生化实验指导

生物化学实验指导

海洋学院生物化学课程组编

2008年7月22日

目录

实验室守则 (2)

实验一糖类的定量测定 (4)

实验二薄层层析法分析氨基酸 (7)

实验三氨基酸含量的测定 (9)

实验四酪蛋白的制备 (11)

实验五考马斯亮蓝G-250 法测定蛋白质含量 (13)

实验六垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳法 (17)

实验七 DNA的提取制备 (29)

实验八酶活性的测定 (33)

实验九过氧化物酶同工酶分析 (37)

海洋学院实验记录的基本要求 (42)

实验报告撰写要求 (44)

实验室守则（试行）

一、安全卫生

1.所有进入实验室的人员都有监督实验室安全、卫生、仪器操作和维护的义务。

2.在测定完成后，使用者须做好实验室的清洁工作，将公用物品归还原位，立即

将所使用过的试验台、实验用品等清洗干净，清除垃圾，并及时归还所借物品。

3.实验室安全卫生实行值日生制，值日生在每天使用完实验室后进行检查，必须

保持实验室内环境整洁，走道畅通，设备器材摆放整齐。

4.禁止在实验室吸烟、吃东西、乱抛纸屑杂物。

5.最后一个离开实验室的人一定要关好水、电、门和窗。

二、仪器使用

1.严禁在实验台的插孔上使用功率大的电器。

2.对于功率大的电器，如烘箱、马福炉等，请严格按照要求操作，每天应在晚上

十点前关闭。

3.烘箱是不锈钢体的，不能将未洗干净的物品放进烘箱。不能用不干净的抹布擦

烘箱。

4.使用离心机，离心管一定要称重平衡后，对称放置。

5.天平，特别是万分之一的天平不得任意搬动。使用完毕后应立即清扫天平，以

免化学试剂腐蚀天平。

6.不能用实验室的分样器、加样枪加强酸或强碱，以免腐蚀。

7.气瓶内气体不能用尽，必须留有剩余压力(如氧气不少于2 Kg/m2)。

8.有毒或有腐蚀性气体的实验必须在通风橱内进行。

9.实验后的废渣、废液，要倒在废渣箱和废液缸中，不准随便倾倒或倒入水池中。

10.超净台使用注意事项：保持干净，紫外灯的使用时需遮盖前面板。

11.冰箱：不得放危险品，或相邻能起化学反应的药品。

三、实验数据及其处理

1.所有实验室存储的样品、试剂必须如实写好标签，如样品应有样品名称、存放

时间、存放人。配制的试剂应有试剂名称、浓度、配制时间和配制人等。

2.必须进行至少三次平行实验，以求得标准偏差。数据图须标有误差棒。

3.实验中，必须如实地记录各种实验数据。实验后，二星期内完成实验结果整理，

正确处理实验数据，不得更改原始数据。

实验一糖类的定量测定

一、实验目的

香菇，又称香蕈、冬菇，是一种生长在木材上的真菌类，它含有大量的氨基酸等对人体有益的营养物质，还含有很多的多糖。香菇多糖具有抗病毒、抗肿瘤、调节免疫功能和刺激干扰素形成等功能。本实验学习香菇水溶性糖类的提取及定量测定方法。

二、实验原理

香菇的可溶性糖主要是指能溶于水及乙醇的单糖和寡聚糖。蒽酮比色定糖法是一个快速而方便的定糖方法，在强酸性条件下，游离的或多糖中存在的己糖、戊糖及己糖醛酸（还原性和非还原性）经强酸脱水生成糠醛或羟甲基糠醛，糠醛或羟甲基糠醛与蒽酮反应生成蓝绿色的糠醛衍生物，其颜色的深浅与糖的含量在一定范围内成正比。蒽酮也可以和其他一些糖类发生反应，但显现的颜色不同。当存在含有较多色氨酸的蛋白质时，反应不稳定，呈现红色。上述特定的糖类物质，反应较稳定。

反应式：

该法特点：灵敏度高，测定量少，快速方便。

三、实验仪器及试剂

1．仪器：分光光度计、电炉、铝锅、20mL刻度试管、刻度吸管、记号笔、吸水纸适量。

2．试剂：

（1）2g/L蒽酮试剂：称取2g蒽酮（AR）溶于1000ml的浓硫酸中，当日配置使用。

（2）1％葡萄糖标准液：将分析纯葡萄糖在80℃下烘至恒重，精确称取1.000g。加少量水溶解，移入100mL容量瓶中，加入0.5mL浓硫酸，用蒸馏水定容至刻度。（3）100ug/ml糖标准液：精确吸取1％葡萄糖标准液1mL加入100mL容量瓶中，加水定容。

