糖蜜酒精废液诱导康氏木霉产纤维素酶的研究

广西大学

硕士学位论文

糖蜜酒精废液诱导康氏木霉产纤维素酶的研究

姓名：林元山

申请学位级别：硕士

专业：发酵工程

指导教师：梁智群

20040501

广两人学硕十论文糖蜜酒精废液诱导康氏木霉产纤维素酶的研究糖蜜酒精废液诱导康氏木霉产纤维素酶的研究

摘要

糖蜜酒精废液是糖厂的主要污染源之一，是一种深褐色、高酸性、高浓度有机废水。广西大学食品与发酵工程所研究其综合治理时，发现糖蜜酒精废液有促进康氏木霉产纤维素酶的作用，本论文为此作了深入研究。

论文研究了糖蜜酒精废液诱导下的纤维素酶酶学特性：ＦＰ，ＥＧ，ＢＧ，ＣＢＨ酶的最适ｐＨ分别为４．８，４．８，４．８，５．０；最适作用温度分别为５０。Ｃ，７０℃，６０℃，５５℃；测定了ＣＢＨ，ＥＧ，ＢＧ酶的米氏常数；探讨了底物浓度、稀释倍数、金属离子等因素对ＦＰ，ＥＧ，ＢＧ，ＣＢＨ酶的影响。

论文分离纯化了纤维素酶：ＥＧ，ＢＧ酶经ＤＥＡＥＣ５２，ＣＬ．６Ｂ柱层析分离，酶活力最终回收率分别为２．０６％，６５．１１％，纯化倍数分别为２４．５５、１６９．８４，比活力分别达１８９．４８ＩＵ／ｍｇ蛋白，６５６．２８ＩＵ／ｍｇ蛋白。ＣＢＨ酶经ＤＥＡＥ．Ｃ５２分离，回收率和纯化倍数分别为８５．６ｌ％，３１．５６。

论文研究分析了糖蜜酒精废液的诱导机理：表明糖蜜酒精废液对纤维素酶的产生具有诱导效应，而非营养因素的作用；其ＦＰ酶活力是Ｍａｎｄｅｌｓ营养液的４．８倍；ＥＧ，ＢＧ，ＣＢＨ酶活力是Ｍａｎｄｅｌｓ营养液的３～５倍。经电泳测定，糖蜜酒精废液诱导康氏木霉大量表达胞外蛋白Ｐ＂～，Ｐ７２９；胞外蛋白Ｐ＂一，Ｐ７２。９不具有ＥＧ，ＢＧ，ＣＢＨ酶活性，即无纤维素酶活性。

关键词：纤维素酶酶活力糖蜜酒精废液Ｍａｎｄｅｌｓ营养液分离纯化诱导

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ＳＴＵＤＩＥＳＯＮＣＥＬＬＵＬＡＳＥＩＮＤＵＣＥＤＢＹ

ＷＡＳＴＥＭＯＬＡＳＳＥＳＯＦＥＴＨＡＮＯＬＦＲＯＭ

ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａＫｎｏｎｉｎｇｉｉ

ＡＢＳＴＲＡＣＴ

Ｔｈｅｗａｓｔｅｍｏｌａｓｓｅｓｏｆｅｔｈａｎｏｌ，ｄｅｅｐｂｒｏｗ，ｈｉｇｈａｃｉｄ，ｃｏｎｄｅｎｓｅｄｗａｓｔｅｏｒｇａｎｉｃｗａｔｅｒ，ｉｓｏｎｅｏｆｔｈｅｍａｉｎｐｕｏｌｌｕｔｉｏｎｓｏｕｒｓｅｓｆｒｏｍｓｕｇａｒｒｅｆｉｎｅｒｉｅｓＤｕｒｉｎｇｔｈｅｃｏｍｐｒｅｈｅｎｓｉｖｅｄｉｓｐｏｓａｌｏｆｔｈｅｗａｓｔｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｂｙＦｏｏｄａｎｄ

Ｆｅｒｍｅｎｔａｔｉｏｎ

ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇＩｎｓｔｉｔｕｔｅｏｆＧｕａｎｇｘｉＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙ，ｔｈｅｗａｓｔｅｍｏｌａｓｓｅｓｏｆｅｔｈａｎｏｌｗａｓｆｏｕｎｄｔｏｂｅｈｅｌｐｆｕｌｔｏｔｈｅｅｘｃｒｅｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｕｌａｓｅｆｒｏｍＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａＫｎｏｎｉｎｇｉｉ．ＴｈｅｆｕｒｔｈｅｒｓｔｕｄｉｅｓｏｎｃｅｌｌｕｌａｓｅｆｒｏｍＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａＫｎｏｎｉｎｇｉｉａｆｆｅｃｔｅｄｂｙｔｈｅｗａｓｔｅａｒｅａｃｈｉｅｖｅｄｉｎｔｈｉｓｔｈｅｓｉｓ

Ｆｉｒｓｔｌｙ，ｔｈｅｅｎｚｙｍｉｃｃｈａｒａｃｔｅｒｉｓｔｉｃｓｏｆｃｅｌｌｕｌａｓｅｆｒｏｍｗａｓｔｅｍｏｌａｓｓｅｓ

ｄｅｔｅｒｍｉｎｅｄｉｎｔｈｉｓｔｈｅｓｉｓ．Ｔｈｅｍｅｄｉｕｍ，ｉｎｃｌｕｄｉｎｇＦＰ，ＥＧ，ＢＧａｎｄＣＢＨａｒｅ

ｏｐｔｉｍｕｍｐＨｆｏｒｃａｔａｌｙｚｅｄｒｅａｃｔｉｏｎｓｏｆＦＰ，ＥＧ，ＢＧａｎｄＣＢＨａｒｅ４．８，４．８，４．８，５．０，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｏｐｔｉｍｕｍｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅｆｏｒｃａｔａｌｙｚｅｄｒｅａｃｔｉｏｎｓｏｆＦＰ，ＥＧ，ＢＧａｎｄＣＢＨａｒｅ５０。Ｃ，７０。Ｃ，６０。Ｃ，５５。Ｃ，ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．ＴｈｅｍｉｃｈａｅｌｉｓｃｏｎｓｔａｎｔｏｆＥＧ，ＢＧａｎｄＣＢＨ，ａｓｗｅｌｌａｓｔｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｓｕｂｓｔｒａｔｅｓ，ｄｉｌｕｔｉｏｎｓａｎｄｉｏｎｓＯＩ＇１ＦＰ，ＥＧ，ＢＧａｎｄＣＢＨａｒｅａｓｓａｙｅｄ

ＳｅｃｏｎｄｌＮｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎａｎｄｉｓｏｌａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｕｌａｓｅａｒｅｐｅｒｆｏｒｍｅｄｉｎｔｈｅｔｈｅｓｉｓ．Ｂｙｍｅａｎｓｏｆａｍｍｏｎｉｕｍｓｕｌｐｈａｔｅｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ，ａｎｉｏｎｅｘｃｈａｎｇｅｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙｃｏｌｕｍｎＤＥＡＥｃｅｌｌｕｌｏｓｅ５２ａｎｄＤＥＡＥｓｅｐｈａｒｏｓｅＣＬ一６Ｂ，ｔｈｅｒｅｃｏｖｅｒｉｅｓｏｆＥＧａｎｄＢＧｒｅａｃｈ２．０６％ａｎｄ６５．１１％．ｐｕｒｉｔｙｏｆＥＧａｎｄＢＧｒｅａｃｈ２４．５５ｔｉｍｅｓａｎｄ１６９．８４ｔｉｍｅｓ，ｓｐｅｃｆｉｃａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＥＧａｎｄＢＧｒｅａｃｈ

