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康氏木霉纤维素酶CBHI基因克隆及在毕赤酵母中的表达研究

基金项目：广西区教委人才项目（桂教人200962）；国家大学生创新基金（合同编号091059318）；广西大学实验教改项目（092301）。收稿日期：2010－11－10

通讯作者：

梁智群，zqliang@https://www.wendangku.net/doc/e81214874.html, 。康氏木霉纤维素酶CBHI 基因克隆

及在毕赤酵母中的表达研究

黄时海1，李湘萍2，康超1，黄飞3，汪

晟1，吴孔阳1，曹喜秀1，曹普美1，何鑫平1，梁智群1

（1.广西大学生命科学与技术学院，广西

南宁

530005；2.广西大学动物繁殖研究所，广西

南宁

530005；

3.南宁新技术创业者中心，广西南宁

530007）

摘要：在毕赤酵母中表达康氏木霉(Trichoderma koningii )纤维素酶基因cbh I 。提取经诱导的康氏木霉mRNA ，通过反转录及PCR 反应扩增纤维素酶cbh I 基因cDNA 。将cbh I 基因克隆到毕赤酵母表达载体pPICZ αA 上，采用电激法将经Sac Ⅰ线性化的重组质粒pPICZ αA -cbh I 转化毕赤酵母GS115，MD 及G418抗性平板筛选cbh I 基因高拷贝转化子,并用PCR 鉴定转化子。BMMY 培养基中加入0.5%甲醇对毕赤酵母进行纤维素酶CBH I 诱导表达。SDS -PAGE 电泳结果显示，表达的重组蛋白相对分子质量约67kD ，pNPC 酶活为24.1U/L ，酶蛋白量为0.22mg/mL ，表明，康氏木霉cbh I 可以在毕赤酵母中表达，并具有较高活性。关键词：微生物；康氏木霉；毕赤酵母；cbh I 基因；表达中图分类号：Q93-3；Q78；Q55

文献标识码：A

文章编号：1001－9286（2011）01－0024－04

Study on the Cloning of Trichoderma koningii Cellulase

CBH I &Its Expression in Pichia Pastoris

HUANG Shi-hai 1，LI Xiang-ping 2,KANG Chao 1,HUANG Fei 3,WANG Sheng 1，WU Kong-yang 1，

CAO Xi-xiu 1,CAO Pu-mei 1,HE Xin-ping 1and LIANG Zhi-qun 1

(1.Life Science and Technology College,Guangxi University,Nan'ning,Guangxi 530005;2Animal Reproduction Research Institute,Guangxi

University,Nan'ning,Guangxi 530005;3.Nan'ning New Technology Incubation Center ，Nan'ning,Guangxi 530007,China)

Abstract :The purpose of this study is to express cellulase cbh I gene of Trichoderma koningii in Pichia pastoris .Cellulase cbh I gene was amplified by using Trichoderma koningii mRNA as template.Then the amplified cbh I cDNA was cloned into pPICZ αA vector and the linearized recombi-nant plasmid pPICZ αA-cbh I was transformed to Pichia pastoris GS115strain by electroporation.The positive transformants were selected by MD and G418-resistance flat screen,and identified by PCR method.0.5%methanol were added into the medium to induce the protein expres-sion.SDS-PAGE results showed that the relative molecular weight of expressed product was 67kD,the enzyme activity was 24.1U/L,while AE was 0.22mg/mL.As a result,recombinant cellulase CBH I of Trichoderma koningii may express in Pichia pastoris and it could display higher

emzyme activity.

Key words :microbe;Trichoderma koningii ;Pichia pastoris ;cbh I gene;expression

纤维素是目前世界上已知分布最广的碳水化合物，也是世界上总量最大的可再生资源。据报道，每年大概全球会产生干重为1.3×1013万t 的陆生植物。其中,纤维素占所有植物干重的50%。如能将这些纤维素水解转化为具有经济潜力的生物多糖，不仅有利于环境保护，还可解决能源、粮食、环境等一系列问题。纤维素的利用具有重大的意义和价值，但是技术上的制约使得绝大部分的纤

维素无法被直接利用。而酶法降解天然纤维素作为一种重要的分解纤维素的方法已被深入研究[1-3]。

纤维素酶是由以下3种酶组成：内切β-1,4-葡聚糖酶（EG ），外切β-1,4-葡聚糖酶（纤维二糖水解酶,CBH ）和β-葡萄糖苷酶（纤维二糖酶，BG ）。通过3种不同但又互补的酶协同作用，降解纤维素为葡萄糖等[4]。虽然许多微生物能合成纤维素酶，但普遍产酶效率低，产酶能力和

各种酶组分差异很大，难以获得大量价廉、质量稳定的产品，成为制约其在生物加工过程中广泛应用的瓶颈[5]。此外，微生物产纤维素酶各种组分所占的比例主要由微生物内部的调控机制调节，很难通过改变培养条件进行人为控制，而纤维素酶的不同应用过程往往对纤维素酶各组分的比例又有不同的要求。高效克隆表达，低成本生产纤维素酶的某单一酶组分，再将各酶组分进行复配以满足不同生产领域的需要，是纤维素酶制剂研发的方向之一[6]。

纤维素酶基因的克隆始于20世纪70年代末，现已从40多种细菌和数种真菌中克隆到了多种纤维素酶基因，且绝大多数基因都已在大肠杆菌中表达[7]。真菌产生的酸性纤维素酶，里氏木霉(Trichoderma reesei)研究较为透彻，已有8个纤维素酶基因被克隆并测序，康氏木霉（Trichoderm.Knoningii）和绿色木霉也做了一些研究[8]。纤维二糖水解酶（CBH）是纤维素水解酶系中唯一可以作用于结晶纤维素的酶组分，酶解纤维线状分子末端的β-1,4糖苷键，逐次切下一个纤维二糖分子,在纤维素水解中的作用比较重要[9]。Wey等在1994年克隆了康氏木霉G-39的纤维素酶cbh I基因，发现它与里氏木霉cbh I仅在非编码区有6个碱基的差异[10]。祝令香等于2001年克隆了康宁木霉K801的外切纤维素酶Ⅱ基因(cbhⅡ)，序列分析发现，与里氏木霉已知序列的同源性达99.89%[11]。王建荣等采用里氏木霉基因序列同源性片段作探针成功地从绿色木霉基因文库中克隆了绿色木霉cbh I和cbhⅡ基因[12]。大肠杆菌原核表达纤维素酶cbh基因，有蛋白分泌表达水平较低、不易纯化且易形成包涵体、蛋白无活性等缺点，逐渐被有多种优点的酵母真核表达系统代替。丁新丽等在酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)中表达了里氏木霉的cbh I基因,但发酵上清液中CBHⅠ酶活低，只有0.067U/L[13]。刘守安等在毕赤酵母（Pichia pastoris）中表达嗜热毛壳菌（Chaetomium thermophilum）cbh I，脱脂棉酶活为21U/mL[14]。张煜等毕赤酵母中高效表达里氏木霉CBHⅡ，CMC酶活为3.82U/mL[15]。

