酵母菌的培养与分离
. . . 微生物学大实验
实验指导
编者：
生物技术教研室
2007.3
目录
实验一酵母菌的培养与分离‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥2 实验二酵母菌的鉴定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥7 实验三酵母菌耐受能力的测定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥19 实验四酵母菌发酵工艺条件的优化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥22 实验五耐高温酵母菌株的诱变选育‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥24 实验六酿酒酵母细胞固定化与酒精发酵‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥27
耐高温酒精酵母菌的选育及发酵条件的研究
实验一酵母菌的培养与分离
一、实验目的
学习培养和分离酵母菌的技术和方法
二、基本原理
大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH为4.5－6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。
利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基上用划线法分离之。
三、实验主要内容和要求
（一）本次实验的方案由同学们自己制定，实验包括：
1．马铃薯葡萄糖培养基, 乳酸马铃薯葡萄糖培养液的配制。
2.菌株的筛选,根据一定的生产目的并从特定的样品筛选出高产酒精的适宜的酵母菌株。
3.酵母菌的分离,要求接种一次, 28-30℃，培养24小时，转接一次，28-30℃，培养24小时，并用镜检的方法独立判定所分离菌株是否为酵母菌。
4.用划线分离法对酵母菌进行纯化，要求每组挑取单个菌落，连续划线分离4代，镜下为单一纯菌株，每组扩繁10支斜面菌种，备用。
四、实验的准备
1、甘蔗、成熟葡萄或苹果等果皮、0.1%美蓝染液、1ml的无菌吸管、无菌培养皿等。
2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：
原料：马铃薯（200克）、葡萄糖（20克）、琼脂（15-20克）、蒸馏水（1000ml）。
配制方法：
（1）先将马铃薯去皮，切片，称200克并加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至1000ml ，制成20%的马铃薯汁。
（2）在20%的马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，补足水分并在115℃条件下高压灭菌20分种。
（3）加入葡萄糖，制成培养酵母菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，但不加琼脂而加乳酸，按每1000ml培养液中含5ml乳酸的量加入，并分装试管。
五、实验设计
l、接种：取一小块果皮，不需冲洗，直接接入乳酸马铃薯葡萄糖培养液管中，置28-30℃，培养24小时，可见培养液变混浊。
2、培养，用无菌吸管取上述培养后培养液0.lml，注入另一管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，置28一30℃再培养24小时或稍长(过长则霉菌长出)。
3、观察：用无菌操作法取少许菌液置于载玻片中央的0.l%美蓝染色液中，混匀后加盖玻片制成水浸片，先用低倍镜后换高倍镜观察酵母菌的形态和出芽生殖情况。
活酵母菌可使美蓝还原，从而使菌体不着色，用此方法可判断酵母菌的死活。
4、分离：马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板。用划线法分离酵母菌培养液，从而得到单个菌落。挑取单个菌落反复再次划线分离纯化，最终可获得纯培养。
六、实验注意事项
1.配制培养基时，应注意琼脂的加量，不同规格及批次的琼脂的加量应由实验确定，不能照搬书上的加量。
2.对培养基加热时应注意琼脂的糊底与暴沸。
3.灭菌锅操作时，首先应注意水一定要加足够，排气要彻底，其次灭菌期间不要离开人，灭菌结束后，关闭电源，拔掉插头，最后放气一定要缓慢，均匀，气放彻底才能开锅，取锅内物品，应小心，防止烫伤。
4.接种前应注意无菌工作台的消毒与杀菌，接种时应注意手与接种工具的消毒。
七、实验结果的观察及记录
1.24小时，观察试管内培养液的情况并作记录，每组转接2支试管。
2.48小时，观察试管内培养液的情况，镜检培养液内菌的数量，粗略判断是否为酵母菌并作记录，每人蘸取培养液进行划线分离，并作记录。
3.72小时后，观察培养皿内菌的生长的情况，挑取单个菌落进一步划线分离，直到为纯菌落。
4.每组转接10支斜面试管，备用。
八、实验的延伸
自然条件下酿造苹果酒，葡萄酒、猕猴桃酒。
七实验报告要求
1.实验完毕后，每位同学都应独立作出实验报告，实验报告应类似于小型论文格式。
2.实验报告内容包括：
（1）立题意义。
（2）实验设计。
（3）实验步骤详细记录。
（4）对实验结果的分析讨论和总结。
（5）实验延伸。
（6）实验心得体会。
附1：果酒的酿制方法
—、目的要求
了解果酒酿制原理，学习苹果酒酿制技术。
二、基本原理
果酒是一类营养丰富、含酒精度低的上乘饮料。它是用含一定糖分和水分的果实压汁，经微生物发酵而成。其生化作用，除酒精发酵的主产物外，还有甘油、醋酸、琥珀酸、杂醇油等的形成；同时，陈酿期中，各种酸类与醇类的酯化反应，赋予果酒特殊的香味；果酒中的单宁、色素、果屑微粒及蛋白质（包括酵母尸体）等的氧化和下沉，使酒液澄清、风味增浓。