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ｌ８９．４８１Ｕｐｅｒｍｇｐｒｏｔｅｉｎａｎｄ６５６．２８ＩＵｐｅｒｍｇｐｒｏｔｅｉｎ，ｒｅｓｐ?ｅｃｔｉｖｅｌｙＴｈｉｒｄｌｙ，ｔｈｅｍｅｃｈａｎｉｓｍｏｆｃｅｌｌｕｌａｓｅｉｎｄｕｃｅｄｂｙｗａｓｔｅｍｏｌａｓｓｅｓｏｆｅｔｈａｎｏｌｆｒｏｍＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａＫｎｏｎｉｎｇｉｉｉｓｉｎｖｅｓｔｉｇａｔｅｄ．Ｉｔ’ＳｔｈｅｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔｎｏｔｆｕｎｃｔｉｏｎｏｆｎｏｕｒｉｓｈｍｅｎｔｔｈａｔｃｅｌｌｕｌａｓｅｉｓｅｘｃｒｅｔｅｄｅｘｃｅｓｓｉｖｅｌｙｆｒｏｍＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａＫｎｏｎｉｎｇｉｉｏｎｔｈｅｍｅｄｉｕｍｏｆｗａｓｔｅｍｏｌａｓｓｅｓ，ＴｈｅａｃｔｉｖｉｔｙｏｆＦＰｉｓ４．８ｔｉｍｅｓａｓｍｕｃｈａｓｔｈａｔｏｆＭａｎｄｅｌｓｍｅｄｉｕｍ，ｃｏｍｐａｒａｔｉｖｅｗｉｔｈＥＧ，ＢＧａｎｄＣＢＨａｒｅ３ｔｏ５ｔｉｍｅｓａｓｍｕｃｈａｓｔｈａｔｏｆＭａｎｄｅｌｓｍｅｄｉｕｍ．ＡｎａｌｙｚｅｄｂｙＳＤＳ—ＰＡＧＥ，ｗａｓｔｅｍｏｌａｓｓｅｓｏｆｅｔｈａｎｏｌｃａｎｉｎｄｕｃｅｔｗｏｐｒｏｔｅｉｎｓ

８ａｎｄｏｖｅｒ－ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｆｒｏｍＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａＫｎｏｎｉｎｇｉ．Ｔｈｅｓｅｐｒｏｔｅｉｎｓ，ｎａｍｅｄｐｔ７

Ｐ７２９ａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｍｏｌｅｃｕｌａｒｗｅｉｇｈｔ１７．８ＫＤ，７２．９ＫＤｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ，ｈａｖｅｎｏａｃｔｉｖｉｔｉｅｓｏｆＥＧ，ＢＧａｎｄＣＢＨ．Ｓｏｐ１７．８ａｎｄＰ７２‘。ｈａｖｅｎｏｔａｃｔｉｖｉｔｙｏｆｃｅｌｌｕｌａｓｅ．Ｔｈｅｙａｒｅｎｏｔｃｅｌｌｕｌａｓｅ．

ＫＥＹＷＯＲＤＳ：ｃｅｌｌｕｌａｓｅｗａｓｔｅｍｏｌａｓｓｅｓｏｆｅｔｈａｎｏｌａｃｔｉｖｉｔｙｉｓｏｌａｔｉｏｎ

Ｍａｎｄｅｌｓｓｏｌｕｔｉｏｎ

ｐｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎｉｎｄｕｃｅｍｅｎｔ

第一章综述

１．１糖蜜酒精废液的来源及综合治理

１１１糖蜜酒精废液的产生

糖蜜酒精废液是甘蔗制糖过程中产生的废糖蜜，经发酵成熟后的废液在蒸馏塔馏出酒精后排放的废液（废醪）。它排放量大，是制糖工业最严重的污染源。据报道我国酒精工业排放的高浓度废水每年达５，０００万吨…，排放的ＣＯＤ约３６０万吨，排放的ＢＯＤ约ｌ８０万吨，约占全国工业废水ＣＯＤ和排放总量的１／８。每生产１吨酒精排出的废液为１３～１５吨，仅广西壮族自治区每年排出的酒精废液多达２２０万吨。一个每天生产２０吨的酒精＿ｒ‘排出的洒精废液卡同当于一个５０万人口城市的污水排放程度【２】。

糖蜜酒精废液含有丰富的有机物及矿物质，属无毒、有害、高浓度的有机废水，其主要成分见表１．１，ｌ一２，１—３”Ｊ。

这种糖蜜酒精废液的ＣＯＤｃｒ含量高达４～７万ＩＴＩ【ｇ／Ｌ，ＢＯＤ５含量高达２～４万ｍｇ／Ｌ，ｐＨ３，５～４，Ｊ禹超高浓度有机酸性废液，是利用糖蜜生产酒精工厂的主要污水。虽然这种废液无毒，但大量废液排入江河，使江河缺氧，鱼虾绝迹，河水发臭，造成严重的环境污染。另外，废液中含有约１０％具有肥效的各种有机物质咀及钙、镁、氮、磷、钏、锰和其它微量元素，尤其钾最为丰富，直接排放浪费大量有用资源１４Ｊ。

表１－１糖蜜酒精废液趵主要组成

ＴａｂｌｅＩ—ｌＴｈｅｍａｉｎｉｎｇｒｅｄｉｅｎｔｓｉｎｗａｓｔｅｍｏｌａｓｓｅｓｏｆｅｔｈａｎｏ

表ｌ－２糖蜜酒精废中液微量元素的舍量

Ｔａｂｌｅ１－２Ｔｒａｃｅｅｌｅｍｅｎｔｓｉｎｗａｓｔｅｍｏｌａｓｓｅｓｏｆｅｔｈａｎｏｌ

表１．３糖蜜酒精废液中氨基酸含量

ＴａｂｉｅＩ－３Ｔｈｅｃｏｎｔｅｎｔｏｆａｍｉｎｏａｃｉｄｓｉｎｗａｓｔｅｗａｔｅｒｏｆｍｏｌａｓｓｅｓｅｔｈａｎｏ

１１２糖蜜酒精废液的处理

日前糖蜜酒精废液的处理方法有：

（１）生化处理法ｆ５Ｊ。包括氧化塘法，使ＣＯＤ、ＢＯＤ下降５０％，该法是广西各糖厂使用最多的方法，有５０家糖厂使用。厌氧生化处理法，用于高浓度的有机废水厌氧处理。好氧生化处理法，借助好氧微生物的作用来进行，一般适用于处理中、低浓度的有机废水。厌氧～好氧生化法。对糖蜜酒精废液来说，用单级工艺处理很难达到排放标准，一般工厂都采用厌氧一好氧生化法。