康氏木霉TK-4-775是本课题组分离、筛选、诱变获得的1株纤维素酶高产菌株。本文将从TK-4-775中克隆纤维二糖水解酶基因Ⅰ，构建可以在毕赤酵母中表达的分泌型重组表达载体，导入并整合cbh I基因至毕赤酵母中，利用酵母生长快、易于培养等特点，期望短时间内快速超量表达纤维二糖水解酶Ⅰ，为大规模发酵及工业化应用奠定基础。

1材料与方法

1.1菌株及质粒

康氏木霉TK-4-775和大肠杆菌（E.coli）DH5α由本实验室保藏。毕赤酵母表达宿主GS115和毕赤酵母表达载体pPICZαA质粒，从Invitrogen公司购买。

1.2工具酶和生化试剂

限制性内切酶、DNA连接酶、Ex Taq DNA聚合酶、DNA片段纯化试剂盒均购自Takara公司(大连)。蛋白质和DNA分子量标准以及培养基成分如蛋白胨、酵母抽提物、酵母碱等由上海生物工程技术服务有限公司提供，zeocin和TRIZOL试剂购自Invitrogen。对硝基纤维二糖苷(p-Nitrophenyl cellobioside,pNPC)购自Sigma公司，其他各种化学试剂均为国产分析纯。PCR引物合成和DNA序列测定由Takara公司完成。

1.3培养基及培养条件

大肠杆菌LB培养基见《分子克隆实验指南》(第三版)，YPD、MM、MD、BMGY、BMMY培养基见Invitrogen 公司毕赤酵母操作手册。在37℃，220r/min的旋转式摇床上培养大肠杆菌，30℃、250r/min的条件下培养毕赤酵母。

1.4纤维二糖水解酶I（cbh I）基因的PCR扩增

改进的TRIZOL法，利用试剂盒一步法提取康氏木霉总RNA。收集以微晶纤维素诱导产生的菌丝，无菌水冲洗，干燥，液氮速冻，研磨。每0.2g加入1mL TRI-ZOL,静置5min，加入0.2mL三氯甲烷，剧烈振荡15s，12000g，4℃，离心15min。取上清液，加入沉淀剂离心得沉淀，75%的乙醇洗沉淀2次，干燥。将沉淀溶解在50μL DEPC处理的双蒸水中，-80℃保存。使用TaKaRa公司的RNA PCR试剂盒反转录进行cDNA第一链的合成，-20℃保存，反应体系和反应条件参照试剂盒的使用说明。参照康氏木霉cbh I基因(GenBank登录号为X69976.1)序列设计带有合适酶切位点的PCR扩增引物：

P1：CGGAATTCCG GAGAATTGATTTTAAAC（引入EcolRⅠ酶切位点）

P2：GCTCTAGAGC CGCTCTCAATTTATTTC（引入XbaⅠ酶切位点）

以cDNA为模板，P1、P2为引物，PCR扩增纤维素酶基因cbh I片段。反应条件：94℃30s，55℃1min，72℃2min，30个循环，72℃延伸7min。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳鉴定并测序。

1.5重组表达质粒的构建

分别将扩增得到的cbh I基因片段和毕赤酵母分泌型表达质粒pPICZαA用EcoRI和XbaI双酶切，胶回收并纯化，经T4DNA连接酶连接后转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，在抗zeocin的LB平板上筛选重组子。提取质粒、酶切，菌落PCR和测序鉴定。

1.6毕赤酵母的诱导表达

1.6.1电转化甲醇毕赤酵母及阳性转化子的筛选

图1cbh I PCR 产物电泳图

根据毕赤酵母表达系统操作手册，将测序正确的重组质粒pPICZ αA -cbh I 用限制性内切酶Sac Ⅰ线性化后，电激转化毕赤酵母GS115，涂布于MD 平板上筛选目标基因整合到受体菌染色体上的转化子。因为基因拷贝数的增加通常可以提高基因产物的表达量，故再以载体上的G418抗性基因筛选高基因拷贝的转化子，即将MD 平板上获得的转化子点种于含200μg/mL 、400μg/mL 、

600μg/mL 、800μg/mL G418的YPD 平板上，30℃培养

3d 后，挑取G418抗性最高的重组转化子，提取总DNA ，以其为模板，P1、P2为引物，PCR 鉴定，以空载体

转化菌作对照。

1.6.2重组cbh I 在毕赤酵母中的诱导表达

重组毕赤酵母在25mL BMGY 培养基(250mL

三角瓶)中培养至OD 为2.0～6.0，离心收集菌体，加入25mL BMMY 培养基后于30℃，250r/min 条件下继续培养，每24h 补加占培养液体积0.5％的甲醇，定时取样，测定菌体密度和酶活性，同时进行培养液的SDS -

PAGE 和外切纤维素酶活测定。1.7SDS -PAGE 凝胶电泳分析

分析按照《分子克隆实验指南》(第三版)，使用的凝胶浓度为12.5%，上样量25μL 。蛋白质用考马斯亮蓝

R -250染色。蛋白质含量测定采用Bradford 法，以牛血

清白蛋白为标准蛋白。

1.8

外切纤维素酶I 的酶活检测

CBHI 酶活测定方法参照文献[16]：pNPC 溶于50mmol/L pH4.8的醋酸缓冲液中，浓度为0.5%，同时加入0.1%葡萄糖内酯抑制β-葡萄糖苷酶对纤维二糖侧链的水解。2mL 反应液中加发酵上清液1mL ，50℃保温12h ，加0.5mL10%Na 2CO 3终止反应，420nm 测定对硝基酚的含量。酶活单位(U)定义为1min 产生1μg 对硝

基酚所需的酶量。

2结果与分析

2.1

康氏木霉cbh Ⅰ基因的克隆

提取总RNA ，通过试剂盒反转录生成cDNA 第一链，并以其为模板进行PCR ，得到1.5kb 片段，测序结果显示与GenBank 中登记的康氏木霉cbh Ⅰ基因相似率为98.5%，因此，可以认为已获得目的基因cbh Ⅰ片段。如图1。