四、实验步骤

1．标准曲线的制作：

取20mL刻度试管11支，从0－10分别编号，按表1－1加入溶液和水，加标准糖液0.0、0.10、0.20、0.40、0.60、0.80、1.20、1.60，用水补足至2ml，然后向试管内加入8.00mL 蒽酮试剂，摇匀后迅速浸入冰水浴中冷却，各管加完后一起浸入沸水浴中，管口加盖以防蒸发。自沸水浴重新煮沸起，准确煮沸10分钟取出，用

自来水冷却，室温放置10分钟左右，于620nm比色。以糖含量为横坐标，光密度为纵坐标，绘制标准曲线，求出标准直线方程。

2．可溶性糖的提取：

取干或新鲜香菇子实体，擦净表面污物，粉碎，称取1.0g，用80-90℃热水30ml，在80-90℃恒温水浴锅中提取30分钟，4000 rpm离心10分钟。收集上清液，沉淀重复提取一次，合并两次上清液，用循环水真空泵抽滤除去漂浮物。吸取滤液1.0ml 稀释至100 ml，得待测样液。

3．测定：

吸取2.0mL样品液于试管中（重复2次），向试管内加入8.00mL 蒽酮试剂，摇匀后迅速浸入冰水浴中冷却，各管加完后一起浸入沸水浴中，管口加盖以防蒸发。自沸水浴重新煮沸起，准确煮沸10分钟取出，用自来水冷却，室温放置10分钟左右，于620nm比色。由标准线性方程求出糖的量，按下式计算测试样品中糖含量。糖的含量＝（C×n×V）/（α×W）

式中：C一标准方程求得糖量（ug）；

n一稀释倍数；

V－提取液量（mL）；

α一吸取样品液体积（mL）；

W一（g）

五、思考题

1、简述苯酚法与蒽酮法测定可溶性糖的基本原理。

2、干扰可溶性糖测定的主要因素有哪些？怎样避免？

实验二薄层层析法分析氨基酸

一、实验目的

1.掌握薄层层析的一般原理和操作方法。

2.了解氨基酸的特征性颜色反应。

3.学会分析未知样品的氨基酸成分。

二、实验原理

薄层层析所依据的原理就是利用不同

物质在两种互不相溶的溶剂中溶解度的

不同而达到分离的目的。实验是在特制

的薄层层析板上进行。板上的吸附剂（如

硅胶）可视作惰性载体，吸附在吸附剂

上的水作为固定相，而有机溶剂作流动

相。将要分离的混合物点在滤纸的一端，

随着展开剂的移动，由于各组分在两相

中的分配系数不同，各组分就以不同速

度在滤纸上随展开剂移动。展开剂停止移动，各组分就停留在滤纸的不同位置上。若各组分无色，可根据其性质。喷上显色剂，以观察斑点的位置。

用Rf值表示各组分的移动率：

b

a R

f

a为溶剂移动的距离，b为各组移动的距离。

各组分的Rf值随实验条件而变化，因此在鉴定时常常采用标准样品对照。此法一般适用于微量有机物质（5—500微克）的定性分析，分离出来的色点也能用比色方法定量。

三、实验仪器及试剂

薄层

1、仪器：色谱缸（或带木塞和挂钩的试剂瓶）、直尺、铅笔、薄层层析板、量筒、喷雾器、点样毛细管。

2、试剂：1.0g·L-1天冬氨酸、1.0g·L-1蛋氨酸 1.0g·L-1亮氨酸

展开剂（正丁醇:甲酸:水=15:3:2）、0.1%茚三铜丙酮溶液。

四、实验步骤

1、点样

取薄层层析板一块，在距下端1.5cm处用铅笔轻轻画一条与下端平行的直线，作为原点线；距原点线10厘米处再画一平行线，作为溶剂前沿线。在原点线上用铅笔每隔2.3cm处画一小圆圈，做为点样的位置。