（２）生产单细胞蛋白，配成饲料【５４Ｊ。杨斌、高孔荣等人报道，采用膨化预处理的蔗渣（１．６ＭＰａ）进行酶解，纤维素转化率达８２．９％。迸一步利用热带假丝酵母（ＡＳ２６７３）间隙发酵，对糖的转化率为５３．０％，蛋白质含量为５４．４％…Ｊ。陈红征，刘勇，申彤等利

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用甜菜糖蜜酒精废液实验生产菌体蛋白，经菌体细胞繁殖后，粗蛋白含量为４１．７％Ｉ＂。

（３）生产有机肥１８“。发酵废液中含有大量有机物及丰富的氮、磷、钾、钙、镁、铜、锌、铁、锰、硼等植物营养元素，充分合理利用这些肥料资源，是目前酒精废液治理中应用最为广泛的方法，也是今后最有发展潜力的途径。日本曾经试图以废糖蜜为原料的发酵产品废液，经浓缩后作为饲料，但由于含钾量太高而不适宜。同本国内缺乏钾的资源，要由国外进口。因此，将含有丰富钾元素的废液作为肥料加以利用，日前该固的产量发展到年产有机混合肥料１４０，ｏｏＯ吨。

（４）农阳灌溉法［５１。该法是根据糖蜜酒精废水有机成分为５％～９％，以及含氮、钾等特点，经简单处理后，可灌溉农田，是较好的肥料。在巴西、澳大利亚、古巴、印度和我因等国家均采用这一方法治理废水，并有多年经验。但该法处理不好，会烧坏农作物，污染地下水。

（５）焚烧处理【４－ｔｏ］。将糖蜜酒精废液浓缩至ｆＪ６０Ｂｘ糖蜜酒精废液可以燃烧，着火温度约为６００。Ｃ～７００℃，热值与甘蔗渣相当，浓缩后的糖蜜酒精废液作为锅炉的主要燃料，甘蔗渣掺兑糖蜜酒精废液进行高温焚烧，达到零排放的目的；燃烧过程产生的热量经锅炉产生蒸汽，供酒精生产工艺用汽及浓缩酒精废液用汽，此处理系统产出的副产品，对附近农业的发展会产生积极的作用，能够达到治理与利用的双重目的，使工厂在治理中得到经济效益。

１．２纤维素酶酶系的作用方式

纤维素（Ｃｅｌｌｕｌｏｓｅｌ是地球上最丰富的有机物质，植物界中碳素的一半以上存在于纤维素中。植物通过光合作用，生产地球上最丰富、最廉价的纤维素资源，全世界每年植物体生成量高达１，５００亿吨干物质，其中纤维素及半纤维素的总量为８５０亿吨Ｉｌ“。山于纤维素具有水不溶性的高结晶构造，其外围又被木质素层包围着，要把它水解成可利用的葡萄糖相当困难，所以到目前为止仍没有得到很好地利用。它是由Ｄ一葡萄糖以Ｂ．１，４糖苷键联结而成，直链状大分子纤维素折叠起来，形成具有高结晶的基本构成单位，由这种基本构成单位集中起来构成微小的结构单位，再由很多的微小单位构成纤维素【１３—１６１。

１２１纤维素酶的组成

纤维素酶（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，不是单一酶，而是起协同作用的多组分酶系。至今，已有很多关于纤维素酶生产菌的报道，纤维素酶

的来源非常广泛，昆虫、软体动物、原生动物、细菌、放线菌和真菌等都能产生纤维素酶；但对纤维素作用较强的菌株多是木霉ｆ＝霭（Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａ）、曲霉属“胖俘胁）、青

霉届（Ｐｅｎｉｃｉｌｌｉｕｍ）、Ｐｅｌｌｉｅｎｌａｌｉａ属和枝顶孢霉属ａｃｒｅｍｏｎｉｕｍ）的菌株，特别是绿色术霉（７’ｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｖｉｒｄｅ）及其近缘的菌株１１７－２０１。

１９５０年，Ｒｅｅｓｅ等曾阐明没有一种纤维素酶生产菌能生产出分解棉花中的天然纤维素的酶，但发现有的菌株生产的酶能分解膨润的纤维素或纤维素诱导体等非晶体性纤维素，因而提｝｝｛了由于天然纤维素的特异性而必须以不同的酶协同作用才能分解的ｃ．一Ｃｘ假说１２“。这个假说认为：当纤维素酶作用时，首先对纤维素的ｃ．组分起作用，继而使Ｃｘ纽分变成纤维低聚糖，再由Ｂ．葡萄糖苷酶分解成葡萄糖。

关于Ｃｌ—ｃｘ酶的假说尚有争议Ｉ”Ｊ。目前比较公认的，分为以Ｆ三大类陟”Ｊ：（１）葡聚糖内切酶ｆ１，４－Ｂ－Ｄ．ｇｌｕｃａｎｇｉｕｅａｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ或ｅｎｄｏ—ｌ，４．１３一Ｄ—ｇｌｕｃａｎａｓｅ，Ｅ．Ｃ３．２．１．４，Ｃｘ酶或ＣＭＣ酶，简称ＥＧ），这类酶一般作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解Ｂ．１，４一糖苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素：（２）葡聚糖外切酶（１，４一ｅ—Ｄ—ｇｌｕｃａｎｅｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ或ｅｘ０１，４一Ｂ—Ｄ—ｇｌｕｃａｎａｓｅ，Ｅ．Ｃ３．２．１．９１，也称ｃ，酶或外切纤维二糖水解酶，简称ＣＢＨ），这类酶作用于纤维素线状分子术端，水解Ｂ．１，４．糖苷键，每次切下一个纤维二糖分子，故又称为纤维二糖水解酶（ｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ）：（３）１３一葡聚糖苷酶（Ｂ—ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，Ｅ．Ｃ３．２．１．２１，纤维二糖酶，简称ＢＧ）．这类酶一般将纤维二糖水解成葡萄糖分子。

１．２．２纤维素酶的作用方式

因纤维素酶组分多，酶系复杂，纤维素酶降解纤维素为葡萄糖的细节至今仍然不清楚，许多研究者提出了不同的看法，主要有：

（１）Ｃ１一Ｃｘ假说

Ｒｅｅｓｅ提出的Ｃ。－Ｃｘ假说，通过对大量的微生物比较研究，认为ｃＩ酶首先作用于结晶纤维素，使其改变成可被Ｃｘ酶作用的形式；Ｃｘ酶随机水解非结晶纤维素、可溶性纤维素衍生物和葡萄糖的０．１，４．寡聚物；Ｂ．葡萄糖苷酶将纤维二糖、纤维三糖水解成葡萄糖。但是在随后几十年的研究中，Ｒｅｅｓｅ提出的Ｃｌ—Ｃｘ酶分阶段水解纤维素的设想在实验中并未碍到证实。

（２１顺序作用模式

ＰｅｒｔｅｒｓｓＯｎ等人口４１报道，在水解天然纤维素中，起关键作用的Ｃｌ酶实际上是外切型６．１，４一葡聚糖纤维二糖水解酶，并提出天然纤维素的水解是从内切型１３－１，４一葡聚糖酶（Ｃｘ）丌始的。ｃｘ酶首先在微纤维上一些特定的薄弱位置把纤维素分子链打开，Ｃｌ酶接着深入到纤维素分子链内把氢键断开，这样就使一段段纤维断片从微纤维上脱落下来，脱落的纤维素断片再经Ｃｘ酶和Ｂ．葡萄糖苷酶作用，形成葡萄糖。