各种果酒以原料而称名。除坚果外，所有栽培果，野生果均可做酿果酒的原料。本实验以苹果酒为例，学习其酿制方法。
三、实验材料
1、菌种在7°Be’麦芽汁琼脂斜面培养基上的葡萄酒酵母（s.cerevisae ellipsoieleus）。
2、器材苹果汁培养基，7°Be’麦芽汁培养基，10ml／管、100ml／三角瓶等装量，白糖，食用酒精，亚硫酸，果胶酶，发酵缸，破碎机，果汁分离器等。
a.苹果汁培养基
粗滤新鲜果汁（蔗糖调至13°Be，酸度0.5%以下）1000ml
K2HPO4 0.1g MgSO4·7H2O 0.1g
配好后，加热煮沸3～5分钟，静置10小时以上，过滤、分装，0.7Kg／cm2灭菌20分钟。
四、实验步骤
（一）酒母培养
1、菌种活化（一级种）取装有10ml苹果汁或7°Be’麦芽汁培养基1支，按无
菌操作法接种葡萄酒酵母菌一环，混匀后置28～30℃下培养2～5天（用苹果汁活化菌种时需培养5天以上），镜检酵母繁殖良好，无杂菌即可。
2、母发酵剂制备（二级种）在装有100ml苹果汁培养基的三角瓶中，接1～2ml 经活化的葡萄酒酵母菌液，于28℃下培养2～3天，当培养液表面有气泡产生，嗅之有酒香味、取样镜检无杂菌时使用。
3、生产发酵剂的制备（三级种）方法与母发酵剂相同，只是采取更大的容器。一般采用500～1000ml的三角瓶或卡氏罐，盛装占容积1／2～3／5的果汁培养液，灭菌冷却后，按10％接种量接人母发酵剂，在25～28℃下培养24～48小时，待发酵正常，镜检无杂菌方可使用。
4、如果使用活性干酵母，添加量为20g/L发酵醪，复水用水量是干酵母重量的5～10倍。复水用水的温度应保持在40℃左右（38～43℃），将酵母静置5～10min后搅拌，酵母在水中的时间不能超过30min。然后使酵母溶液缓慢冷却到与将被接种发酵醪的温差小于10℃，然后直接加入发酵醪。
（二）果酒生产
工艺流程如下：
果胶酶
↓
苹果→分选除杂下清洗→破碎→压榨→粗果汁→果楂、苹果酸、丹宁
↑
活化酵母→母发酵剂→生产发酵剂
↓
蔗糖→发酵→皮渣分离→后发酵→原酒→
→换捅除渣→贮存陈酿→配制→贮存→澄清过滤→装瓶→巴氏灭菌→封口→成品。(2～3次)
操作要点：
1、分选取成熟苹果，除去腐烂、干疤和伤果。
2、清洗清水充分洗涤，除去果皮上的污物、杂质及药剂，以保证原料干净卫生。
3、破碎为易于压榨，提高出汁率，需进行破碎。用破碎机破碎至果块粒度0．5cm3左右，并除去果籽。
4、压榨分离破碎后立即进行压榨分离。分离出的果汁中不得夹带果肉，同时需添加适量苹果酸调整含量（要求果汁总酸含量为5g／L），并加入0.1～0.15g／L的果胶酶，促进果胶分解，使果汁澄清并提高酒的风味。
由于苹果汁易被自身含有的多酚氧化酶氧化，故需加SO
2
还原剂抑制酶活性，同时
SO
2也具有杀菌、防腐和澄清果汁作用。SO
2
来源，除工厂应用液态SO
2
外，实验室常加
入亚硫酸钠（Na
2SO
3
）和偏重亚硫酸钾（K
2
S
2
O
5
），其用量为果汁量的0.02％即可。
5、前发酵取澄清果汁放入经干热灭菌的发酵缸中，装量占缸容积的4／5，按3～5％的接种量接入酵母生产发酵剂进行发酵，保持品温在18～22℃之间，最高勿超过25℃，发酵应在7～12天内结束。一般苹果汁糖分约为11％，经发酵后，酒精含量约达6％以上，前发酵结束后，原酒酒度应大于8％（V），残糖＜20g／L，总酸（苹果酸）＞5g／L。
6、后发酵前发酵结束后，迅速将酒液与皮渣分离，酒汁转入经干热灭菌的发酵缸中，进行后发酵，使残糖继续分解。期间，控制品温在18～22℃之间，不要超过25℃，时间1个月，即得原酒。要求残糖含量小于2g／L以下，挥发酸（以醋酸计）小于0.6g ／L，总酸（以苹果酸计）大于5g／L。
7、换桶除渣为使已澄清的原酒与其酒脚（沉淀物）及时分离，以免酒脚产生异味而影响酒质，故需进行换桶（缸）。换桶次数新酒每年换三次。
8、贮存陈酿应满桶贮存。陈酿即酒的老熟，经长期密闭贮存，可使酒质澄清、风味醇厚。贮存室温8～16℃，存期半年以上。
9、配制原酒贮存半年后可开始配制。配制时，按工艺规定将不同原酒按一定配比相混，然后添加适量的糖、酒精、继续贮存半年以上。
10、澄清过滤可采用冷冻法使其澄清，即于-4℃左右存放7天，然后冷过滤。澄清后的酒置-5～-7℃下冷冻3天不发生混浊沉淀，或暴露空气中氧化4天不变混浊即为合格。
11、装瓶灭菌装瓶后需进行巴氏灭菌，即在63℃下处理15分钟，冷却后封口保
存。
五、实验报告
1、简述苹果酒的酿制法。
2、二氧化硫在果酒酿制中的作用是什么？
六、思考题
1、酵母菌酿酒的原理是什么？
2、果酒酿制中为何要加入果胶酶？
实验二酵母菌的鉴定
酒精生产中所用酵母菌在微生物学中的分类依据是什么?
微生物学的类别分门、纲、目、科、属、种，生产酒精用酵母菌属于微生物中的真菌门、子囊菌纲、原子囊菌亚纲、内孢霉目、内孢霉科、啤酒酵母属、卡尔斯伯酵母属等。酵母菌的分类依据是根据它的形态特征、生理生化反应特征来确定的。在分类前将菌体细胞进行分离纯化，得到由单细胞长成的菌落，然后再进行形态特征和生理生化鉴定。
(一)形态特征的鉴定
把酵母菌接种到麦芽汁固体培养基上，让它长成菌落，观察其菌落的形态、颜色、质地、边缘、表面等特征。把它再接种到液体麦芽汁培养基中，观察是否能产生醭、试管或培养仪器表面壁上能否形成菌环，培养液中是否产生沉淀、混浊程度等。另外，还要取样在显微镜下观察其单细胞的形态、大小、能否形成孢子、孢子的大小以及繁殖方式等。
(二)生理生化特征的鉴定
酵母菌的生理生化特征主要表现为发酵葡萄糖、果糖、蔗糖、麦芽糖等糖类的能力。同时，还需测定利用其它碳水化合物、同化酒精、耐酒精，利用硝酸盐还是硫酸盐，发酵产酸、产醋、耐温、耐酸、抗重金属离子、抗杂菌性等的能力。
最后，根据以上得出的形态特征和生理生化特征，查阅有关资料，把具有相同特征的一类酵母菌，就可以归属于某一属。
怎样鉴定酵母菌在液体培养基中的培养特征?