2.2重组表达质粒构建

通过过渡宿主DH5α，筛选到重组质粒pPICZ αA -cbh I ，大小为5.1kb 左右。双酶切和菌落PCR 分析，得到1.5kb 的特异性条带，和预测的结果一致。证实已成功将cbh I 基因插入毕赤酵母分泌型表达载体pPICZ αA 的多克隆位点，见图2。测序表明,cbh I 位于pPICZ αA 质粒甲

醇启动子的下游，并具有正确的阅读框。

2.3

重组毕赤酵母的筛选和鉴定

在MD 筛选培养基上筛选到41个阳性转化子，分别点种到含不同浓度G418的MD 平板，在含有800μg/mL G418的平板上获得了近5个阳性转化子。提取基因组DNA 进行PCR 鉴定，结果表明，cbh I 基因已整

合到毕赤酵母的基因组中（图略）。

2.4

毕赤酵母的诱导表达及外切纤维素酶活力测定重组转化子在BMMY 中诱导0h 、24h 、48h 、72h 、96h 、120h 和144h 后分别取适量发酵上清液，以pNPC 为底物测定其胞外外切纤维素酶的酶活力。其中，1株转化子发酵液的酶活力在96h 达到24.1U/L ，酶蛋白量为0.22mg/mL 。SDS -PAGE 电泳分析结果表明，表达产物的分子量约为67kD ，如图3。3

讨论

毕赤酵母是一种甲醇营养型酵母，可以对表达的外源蛋白进行翻译后加工修饰，如磷酸化、糖基化、酰胺化等，易实现活性表达并抗宿主菌蛋白酶降解。毕赤酵母

可以高密度培养，并稳定表达结构较为复杂的外源蛋白。此外，毕赤酵母自身分泌的胞外蛋白很少，有利于表达外源蛋白的分离纯化，因此，是目前一种较为理想的表达胞内和胞外外源蛋白的真核表达系统。本实验从康氏木霉TK-4-775菌株中克隆到cbh I基因，拓展了纤维素酶的基因资源，并在毕赤酵母中成功实现cbh I的分泌型活性表达。诱导96h，pNPC酶活为24.1U/L，酶蛋白量为0.22mg/mL，表明康氏木霉cbh I在毕赤酵母中表达是适宜的。

目前，多数研究者对木霉纤维素酶的研究多集中在里氏木霉、绿色木霉等，cbh I在毕赤酵母中表达时，重组蛋白的酶活力普遍偏低。从康氏木霉cbh I基因的结构特性分析，可能的原因有：①密码子偏好性。康氏木霉cbh I 中有7个编码精氨酸(Arg)的密码子，属于毕赤酵母的稀有密码子。稀有密码子数量多会减慢翻译过程中核糖体的运动速度，导致蛋白表达水平降低。②过度糖基化会影响蛋白质的合成、分泌，甚至改变蛋白质的活性，同时也不利于外源表达蛋白质的纯化。克隆基因cbh I的氨基酸序列分析表明，重组蛋白在催化域（catalytic domain,CD）内有5个潜在的N-糖基化位点，因此，有可能导致毕赤酵母表达过程中过度糖基化。本文克隆的康氏木霉cbh I 是没有经过改造的天然基因，后续实验中，课题组拟将进一步通过定点突变等技术优cbh I，去掉其糖基化位点及稀有密码子，或将目标蛋白与糖苷酶共表达，提高cbh I 酶活和表达量[17]。

本研究中仅在摇瓶做了初步实验，未对诸如甲醇诱导浓度、诱导时间、温度、pH值等影响目的基因表达的条件进行优化，也是影响重组蛋白表达和酶活力的原因之一。巴斯德毕赤酵母有时在发酵罐中表达外源蛋白的活力比摇瓶要高10倍以上，今后有必要对重组菌株的发酵条件进一步优化，努力寻找较合适的表达条件，并对重组酶产酶动力学和酶学性质做详细研究[14]。此外，也有报道利用纤维素内切（EG）和外切（CBH）酶的协同作用，将cbh与eg基因在酵母中共表达，可显著提高重组酶对纤维素底物的降解酶活[13]。课题组目前正尝试在毕赤酵母GS115中共表达已克隆得到的康氏木霉egI[18]和cbh I，已取得一些比较满意的结果，相关研究工作将做后续报道。参考文献：

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毕赤酵母实验操作技巧介绍材料

毕赤酵母表达实验手册大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻泽后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，主更是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低，包涵体变性、复性等等间题［1］。与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制

毕赤酵母表达系统研究进展

毕赤酵母表达系统研究进展作者：齐连权，陈薇，来大志，于长明，王海涛作者单位：军事医学科学院微生物学流行病学研究所,北京,100071 刊名：中国生物工程杂志英文刊名：JOURNAL OF CHINESE BIOTECHNOLOGY 年，卷(期)：2002,22(6) 被引用次数：11次参考文献(21条) 1.Trinh L;Noronha S B;Fannon M Recovery of mouse endostatin producedby Pichia pastoris using expanded bed adsorption[外文期刊] 2000(04) 2.查看详情 3.Barr KA;Hopkins S A;Sreekrishna K Protocol for efficient secretion of HSA developed from Pichia pastoris 1992 4.Cereghino J L;Cregg J M Heterologous protein expression in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 2000(1) 5.Kjeldsen T;Pettersson A F;Hach M Secretory expression and characterization of insulin in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(29) 6.Bewley M C;Tam B M;Grewal J X ray crystallography and massspectroscopy reveal that the N lobe of human transferrin expressed in Pichia pastorisis folded correctly but is glycosylated on serine 32 [外文期刊] 1999(08) 7.Kalidas C;Joshi L;Batt C Characterization of glycosylated variantsof beta lactoglobulin expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(03) 8.Briand L;Perez V;Huet J C Optimization of the production ofa honeybee odorant binding protein by Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 9.Rydberg E H;Sidhu G;Vo H C Cloning mutagenesis and structural analysis of human pancreatic alpha amylase expressed in Pichia pastoris[外文期刊] 1999(03) 10.Guo R T;Chou L J;Chen Y C Expression in Pichia pastoris andcharacterization by circular dichroism and NMR of rhodostomin[外文期刊] 2001(04) 11.Zani M;Brillard Bourdet M;Lazure C Purification and characterization of active recombinant rat kallikrein rK9[外文期刊] 2001(02) 12.ChirulovaV;Cregg J M;Meagher M M Recombinant protein production in an alcohol oxidase defective strain of Pichia pastoris in fed batch fermentations[外文期刊] 1997 13.Hasslacher M;Schall M;Hayn M High level intracellular expression of hydroxynitrile lyase from the tropical rubber tree Hevea brasiliensis in microbial hosts[外文期刊] 1997(1) 14.Takahashi K;Takai T;Yasuhara T Effects of site directed mutagenesis in the cysteine residues and the N glycosylation motif in recombinant Der f 1on secretion and protease activity[外文期刊] 2001(04) 15.Boado R J;Ji A;Pardridge W M Cloning and expression in Pichia pastoris of a genetically engineered single chain antibody against the rat transferrin receptor[外文期刊] 2000(06)