（３）协同作用模式

ＭａｎｄｅＩｓ等［２５’２７】作了如下推测，认为首先由Ｃｌ和Ｃｘ酶形成复合体，共同对纤维素进

行水解，生成物放出时复合物解离，然后一个酶单独吸附到纤维素上，这种酶就不再有活性了。Ｗｏｏｄ等【２８ｌ还报道了好气真菌纤维二糖水解酶与厌氧真菌和厌氧细菌纤维素酶问的协同作用。中国科学院微生物所纤维素酶组报道１２９１，对于排列越是紧密的天然纤维素，ＣＩ－－Ｃｘ酶的协同作用就越显著。对棉花的协同效果为８倍，微晶纤维素３．４倍，而对磷酸膨胀纤维素则为１．７倍。关于纤维素酶协同作用，近些年有较多的研究和报道，认为纤维素酶酶系各组分共同作用时能将纤维素降解为水溶性产物，若将各组分分玎便失去这种能力，若将分离的各组分再按比例又可恢复这种能力。因此，目前最易接受的纤维素酶水解机理为：

结晶纤维素（Ｃｘｌ

』

Ｊ内切葡萄糖酶

ｌ

无定型纤维素或可溶性低聚糖

Ｊ

上

Ｊ纤维二糖水解酶

一一一一一纤维二糖（Ｃ２）

ｌ

ｌＢ葡萄糖苷酶

ｌ

一一一一葡萄糖（ＣＩ）

１３纤维素酶的研究进展

纤维素酶的发现比较早，１９０６年Ｓｉｌｌｉｅｒｅ在蜗牛的消化液中发现有纤维素酶，能分解天然纤维素。１９３３年Ｇｒａｓｓｍａｎ等研究了一种真菌的纤维素酶系，分辨出两个组分。１９４０～１９５０年对纤维素酶产生菌进行了大量的筛选分离工作。建立了比较完罄的分离筛选方法。至１９５０年Ｒｅｅｓｅ等提出了纤维素酶作用方式的Ｃｌ—Ｃｘ假说以后，开始转入纤维素酶的基础研究，包括纤维素酶的性质，作用方式，培养条件和测定方法等。１９６０年后，由于分离技术的发展，推动了纤维素酶的分离纯化方法，对纤维紊酶的组分、作用方式以及诱导作用等方面的研究进展比较快，并实现了纤维素酶制剂的工业生产，在应用上也取得了一定的成绩。目前有许多国家在进行纤维素酶的研究，其中美圈、日本、德国和英国等国家发展比较快，以纤维素转化成糖为主要目标，纤维素酶制剂的产量逐年增加。

７０年代以来，基因重组技术的迅速发展，纤维素酶的研究日新月异。由于丝状真菌木霉属能产生大量的胞外酸性纤维素酶，酶系较完全，并且对结晶纤维素有较好的

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酶解活性，其中对罩氏木霉（Ｔｒｉｃｋｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ）纤维素酶基因研究比较透彻，ｃｂｈＪ、ｃｂｈ１１、ｃｂｈＩＩＩ、ｃｂｈＩＶ、ｅｇＩ、ｅｇＩＩＩ、ｂｇ７个基因得到了克隆…】，但是纤维素酶在Ｅ．ｃｏｌｉ中的分泌表达水平很低。Ｇｏｄｂｏｌｅ等ｆ３２Ｊ将ＺｒｅｅｓｅｉｃｂｈＩ在酵母Ｐｉｃｈｉａｐ∞ｔｏｒｉｓ中成功转化并表达。细菌主要产中性纤维素酶和碱性纤维素酶。由于酶的耐热性在￡Ｌ产中具有实用意义，所以耐热细菌是研究的热点。Ｋｉｍ等【３２】克隆ＴＡｑｕｉｆｅｘａｅｏｌｉｃｕｓＶＦ５编码ＥＧ的ｃｅｌＳＹ基圉，在ＥｃｏｌｉＸＬｌ一Ｂｌｕｅ中表达成功。酶ＣＥＬ８Ｙ有很好的耐热性．最适作用温度｝［１ｐＨ分别为８０９Ｃ和７，０。而碱性纤维素酶由于在洗涤剂工业中有很好的应用价值，所以对其的研究也是热点之一，其产生菌主要集中在芽孢杆菌属。Ｈａｋａｍａｄａ等＂３’列Ｂａｃｉｌｌｕｓｃｉｒｃｕｌａｎｓ．ＫＳＭ—Ｎ２５７进行了研究，运用盒式连接介导ＰＣＲ￥口反向ＰＣＲ克隆到了编码Ｅｇｌ一２５７的基因ｅｇｌ一２５７，对ｅｇｌ－２５７全长基因序列分析表明，ｅｇｌ一２５７包含一个长度为１２２１ｂｐ的丌放读码框架，核苷酸链２４８位为ＡＴＧ起始密码子，１４６９位ＴＡＡ终止密码子。ＳｈｏｕＴａｋａｓｈｉｍａ等ｐ４１用麦芽糖作为主要碳源和诱导物，利用米曲霉Ｔａｋａ．ａｍｙｌａｓｅ启动子，建立。个米曲霉Ａｓｐｅｒｇｉｌｌｕｓｏｒｙｚａｅ宿主表达系统，使里氏木霉Ｔｒｉｃｈｏｄｅｒｍａｒｅｅｓｅｉ的纤维素酶基因（ｃｂｈＩ，ｅｂｈ２，ｅｇｌｌ，ｅｇｌ３，ｅｇｌ５，ｂｇｌ１）在该启动子控制之下并得以过量表达。

我困研究纤维素酶有几十年的历史，１９６０．１９９０年主要进行菌种筛选和纤维素酶的分离纯化工作，做了酶制剂的生产实验。纤维素酶在食品加：［、酿酒、饲料、纤维素糖化等方面的应用取得了一定的成绩。肖壮志等【３５ｌ采用刚果红染色法从ＺｒｅｅｓｅｉｃＤＮＡ文库中筛选到ＥＧＩＩＩ基因，转化到酿酒酵母中成功表达，比较了酿酒酵母的蛋白质分泌系统组分ＳＳ０２和ＳＥＢｌ对ＥＧ［１１分泌的影响，研究结果显示ｒｒｅｅｓｅｉｅｇＩＩＩ在酿酒酵母细胞中表达时，其ｍＲＮＡ５’端先导序列中可能存在影响该基因表达水平的调控序列。中科院微生物所和山东大学等单位还进行了纤维素酶的基础理论研究。

１．４纤维素酶的应用

ｌ，ｌｋ酶制剂的应用中相当普遍，尤其是稳定性好、活性高、特异性强的酶制荆更受欢迎，其发展相当迅速。１９９５年世界工业酶制剂市场有ｌＯ亿美元的市场份额，２０００年达１６亿美元，２００５年预计超过２０亿美元。６０％的酶制剂由欧洲生产，４０％产自美国和Ｈ本。大约７５％工业酶制剂是水解酶类。纤维素酶及半纤维素酶的应用始于上世纪８０年代初，首先用于动物饲料，其次是食品行业，后来用于纺织、洗涤、造纸等行业。近２０年来，纤维素酶、半纤维素酶、果胶酶的产量增加迅速，广泛用于纺织、食品、饮料、酿酒和造纸工业，约占整个工业酶制剂市场的２０％。这类工业酶￥Ｏ齐ｌＪ主要由木霉属和曲霉属生产ｍＪ。