将酵母菌种接种于米曲汁或麦芽汁液体培养基中，放于恒温培养箱内以28—30℃保温培养18—24、24—48、48—72小时，取出观察各个时期液体培养基表面有无白色浮膜物-醭的存在，各个不同时期培养基中有无沉淀或沉淀的多少、有无混浊和混浊程度、试管或其它培养器壁上有无菌环形成，最后取出各个不同时期的样液，注入酵母细胞计数器--血球计中，放置显微镜下观察单个细胞的形态变化情况、液泡的大小、细胞数增加的多少以及培养基中pH值的变化情况等，并测定其酒精和二氧化碳的生产量。然后根据不同的反应情况，作好详细的原始记录，便于以后培养菌种时比较和参考。
酵母菌生理生化试验
一、酵母菌糖发酵试验
（一）实验目的
酵母菌的分离筛选方法
酵母菌的分离筛选方法 酵母菌多数为腐生，一般生长在含糖较高，偏酸的环境中，在通气条 件下，液体培养比霉菌快。菌落与细菌相似，较大而厚，多数不透明， 菌落光滑湿润粘稠，乳白色，少数干皱，边缘整齐，呈红色或粉红色， 圆形椭圆卵形，液体培养基生长会生成沉淀或菌膜。 含高糖浓度（45%），分离蜂蜜酵母，球拟酵母属等嗜高渗透压的酵母。 1.培养基： 葡萄糖 50g/L 尿素1g/L （NH4）2SO41g/L L L MgSO41g/L FeSO4 L 酵母膏 L 孟加拉红 L （富集用） ★乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基：马铃薯200g/L 葡萄糖（霉菌用蔗 糖）20g/L 乳酸5ml马铃薯去皮切片200g，加水煮沸30min，纱布 过滤，补足蒸馏水1L，PH自然。（去掉乳酸可用于酵母菌和霉菌培养 用）（富集用） ★麦芽汁培养基：1：4水60-65℃水浴3-4小时，4-6层纱布过 滤，可加一个蛋清加水20mL调均生泡沫，倒入糖化液中，煮沸过滤， 10-15波林，氯霉素L 121℃ 20min （分离保存 用） 灭菌后加入300u/ml硫酸链霉素（集菌用） ★虎红（孟加拉红）培养基：蛋白胨L 葡萄糖10g/L L L 孟加拉红L 氯霉素L 琼脂15g/L PH自然 （分离纯化用）
★豆芽汁培养基：黄豆芽100g/L 葡萄糖50g/L PH自然。100g黄豆芽，加水煮沸30min，纱布过滤，补足蒸馏水1L 察氏培养基：主要培养霉菌观察形态用 蔗糖30g/L 硝酸钠3g/L 磷酸氢二钾1g/L 氯化钾L 硫酸镁 L 硫酸亚铁L 琼脂15-20g/L 121℃ 20min PH自然 一般分离黄酒酵母酒精酵母使用曲汁培养基，啤酒酵母用酒花麦汁培养基，葡萄酒酵母用葡萄汁培养基。 2.集菌：研究酵母菌生态和某种基物或样品中的酵母菌区系，一般不进行集菌，以免改变其中不同种类数量间的对比，将样品制成菌悬液按常规法分离。若从样品中分离特定种类时先集菌。集菌发酵力强菌株，加酸性含糖的培养基，酸性豆汁，必要时注入高浓度的酒精（13-17%），霉菌在液体中形成菌丝体，酵母不形成菌丝，25-28℃2-3d，遇到菌丝体用接种环挑去烧掉，去掉上清液，取沉淀酵母一至两环移植另一液体培养基中，集菌连续两至三次才能完成，要配合镜检。 实例：将待分离的样品10g（ml）放入90ml无菌水或生理盐水/150ml 三角瓶（玻璃珠），摇床振荡20-30min，取上清液接种于酸性培养液（乳酸-马铃薯-葡萄糖培养基酸性麦芽汁或酸性豆芽汁）25-28℃2-3d，培养过程中若出现菌丝体跳出烧掉，集菌连续两至三次，培养液变成混浊，产生菌膜和沉淀物。镜检：美兰染液染色，活菌可还原美兰染液，菌体无色。 3.筛选：
酵母菌的分离纯化
酵母菌的分离纯化-CAL-FENGHAI-(2020YEAR-YICAI)_JINGBIAN
酵母菌的分离纯化、固定化和酒精发酵 第一部分酵母菌的分离纯化 一、实验目的 应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。 二、实验原理 酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为酵母菌生长迅速，容易分离培养。在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。 三、器材和用品 1、甘蔗、苹果皮、葡萄皮、果园土、菜园土等。 2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g（煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。分装三角瓶；试管斜面1支/组 3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为左右，再分装试管9ml2支/组。 4、无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、美兰染液、显微镜、接种环等。 四、实验方法 1、接种：取果皮（不需冲洗）或土壤5克，加入到100ml无菌水中，充分搅拌后，用无菌吸管取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h，可见培养液变浑浊。 2、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1m l，注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h。 3、镜检：用无菌操作法用接种环取少量菌液置于载玻片上，中央滴一滴美兰染液，混合均匀后制成水浸片，在高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽方式，并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因活细胞使美兰染液还原，故菌体不着色。 4、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌吸管取加富培养液到平板中，用涂棒涂匀后培养24h。 5、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分
酵母菌的培养和观察
酵母菌的培养和观察 目的认识酵母菌的形态特征，了解培养酵母菌的方法。 实验前的思考人类认识和利用酵母菌的历史悠久，早在史前时期，先人们就学会酿酒。约在6000年前，就发明发面的方法。直到十九世纪有了显微镜，人们才窥探到醉母菌的真面目。对酵母菌做纯系培养分类研究的是与巴斯德同时代的丹麦人汉斯，他是为寻求酿造高品质啤酒的途径才去深入研究酵母菌的。 材料器具甜酒酿汁液，新鲜酵母，豆芽；显微镜，载玻片，盖玻皮，玻璃棒，镊子，滴管，吸水纸，酒精灯，石棉网，火柴，漏斗架，玻璃斗，量杯，三角烧瓶，烧杯，天平，量筒，棉絮；蔗糖，乳酸，碘液。 步骤 1．观察酵母菌 （1）用滴管从甜酒酿的汁液中吸取一滴汁液，滴在载玻片上，用针摊开，盖上盖玻片，在低倍镜下就能清楚地看到甜酒酿的汁液中悬浮着无数酵母菌。再换高倍镜仔细观察一个酵母菌，可以看到酵母菌是椭圆形的单个细胞，细胞中有许多小颗粒，也有几个大的液泡（图示）。有的酵母菌的一端长出大小不同的突起，这是酵母菌的芽体。芽体成长脱落，就成为新的个体，有的芽体在从母体脱落前又长出突起。这种繁殖方法叫出芽繁殖。 （2）在盖玻片一边加一滴碘液，从另一边用吸水纸把染液引入盖玻片下。不久就能看到被染成棕褐色的细胞核和变成蓝紫色的淀粉粒。 2．培养酵母菌 （1）用蔗糖液培养在盛有100毫升的三角烧瓶里加5克蔗糖，煮沸。等到溶液稍稍冷却，加一小块鲜酵母，用玻璃棒搅拌均匀；再用棉絮塞紧瓶口。然后把烧瓶放在25～30℃的温暖地方，数小时后就可见到溶液里有气泡产生，并散发出酒味。这是因为酵母菌正在把糖分解成乙醇和二氧化碳。 （2）二三天后吸取溶液在显微镜下观察，就可看到已培养出大量酵母菌。