酵母表达系统使用心得

Pichia酵母表达系统使用心得甲醇酵母表达系统有不少优点，其中以Invitrogen公司的Pichia酵母表达系统最为人熟知，并广泛应用于外源蛋白的表达。虽然说酵母表达操作简单表达量高，但是在实际操作中，并不是每个外源基因都能顺利得到高表达的。不少人在操作中会遇到这样那样的问题，收集了部分用户在使用EasySelect Pichia Expression System这个被誉为最简单的毕赤酵母表达的经典试剂盒过程中的心得体会。其中Xiang Yang是来自美国乔治城大学（Georgetown University）Lombardi癌症中心（Lombardi Cancer Center），部分用户来自国内。甲醇酵母部分优点： 1.属于真核表达系统，具有一定的蛋白质翻译后加工，有利于真核蛋白的表达； 2.AOX强效启动子，外源基因产物表达量高，表达产物可以达到每升数克的水平； 3.酵母培养、转化、高密度发酵等操作接近原核生物，远较真核系统简单，非常适合大规模工业化生产； 4.可以诱导表达，也可以分泌表达，便于产物纯化； 5.可以甲醇代替IPTG作为诱导物，部分甲醇酵母更可以用工业甲醇替代葡萄糖作为碳源，生产成本低。产品性能：优点——使用简单，表达量高，His-tag便于纯化；缺点——酵母表达蛋白有时会出现蛋白切割问题。巴斯德毕赤酵母（Pichia pastoris）是一种能高效表达重组蛋白的酵母品种，一方面由于其是属于真核生物，因此表达出来的蛋白可以进行糖基化修饰，另一方面毕赤酵母生长速度快，可以将表达的蛋白分泌到培养基中，方便蛋白纯化。毕赤酵母表达载体pPICZ在多克隆位点（MCR）3'端带有his-tag和c-myc epitopes，这些tag有利于常规检测和纯化，而且在MCR5'端引入了alpha factor（α-factor）用以分泌表达，并且在表达后α-factor可以自动被切除。在进行克隆的时候，如果你选择的是EcoRI，那么只需在目标蛋白中增加两个氨基酸序列即可完成。另外pPICZ系列选用的是Zeocin抗生素作为筛选标记，而诱导表达的载体需要甲醇——甲醇比一般用于大肠杆菌表达诱导使用的IPTG便宜。第一步——构建载体 Xiang Yang：pPICZ系列有许多克隆位点可供选择，同时也有三种读码框以便不用的用户需要。红叶山庄：有关是选择pPIC9K还是pPICZ系列？pPIC9K属于穿梭质粒，也可以在原核表达，而pPICZ系列比较容易操作，大肠和毕赤酵母均用抗Zeocin筛选（PIC9K操作麻烦一点，大肠用amp抗性，而毕赤酵母先用His缺陷筛选阳性克隆，在利用G418筛选多拷贝），而且对于大小合适（30—50KD）的蛋白在产量上是pPIC9K无法比拟的。 leslie：要做毕赤酵母表达实验，首先当然就要了解这个可爱的酵母了（椭圆形，肥嘟嘟的，十分可爱），她和大肠杆菌长得有较大区别（大肠杆菌是杆状的），因此在培养的过程中要区别这两种菌体，除了气味，浓度，颜色以外，也可以取样到显微镜中观测。大家做毕赤表达的时候应该都遇过这种情况吧，表达过程中染菌（我们实验室曾经污染过各种颜色形状的细菌，那真是一段可怕的经历），如果在不知情的情况下继续做下去，那可以就是浪费大把的

外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略

第22卷第3期吉首大学学报(自然科学版)Vol.22 No.3 2001年9月J ournal of J ishou University(Natural Science Edi ti on)Sept.2001 文章编号:1007-2985(2001)03-0040-05 外源蛋白在巴氏毕赤酵母中高效表达的策略聂东宋,梁宋平,李敏 (湖南师范大学生命科学院,湖南长沙 410081) 摘要:高效表达外源蛋白,在理论和实践上特别是在生物制药中具有重要意义,巴氏毕赤酵母(Pichia pastoris)是表达外源蛋白最理想的真核表达系统之一.影响外源蛋白在P.pas toris中表达的因素很多,主要包括外源基因自身的特性、载体、宿主细胞几个方面,了解和灵活运用它们的联系,有助于获得外源基因在P.pastoris中的高效表达. 关键词:巴氏毕赤酵母;外源蛋白;高效表达中图分类号:Q75 文献标识码:A 巴氏毕赤酵母(P.pastoris)是一种单细胞真核生物,基因工程菌近年来已被广泛用于商业化生产外源蛋白.与其它表达系统比较,该系统具有以下优点:(1)高表达.该表达系统利用醇氧化酶基因启动子很强,细胞生长速度快,所以该表达系统表达的外源蛋白产量很高,如破伤风毒素蛋白的产量高达12g/L[1],其它表达系统一般为毫克级.(2)高稳定.由于该表达系统的表达载体不是以自主复制的质粒形式存在,而是整合到酵母染色体上,所以构建的菌株十分稳定.(3)高分泌.P.pastoris中一些分泌信号和先导序列如a-因子的分子生物特性已研究得十分清楚,加之它身体的生物学特性,其分泌表达可达10g/L,这在已知的分泌表达系统中是十分罕见的.虽然已有许多蛋白在P.pastoris中实现了高效表达,但仍有一些蛋白表达量相对较低,如 -cryptogein表达量级为1~5mg/L[2],AFP在摇瓶中表达时最高水平不超过5mg/L[3],有些甚至不能表达,如HIV表面糖蛋白[4].此外,酵母表达系统的局限性还在于分泌表达产物的不均一性,如信号肽加工不完全,表达产物内部降解等现象[5] 其次,当利用该系统的载体将外源基因通过双交换整合到宿主体中AOX1基因位置时,AOX1基因被破坏,这样使细胞利用甲醇能力大大降低.从而大大延长了细胞培养发酵时间.这种外源蛋白表达的差异,一方面是由于外源基因本身的特性而引起的,另一方面,表达条件也对表达量起了极其重要的作用.笔者综述了影响甲醇酵母中外源基因高效表达的各种因素,并阐述了优化外源蛋白在P.pastoris中高效表达的策略. 1 外源基因本身的特性对表达的影响 1 1外源基因的A+T组成外源基因本身的4种核苷酸的组成对基因的表达起重要作用.许多高A+T含量的基因通常会由于提前终止而不能有效转录,共有序列ATTATTTTATAAA就是一个转录提前终止信号 Caro1A Scorer[6]在表达人免疫缺损病毒(HI V)包膜糖蛋白gp120时,这个信号造成了gp120的转录提前终止.提前终止被认为是一种具有种族特异性的现象,如在P.pastoris中不能表达的HIVE NV蛋白在酿酒酵母中表达良好.[4]因此,可以通过调整高A+T含量区的核苷酸的组成来避免提前终止的发生,使其A+T含量在30%~50% 收稿日期:2001-08-05 基金项目:国家自然科学基金资助项目(39670392) 作者简介:聂东宋(1967-),男,湖南省衡阳县人,湖南师范大学硕士研究生,主要从事基因结构与功能研究.