用毛细管点样：每种5-20ul为宜。点样的斑点直径不要超过0.3cm。在整个操作过程中，手和其它物质不要接触层析板的层析部分（即展开相流经的部分）。

2、展开

将层析板放入层析缸中，先使层析板不接触展开剂。在展开剂（正丁醇：甲酸：水=15：3：2）的蒸气中饱和20分钟。然后将层析板浸入展开剂约1cm。展开剂沿纸而上升，当达到前沿线时，取出层析板，立即用铅笔划出溶剂前沿位置，晾干。

3、显色

将层析板干燥，向层析板均匀喷洒0.1%茚三酮的丙酮溶液，干燥后，电吹风吹干，用铅笔描出斑点形状。用尺测算各斑点的Rf值，判断混合物中含有什么氨基酸。

五、思考题

（1）薄层层析法的特征和用途是什么？

（2）影响Rf值大小的因素有哪些？

（3）展开前为什么需要一个饱和过程？

实验三氨基酸含量的测定

一、目的

学习茚三酮比色法测定氨基酸含量的原理，学会具体的操作方法，了解本方法的应用。

二、原理

氨基酸在一定PH范围内能与茚三酮溶液生成紫色化合物。该化合物颜色的深浅与氨基酸的含量成正比，可通过测定570nm 处的光密度，测定氨基酸的含量。

三、实验仪器及试剂

（1）标准氨基酸溶液：配制成200ug/mL 溶液。

（2）pH8.04磷酸缓冲液：称磷酸二氢钾4.5350克定容500ml；称磷酸氢二钠11.9380克定容500ml.取磷酸二氢钾10ml和磷酸氢二钠190ml混合即pH8.04磷酸缓冲液

（3）0.2%茚三酮显色液：称取1g 茚三酮溶于35ml热水，加入40mgSnCl2.H2O搅拌过滤，滤液于冷暗处过夜，定容50ml .

（4）样品液：每毫升含0.5～50μg 氨基酸。

（5）分光光度计。

（6）水浴锅。

四、操作步骤

1、标准曲线的制作

分别取标准氨基酸溶液0，0.4，0.8，1.0，1.2，1.6mL 于比色管中，用水补足至4mL。各加入1mL缓冲液；再加入1mL 茚三酮显色液，充分混匀后，盖住试管口，在100℃沸水浴中加热15min，冷却定容25ml。放置15min 后，用分光光度计测定OD570nm。（脯氨酸和羟脯氨酸与茚三酮反应呈黄色，应测定OD440nm）。以OD570nm 为纵坐标，氨基酸含量为横坐标，绘制标准曲线。

2、氨基酸样品的测定

取样品液1mL，加入水3ml，缓冲液1mL 和茚三酮显色液1mL，混匀后于100℃沸水浴中加热15min，冷却定容25ml。放置15min 后，摇匀后测定OD570nm。将样品测定的OD570nm 与标准曲线对照，可确定样品中氨基酸含量。

五、结果计算

OD570nm对应标准曲线查得值

氨基酸含量（ug/g）=

样品克数

六、思考题

1．茚三酮是否可用于氨基酸和蛋白质的定性鉴定？

实验四酪蛋白的制备

一、目的

1、学习从牛奶中制备酪蛋白的原理和方法。

2、掌握等电点沉淀法提取蛋白质的方法。

二、原理

牛乳中的主要的蛋白质是酪蛋白，含量约为35g/L。酪蛋白是一些含磷蛋白质的混合物，等电点为4.7。利用等电点时溶解度最低的原理，将牛乳的pH调至4.7时，酪蛋白就沉淀出来。用乙醇洗涤沉淀物，除去脂类杂质后便可得到纯酪蛋白。