细菌 、放线菌 、酵母菌及霉菌的分离与纯化
土壤中细菌、放线菌、酵母菌及霉菌的分离与纯化 一、实验目的 1. 学习、掌握从土壤稀释分离、划线分离各类微生物的技术。 2. 学习从样品中分离、纯化出所需菌株。 3. 学习并掌握平板倾注法和斜面接种技术，了解培养细菌、放线菌、酵母菌及霉菌四大类微生物的培养条件和培养时间。 4. 学习平板菌落计数法。 二、实验原理 将待分离的样品进行一定的稀释，使微生物的细胞（或孢子）尽量呈分散状态，选用有针对性的培养基，在不同温度、通风等条件下培养，让其长成一个纯种单个菌落。 要想获得某种微生物的纯培养，还需提供有利于该微生物生长繁殖的最适培养基及培养条件。微生物四大类菌的分离培养基、培养温度、培养时间见表2-1所示。 表2-1 微生物四大类菌的分离和培养要求 样品来源分离对象分离方法稀释度培养基名称培养温度 /℃培养时间/d 土样细菌稀释分离10-5，10-6， 10-7 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2 土样放线菌稀释分离10-3，10-4， 10-5 高氏1号28 5～7 土样霉菌稀释分离10-2，10-3， 10-4 马丁氏琼脂28～30 3～5 面肥或土样酵母菌稀释分离10-4，10-5， 10-6 马铃薯葡萄糖28～30 2～3 细菌分离平 板 细菌单菌落划线分离10-2 牛肉膏蛋白胨30～37 1～2 三、实验材料 1. 菌源土样 2. 培养基牛肉膏蛋白胨培养基，马丁氏培养基，高氏合成1号培养基，马铃薯葡萄糖培养基(制平板和斜面)，见附录Ⅲ。 3. 无菌水 250 mL锥形瓶，每瓶装99 mL无菌水(或95mL为分离霉菌用)，内装10粒玻璃珠。 4.5 mL无菌水试管(每人5～7支)。 4. 其他物品无菌培养皿，无菌移液管，无菌玻璃涂棒(刮刀)，称量纸，药勺，橡皮头，10%酚溶液。 （一）系列稀释平板法 1. 取土样 选定取样点，按对角交叉（五点法）取样。先除去表层约2cm的土壤，将铲子插入土中数次，然后取2～10cm处的土壤。盛土的容器应是无菌的。将5点样品约1kg充分混匀，除去碎石、植物残根等杂物，装入已灭过菌的牛皮纸袋内，封好袋口，并记录取样地点、环境及日期。同时取10～15g，称重后经105℃烘干8h，置干燥器中冷却后再次称重，计算含水量。土样采集后应及时分离，凡不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥条件下，尽量减少其中菌种的变化。 2. 制备土壤稀释液 称土样1g于盛有99mL无菌水的三角瓶中，充分振荡，此即为10-2浓度的菌悬液。用无菌移液管吸取悬液0.5mL于4.5mL无菌水试管中，用移液管吹吸三次，摇匀，此即为10-3浓度。同样方法，依次稀释到10-7。稀释过程需在无菌室或无菌操作条件下进行。
传统酸面团中细菌与酵母菌的分离与鉴定
传统酸面团中细菌与酵母菌的分离与鉴定 刘同杰1，李云1，吴诗榕1，金乐天1，2，张国华1，杨浣漪1，何国庆1 （1.浙江大学生物系统工程与食品科学学院，浙江省食品微生物技术重点实验室，浙江大学馥莉食品研究院，浙江杭州 310058）（2.朝鲜韩德秀平壤轻工业大学，朝鲜平壤） 摘要：为进一步描述我国传统面食发酵剂的理化性质和菌落组成，收集了北方地区6份发酵剂样品，测定了其酸度和菌落总数，并对分离、纯化、初筛后得到的75株细菌和60株酵母菌进行了测序鉴定。结果显示，样品pH值范围为3.73~5.46，总滴定酸度为8.3~19.8 mL；乳酸菌和酵母菌的计数结果分别为8.35±0.07~9.75±0.12 Log cfu/g，6.31±0.22~8.68±0.04 Log cfu/g。鉴定出包括短乳杆菌 （Lactobacillus brevis）、植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）和旧金山乳杆菌（Lactobacillus sanfranciscensis）在内的乳酸菌8种；酵母菌4种，其中优势菌为酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）；其他细菌6种，主要为解淀粉芽孢杆菌（B. amyloliquefaciens）、地衣芽孢杆菌（B. licheniformis）和醋杆菌。结果表明，我国传统面食发酵剂菌相复杂，以酵母菌和乳酸菌为主，还包括芽孢杆菌、醋酸杆菌在内的多种其他细菌，甚至可能含有致病菌。通过比较细菌和酵母在不同酸面团样品中的分布，发现不同来源样品的微生物种类组成存在差异。 关键词：酸面团；菌相分析；16S/26S rDNA测序；生物多样性；系统发育树 文章篇号：1673-9078(2014)9-114-120 DOI: 10.13982/j.mfst.1673-9078.2014.09.020 Isolation and Identification of Bacteria and Yeast from Chinese T raditional Sourdough LIU T ong-jie1, LI Yun1, WU Shi-rong1, JIN Le-tian1,2, ZHANG Guo-hua1, YANG Huan-yi1, HE Guo-qing1 (1.College of Biosystems Engineering and Food Science of Zhejiang University, Zhejiang provincial key laboratory of Food Microbiology, Fuli Institute of Food Science of Zhejiang University, Hangzhou 310058, China) (2.DPRK Han Dexiu Pyongyang University of light industry, Pyongyang, DPRK) Abstract: In this study, the physicochemical properties and microbial profile of traditionally fermented sourdough for Chinese steamed bread were examined. Six samples of sourdough were collected from northern China. Acidity and colony counts were measured. After isolation, purification, and preliminary screening, 75 strains of bacteria and 60 strains of yeasts were obtained and identified by DNA sequencing. The pH was between 3.73 and 5.46 and total titratable acid (TTA) values ranged from 8.3 to 19.8 mL. In all the samples, the number oflactic acid bacteria (LAB) and yeasts ranged from 8.35±0.07 to 9.75±0.12 Log cfu/g and 6.31±0.22 to 8.68±0.04 Log cfu/g, respectively. Eight LAB species, including Lactobacillus brevis, L. plantarum, and L. sanfranciscensis, and six other bacterial species, including