毕赤酵母表达手册

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毕赤酵母多拷贝表达载体试剂盒用于在含多拷贝基因的毕赤酵母菌中表达并分离重组蛋白综述：基本特征：作为真核生物，毕赤酵母具有高等真核表达系统的许多优点：如蛋白加工、折叠、翻译后修饰等。不仅如此，操作时与E.coli及酿酒酵母同样简单。它比杆状病毒或哺乳动物组织培养等其它真核表达系统更快捷、简单、廉价，且表达水平更高。同为酵母，毕赤酵母具有与酿酒酵母相似的分子及遗传操作优点，且它的外源蛋白表达水平是后者的十倍以至百倍。这些使得毕赤酵母成为非常有用的蛋白表达系统。与酿酒酵母相似技术：许多技术可以通用：互补转化基因置换基因破坏另外，在酿酒酵母中应用的术语也可用于毕赤酵母。例如：HIS4基因都编码组氨酸脱氢酶；两者中基因产物有交叉互补；酿酒酵母中的一些野生型基因与毕赤酵母中的突变基因相互补，如HIS4、LEU2、ARG4、TR11、URA3等基因在毕赤酵母中都有各自相互补的突变基因。毕赤酵母是甲醇营养型酵母：毕赤酵母是甲醇营养型酵母，可利用甲醇作为其唯一碳源。甲醇代谢的第一步是：醇氧化酶利用氧分子将甲醇氧化为甲醛，还有过氧化氢。为避免过氧化氢的毒性，甲醛代谢主要在一个特殊的细胞器－过氧化物酶体－里进行，使得有毒的副产物远离细胞其余组分。由于醇氧化酶与O2的结合率较低，因而毕赤酵母代偿性地产生大量的酶。而调控产生醇过氧化物酶的启动子也正是驱动外源基因在毕赤酵母中表达的启动子。两种醇氧化酶蛋白：毕赤酵母中有两个基因编码醇氧化酶－AOX1及AOX2。细胞中大多数的醇氧化酶是AOX1基因产物。甲醇可紧密调节、诱导AOX1基因的高水平表达，较典型的是占可溶性蛋白的30%以上。AOX1基因已被分离，含AOX1启动子的质粒可用来促进编码外源蛋白的目的基因的表达。AOX2基因与AOX1基因有97%的同源性，但在甲醇中带AOX2基因的菌株比带AOX1基因菌株慢得多，通过这种甲醇利用缓慢表型可分离Muts菌株。表达： AOX1基因的表达在转录水平受调控。在甲醇中生长的细胞大约有5%的polyA+ RNA 来自AOX1基因。AOX1基因调控分两步：抑制/去抑制机制加诱导机制。简单来说，在含葡萄糖的培养基中，即使加入诱导物甲醇转录仍受抑制。为此，用甲醇进行优化诱导时，推荐在甘油培养基中培养。注意即使在甘油中生长（去抑制）时，仍不足以使AOX1基因达到最低水平的表达，诱导物甲醇是AOX1基因可辨表达水平所必需的。 AOX1突变表型：缺失AOX1基因，会丧失大部分的醇氧化酶活性，产生一种表型为Muts的突变株（methanol utilization slow），过去称为Mut，而Muts可更精确地描述突变子的表型。结果细胞代谢甲醇的能力下降，因而在甲醇培养基中生长缓慢。Mut+（methanol utilization plus）指利用甲醇为唯一碳源的野生型菌株。这两种表型用来检测外源基因在毕赤酵母转化子中的整合方式。蛋白胞内及分泌表达：外源蛋白可在毕赤酵母胞内表达或分泌至胞外。分泌表达需要蛋白上的信号肽序列，将外源蛋白靶向分泌通路。几种不同的分泌信号序列已被成功应用，包括几种外源蛋白本身分制作者：陈苗商汉桥

毕赤酵母手册

毕赤酵母表达实验手册作者：Jnuxz 来源：丁香园时间：2007-9-5 大肠杆菌表达系统最突出的优点是工艺简单、产量高、周期短、生产成本低。然而，许多蛋白质在翻译后，需经过翻译后的修饰加工，如磷酸化、糖基化、酰胺化及蛋白酶水解等过程才能转化成活性形式。大肠杆菌缺少上述加工机制，不适合用于表达结构复杂的蛋白质。另外，蛋白质的活性还依赖于形成正确的二硫键并折叠成高级结构，在大肠杆菌中表达的蛋白质往往不能进行正确的折叠，是以包含体状态存在。包含体的形成虽然简化了产物的纯化，但不利于产物的活性，为了得到有活性的蛋白，就需要进行变性溶解及复性等操作，这一过程比较繁琐，同时增加了成本。大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物，不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益引起重视，原因是与大肠杆菌相比，酵母是低等真核生物，除了具有细胞生长快，易于培养，遗传操作简单等原核生物的特点外，又具有真核生物时表达的蛋白质进行正确加工，修饰，合理的空间折叠等功能，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。［1］。同时与大肠杆菌相比，作为单细胞真核生物的酵母菌具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产物的加工修饰能力。酿酒酵母（Saccharomyces.Cerevisiae）在分子遗传学方面被人们的认识最早，也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1981年酿酒酵母表达了第一个外源基因----干扰素基因［2］，随后又有一系列外源基因在该系统得到表达［3、4、5、6］。干扰素和胰岛素虽然已经利用酿酒酵母大量生产并被广泛应用，当利用酿酒酵母制备时，实验室的结果很令人鼓舞，但由实验室扩展到工业规模时，其产量迅速下降。原因是培养基中维特质粒高拷贝数的选择压力消失［7、8］，质粒变得不稳定，拷贝数下降。拷贝数是高效表达的必备因素，因此拷贝数下降，也直接导致外源基因表达量的下降。同时，实验室用培养基成分复杂且昂贵，当采用工业规模能够接受的培养基时，导致了产量的下降［9］。为克服酿酒酵母的局限，1983年美国Wegner等人最先发展了以甲基营养型酵母（methylotrophic yeast）为代表的第二代酵母表达系统［10］。甲基营养型酵母包括：Pichia、Candida等．以Pichia.pastoris（毕赤巴斯德酵母）为宿主