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１．４１饲科工业

世界年产动物饲料６，０００亿吨，价值５００亿美元，９０％主要用于饲养禽类、猪、和反刍动物，１０％用于宠物和鱼类。纤维素酶和纤维素酶产生菌能转化粗饲料如麦秸、稻草、玉米等，把其中一部分纤维素转化为糖、菌体蛋白、脂肪等，降低饲料中粗纤维含量，从而促进动物对饲料的消化吸收，提高了饲料利用价值。目前纤维素酶大多与其它酶制成复合酶，其中古纤维素酶、木聚糖酶、果胶酶、淀粉酶、蛋白酶等。在农业实践中已取得很大成效。如朱元招等１３８Ｊ添加以纤维素酶为主酶制剂对断奶犊牛生产效果冠著，增重提高７５％。席兴军等１３９Ｊ添加纤维素酶使玉米秸秆青贮饲料中氨态氮与总氮质量比（ｍ（ＶＢＮ）／ｍ（ＴＮ））和丁酸与总酸摩尔比分别下降２８％和１００％，酸性洗涤纤维（ＡＤＦ）质量分数下降２０％，显著提高了玉米秸秆青贮饲料的营养价值。纤维素酶在发酵工业中的另一重要应用为生产单细胞蛋白。

１４２食品发酵工业方面『３６。７】

在食品发酵工业中，纤维素酶可应用于制酒，先用纤维素酶糖化，再经酵母发酵，可提高酒精和白酒的出酒率，降低醪液的黏度。用纤维素酶和其他细胞裂解酶来抽提茶汁，生产速溶茶，不仅收率高，而且茶叶色、香、味等品质较热浸法佳。用纤维素酶提炼橄榄油，改善烟草品质，改善果蔬汁的口感风味，提高面包质量。此外，还广泛用于生产酱油，加工果酱饮料及其他食品。

１．４．３纺织业中的应用１４”’】

纤维素酶应用ｊ二纺织业是近十几年来的事，现己发展成纤维素第三大纤维素酶应用行业，可用１：纺织、ＩＬ退浆处理、生物磨光、石磨等方面。利用纤维素酶对棉、麻、人造丝等织物进行处理，改善其内在品质和外观。在适当的条件下，纤维素酶仅对织物的表面或伸出织物表面的绒毛状短小纤维作用，尤其在替代牛仔装的石洗和酸洗时，可克服断纱、磨损和日久发黄的缺点，使产品柔软、滑爽、膨松、丰满。

１４４造纸业上的应用

纤维素酶在造纸工业上可用于酶法废纸脱墨，改善纸浆性能，抑制纸浆返黄，抑制导管的脱落．漂白、去除碎浆ｉ４“。

纤维素酶以及纤维素酶与半纤维素酶混合物的脱墨机理尚不完全清楚１４…。一些学者根据自己的实验结果分别提出了一些推测性的假说，如Ｆｒａｎｋｓ，Ｋｉｍ等提出水解说，Ｚｅｙｅｒ的机械摩擦说，Ｅｏｍ的纤维剥离说，Ｊｅｆｆｒｉｅｓ的间接作用说，Ｗｏｏｄｗａｒｄ的等效说。酶法脱墨作为一种新的造纸生物技术，具有很多的优点：首先酶法脱墨纸浆和化学脱墨纸浆相比具有很高的物理性能，如高白度和低残存墨粉；其次ｔ从经济上看，酶法

广两人学硕十论文糖蜜酒精废液诱导康氏木霉产纤维素酶的研究

脱墨比化学脱器的费用低，酶法脱墨既可节省能耗，降低生产成本，又可大量减少化学药品的使用，包括减少漂白需求，降低了漂白费用：酶法脱墨系统废水的需氧量和毒性也较低。

１．５本课题研究的意义和主要内容

通常认为纯纤维素是最好的诱导物，但纯纤维素价格高，在实际应用中受到限制。纸浆、经预处理的木质纤维索可作生产纤维素酶的碳源和诱导物，但其水不溶性会影响生化反应器中搅拌、氧气运输、物质传递而带来操作上的困难。常用诱导的可溶性碳源有：乳糖、葡萄糖、纤维二糖、槐糖及纤维素水解液，其中葡萄耱对纤维素酶的涛导作用最弱，高浓度的葡萄糖对纤维素酶的合成有到抑制作用。对纤维素酶的诱导合成机理还了解得很少。糖蜜酒精废液来源广，价格低，如能开发综合利用则具有重大现实意义。

广西大学食品发酵所在糖厂废弃物综合治理的研究探索中１４…，利用糖蜜酒精废液和蔗渣两步发酵法生产畜禽饲料，取得了初步进展。此法首先在糖蜜酒精废液和蔗糖组成的固体培养基上接入纤维素产生菌，分解蔗渣为葡萄糖，然后再接入饲料酵母菌种，利用纤维素酶降解产生葡萄糖来生产单细胞蛋白。在此过程中纤维素酶的活力直接影响底物饲料的转化效率，课题组在研究过程中发现糖蜜酒精废液中存在某种对纤维素酶产生具有诱导作用的因子，大大提高了康氏木霉生产纤维素酶的能力。课题组对糖蜜酒精废液中的诱导因子进行了分离鉴定，经蒽酮显色和红外光谱分析确证为糖类物质，高效液相色谱分析表明该糖类物质出葡萄糖、果糖、木糖以６：３：１比例聚合而成‘４”。本论文在上述课题基础上，研究糖蜜酒精废液诱导纤维素酶的产生，并列纤维素酶进行分离纯化，研究了纤维素酶的酶学特性，并对其诱导机理进行初步探索。

广两人学硕十论文糖蜜酒精废液诱导康氏木霉产纤维素酶的研究第二章糖蜜酒精废液影Ｐ瘟Ｉ－Ｖ的纤维素酶酶学特性的研究

纤维素酶（ｃｅｌｌｕｌａｓｅ）是降解纤维素生成葡萄糖的一组酶的总称，不是单一酶，而是起协同作用的多组分酶系。目前比较公认的是，纤维素酶系分为三大类［２３－２４Ｉ：ｆ１）葡聚糖内切酶（１，４—８．Ｄ—ｇｌｕｃａｎｇｉｕｃａｎｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ或ｅｎｄｏ—ｌ，４一Ｂ—Ｄ—ｇｌｕｃａｎａｓｅ，Ｅ．Ｃ３．２．１．４．Ｃｘ酶或ＣＭＣ酶，简称ＥＧ）；（２）葡聚糖外切酶（１，４一Ｂ．Ｄ．ｇｌｕｃａｎｃｅｌｌｏｂｉｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ或ｅＸ０１，４一Ｂ．Ｄ—ｇｌｕｃａｎａｓｅ，Ｅ，Ｃ３．２．１，９１，也称ＣＩ酶或外切纤维二糖水解酶，简称ＣＢＨ）：（３）目一葡聚糖：肾酶（Ｂ—ｇｌｕｃｏｓｉｄａｓｅ，Ｅ．Ｃ３．２．１．２ｌ，纤维二糖酶，简称ＢＧ）。