Bacillusamyloliquefaciens, Bacilluslicheniformis, and three species of Acetobacter, were identified. Among the four identified yeasts, the dominant species was Saccharomyces cerevisiae. The results indicate that Chinese traditional starter cultures for flour-based food are complex bacterial floras dominated by LAB and yeast, in addition to several other microorganisms, including Bacillus spp., Acetobacter spp., and even pathogenic bacteria. Differences in microbial species compositions among LAB and yeasts in samples from different areas were identified by comparing species distributions in different sourdough samples. Key words: sourdough; elucidation of microbial flora structure; 16S/26S rDNA sequencing; biodiversity; phylogenetic tree 我国传统的面食发酵剂类似于西方发酵面包用的酸面团，在我国一般被称为“老面”、“酵子”、“面收稿日期：2014-04-17 基金项目：国家自然科学基金资助项目（31371826） 作者简介：刘同杰（1989-），男，在读博士，研究方向：传统发酵食品通讯作者：何国庆（1957-），男，博士，教授，研究方向：食品生物技术及发酵工程肥”等[1]，具有悠久的使用历史。上世纪80年代，即发活性干酵母被引入我国，因其使用便捷，传统面食发酵剂逐渐被取代，但直到现在仍有很多地区尤其农村地区，仍然使用其制备馒头等主食，因使用传统面食发酵剂制备的馒头品质更优。究其原因，活性干酵母为单一菌种发酵，与传统发酵剂的混菌体系发酵相比，发酵的馒头风味平淡、香气不佳，总体的感官品 114
实验 酵母RNA的分离及组分鉴定
※实验六酵母RNA的分离及组分鉴定 【实验目的】 了解核酸的组分，并掌握鉴定核酸组分的方法。 【实验原理】 酵母核酸种RNA含量较多。RNA可溶于碱性溶液，在碱提取液中加入酸性乙醇溶液可以使解聚的核糖核酸沉淀。由此即得到RNA的粗制品。 核糖核酸含有核糖、嘌呤碱、嘧啶碱和磷酸各组分。加硫酸煮沸可使其水解，从水解液中可以测出上述组分的存在。 鉴定依据：磷酸与定磷试剂反应产生蓝色物质。核糖与苔黑酚作用产生绿色物质。嘌呤碱与硝酸银能产生白色的嘌呤碱银化合物沉淀。 【实验器材】 150 ml锥形瓶、水浴、量筒、漏斗及抽虑瓶、吸管7、滴管8、试管及试管架9、烧杯、离心机、漏斗 【试剂和材料】 1、0.04 mol/L氢氧化钠溶液； 2、酸性乙醇溶液：将0.3毫升浓盐酸加入30毫升乙醇中； 3、95%乙醇； 4、乙醚； 5、1.5 mol/L硫酸溶液； 6、浓氨水； 7、0.1 mol/L硝酸银溶液； 8、三氯化铁浓盐酸溶液：将2 ml 10% 三氯化铁溶液（用FeCl3·6H2O配制）加入到400 ml浓盐酸中； 9、苔黑酚（地衣酚）乙醇溶液：溶解6 g苔黑酚于100 ml 95% 乙醇中（可在冰箱中保存一个月）； 10、定磷试剂：（1）17% 硫酸溶液：将19 ml浓硫酸（比重1.84）缓缓加入到83 ml 水中（2）2.5% 钼酸铵溶液：将2.5 g钼酸铵溶于100 ml水中（3）10% 抗坏血酸溶液：10 g抗坏血酸溶于100 ml水中，贮棕色瓶保存（溶液呈淡黄色时可用，如呈深黄或棕色则失败，需纯化抗坏血酸）。临用时将上述3种溶液与水按如下比例混合。17% 硫酸溶液：2.5%
酵母菌的培养与分离
微生物学大实验 实验指导 编者: 生物技术教研室 200７。3 目录 实验一酵母菌得培养与分离‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥2 实验二酵母菌得鉴定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥７实验三酵母菌耐受能力得测定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥19 实验四酵母菌发酵工艺条件得优化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥2２
实验五耐高温酵母菌株得诱变选育‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥24 实验六酿酒酵母细胞固定化与酒精发酵‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥２７耐高温酒精酵母菌得选育及发酵条件得研究 实验一酵母菌得培养与分离 一、实验目得 学习培养与分离酵母菌得技术与方法 二、基本原理 大多数酵母菌为腐生,其生活最适pH为4。５－６,常见于含糖分较高得环境中,例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生长迅速,易于分离培养,在液体培养基中,酵母菌比霉菌生长得快。 利用酵母菌喜欢酸性环境得特点,常用酸性液体培养基获得酵母菌得培养液(这样做得好处就是酸性培养条件则可抑制细菌得生长),然后在固体培养基上用划线法分离之。 三、实验主要内容与要求 (一)本次实验得方案由同学们自己制定,实验包括: １.马铃薯葡萄糖培养基, 乳酸马铃薯葡萄糖培养液得配制。 2、菌株得筛选,根据一定得生产目得并从特定得样品筛选出高产酒精得适宜得酵母菌株。 3。酵母菌得分离,要求接种一次, 2８-３０℃,培养24小时,转接一次,２8－30℃,培养２4小时,并用镜检得方法独立判定所分离菌株就是否为酵母菌、 4、用划线分离法对酵母菌进行纯化,要求每组挑取单个菌落,连续划线分离4代,镜下为单一纯菌株,每组扩繁10支斜面菌种,备用、 四、实验得准备 1、甘蔗、成熟葡萄或苹果等果皮、0.1％美蓝染液、1ml得无菌吸管、无菌培养皿等。 ２、马铃薯葡萄糖琼脂培养基: 原料:马铃薯(２０0克)、葡萄糖(20克)、琼脂(15－20克)、蒸馏水(１000ｍｌ)。 配制方法: (1)先将马铃薯去皮,切片,称20０克并加蒸馏水10０0ml,煮沸半小时,用纱布过滤,补足蒸馏水量至1000mｌ ,制成2０%得马铃薯汁。
【实验】微生物的分离与纯化