毕赤酵母表达外源基因存在的问题与对策

万方数据

毕赤酵母表达外源基因存在的问题与对策作者：丁镌，宋跃芬，袁野，刘娣作者单位：丁镌,宋跃芬(东北农业大学动物科技学院,黑龙江,哈尔滨,150030)，袁野(中国刑警学院警犬技术系,辽宁,沈阳,110034)，刘娣(东北农业大学动物科技学院,黑龙江,哈尔滨 ,150030;黑龙江省农科院,黑龙江,哈尔滨,150086) 刊名：畜牧与兽医英文刊名：ANIMAL HUSBANDRY & VETERINARY MEDICINE 年，卷(期)：2007,39(2) 被引用次数：1次参考文献(9条) 1.Li A;Xiong F;Lin Q Low temperature increases the yiede of biologically active herring antifreeze protein in Pichia pastoris[外文期刊] 2001(3) 2.Potter K L;Zhang W;Smith L A Production and purification of the heavy chain fragment C of botulinum neurotoxin,serotype A,expressed in the methylotrophic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 2000(3) 3.Inan M;Meagher M M The effect of ethanol and acetate on protein expression[外文期刊] 2001 4.Brierley R A Secretion of recombinant human insulin-like growth factor I (IGF-1) 1998 5.Dring F;Klapper M;Theis S Use of the glyceroldehyde 3phosphate dehydrogenase promoter for production of functional mammalian membrane transport proteins in the yeast Pichia Pastoris[外文期刊] 1998(2) 6.Goodrick J C;Xu M;Finnegan R High-level expression and stabilization of recombinant human chitinase produced in a continuous constitutive Pichia Pastoris expression system[外文期刊] 2001(06) 7.Scorer C A;Buckholz R G;ClareJ J The intracellular production and secretion of HIV-1 envelope protein in the methylotrophic yeast Pichia pastori[外文期刊] 1993 8.Monteino R;Garcia R;Quintero O Variation in N-linked oligosaccharide structures on heterologous proteins secreted by the methylotrophic yeast Pichia pastoris[外文期刊] 1998(02) 9.隋少飞;陈松林巴氏毕赤酵母表达系统的特点及其研究进展[期刊论文]-生物技术通讯 2004(03) 引证文献(1条) 1.王希辉.岳寿松.胡敬东.黄亦钧.陈金龙.王婷婷.范忠玲.赵宏坤鸡白介素18成熟蛋白突变体在毕赤酵母中的高效表达及其生物活性检测[期刊论文]-微生物学报 2010(9) 本文链接：https://www.wendangku.net/doc/e81214874.html,/Periodical_xmysy200702022.aspx

重组巴斯德毕赤酵母高密度培养中铵离子浓度的影响

V o l .30N o.62004212 华　东　理　工　大　学　学　报 Journal of East Ch ina U niversity of Science and T echno logy 基金项目:教育部科学技术研究重点项目(99166);上海市重点学科基金 E -ma il :qye @ecust .edu .cn 收稿日期:2003212208 作者简介:谢静莉(19742),女,江苏南京人,博士研究生,研究方向为发酵工程。研究简报文章编号:100623080(2004)0620723204 重组巴斯德毕赤酵母高密度培养中铵离子浓度的影响谢静莉1,　周庆玮2,　杜　鹏2,　甘人宝2,　叶　勤13 (1.华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室,上海200237; 2.中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所,上海200031) 摘要:采用M u t S 表型的重组毕赤酵母生产血管生长抑制素,表达阶段流加甘油2甲醇混合碳源以提高菌体密度和血管生长抑制素的表达水平,菌体密度可达174g L ,约是表达阶段采用甲醇为单一碳源的发酵过程的3倍。菌体密度的提高导致表达阶段发酵液中铵离子浓度下降很快,当发酵液中的铵离子浓度低至40mm o l L 时,影响了血管生长抑制素的表达。改变pH 调节方式并在发酵后期添加25mm o l L (N H 4)2SO 4使发酵液中铵离子浓度维持在150mm o l L 以上,血管生长抑制素的表达产量达到108m g L 。关键词:巴斯德毕赤酵母;血管生长抑制素;发酵;铵离子浓度中图分类号:TQ 920.6文献标识码:A Effect of Amm on iu m Concen tration on the Expression of Ang iostati n i n H igh Cell D en sity Culture of Recom bi nan t P ich ia p astoris X IE J ing 2li 1 ,　ZH OU Q ing 2w ei 2 ,　DU P eng 2 ,　GA N R en 2bao 2 ,　Y E Q in 13 (1.S ta te K ey L abora tory of B ioreactor E ng ineering ECU S T ,S hang ha i 200237,Ch ina ;2.Institu te of B ioche m istry and Cell B iology ,S hang ha i Institu te of B iolog ica l S cience , Ch inese A cad e m y of S cience ,S hang ha i 200031,Ch ina ) Abstract :In fed 2batch cu ltivati on of recom b inan t P ich ia p astoris (M u t S pheno type ),feeding w ith glycero l and m ethano l w as conducted du ring the exp ressi on phase to enhance the cell grow th and angi o 2statin exp ressi on .T he cell den sity reached 174g L at the end of fer m en tati on ,w h ich w as abou t 3fo ld of that ob tained w ith m ethano l as the so le carbon sou rce in the inducti on phase .H igh cell den sity resu lted in a qu ick drop of amm on ium concen trati on in the fer m en tati on b ro th ,and w hen the amm on ium concen trati on w as below 40mm o l L ,the p roducti on of angi o statin also decreased .T he change of pH con tro l strategy and additi on of 25mm o l L (N H 4)2SO 4w ere app lied to release the effect cau sed by low amm on ium concen 2trati on .T he amm on ium concen trati on w as m ain tained above 150mm o l L in the inducti on p hase ,and 108m g L angi o statin w as ach ieved at the end of fer m en tati on . Key words :P ich ia p astoris ;angi o statin ;fer m en tati on ;amm on ium concen trati on 3 27

巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展

第28卷第1期农业科学研究2007年3月　Vol.28No.1 Journal of Agricultural Sciences Mar.2007 文章编号:167320747(2007)0120068204 巴斯德毕赤酵母表达系统研究进展魏凡华1,2,3,曹瑞兵3,吴　润1,陈溥言3 (1.宁夏大学农学院,宁夏银川　750021;　2.甘肃农业大学,甘肃兰州　730071; 3.南京农业大学农业部疫病诊断与免疫重点开放实验室,江苏南京　210095) 摘　要:巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)表达系统是基因工程研究中广泛使用的真核表达系统,对Pichia pasto2 ris基因结构、载体元件以及影响外源基因表达的因素等进行了较为全面的综述. 关键词:巴斯德毕赤酵母;基因表达系统;研究进展中图分类号:TQ926.1 文献标志码:A 目前,大肠杆菌类原核表达系统虽然较为成熟,但表达产物以包含体形式存在,无翻译后的糖基化等修饰加工过程,并且可能还会有细菌毒素.昆虫细胞表达存在不正确的糖基化,产物复杂,不易纯化,而哺乳动物细胞表达成本高,产量低.甲基营养型巴斯德毕赤酵母(Pichi a p astoris)已发展成为能够生成多种外源蛋白的卓越表达系统. 1　巴斯德毕赤酵母菌株一般用于外源基因表达的Pichi a p astoris菌株有Y211430,M2C10023,GS115,KM71,SMD1168等.根据利用甲醇的能力,可将巴斯德毕赤酵母分为3型[1]:①Mut+型为甲醇快利用型,此型毕赤酵母具有完整的AOX1和AOX2基因,绝大多数毕赤酵母为Mut+表型.②Muts型,此型毕赤酵母(如KM71)菌细胞AOX2基因编码的醇氧化酶可依赖15%AOX活性,为甲醇慢利用型.③Mut2型(如M2G10023),此型毕赤酵母AOX1及AOX2基因均被敲除,为甲醇不利用型.研究发现,蛋白酶缺陷型毕赤酵母,如SMD1163, SMD1165和SMD1168可有效降低外源目的蛋白的酶解.一般说来,蛋白胞内表达时,优先考虑用Muts表型,对于分泌表达,Mut+和Muts都可使用.甲醇慢利用型有时比Mut+型菌株能够达到更高的表达量[2]. 2　Pichi a p astoris表达载体载体是由许多元件构成的,包括启动子、终止子、选择标记、报告基因、复制起点和信号肽序列等,典型的表达载体含有乙醇氧化酶基因5′AOX1启动子和3′AOX1终止子,其中含有供外源基因插入的多克隆位点,以组氨醇脱氢酶基因HIS4作为互补筛选标志或ZeocinR作为筛选标志. 2.1　启动子 Pichia pastoris含有两个基因编码醇氧化酶: AOX1和AOX2,二者序列有92%同源性,但是AOX1表达水平高于AOX2.AOX1启动子的表达受甲醇严格调控[3].以甲醇为碳源生长时,约5%的mRNA 由AOX1基因转录.P GA P(三磷酸甘油醛脱氢酶启动子)是最近在毕赤酵母中克隆到的一个组成型启动子,GA P启动子不需甲醇诱导,发酵工艺更为简单.Vassilen利用GA P启动子表达乙肝表面抗原获得高表达[4],Genzyme也利用GA P启动子表达人几丁质酶,不仅获得高表达,而且还可以避免蛋白酶水解[5].Phongdara在H ansenul a pol y mor p ha克隆到酸性磷酸酶(p HO1)基因启动子[6].这些启动子丰富了甲醇酵母对启动子的选择. 2.2　选择标记选择标记一般为对应于营养缺陷型受体的野生型基因,常用HIS4,也可用来源于酿酒酵母的AR G4基因和SUC2基因.kanr基因和Shbler基因能够作为细菌和酵母菌的选择标记,因此较其他表达载体更易于筛选. 2.3　信号肽序列可供毕赤酵母选择的信号肽有外源蛋白自身的收稿日期:2006205220 作者简介:魏凡华(19802),男,宁夏隆德人,硕士研究生,主要从事微生物学与免疫学研究.

CHO细胞表达系统与酵母细胞表达系统比较

CHO细胞表达系统与酵母细胞表达系统比较 CHO细胞表达系统与毕赤酵母表达系统是当前发展前景看好的两个表达系统，为了能够更加直观地对两个表达系统有一定的认识，特意在此篇中对两个表达系统作一定的比较，从而能够更进一步的对两个表达系统有更深的了解 1．CHO细胞表达系统（1）优点 CHO细胞属于成纤维细胞，既可以贴壁生长。也可以悬浮生长。目前常用的CHO细胞包括原始CHO和二氢叶酸还原酶双倍体基因缺失型(DHFR-)突变株CHO。近年来，为降低生产成本和减少血制品带来的潜在危害性，动物细胞生产开始使用无血清培养基(SFM)，但SFM往往导致细胞活力差，贴壁性差，分泌外源蛋白的能力差等缺点。另有研究者尝试将类胰岛素生长因子IGF基因和转铁蛋白基因转入CHO细胞获得能自身分泌必需蛋白的“超级CHO”，无需在培养基中转铁蛋白和胰岛素，细胞可在SFM 中生长良好。与其他表达系统相比，CHO表达系统具有以下的优点： (1)具有准确的转录后修饰功能，表达的蛋白在分子结构、理化特性和生物学功能方面最接近于天然蛋白分子； (2)既可贴壁生长，又可以悬浮培养，且有较高的耐受剪切力和渗透压能力； (3)具有重组基因的高效扩增和表达能力，外源蛋白的整合稳定； (4)具有产物胞外分泌功能，并且很少分泌自身的内源蛋白，便于下游产物分离纯化； (5)能以悬浮培养方式或在无血清培养基中达到高密度培养。且培养体积能达到1000L以上，可以大规模生产。（2）存在的问题在过去的几十年里，人类对动物细胞的培养技术进行了大量的研究开发，取得了很大进展，但是利用CHO细胞表达外源基因的技术水平尚不能满足生物药品的开发和生产的要求，目前上游工作中主要存在以下问题： ①构建的重组CHO细胞生产效率低，产物浓度亦低； ②某些糖基化表达产物不稳定，不易纯化； ③重组CHO细胞上游构建与下游分离纯化脱节，主要表现在上游构建时着重考虑它的高效表达，而对高教表达的产物是否能有效地提取出来，即分离纯化过程考虑较少； ④重组细胞培养费用昂贵，自动化水平低下。 2．毕赤酵母细胞表达系统（1）特点自1987年Gregg等首次在毕赤酵母中表达乙型肝炎表面抗原(HBsAg)到1995年，已有四十多种外源蛋白在毕赤酵母宿主菌中获得表达。而最近几年每年报道的在毕赤酵母中表达的外源基因就有几十种，且一年比一年多，与其它表达系统相比，毕赤酵母表达系统具有以下优势： 1）含有特有的强有力的AOX（醇氧化酶基因）启动子，用甲醇可严格地调控外源基因的表达； 2）表达水平高，即可在胞内表达，又可分泌型表达。毕赤酵母中，报道的最高表达量为破伤风毒素C为12g/l，一般大于1g/l。绝大多数外源基因比在细菌、酿酒酵母、动物细胞中表达水平高。一般毕赤酵母中外源基因都带有指导分泌的信号肽序列，使表达的外源目的蛋白分泌到发酵液中，有利于分离纯化； 3）发酵工艺成熟，易放大。已经有大规模工业化高密度生产的发酵工艺，且细胞干重达100g/l 以上，表达重组蛋白时，已成功放大到10000升； 4）培养成本低，产物易分离。毕赤酵母所用发酵培养基十分廉价，一般碳源为甘油或葡萄糖及甲