不同微生物菌种产的纤维素酶是有差异的，纤维素酶组分的分子量大小也不一样垆…。糖蜜酒精废液对康氏木霉产纤维素酶有很大促进作用［４４４５１。为系统全面地了解纤维素酶分解纤维素作用方式，深入研究糖蜜酒精废液影响对康氏木霉产纤维素酶的影响，论文首先探讨糖蜜酒精废液固态发酵的纤维素酶酶学特性。

２．１ｐＨ值对纤维素酶的影响

２．１．１材料与试剂

（１）菌种：康氏木霉（ＴｒｉｃｈｏｄｅｒｍａＫｎｏｎｉｎｇｉｉ）：ＡＳ３．２７７４，为广西大学食品与发酵一Ｉ＝程研究所保藏。

（２）试管斜面培养基：１０％（Ｗ／Ｖ）麸皮水煮２０—３０ｍｉｎ，４层纱布过滤．滤液中添加２％葡萄糖，２％琼脂，自然ｐＨ。Ｏ．１ＭＰａ（１２ｌ℃）灭菌２０分钟。

（３）固体发酵培养基：蔗渣３９，麸皮２９，２０Ｂｘ糖蜜酒精废液１５ｍｌ，ｏＨ５。０，装于２５０ｍｌ三角瓶中．搅匀。以１５ｍｌＭａｎｄｅｌｓ等营养盐溶液代替糖蜜酒精废液为对照，其它条件不变。０．１ＭＰａ（１２１℃）灭菌２０ｍｉｎ。

（４）Ｍａｎｄｅｌｓ营养盐液：ＫＨ：ＰＯ。２９，（Ｎ叱）２ＳＯｔ１．４９，ＭｇＳＯＪＨ。０３９，ＣａＣｌｔ０．３９，

ＦｅＳＯ．７Ｈ２０５ｍｇ，ＭｎＳＯ。１．６ｍｇ，ＺｎＣｌ：１．７ｍｇ，ＣｏＣｌ２２．Ｏｍｇ，溶于１０００ｍｌ蒸馏水中。

（５）限量培养液：葡萄糖１．Ｏｇ，（Ｎｉｔ；）。Ｓｎ０．５９，水１０００ｍｌ，０．１ＭＰａ（ｔ２ｌ℃）灭菌２０分钟。

（６）主要试剂：

３，５：：硝基水杨酸（ＤＮＳ）

新华ｌ４滤纸

５９ｍｏｌ／ｍｌｐ－ＮｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌＢ－Ｄ?Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｐ—ＮＰＧ为ＳＩＧＭＡ公司产品），

５９ｍｏｌ／ｍｌｐ－ＮｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌＢ—Ｄ—Ｏｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｐ－ＮＰＧ为ＳＩＧＭＡ公司产品），

ｐＨ３．０～６．０柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液１％ＣＭＣ—Ｎａ溶液

ｐＨ３．Ｏ～６，０柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液１０９ｍｏｌ／ｍｌ纤维二糖溶液

广两人学硕十论文糖蜜酒精废液诱导康氏木霉产纤维素酶的研究

ｐＨ３，０～６．０柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液１０９ｍｏｌ／ｍｌ葡萄糖标准溶液

ｐＨ３．Ｏ～６．０柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液５９ｍｏｌ／ｍｌｐ－ＮＰＧ

ｐＨ３．Ｏ～６，０柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液１９ｍｏｌ／ｍｌＰ－ＮＰＣ

２．ｔ２方法

（１）孢子悬浮液的制备：斜面接种培养３ｄ孢子成熟变绿后，用限量培养液从菌株斜丽上沈下分生他子，２８。Ｃ（ｉ５０ｒ／ｒａｉｎ）培养１２ｈ时，使孢子萌动而未发芽，稀释到孢子数含量为１０６个／ｍｌ。

（２）固体培养：固体发酵培养基接种孢子悬液２ｍｌ，混匀，每天翻动一次，２８。Ｃ恒温培养４．５ｄ后提取粗酶液。（３）粗酶液的制各：固体发酵后，按１：２０（ｗ／ｖ）加入蒸馏水，４０。Ｃ水浴振荡浸提１小时，四层纱布过滤，滤液于３５００ｒ／ｒａｉｎ离心，收集上清液．即为粗酶液。

（４）ｐＨ值对纤维索酶影响的测定：分别在ｐＨ３．０、３．６、４．２、４．６、４．８、５．０、５．４、６．０条件下作单因素实验，取适当稀释酶液０．５ｍｌ于不同ｐＨ柠檬酸缓冲液中，在５０。Ｃ与底物反应．分别测定滤纸酶活力（ＦＰ），纤维素内切酶活力（ＥＧ），０．葡聚糖苷酶活力（ＢＧ），纤维素外切酶活力（ＣＢＨ）（测定方法见附录ｌ，附录２，附录，３附录，附录４）。以相对酶活力为纵轴，以ｐＨ为横轴作图。２１３结果与讨论

分别在ｐｔｔ３．０、ｐＨ３．６、ｐＨ４．２、ｐＨ４．８、ｐＨ５，４、ｐＨ６．０条件下测定糖蜜酒精废液

固态发酵的纤维素酶ＦＰ，ＥＧ，ＢＧ，ＣＢＨ相对酶活力，结果（见图２．１）。

乎ｊ≯一…．

３３．６４．２４．８５．４６６，６

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———●——一ＦＰ

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图２－Ｉ不同ｐＨ条件下ＦＰ、ＥＧ、ＢＧ、ＣＢＨ酶活性变化曲线

Ｆｉｇ．２一ｌＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔ０ＨＯｎＦＰ，ＥＧ，ＢＧａｎｄＣＢＨａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ

４加∞∞∞∞舯。０拉『∞”—一∞。¨一≯一≈，一口∞

广两人学硕十论文糖蜜酒精废液诱导康氏木霉产纤维素酶的研究

由图２－１可知，ＦＰ，ＥＧ，ＢＧ，ＣＢＨ酶的最适ｐＨ值分别为４．８，４．８，４．８，５．０。

［Ｉ｛＋】通过影响酶及底物的解离常数影响酶的反应速度，在理论上ｐＨ对酶作用的影响表现为钟形曲线，实验结果与理论相符合。ＦＰ，ＥＧ，ＢＧ，ＣＢＨ最适ｐＨ非常接近，选用ｐＨ４．８作为测定酶活力是可行的。

２２温度对酶活力的影响

２．２１材料与试剂

（１）材料（同２．１）

（２）试剂

３．５二硝基水杨酸（ＤＮＳ）

新华ｌ４滤纸

ｐＨ４．８柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液配制１０ｍｇ／ｍｌＣＭＣ．Ｎａ溶液

ｐＨ４．８柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液配制１０¨ｍｏｌ／ｍｌ纤维二糖溶液

ｐＨ４．８柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液配制ｌＯｐ，ｍｏｌ／ｍｌ葡萄糖标准溶液

ｐＨ４．８柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液配制５ｐ．ｍｏｌ／ｍｌＰ－ＮＰＧ

ｐＨ４．８柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液配制ｌｌａｍｏｌ／ｍｌＰ－ＮＰＣ

２．２．２方法

（１）孢予悬浮液的制备，固体培养，粗酶液的制备（同２．１）

（２）温度对纤维素酶影响的测定

对纤维素酶反应温度作单因素实验，取适当稀释酶液０．５ｍｌ于ｐＨ４．８的柠檬酸缓冲液，分别在３５℃，４０℃，４５℃，５０。Ｃ，５５℃，６０。Ｃ，６５℃，７０。Ｃ，７５℃下与底物反应，测定滤纸酶活力ＦＰ，纤维素内切酶活力（ＥＧ），纤维二糖酶活力（ＢＧ），纤维素外切酶活力（ＣＢＨ）（测定方法见附录ｌ，附录２，附录，３附录，附录４）。以相对酶活力为纵轴，以温度为横轴作图。