微生物的实验室培养——自酿葡萄酒中酵母菌的分离与纯化 一、实验目的：掌握无菌技术的操作，尝试用平板划线法和稀释涂布平板法分离纯化酵母菌。 二、实验步骤 （1）制备培养基（马铃薯琼脂培养基）：计算→称量→溶化→灭菌→倒平板（已完成） （2）分离纯化 实验 步骤 操作流程流程叙述操作目的、作用 接种方法一：点燃酒精灯 ↓ 1.灼烧接种 环并冷却 ↓ 2.沾取菌液 ↓ 3.平板划线 ↓ 4.转动培养 皿约70°角 ↓ 5.灼烧并冷 却接种环 ↓ 6.平板划线 ↓ 7．倒置培养 用火柴点燃酒精灯，保证实验操作在酒精 灯火焰进行 将接种环放在火焰上灼烧，直至烧红， 让接种环自然冷却 打开装有菌液的试管，塞子要拿在手上， 将试管口通过火焰灭菌，将冷却的接种环 伸入菌液中，沾取菌液。将试管口通过火 焰灭菌，用塞子塞住试管 左手将皿盖打开一条缝隙；右手把沾有菌 种的接种环迅速伸入平板内，划3到5条 平行线（不要划破培养基），盖上培养皿盖 逆时针旋转培养皿约70°角 将接种环放在火焰上灼烧，直至烧红让接 种环自然冷却 从第一区域划线的末端开始往第二区域划 线，重复以上操作，在三、四、五区域划 线，注意不要将最后一区的划线与 相连。（也可以用连续划“Z”字形线的方 法 倒置培养皿，放入培养箱中培养 避免周围环境中微生物的 污染 清除； 防止杀死菌种 防止塞子被污染； 清除的杂菌 接种到培养基表面 调整角度，准备第二区域 的划线 在琼脂固体培养基表面连 续划线的操作，将聚集的 菌种逐步稀释分散到培养 基的表面 减少培养基内的水分蒸 发，使培养基保持湿润； 防止水珠回流打散菌落 在右图所示 的培养皿内 用笔模拟接 种环画出两 种平板划线 法的划线轨 迹 接种 方法 二： 1.系列稀 释操作 准备六只试管 ↓ 分别加入4.5mL蒸馏水并灭菌，编号 ↓ 取 mL菌液放入第1支试管并混匀 ↓ 从第1支试管取0.5ml菌液放入第2只试管并 混匀 ↓ 重复步骤，直至最后一支试管 2.涂布平 板操作 滴加100μL菌液到培养基表面 ↓ 引燃涂布器，待酒精燃尽后，冷却8～10s ↓ 把培养皿打开一条缝 ↓ 在培养皿盖内侧进一步冷却涂布器，均匀涂布 菌液，转动培养皿，涂匀 ↓ 盖上皿盖,放置10min ↓ 倒置培养皿，放入培养箱中培养 清除涂布器上的杂菌 使菌液均匀分布在培 养基表面 使液体被充分吸收 结果 观察 观察划线平板和涂布平板上的菌落形态、颜 色、大小，可挑取少量菌落制成临时装片，显 微镜下观察。 对菌落进行初步鉴定 1
酵母菌的分离与纯化
酵母菌的分离与纯化 小组组员: 一、实验目的 1.学习分离纯化酵母菌的技术与方法 2.了解培养基的配置与灭菌技术 3.增强无菌操作技术的意识 二、基本原理 从混杂的微生物群体获得只含某一种某一株微生物的过程叫做微生物分离与纯化，酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为4.5-6.0.酵母菌生长迅速，容易分离培养。马丁氏培养基是一种用来分离真菌的选择性培养基。此培养基是由葡萄糖、蛋白胨、KH2PO4、MgSO4·7H2O、孟加拉红(玫瑰红，Rose Bengal)和链霉素等组成。其中葡萄糖主要作为碳源，蛋白胨主要作为氮源，KH2PO4和MgSO4·7H2O作为无机盐，为微生物提供钾、磷和镁离子。而孟加拉红和链霉素主要是细菌和放线菌的抑制剂，对真菌无抑制作用，因而真菌在这种培养基上可以得到优势生长，从而达到分离真菌的目的。 三、实验材料及用具 1.用品：苹果、葡萄糖、琼脂、水、1%孟加拉红水溶液、马铃薯 2.设备与器材：1ml的无菌吸管、无菌培养皿等. 四、实验步骤 1、马铃薯培养基的配置 培养基成分:马铃薯 40克、蔗糖（葡萄糖） 4克、琼脂 4克、水 200毫升、 pH 自然。配置方法: （1）配制20%马铃薯浸汁：取去皮马钓薯40g，切成小块，加水200ml.加热煮游30 min ，用纱布过滤，然后补足失水互所需体积。121Pa灭菌30min.即成20%马铃馨漫汁，贮存备用。 （2）配制时，按每100ml 马铃薯浸汁加入2g蔗糖，加热煮沸后加入4克琼脂，继续加热融化并补足失水。 （3）分装、加塞，包扎。 （4）高压蒸汽灭菌：121Pa灭菌30min
酵母菌的分离与纯化
酵母菌的分离与纯化 土壤是微生物生活的大本营，是寻早有重要应用潜力的微生物的主要菌源。不同图样中各类微生物的含量不同，一般土壤中细菌数量最多，其次为放线菌和霉菌。放线菌一般在较干燥、偏碱性、有机质较多的土壤中较多；霉菌在含有机质丰富、偏酸性、通气性较好的土壤中较多；酵母菌在一般土壤中的数量较少，而在酒曲、面肥、水果表皮、果园土壤中数量多些。（一）菌源 1土样用无菌的采样小铲在橘树果园中取土壤表层下1~10cm土壤10g，装入灭菌的牛皮纸袋内。封好袋口，记录取样地点、环境及日期。图样采集后应及时分离，饭不能立即分离的样品，应保存在低温、干燥的条件下，以减少其中菌相的变化。 2面肥 （1）面粉500克，白酒100克，水250，和好静置发酵就可以了。冬季10个小时。（2）在温水中兑一点酒，倒入适量面粉拌匀后放入绝缘保温盛器（陶瓷，砂锅）中，用布将整个盛器盖好置于温度较高处，6小时后即成面肥。 *以上方法做出的面肥只能保存几天，不宜放置太久。 3水果果皮 桔子和葡萄等的果皮上含有数量较多的酵母菌，既可单独作为菌源也可以和果园土壤作为混合菌源。 （二）酵母菌的分离 1制备菌悬液 称取菌源1g，加入盛有99ml无菌水或无菌生理盐水并装有玻璃珠的锥形瓶中。振荡20min，即成10-2的菌源悬液。再一次稀释成10-4、10-5、10-6三个稀释度。 2涂布法分离 取融化并冷却至45~50度左右的豆芽汁葡萄糖培养基，每皿分别倾注约12ml培养基到培养皿内。注意，温度过高易将菌烫死，皿盖上冷凝水太多也会影响分离效果；低于45度培养基易凝固，平板高低不平。呆平板冷却后，用无菌移液管分别吸取上述已经制好的菌源稀释液10-4、10-5、10-6三个稀释度菌悬液各0.1ml，依次滴加于相应编号的豆芽汁葡萄糖培养基平板上。每个稀释度做2~3个平行皿。左手拿培养皿，并用拇指将皿盖打开一缝，再火焰旁右手持无菌玻璃涂棒将菌液自平板中央均匀向四周涂布扩散。注意，切忌用力过猛，这样会将菌液直接推向平板边缘或将培养基划破。3培养 接种后，平版倒置于30度恒温箱中，培养2~3天，观察结果。 4纯化 用接种环挑取单个单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后分离得到单个菌落。 酵母扩培方案 一、培养基制备 (一)麦芽汁培养基的配制 1．培养基成分 新鲜麦芽汁一般为10-15波林。 2．配制方法 (1)用水将大麦或小麦洗净，用水浸泡6-12h，置于15℃阴凉处发芽，上盖纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，让其停止发芽，晒干或烘干，研磨成麦芽粉，贮存备用。 (2)取一份麦芽粉加四份水，在65℃水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化，直
酵母菌培养基的培养技术
酵母菌的培养技术 一.酵母菌的培养基的配方 1.麦芽汁培养基的配制 培养基成分:新鲜麦芽汁一般为10-15波林。 配制方法:(1)用水将大麦或小麦洗净，用水浸泡6-12h，置于15℃阴凉处发芽，上盖纱布，每日早、中、晚淋水一次，待麦芽伸长至麦粒的两倍时，让其停止发芽，晒干或烘干，研磨成麦芽粉，贮存备用。 (2)取一份麦芽粉加四份水，在65℃水浴锅中保温3-4h，使其自行糖化，直至糖化完全(检查方法是取0.5ml的糖化液，加2滴碘液，如无蓝色出现，即表示糖化完全) (3) 糖化液用4-6层纱布过滤，滤液如仍混浊，可用鸡蛋清澄清(用一个鸡蛋清，加水20 m1，调匀至生泡沫，倒入糖化液中，搅拌煮沸，再过滤)。 (4)用波美比重计检测糖化液中糖浓度，将滤液用水稀释到10-15波林，调pH至6.4。如当地有啤酒厂，可用未经发酵，未加酒花的新鲜麦芽汁，加水稀释到10-15波林后使用。 (5)如配固体麦芽汁培养基时，加入2％琼脂，加热融化，补充失水。 (6)分装、加塞、包扎。 (7)高压蒸汽灭菌100 Pa灭菌20 min。 2.马铃薯葡萄糖培养基的配制 培养基成分:马铃薯20g 葡萄糖2 g 琼脂1.5-2g 水100ml 自然pH 配制方法:(1)配制20％马铃薯浸汁取去皮马铃薯200g，切成小块，加水1000m1。80℃浸泡lh用纱布过滤，然后补足失水至所需体积。100 Pa灭菌20 min。即成20％马铃薯浸汁，贮存备用。 （2)配制时，按每100 m1马铃薯浸汁加入2g葡萄糖，加热煮沸后加入2g琼脂，继续加热融化并补足失水。 (3)分装、加塞、包扎。 (4)高压蒸汽灭菌100 Pa灭菌20 min。 3.豆芽汁葡萄糖培养基的配制