三、材料、试剂与器具

1．材料

新鲜牛奶

2．试剂

1、95%乙醇 1 200mL

2、无水乙醚 1 200mL

3、0.2mol/L pH4.7醋酸——醋酸钠缓冲液 300ml

先配A液与B液

A液：0.2mol/L醋酸钠溶液称NaAC·3H2O 54.44g，定容至2000ml。

B液：0.2mol/L醋酸溶液，称优纯醋酸（含量大于99.8%）12.0g定容至1000ml。

取A液1770ml，B液1230ml混合即得Ph4.7的醋酸——醋酸钠缓冲液3000ml。

4、乙醇——乙醚混合液

乙醇：乙醚=1 ：1（V/V）

3．器具

离心机、抽滤装置、精密pH试纸或酸度计、电炉、烧杯、温度计

四、操作步骤

1．酪蛋白的粗提

100mL 牛奶加热至40℃。在搅拌下慢慢加入预热至40℃、pH4.7的醋酸缓冲液100mL.用精密pH 试纸或酸度计调pH 至4.7。

将上述悬浮液冷却至室温。离心15分钟（3000 r /min ）。弃去清液，得酪蛋白粗制品。

2．酪蛋白的纯化

（1）用水洗涤沉淀 3次，离心10分钟（3 000r/min ），弃去上清液。

（2）在沉淀中加入30mL 乙醇，搅拌片刻，将全部悬浊液转移至布氏漏斗中抽滤。用乙醇—乙醚混合液洗沉淀2次。最后用乙醚洗沉淀2次，抽干。

（3）将沉淀摊开在表面 上，风干；得酪蛋白纯品。

3．准确称重，计算含量和得率。

含量：酪蛋白g/100 mL 牛乳（g%）

100% 测得含量

得率:理论含量

式中理论含量为3.5g/100mL 牛乳。

五、注意事项

1．由于本法是应用等电点沉淀法来制备蛋白质，故调节牛奶液的等电点一定要准确。最好用酸度计测定。

2．精制过程用乙醚是挥发性、有毒的有机溶剂，最好在通风橱内操作。

3．目前市面上出售的牛奶是经加工的奶制品，不是纯净牛奶，所以计算时应按产品的相应指标计算。

六、实验报告

1．根据实际操作，以流程图形式总结酪蛋的制备方法。

2．合理分析实验所得率

七、思考题

1．制备高产率纯酪蛋白的关键是什么？

2．试设计另一种提取酪蛋白的方法？

实验五 考马斯亮蓝G-250 法测定蛋白质含量

一、目的

学习和掌握考马斯亮蓝G-250 测定蛋白质含量的原理，学会测定蛋白质的方法，了解本方法的具体应用范围。

二、原理

考马斯亮蓝G-250（Coomassie brilliant blue G-250）测定蛋白质含量属于染料结合法的一种。考马斯亮蓝G-250 在游离状态下呈红色，最大光吸收在488nm ；

当它与蛋白质结合后变为青色，蛋白质-色素结合物在595nm 波长下有最大光吸收。其光吸收值与蛋白质含量成正比，因此可用于蛋白质的定量测定。蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合在2min 左右的时间内达到平衡，完成反应十分迅速；其结合物在室温下1h 内保持稳定。该法是1976年Bradford 建立，试剂配制简单，操作简便快捷，反应非常灵敏，灵敏度比Lowry 法还高4 倍，可测定微克级蛋白质含量，测定蛋白质浓度范围为0～1 000μg／mL，是一种常用的微量蛋白质快速测定方法。

三、实验器材及试剂

1．实验材料：新鲜绿豆芽

2．主要仪器

（1）分析天平、台式天平（2）刻度吸管（3）具塞试管、试管架（4）研钵（5）离心机、离心管（6）烧杯、量筒（7）微量取样器（8）分光光度计

3．试剂

（1）100ug/ml牛血清白蛋白标准溶液的配制：准确称取100mg 牛血清白蛋白，溶于100mL 蒸馏水中，即为1 000μg／mL 的原液。用时稀释10倍得100ug/ml。（2）蛋白试剂考马斯亮蓝G-250 的配制：称取100mg 考马斯亮蓝G-250，溶于50mL90％乙醇中，加入85％（W／V）的磷酸100mL，最后用蒸馏水定容到1 000mL。此溶液在常温下可放置一个月。

（3）乙醇（4）磷酸（85％）

四、操作步骤

1、标准曲线制作

（1）0~100μg／mL 标准曲线的制作：取6 支10mL 干净的具塞试管，按表1 取样。盖塞后，将各试管中溶液纵向倒转混合，放置2min 后用1cm 光经的比色杯在595nm 波长下比色，记录各管测定的光密度OD595nm，并做标准曲线。

表1 低浓度标准曲线制作

管号 1 2 3 4 5 6

标准蛋白液（mL）0 0.02 0.04 0.06 0.08 0.10

蒸馏水（mL） 1.00 0.98 0.96 0.94 0.92 0.90

考马斯亮蓝试剂（mL） 5 5 5 5 5 5

蛋白质含量（μg）0 20 40 60 80 100

OD595nm

（2）0~1 000μg／mL 标准曲线的制作：另取6 支10mL 具塞试管，按表2 取样。其余步骤同（1）操作，做出蛋白质浓度为0~1 000μg／mL 的标准曲线。