２．２３结果与讨论

温度对酶活的影响：分别在３５．７５６Ｃ温度下测定糖蜜酒精废液固态发酵的纤维紊酶ＦＰ、ＥＧ、ＢＧ、ＣＢＨ相对酶活性，结果见图２．２图，图２—２显示，ＦＰ、Ｅ０、ＢＧ、ＣＢＨ酶的最适作用温度分别为５０℃、７０℃、６０℃、５５℃。酶与底物作用时，当温度达到最适温度之前，酶的反应速度随温度的升高而加快，当其温度超过最适温度时，由于高温使酶变性，从而使酶的反应速度减慢。因此，理论上温度对酶催化反应的影响表现为钟形曲线，由于纤维素酶分解不同的底物所需的条件是不同的，而且前后反应时有一定的波动，这也可以使实验结果出现一定的误差。但从总体来看，实验结果与理论相符合。实验的操作中兼顾纤维素酶方便测定，选用５０＂（７作为酶催化反应温度是

广两人学硕十论文糖蜜酒精废液诱导康氏木霉产纤维素酶的研究可行的，基本反映酶活力的总体水平。

１２０

１００

８０

６０

４０

２０

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Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｏ—．一——．，—，—Ｊ一，．Ｊ，，—．—，，．，—』

６５７０７５８０

一一心一一ＥＧ

一－ｏ－一ＢＯ

＊一ＣＢＨ

图２－２不同温度下ＦＰ、ＥＧ、ＢＧ、ＣＢＨ酶活性变化曲线。

Ｆｉｇ．２．２：ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅＯｎＦＰ，ＥＧ，ＢＧＣＢＨａｃｔｉｖｉｔｉｅｓ

２．３底物浓度对纤维素酶活的影响

２３．１材料与试剂

（１）孢予悬浮液的伟０备，固体培养，租酶液的制备（同２，１）

（２）主要试剂：

３，５二硝基水杨酸（ＤＮＳ）

口Ｈ值４．３柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液

新华１４滤纸

用ｐＨ４．８浓度为５０ｐｍｏｌ／ｍｌ柠檬酸一柠檬酸钠缓冲液配制：

不同浓度ＣＭＣ．Ｎａ溶液

不同浓度纤维二糖溶液

不同浓度葡萄糖标准溶液

不同浓度ｐ－Ｎｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌ３－Ｄ—Ｇｌｕｃｏｐｙｒａｎｏｓｉｄｅ（Ｐ—ＮＰＧ）

不同浓度ｐ－ＮｉｔｒｏｐｈｅｎｙｌＢ—Ｄ—Ｃｅｉｌｏｂｉｏｓｉｄｅ（Ｐ—ＮＰＣ）

２３．２方法

（１）粗酶液的制备（同２．１）

（２）底物量对纤维素酶影响的测定（测定方法见附录１，附录２，附录，３附录，附录４）。以相对酶活力为纵轴。以底物量为横轴作图。

广两人学硕十论文糖蜜酒精废液诱导康氏木霉产纤维素酶的研究

Ａ取适当稀释酶液０．５ｍｌ，加入５０ｐ．ｍｏｌ／ｍｌ，ｐＨ４．８的柠檬酸缓冲液１．５ｍｌ，然后分别加入新华１４滤纸１５．３３３ｍｇ，３０．６６７ｍｇ，４６．０００ｍｇ，６１．３３３ｍｇ，７６．６６７ｍｇ，９２．００ｍｇ（１×６ｃｍ）测定滤纸酶活力。以沸水先灭酶活１５ｒａｉｎ的酶液为空白消零。

ｆ３取适当稀释酶液０．５ｍｌ，分别加入浓度为５ｍｇ／ｍｌ，１０ｍｇ／ｍｌ，１５ｍｇ／ｍｌ，２０ｍｇ／ｍｌ，５ｍｇ／ｍｌ，３０ＩＴｌ【∥ｍｌ的ＣＭＣ－Ｎａ溶液１．５ｍ！，测定ＣＭＣ酶活力。以沸水先灭酶活ｌ５ｒａｉｎ的酶液为空白消零。

Ｃ取适当稀释酶液０．５ｍｌ，分别加入浓度０．６６６７ｕｍｏｌ／ｍｌ，２．６６６７ｕｍｏｌ／ｍｌ，５．３３３３

ｕｍｏｌ／ｍｌ，８ｕｍｏｌ／ｍｌ，１０ｕｍｏｌ／ｍｌ的纤维二糖溶液１．５ｍｌ，进行ＢＧ相对酶活力的测定。以沸水先灭酶活１５ｍｉｎ的酶液为空白消零。

Ｄ取适当稀释酶液０．５ｍｌ，分别加入浓度为０．４ｕｍｏｌ／ｍｌ，Ｏ．８ｂｔｍｏｌ／ｍｌ，１．２ｕｍｏｌ／ｍｌ，１．６ｕｍｏｌ／ｍｌ，２．０ｕｍｏｌ／ｍｌ的Ｐ．ＮＰＣ溶液１．５ｍｌ，测定ＣＢＨ相对酶活力。以沸水先灭酶活１５ｒａｉｎ的酶液为空白消零。

２３３结果与讨论

（１）底物浓度对滤纸酶活力的影响

４ｉ同含量的滤纸对糖蜜酒精废液固念发酵的纤维素酶ＦＰ酶活力的影响，结果见图２—３，从图中可以看出：

ＴｈｅｅｆｆｅｃｃｏｆｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｆｉｌｔｅＦｐａｐｅｒｏｉｌｃｅｌｌｕｌａｓｅ

ａｃｔｉｖｉｔＹ

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Ｔｈｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｆｉｌｔｅｒｐａｐｅｒ（ｍｇ／ｍ１）

图２－３不同底物浓度下的ＦＰ相对酶活

Ｆｉｇ．２—３ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｌｃｏｎｔｅｎｔｏｆｆｉｌｌｅｒｐａｐｅｒＯｎＦＰａｃｔｉｖｉｔｙ

在２ｍｌ反应液中，随着滤纸含量的增加，相对ＦＰ酶活力不断增加，当每毫升反应液的滤纸含量达３８。３３３ｍｇ时，相对酶活力达到最大，由于滤纸是水不溶性的?可以认为纤维素酶已被滤纸表面纤维素分子所饱和。所以，试验选择１×６ｃｍ新华１４滤纸