微生物菌种的分离和纯化方法
从混杂微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物分离与纯化。在分子生物学的研究及应用中，不仅需要通过分离纯化技术从混杂的天然微生物群中分离出特定的微生物，而且还必须随时注意保持微生物纯培养物的“纯洁”，防止其他微生物的混入。 1、用固体培养基分离和纯化 单个微生物在适宜的固体培养基表面或内部生长、繁殖到一定程度可以形成肉眼可见的、有一定形态结构的子细胞生长群体，称为菌落。当固体培养基表面众多菌落连成一片时，便成为菌苔。不同微生物在特定培养基上生长形成的菌落或菌苔一般都具有稳定的特征，可以成为对该微生物进行分类、鉴定的重要依据。大多数细菌、酵母菌、以及许多真菌和单细胞藻类能在固体培养基上形成孤立的菌落，采用适宜的平板分离法很容易得到纯培养。所谓平板，即培养平板的简称，它是指固体培养基倒入无菌平皿，冷却凝固后，盛固体培养基的平皿。这方法包括将单个微生物分离和固定在固体培养基表面或里面。固体培养基用琼脂或其它凝胶物质固化的培养基，每个孤立的活微生物体生长、繁殖形成菌落，形成的菌落便于移植。最常用的分离、培养微生物的固体培养基是琼脂固体培养基平板。这种由Kock建立的采用平板分离微生物纯培养的技术简便易行，100多年来一直是各种菌种分离的最常用手段。1.1 稀释倒平板法 首先把微生物悬液作一系列的稀释（如1:10、1:100、1:1000、1:10000），然后分别取不同稀释液少许，与已熔化并冷却至50℃左右的琼脂培养基混合，摇匀后，倾入灭过菌的培养皿中，待琼脂凝固后，制成可能含菌的琼脂平板，保温培养一定时间即可出现菌落。如果稀释得当，在平板表面或琼脂培养基中就可出现分散的单个菌落，这个菌落可能就是由一个细菌细胞繁殖形成的。随后挑取该单个菌落，或重复以上操作数次，便可得到纯培养。 1.2 涂布平板法 因为将微生物悬液先加到较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，且采用稀释倒平板法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中常用的纯种分离方法是涂布平板法。其做法是先将已熔化的培养基倒入无菌平皿，制成无菌平板，冷却凝固后，将一定量的微生物悬液滴加在平板表面，再用无菌玻璃涂棒将菌液均匀分散至整个平板表面，经培养后挑取单个菌落（图1）。
酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵3(DOC)
酵母菌的分离鉴定、固定化及酒精发酵 吴英玲 10197020 10生物创新班 摘要：酵母菌喜欢酸性环境，可利用乳酸豆芽葡萄糖培养基富集培养酵母菌，然后在YPG培养基上用划线法分离纯化出酵母菌。将分离的酵母菌转接于YPG斜面培养基上培养，待长好后置于冰箱内 4 ℃下保存。用TTC显色剂及杜氏小管观察法筛选出发酵能力高的酵母菌。并通过菌落形态、细胞形态、生化分析及分子生物学手段进行微生物鉴定。采用PVA-海藻酸钠固定化技术固定酵母细胞进行酒精发酵。 关键词：酵母菌分离鉴定固定化酒精发酵 Abstract: Yeast like acid environment, the use of lactic acid glucose medium enrichment culture yeast, bean sprouts and purification by marking method on the YPG culture medium of yeast will transfer separation of the yeast in the YPG cant medium cultivation, staying long placed in the refrigerator after use the TTC chromogenic agent, save and duchenne tubular observation screen high fermentation ability by colony morphology of yeast cell morphological and biochemical analysis and molecular biology means to identify the microorganisms using PVA - sodium alginate immobilized technology fixed yeast cells for ethanol fermentation。 前言 酵母菌（yeast）是一类单细胞真菌。一般呈圆形、卵圆形、圆柱形，其菌落呈乳白色或红色，表面湿润、粘稠，易被挑起。酵母菌多数为腐生，专性或兼性好氧，广泛生长在偏酸性的潮湿的含糖环境中，例如水果、蔬菜、蜜饯的内部和表面以及在果园土壤中最为常见。酵母菌在有氧环境下将葡萄糖转化为水和二氧化碳，主要用于馒头、面包等食品发酵；在工业上，酿酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）将葡萄糖、果糖、甘露糖等单糖吸
酵母菌的分离纯化实验方案
酵母菌的分离纯化 ?实验目的 1.了解培养基的配置与灭菌技术； 2.无菌操作技术； 3.工业微生物的分离与纯化技术； 4.工业微生物的检测及保藏。 ?基本原理 1、培养基是人工配置的用于培养、分离、鉴定和保存各种微生物的营养基质。也适合微生物在生命活动中积累各种代谢产物。由于微生物种类不同，营养类型各异以及实验目的不同，因此培养基的种类也很多。不同微生物对营养的要求不同，在配置时根据微生物对PH 的要求选择合适的PH。由于本次实验主要是分离纯化酵母菌，所以配置的培养基是适合酵母菌生长麦芽汁平板培养基，同时添加抗生素抑制霉菌及其它菌的生长。 2、接种和培养过程中必须保证不被其它微生物所污染，关键在于严格进行正确的无菌操作，但是绝对无菌是不可能的，只能人工创造相对无菌的环境。所以本次实验无菌操作是在超净工作台的酒精灯火焰旁进行。 3、把特定微生物从混杂的微生物群体中分离出来而获得某一种或某一株微生物的过程叫微生物的分离与纯化。首先根据其生长特性设计只利于此菌生长的条件，再根据各种稀释法使他们在固体培养基上单独长成菌落。分离纯化的方法通常有：稀释混合倒平板法、稀释涂布平板法和平板划线。此次实验采用梯度稀释涂布平板法。 4、微生物检测项目最常用的是细胞数的检测，方法比较多，主要有显微镜直接计数法、平板菌落计数法（CFU）、光电比浊计数法等。本次实验设计酵母菌的数量检测，选用显微镜直接计数法和平板菌落计数法。
实验器材 仪器设备 恒温水浴锅、电热干燥箱、蒸汽灭菌锅、超净工作台、恒温培养箱、恒温摇床、水浴锅、电炉、铜锅、酒精灯、接种环、电子天平、研钵、光学显微镜、血细胞计数器 玻璃器皿 烧杯、锥形瓶、大小试管、培养皿、漏斗、三角涂棒、吸管、试管架、玻璃涂棒、盖玻片 试剂与材料 苹果、大麦芽、琼脂、蒸馏水、碘液、抗生素、染色液 其它 纱布、滤纸 实验内容及操作步骤 (一)、样品的选择 酵母菌一般在果园的土壤中或者水果的表面含量较多，因此选择苹果为样品。（二）、样品的处理 制备苹果悬液 1.首先将1g苹果在研钵中磨细，放入装有10ml生理盐水和玻璃珠的100ml三角瓶中去。 2.激烈震荡约10min,使菌体分散并悬浮与液体中。 3.用无菌吸管吸取1ml苹果悬液注入盛有9ml生理盐水的试管中，吸取三次并混匀。 4.再去一只无菌吸取管，从此试管中吸取1ml，注入另一盛有9ml生理盐水的试管中，取 三次并混匀。 5.同法类推制成10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的各种稀释度的苹果悬液。
酵母菌的分离纯化.