表2 高浓度标准曲线制作

管号7 8 9 10 11 12

标准蛋白液（mL）0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

蒸馏水（mL） 1.00 0.8 0.6 0.4 0.2 0

考马斯亮蓝试剂（mL） 5 5 5 5 5 5

蛋白质含量（μg）

OD595nm

2、样品提取液中蛋白质浓度的测定

（1）待测样品制备：称取新鲜绿豆芽下胚轴2g 放入研钵中，加2mL 蒸馏水研磨成匀浆，转移到离心管中，再用6mL 蒸馏水分次洗涤研钵，洗涤液收集于同一离心管中，放置0.5~1h 以充分提取，然后在4 000r/min 离心20min，弃沉淀，上清转入10mL 容量瓶，以蒸馏水定容至刻度，得待测样品提取液。

（2）测定：另取2 支10mL 具塞试管，按下表取样。吸取提取液0.2mL（做一重复），放入具塞刻度试管中，加入5mL 考马斯亮蓝G-250 蛋白试剂，充分混合，放置2min 后用1cm 光径比色杯在595nm 下比色，记录光密度OD595nm，并通过标准曲线查得待测样品提取液中蛋白质的含量X（μg）。以标准曲线1 号试管做空白。表3 待测液蛋白质浓度测定

管号13 14

蛋白质待测样品提取液（mL）0.2 0.2

蒸馏水（mL）0.8 0.8

考马斯亮蓝G-250试剂（mL） 5 5

OD595nm

蛋白质含量（μg）

五、结果计算

提取液总体积（mL）

X×

测定时取样体积（mL）

样品蛋白质含量（μg / g 鲜重）=

样品鲜重（g）

式中：X 为在标准曲线上查得的蛋白质含量（μg）。

六、附注

1．Bradford 法由于染色方法简单迅速，干扰物质少，灵敏度高，现已广泛应用于蛋白质含量的测定。

2．有些阳离子，如K+、Na+、Mg2+、(NH4)2SO4、乙醇等物质不干扰测定，但大量的去污剂如TritonX-100、SDS 等严重干扰测定。

3．蛋白质与考马斯亮蓝G-250 结合的反应十分迅速，在2min 左右反应达到平衡；其结合物在室温下1h内保持稳定。因此测定时，不可放置太长时间，否则将使测定结果偏低。

七、思考题

1、考马斯亮蓝G-250测定蛋白质含量应该注意些什么？

2、制作标准曲线及测定样品时，为什么要将各试管中溶液纵向倒转混合？

实验六垂直板聚丙烯酰胺凝胶电泳法

一、目的要求

(1) 学习聚丙烯酰胺凝胶电泳原理

(2) 掌握聚丙烯酰胺凝胶垂直板电泳的操作技术。

二、实验原理

1、电泳的概念

带电粒子在电场中向与其自身带相反电荷的电极移动，这种现象称为电泳。多年来，电泳作为一项有效的分析、分离和制备技术发展很快，在生产、科研和医疗工作中得到了广泛应用。利用电泳技术分离、分析蛋白质、酶、核酸等生物大分子，有较高的分利率，目前已成为生物科学研究中必不可少的手段之一。

2、电泳具有的特点

①凡是带电物质均可应用某一电泳技术进行分离，并可进行定性或定量分析②样品量极少③设备简单④操作简便⑤分辨率高⑥便于观察、记录和保存。

3、电泳的基本原理

在溶液中任何一个带电颗粒在电场作用下的移动大致要受到三方面的影响：①颗粒的性质，如：实际电荷，大小及形状，解离强度的难易等。②所处的环境，如：电解质或缓冲液的浓度，离子强度，pH，粘度，温度等。③应用电场的性质，如：电场强度。不同带电颗粒在同一电场中泳动的速度不同，常用泳动度或迁移率来表示，迁移率是指带电颗粒在单位电场强度下泳动的速度。其数学表达式如下：

μ=v/E=dL/Ut

式中：μ 是迁移率； v 是颗粒迁移速度（cm/s或min）；E 是电场强度或电势梯度（V/cm）；d 是颗粒移动距离（cm）；L 是支持物的有效长度（cm）；U 是支持