广两人学硕十论文糖蜜酒精废液诱导康氏木霉产纤维素酶的研究作反应底物是适合的。

（２）底物浓度对ＥＧ酶活力的影响

坷；同浓度的ＣＭＣ—Ｎａ对糖蜜酒精废液固态发酵的纤维素酶ＥＧ酶活力的影响，结果见图２－４，从图中可以看出，在２ｍｌ反应液中随着ＣＭＣ－Ｎａ含量的增加，相对ＥＧ酶活力也不断增加，当每毫升反应液的ＣＭＣ．Ｎａ含量达２０ｍｇ／ｍｌ时，相对ＥＧ酶活力反而减少，可能是５０ｍｍｏｌ／Ｌ的柠檬酸缓冲液缓冲能力不够，影响反应液中【Ｈ＋】，使ｐＨ向碱性偏移，进而影响纤维素内切酶ＥＧ的活性。所以，实验测定选用ｌＯｍｇ／ｍｌ（１％）的ＣＭＣ．Ｎａ为底物，试验结果稳定，重复性高。

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１０１５２０２５ＴｈｅＣｏｎｃｅｎｌｒａｔｉｏｎｏｆＣＭＣ—Ｎａ（ｍｇ／ｍｉ）

图２．４不同ＣＭＣ．Ｎａ浓度下纤维素酶的酶活力变化曲线

Ｆｉｇ２—４ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＣＭＣ?ＮａｏｎＥＧａｃｔｉｖｉｔｙ

（３）底物浓度对ＢＧ酶活的影响

不同浓度的纤维二糖对ＢＧ酶活力的影响，结果见图２—５。从图中呵以看出，在２ｍｌ反应液中随着纤维二糖含量的增加，相对ＢＧ酶活力也不断增加，其浓度在０．６６７～２．６６７１ａｍｏｌ／ｍｌ时酶活力增加较快，随后逐渐缓慢，在３～１０／．ｔｍｏｌ／ｍｌ范围内可以认

ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆｃｅｌｌｏｂｉｏｓｅＯｎＢＧ

图２．４不同底物浓度下的ＢＧ酶活力变化曲线

Ｆｉｇ．２．５ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＣｅｌｌｏｂｉｏｓｅｏｎＥＧａｃｔｉｖｉｔｙ

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广两人学硕十论文糖蜜酒精废液诱导康氏木霉产纤维素酶的研究为１３－葡聚糖苷酶（ＢＧ）基本被底物所饱和，．本试验选用１０ｐ．ｍｏｌ／ｍｌ的纤维二：糖为底物是可行的。

（４）底物浓度对ＣＢＨ酶活的影响

不同浓度的对硝基纤维二糖苷对糖蜜酒精废液固态发酵的纤维素酶ＣＢＨ酶活力的影响，结果见图２－６，从图中可以看出，在２ｍｌ反应液中随着对硝基纤维二糖苷含量的增加，相对ＢＧ酶活力很快达最大值。对硝基纤维二糖苷浓度在ｌ～２ｍｍｏｌ／ｍｌ内，其相对酶活力几乎完全一样，说明酶活性中心完全被底物所饱和，同时也说明反应液中酶含量很低。

ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｏｆＣＯｎＣｅｎｔｒａｔｊｏｎｏｆＰ－ＮＰＣｏ［ｉＣＢＨ

００．５ｌ１．５２ｍｍｏｌ／Ｌ

图２－６不同底物浓度Ｐ．ＮＰＣ下的ＣＢＨ酶活力变化曲线

Ｆｉｇ．２—６ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｆｆｅｒｅｎｔｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｏｆＰ－ＮＰＣｏｎＣＢＨａｃｔｉｖｉｔｙ

２．５

２．４金属盐离子对纤维素酶活的影响

２４１材料

（１）培养基：固体发酵培养基（同２．１）

（２）主要试剂：（同２．１）

２４２方法

耿Ｏ．５ｍｌ粗酶液分别加入Ｏ．５ｍｌ浓度为ｌＸ１０一ｍｏｌ／ＬＦｅＳ０４、ＣｕＳ０４、Ｐｂ（Ｎ０３）２、ＣｏＣｌ２、ＭｇＳ０４、ＣａＣｌ２溶液，再加入５０｝＿ｔｍｏｌ／ｍｌｐＨ４．８的柠檬酸缓冲液１．５ｍｌ，静置３．５ｈ，测定滤纸酶活力（ＦＰ），纤维素内切酶活力（ＥＧ），１３一葡聚糖苷酶酶活力（ＢＧ），纤维素外切酶活力（ＣＢＨ）（测定方法见附录１，附录２，附录，３附录，附录４）；空白为加０．５ｍｌ粗酶液灭酶活；对照为不加离子溶液，相对酶活力为１００％。

２４３结果与讨论

不同金属、盐离子对糖蜜酒精废液固态发酵的纤维素酶活力的影响，结果见表２—１加

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广两人学硕十论文糖蜜酒精废液诱导康氏木霉产纤维素酶的研究

从表中可以看出，各种离子通过影响酶的活性中心影响酶的作用，实验发现在１×１０。３ｍｏｌ／Ｌ浓度下Ｆｅ２＋、Ｃｕ”、ＮＩ－１４＋、Ｐｂ２＋、Ｃ０２＋、Ｍ９２＋、Ｚｎ”、Ｎａ＋、ｃａ２＋对ＦＰ酶均表现为或强或弱的抑制作用。其原因可能是离子通过影响酶的活性中心从而抑制酶的作用，也可能是采用的离子浓度过高，导致酶变性；再则，滤纸酶活力反映的是整个纤维素酶系的总体效果，很难发现某种离子对该酶系中每一组分均有激活作用。

同时发现Ｆｅ”对ＥＧ酶有较强的激活作用，Ｃｕ”对ＥＧ酶有一定的抑制作用．其他离子无明显影响。

ｊ二述离了对ＢＧ酶和ＣＢＨ酶的影响具有一致性、相似性，Ｆｅ”、Ｃｕ”、ＮＨａ＋、Ｐｂ２＋对ＢＧ酶和ＣＢＨ酶有抑制作用，Ｃａ２＋对ＢＧ和ＣＢＨ酶活力略有促进作用。

表２．１：金属，盐离于对纤维素酶活的影响

Ｔａｂｌｅ２－１ＴｈｅｅｆｆｅｃｔｓｏｆｄｉｅｆｉｅｒｅｎｔｍｅｔａｌｌｉｃｉｏｎｓＯｉｌｃｅｌｌｕｌａｓｅ

２．５稀释倍数对纤维素酶活的影响

２５．１材料与试剂

（１）培养基：固体发酵培养基（同２．１）

（２）主要试剂：（同２．２）

２．５２方法

（１）粗酶液的制备（同２．１）

（２）稀释倍数对纤维素酶活力影响的测定

分别取Ｏ．５ｍｌ稀释５，１０，２０，５０，１００，１５０，２００倍的粗酶液，分别测滤纸酶活力，纤维素内切酶活力（ＥＧ），Ｂ．葡聚糖苷酶酶活力（ＢＧ），纤维素外切酶活力（ＣＢＨ）；以０．５ｍｌ酶液先灭酶活１５ｍｉｎ为空白消零，计算出酶液稀释前后的总活力，未稀释酶液的相对酶活力为ｌＯＯ％（测定方法见附录ｌ，附录２，附录，３附录，附录４）。

２５３结果与讨论

稀释倍数对糖蜜酒精废液固态发酵的纤维素酶活力影响，结果见表２—２。从表中可以看出，不同稀释倍数下测得的酶活力是不同的，随着稀释倍数不断扩大，纤维素酶