毕赤酵母表达操作手册(精译版)

巴斯德毕赤酵母表达系统

文章编号:100128751(2002)0620246205 巴斯德毕赤酵母表达系统唐元家　余柏松　综述(中国医药集团四川抗菌素工业研究所,　成都610051) 摘要:　巴斯德毕赤酵母表达系统在DNA 重组技术中得到越来越广泛的应用。该酵母具有独特的生物学特性,作为真核表达系统,具有严格调控外源蛋白的表达,加工修饰表达产物,表达量高,营养要求低等优点;在该表达系统中,主要有3种表达宿主菌,其载体包括整合型载体和自我复制型游离载体,其转化和表达比大肠埃希氏菌系统复杂;巴斯德毕赤酵母中表达产物可分泌至胞外,从而获得较高表达量和利于表达产物的分离纯化。关键词:　巴斯德毕赤酵母;　外源蛋白;　表达中图分类号:　Q816　文献标识码:　A 　收稿日期:2001209227　修订日期:2002206215 　作者简介:唐元家,男,生于1975年,在读硕士研究生,主要从事基因工程药物的研究。余柏松,男,生于1957年,硕士,研究员,主要从事生物药物的研究及开发。基因工程技术的发展为生物体生产外源蛋白展示了广阔的前景。到目前为止,已发展了多种蛋白质表达系统,比如大肠埃希氏菌表达系统,酵母表达系统,高等真核细胞表达系统等。长期以来,人们用大肠埃希氏菌作为宿主表达了多种蛋白。这是因为大肠埃希氏菌具有若干优点,如遗传背景和生化特性清楚,容易操作,生长迅速,营养要求简单等。但这一系统本身也存在若干缺陷:(1)缺少真核生物的蛋白翻译后的修饰和加工,如剪切、糖基化、形成二硫键等;(2)表达的蛋白多形成不溶性包含体,需要经过复杂的复性才能恢复构象和活性;(3)背景蛋白很多,纯化麻烦;(4)表达量一般不是很高。从1979年开始,为了克服大肠埃希氏菌表达系统的缺点,发展了酵母表达系统。最先使用的是酿酒酵母,它具有繁殖速度快,能高密度发酵,可以进行蛋白质翻译后的修饰和加工等优点。1981 年Hitzeman 等用酿酒酵母表达人干扰素获得成功〔1〕。此后用该系统还表达了其它多种原核和真核蛋白,但酿酒酵母系统也具有局限性,如缺乏强有力的启动子, 分泌效率差,表达菌株不够稳定,表达质粒易于丢失等。有鉴于此,人们发展了新一代的酵母表达系统———巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris )表达系统,即甲醇酵母表达系统。 1　巴斯德毕赤酵母表达系统的优点巴斯德毕赤酵母表达系统是近年来发展迅速、应用广泛的一种真核表达系统,有许多其它蛋白表达系统所不具备的优点。(1)具有强有力的乙醇氧化酶(AOX1)基因启动子,可严格调控外源蛋白的表达;(2) 作为真核表达系统,可对表达的蛋白进行加工折叠和翻译后修饰,。比如,用原核表达系统表达人组织型基质金属蛋白酶抑制剂(TI MP ),虽然获得了大量重组蛋白,但是由于重组蛋白形成包含体,难以使TI MP 分子内的6对二硫键正确折叠配对,始终未能得到有活性的全长分子。李克勤等用巴斯德毕赤酵母表达系统获得了分泌型前正确折叠的TI MP 21,重组蛋白的表达量达40mg/L 〔2〕 ;(3)营养要求低,生长快,培养基廉价,与昆虫、哺乳动物等高等真核细胞相比,巴斯德毕赤酵母易于进行操作和培养。巴斯德毕赤酵母对需氧生长有强的偏好,这一生理学特性使得它既能高密度发酵生长,亦有利于工业放大生产;(4)表达量高。酿酒酵母中表皮生长因子(EG F )的表达量为714mg/L ,而在巴斯德毕赤酵母中的表达量为450mg/L ,表达量提高约60倍。许多蛋白在巴斯德毕赤酵母中的表达量可达到g/L 以上水平,如破伤风毒素C 片段表达量达12g/L 〔3〕 ,Heva brasiliensis 羟腈裂合酶的表达水平高达22g/L 〔4〕 ;(5)在巴斯德毕赤酵母中表达的蛋白既可存在于胞内,又可分泌到胞外。由于巴斯德毕赤酵母自身分泌的蛋白(背景蛋白)非常少和培养基中不含其他的蛋白质,这样分泌的外源蛋白占了培养液中总蛋白的绝大部分,因此十分有利于外源蛋白的分离和纯化,如表达的重组水蛭素 (HIR ),仅经过二步层析纯化,纯度高达97%以上〔5〕 ,表达的人重组白细胞介素经过疏水层析、离子交换和凝胶过滤三步纯度即可达到99%〔6〕 ;(6)外源基因能通过质粒整合到巴斯德毕赤酵母基因组上,这样得到