物两端实际电压（V）；t 是通电时间。颗粒的迁移率可通过测量d 、I、U、t 计算出。影响迁移率的主要因素具体讨论如下：

（1）带电颗粒的性质

即净电荷数量，颗粒大小及形状。一般来说，颗粒带净电荷多，直径小而近于球形，则泳动速度快，反之则慢。物质在电场中所受到的力（F）为：

F＝EQ ①

式中：E是电场强度，即单位长度支持物的电位降；Q是物质颗粒的净电荷。根据史氏定律（Stoke’s law）。球形分子在液体中泳动所受到的阻力（摩擦力）Fˊ为：

Fˊ＝6 π r ηυ②

式中：r是分子半径；η是介质粘度；υ是分子泳动速度；6π是常数。

当颗粒半径较大时，则常数为4π，即此常数在4π～6π之间，视颗粒半径大小而定。当物质在电场中受到的力与物质在液体中受到阻力平衡时，F＝Fˊ

与②合并；EQ＝6 π r ηυ; υ=EQ/6 π r η………………错误！未找到引用源。

由于υ是电泳速度（cm／s）E 是电场强度（V／cm）所以μ的单位是（cm2/ s·V）。将③代入上式中，则：u = v/E = Q/6πrη。

这就是迁移率公式。由此可见，迁移率与分子的形状、介质粘度、颗粒所带电荷有关。其与颗粒表面电荷成正比，与介质粘度及颗粒半径成反比。然而在实际电泳中，带电颗粒的迁移率总是比理想的稀溶液中要低些。因为电泳中使用的是具有一定浓度的缓冲溶液。带电荷的生物分子在电解质缓冲溶液中将带有相反电荷的离子吸引到其周围，形成一离子扩散层。在电场中，当颗粒向相反电极移动时，离子扩散层所带有的过剩电荷向颗粒泳动的反方向移动，结果，颗粒与离子扩散层之间的静电引力使颗粒的泳动速度减慢。另外，分子颗粒表面有一层水，在电场影响下，它与颗粒一起移动，可以认为是颗粒的一部分。

（2）电场强度

电场强度也称电位梯度，是指单位长度（每1cm）支持物体上的电位降，它对泳动度起着十分重要的作用，例如纸电泳，测量25cm长纸条两端电压降为250 V，则电场强度为250 V／25 cm＝ 10 V／cm。一般电场强度越高，带电颗粒移动速度越快。根据电场强度大小，可将电泳分为常压电泳和高压电泳。前者的电压在 100～500 V，电场强度一般是 2～10 V／cm，分离时间需数小时至数天；后者电压可高达500～1000 V，电场强度在20～2000 V／cm，电泳时间短，有时仅几分钟即可，主要用于分离氨基酸、肽、核苷酸。由于电压升高，电流也随之增大，故需冷却装置。

（3）溶液的pH

溶液的pH决定了带电颗粒解离的程度，也决定了物质所带净电荷的多少。对于蛋白质、氨基酸等两性电解质而言，溶液pH离等电点越远，颗粒所带净电荷越多，电泳速度越快，反之则越慢。例如，血清中几种主要蛋白质的等电点各不相同，白蛋白pI＝4.0，α2球蛋白pI＝5.06，β球蛋白等pI＝5.1，γ球蛋白 pI=7.1。当在pI=8.6的缓冲液中电泳时，这些蛋白质都带负电荷，它们的泳动速度：白蛋白＞α2球蛋白＞β球蛋白＞γ球蛋白。因此，当要分离一种蛋白质混合物时，应选择一种能使各种蛋白质所带电荷量差异明显的pH值，以利于各种蛋白质分子的解离。（4）溶液的离子强度

溶液的离子强度是另一个重要条件。在保持足够缓冲能力前提下，离子强度要求最小。溶液的离子强度越高，带电颗粒泳动速度越慢，反之越快。通常缓冲液离子强度选择在0.05～0.1mol／L之间。在缓冲液中离子强度可用下式计算：