酵母菌的分离纯化、固定化和酒精发酵 第一部分酵母菌的分离纯化 一、实验目的 应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。 二、实验原理 酵母菌常见于含糖份比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适pH为4.5-6.0.酵母菌生长迅速，容易分离培养。在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。 三、器材和用品 1、甘蔗、苹果皮、葡萄皮、果园土、菜园土等。 2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基：马铃薯200g（煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g，水1000ml，pH自然。分装三角瓶；试管斜面1支/组 3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液：配方同上，不加琼脂加乳酸，按1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为5.5左右，再分装试管9ml2支/组。 4、无菌吸管3支/组、无菌培养皿、100ml无菌水1瓶/组、涂棒、美兰染液、显微镜、接种环等。 四、实验方法 1、接种：取果皮（不需冲洗）或土壤5克，加入到100ml无菌水中，充分搅拌后，用无菌吸管取1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h，可见培养液变浑浊。 2、加富培养：用无菌吸管取上述培养液1m l，注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在28-30℃培养箱中培养24h。 3、镜检：用无菌操作法用接种环取少量菌液置于载玻片上，中央滴一滴美兰染液，混合均匀后制成水浸片，在高倍镜下观察酵母菌的形态及出芽方式，并可根据菌体是否染色来区分酵母菌的死活细胞，因活细胞使美兰染液还原，故菌体不着色。 4、涂皿：用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用无菌吸管取0.1ml 加富培养液到平板中，用涂棒涂匀后培养24h。 5、分离纯化：用接种环挑取单个酵母菌菌落，在平板上四区划线，培养后
酵母菌的培养与分离
. . . 微生物学大实验 实验指导 编者： 生物技术教研室 2007.3
目录 实验一酵母菌的培养与分离‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥2 实验二酵母菌的鉴定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥7 实验三酵母菌耐受能力的测定‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥19 实验四酵母菌发酵工艺条件的优化‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥22 实验五耐高温酵母菌株的诱变选育‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥24 实验六酿酒酵母细胞固定化与酒精发酵‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥‥27
耐高温酒精酵母菌的选育及发酵条件的研究 实验一酵母菌的培养与分离 一、实验目的 学习培养和分离酵母菌的技术和方法 二、基本原理 大多数酵母菌为腐生，其生活最适pH为4.5－6，常见于含糖分较高的环境中，例如果园土、菜地土及果皮等植物表面。酵母菌生长迅速，易于分离培养，在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长得快。 利用酵母菌喜欢酸性环境的特点，常用酸性液体培养基获得酵母菌的培养液（这样做的好处是酸性培养条件则可抑制细菌的生长），然后在固体培养基上用划线法分离之。 三、实验主要内容和要求 （一）本次实验的方案由同学们自己制定，实验包括： 1．马铃薯葡萄糖培养基, 乳酸马铃薯葡萄糖培养液的配制。 2.菌株的筛选,根据一定的生产目的并从特定的样品筛选出高产酒精的适宜的酵母菌株。 3.酵母菌的分离,要求接种一次, 28-30℃，培养24小时，转接一次，28-30℃，培养24小时，并用镜检的方法独立判定所分离菌株是否为酵母菌。 4.用划线分离法对酵母菌进行纯化，要求每组挑取单个菌落，连续划线分离4代，镜下为单一纯菌株，每组扩繁10支斜面菌种，备用。 四、实验的准备 1、甘蔗、成熟葡萄或苹果等果皮、0.1%美蓝染液、1ml的无菌吸管、无菌培养皿等。 2、马铃薯葡萄糖琼脂培养基： 原料：马铃薯（200克）、葡萄糖（20克）、琼脂（15-20克）、蒸馏水（1000ml）。 配制方法： （1）先将马铃薯去皮，切片，称200克并加蒸馏水1000ml，煮沸半小时，用纱布过滤，补足蒸馏水量至1000ml ，制成20%的马铃薯汁。 （2）在20%的马铃薯汁中加入琼脂，煮沸溶化，补足水分并在115℃条件下高压灭菌20分种。 （3）加入葡萄糖，制成培养酵母菌的马铃薯葡萄糖琼脂培养基。
果皮上酵母菌的分离与提纯
果皮中酵母菌的分离与纯化 一、实验目的 应用酵母菌的生理生化和生态学的特点，从自然环境中分离酵母菌，并掌握微生物分离纯化的基本方法。 二、实验原理 酵母菌常见于含糖比较高的环境中，如果园土、菜园土及果皮等的表面。多数酵母菌喜欢偏酸条件，最适 pH 为 4.5- 6.0.酵母菌生长迅速，容易分离培养。在液体培养基中，酵母菌比霉菌生长快，利用酸性条件则可以抑制细菌的生长。因此常用酸性液体培养基获得酵母菌的加富培养，然后在固体培养基上划线分离纯化。 三、器材和用品 1、苹果皮、葡萄皮等。 2、马铃薯葡萄糖 xx 培养基： 马铃薯200g （煮开10min后过滤取汁），葡萄糖20g，琼脂20g,水 1000ml， pH 自然。 3、乳酸马铃薯葡萄糖培养液： 配方同上，不加琼脂加乳酸，按 1000ml培养基加入5ml乳酸，pH为 5.5 左右。 4、无菌吸管、无菌培养皿、涂布棒、美兰染液、显微镜、接种环等。 四、实验方法 1 、接种： 取果皮（不需冲洗） 5 克，加入到 100ml 无菌水中，充分搅拌后，用无菌吸管取
1ml接入到9ml乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在 28-30C培养箱中培养24h- 48h,可见培养液变浑浊。 2、xx培养： 用无菌吸管取上述培养液1ml,注入另1管乳酸马铃薯葡萄糖培养液中，在 28-30C培养箱中培养24h-48h。 3、分离纯化 : 用 1ml 的无菌吸管单独吸取上述培养液至 9ml 的无菌水中便是 10-1 如此稀释 10- 2、 10-3。马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板，用1ml的无菌吸管吸取10-3 培养液至培养基表面,用无菌的玻璃刮产迅速涂抹均匀,而后做好标记放置恒温箱培养大约 24-48小时（培养皿倒置）,菌落长出后,观察菌落,并镜检菌体,一般一个单独的菌落可视为一个细胞发育而来,是纯培养,如果结果复杂,未得纯培养,可进行再次分离培养（划线法）,直到纯化为止（注意保藏菌种），对纯化菌种再次固体培养 24h-48h,观察菌落特征（特征： 菌落质地是否为奶酪状、粘液状。菌落颜色常为乳白色、奶油色、红色等。菌落表面是否反光或暗淡,是否平滑或粗糙,有无纹状皱折或疣状突起, 菌落边缘是否光滑。）以及是否有酒香味。并拍照。 3、分离纯化： 用马铃薯葡萄糖琼脂培养基溶化后制成平板,用无菌吸管取 0.1ml加富培养液到平板中，用涂棒涂匀后培养 24h-48h。然后用接种环挑取单个酵母菌菌落,在平板上四区划线,培养后分离得到单个菌落。 4、镜检： 挑取单菌落,制片观察其形态（美兰染色水浸片）。观察记录（拍照）细胞的 形态、大小和出芽方式。