在农杆菌侵染细胞时，从Ti质粒上切割下来转移到植物基因组中的一段DNA，其携带的基因与肿瘤的形成有关，但与T-DNA本身的转移与整合无关。T-DNA 上最重要的是两端的2个边界(LB和RB)，它们是T-DNA转移所必需的。只要其存在，T-DNA可以将携带的任何基因转移并整合到植物基因组中， T-DNA的右边界在T-DNA的整合中对于靶DNA位点的识别具有重要作用，因此，尤以右边界更为重要． （2）毒性区：位于T-DNA以外的1个30~40 kb的区域内，该区段编码的基因但对T-DNA 的转移和整合非常重要．这些基因也称为Ti质粒编码毒性基因(vir)。 （3）接合转移区：该区段存在有与细菌间接合转移有关的基因(tra)，调控Ti质粒在农杆菌间转移。 （4）复制起始区：该区段调控Ti质粒的自我复制。在遗传转化过程中除了Ti质粒上的基因参与外，还有农杆菌染色体基因。染色体基因包chvA、chvB、att、pscA、chvD 以及chvB。它们大多编码一些膜相关蛋白，负责细菌向植物受伤细胞趋化移动和帮助细菌附着于植物受伤细胞上。延伸因子P对于农杆菌的生长非常重要，但非必需．高水平的糖结合蛋白一ChvE可以扩大VirA蛋白对酚类物质的识别范围。结合ATP盒式转运体类似物蛋白ChvD，参与Vir区基因的表达调控，chvD基因座中插入无启动子的lacZ，农杆菌侵染力以及Vir区基因表达量大大下降，ChvD突变体中virG组成型表达侵染力则得以恢复，这一现象说明ChvD通过影响virG表达控制毒性。 2 Vir 基因的诱导表达机制 在植物受到创伤后，创伤组织的细胞释放出创伤信号——酚类化合物，如乙酰丁香酮。

农杆菌感受态细胞的制备方法

实验一农杆菌感受态细胞的制备 ［目的及要求］ 了解和掌握农杆菌感受态细胞制备的原理和方法。 ［实验原理］ 在利用根癌农杆菌介导的基因转化中，首先要获得含有目的基因的农杆菌工程菌株。 在基因工程操作中，感受态细胞的制备和质粒的转化是一项基本技术。感受态是细菌细胞具有的能够接受外源DNA的一种特殊生理状态。农杆菌的感受态可 用CaCl 2处理而诱导产生。将正在生长的农杆菌细胞加入到低渗的CaCl 2 溶液中， 0℃下处理便会使细菌细胞膜的透性发生改变，此时的细胞呈现出感受态。制备好的农杆菌感受态细胞迅速冷冻于-70℃可保存相当一段时间而不会对其转化效率有太大的影响。 ［实验仪器、材料和试剂］ 一、仪器：超净工作台，恒温摇床，冷冻高速离心机，高压灭菌锅，冰箱， -70℃超低温冰柜，分光光度计，接种针，10ml试管，50ml离心管，1.5ml 离心管，冰浴，微量进样器及吸头。 以上玻璃仪器和离心管需在用前灭菌，灭菌条件：120℃，15分钟。 二、材料：土壤农杆菌LBA4404菌株或其它农杆菌菌株 三、试剂：YEB液体培养基（1L）：酵母提取物1g，牛肉膏5g，蛋白胨5g， 蔗糖5g，MgSO 4·7H 2 O 0.5g，pH7.0，高压灭菌。 利福平（Rif）储液：50mg/ml 20mM CaCl 2 ，高压灭菌。 ［实验步骤］ 1、挑取根癌农杆菌LBA4404单菌落于3ml的YEB液体培养基（含Rif 50mg/l）中，28℃振荡培养过夜； 2、取过夜培养菌液1ml接种于50mlYEB（Rif 50mg/l）液体培养基中， 28℃振荡培养至OD 600 为0.5；

3、取2ml菌液，13000rpm，离心30sec, 弃上清； ，使农杆菌细胞充分悬浮，冰浴30min； 4、加入1000μl 20mM CaCl 2 5、13000rpm，离心30sec，弃上清，置于冰上，加入500μl预冷的20mM CaCl ，充分悬浮细胞，冰浴中保存，24hr内使用，或液氮中速冻1min，置-70℃ 2 保存备用。 实验二质粒DNA直接导入农杆菌 ［目的及要求］ 了解和掌握质粒DNA转化农杆菌细胞的原理和方法，获得能用于植物转化的工程菌。 ［实验原理］ 在低温下，外源DNA（质粒）可吸附到感受态细胞表面，诱导细胞吸收DNA。（加入热激原理）转化了质粒DNA的农杆菌随后28℃恢复培养，可使质粒上携带的编码抗生素的抗性基因得到表达，因此，转化了质粒的农杆菌细胞可在含有相应抗生素的培养基上生长，而没有转化的细胞则无法生长。

水热法制备纳米氧化铈粉体

水热法制备纳米氧化铈粉体 摘要：CeO2是一种价廉且用途极广的工业材料，具有广阔的市场应用前景。近年来，氧化铈纳米材料的形貌、尺寸控制以及性能应用方面已成为研究的热点之一。本论文对氧化铈进行结构、形貌以及光学性能的表征，分析了固相法，液相法，气象法制备纳米材料的优缺点并采用水热法制备出氧化铈纳米材料。 关键词：纳米CeO2；水热法；制备方法 Hydrothermal synthesis ，Preparation of nano-sized CeO2 particles Abstract：Ceria is a cheap and widely used industry material, which has a broad market applied prospect. In this paper, the preparation, characterization and optical properties of as ceria nanomaterials have been studied，the advantage and disadvantage of solid method ，liquid method and gas method have been contrasted and ceria nanomaterials were prepared by hydrothermal method. Keyword：nanometer CeO2；Hydrothermal synthesis；preparation method 随着纳米技术的不断进步，纳米CeO2由于粒径比较小，具有高的表面效应、量子尺寸效应、小尺寸效应以及宏观量子隧道效应等特性，因此产生了与传统材料不同的许多特殊性质，成为近年来材料科学中研究的热点。CeO2作为稀土家族中一种重要的化合物,可用于汽车尾气净化催化材料[1]、高温氧敏材料[2]、固体氧化物燃料电池(SOFC)电极材料[3][4]、化学机械抛光(CMP)研磨材料[5]等行业，对人类改善工作条件、提高生活质量、保障身体健康,节约能源、加强环境保护具有重要的现实意义,并具有显著的经济效益和社会效益。 1 氧化铈纳米材料概述 1.1 氧化铈的结构和性质 由于Ce具有独特的4f 层电子结构，氧化铈属于立方晶系，是面心立方结构，具有萤石结构。所属点群为Fm3m点群。从热动力学方面讲，其（111）面是最稳定的。CeO2晶胞中的Ce4+ 按面心立方阵排列，O2-占据所有的四面体位置，每个Ce4+被8个O2-包围，而每个O2-则与4个Ce4+配位，如下图所示。氧化铈经高温(T>950°C)还原后，CeO2转化为具有氧空位、非化学计量比的CeO2-x 氧化物(0