I＝0.5∑c Z2

式中：I一溶液的离子强度；c一离子的浓度；Z一离子的价数。

例如：求0.154 mol／L。NaCl 溶液的离子强度。

I＝0.5 ×（0.154 ×I 2＋0.154 ×I 2）= 0.154

浓度大的缓冲液在合适电压下，有较低的电阻和较大的电流，产热较高。离子强度很高时要用低电压，避免过多产热，这样又导致电泳时间延长，增加变性和区带分离困难。

（5）电渗作用

在有支持物的电泳中，影响电泳的另一个重要因素是电渗作用。所谓电渗就是指在电场中，液体对固体支持物的相对移动。例如在 pH 8.6时，血清蛋白质进行纸电泳时，γ球蛋白与其他蛋白质一样带负电荷，应该向正极移动，然而它却向负极方向移动，这就是电渗作用的结果。滤纸的纤维间具有大量孔隙带有负电荷，如一束毛细管，进行电泳时蛋白质通过这些孔隙向前移动。由于纸的孔隙带有负电荷，与带电颗粒一样可以吸引正离子，因此介质沿管壁相对地带有较多的正电荷。在电场中，带负电荷的蛋白质向正极移动，而介质却向负阴极移动，从而对蛋白质颗粒的泳动起阻碍作用。由于γ蛋白分子颗粒大，净电荷较小移动速度慢，电渗作用大于颗粒向前泳动的力，结果γ球蛋白向后退。其他血清蛋白质因分子较小，净电荷较多，电渗作用小于分子向前移动的力，因此，电泳后γ球蛋白反而在点样位置之后，若电渗方向与样品电泳移动方向一致，则样品的表观迁移率就加快，反之则降低。所以电渗作用与电泳速度关系密切。根据支持介质的不同，可产生不同程度、不同方向的电渗流动。

聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamid gel electrophoresis， PAGE）是以聚丙烯酸胺凝胶作为载体的一种区带电泳。这种凝胶是由丙烯酰胺单体（Acrylamide，Acr）和交联剂N，Nˊ_甲叉双丙烯酰胺（N，Nˊ一Methylene bisacrylamide， Bis)，在引发剂和催化剂的作用下聚合而成的。Acr和Bis在它们单独存在或混合在一起时是稳定的，且具有神经毒性，操作时应避免接触皮肤。但在具有自由基团体系时，他们就聚合。引发产生自由基团的方法有两种，即化学法和光化学法。化学聚合的引发剂过硫酸铵（Ap）在聚合过程中提供自由基，通过自由基传递，使丙烯酰胺成为自由基，发动聚合反应。催化剂是四甲基乙二胺（Tetramethyl ethylenediamine，TEMED）则可加快引发剂释放自由基的速度，具体反应是过硫酸铵在水溶液中形成一个过硫酸自由基，此自由基可以激活TEMED，TEMED作为一个电子载体提供一个未配对电子，将丙烯酰胺单体转换化成丙烯酰胺自由基，经反应，多聚物聚合成网状结

构的凝胶状，其网状孔径大小由聚合条件及单体浓度决定。TEMED 在低pH 时失效，会使聚合作用延迟。冷却也可使聚合速度变慢。一些金属抑制聚合，分子氧阻止链的延长，妨碍聚合作用。这些因素在实际操作时都应予以控制

光聚合以核黄素（即V B2）作为引发剂，需要强光照射反应液和有痕量氧存在下进行。核黄素经光解形成无色基，无色基被氧再氧化成自由基，从而引起聚合作用。光聚合时氧含量过高会抑制聚合反应。

聚丙烯酰胺凝胶的质量主要由凝胶浓度和交联度决定。每100毫升凝胶溶液中含有的单体（Acr ） 和交联剂（Bis ） 总克数称为凝胶浓度，用T ％表示。凝胶溶液中，交联剂（Bis ）占单体（Ac r ）和交联剂（Bis ） 总量的百分数称为交联度，用C ％表示。改变凝胶浓度（T ％）和交联度（C ％），可获得不同密度、粘度、弹性、机械强度和孔径大小的凝胶，以便适应各种样品的分离。一般常用7.5％浓度的聚丙烯酸胺凝胶分离蛋白质，而用2.4％的分离核酸。但根据蛋白质与核酸分子量不同，适用的浓度也不同（见下表）。

表10-1 凝胶浓度选用

聚丙烯酰胺凝胶的基本结构是丙烯酰胺形成三维网状结构。使凝胶具有分子筛性质。网状结构还能限制蛋白质等样品的扩散运动，使凝胶具有良好的抗对流作用。此外，长链上富含酰胺基团，使其成为稳定的亲水凝胶。该结构中不带电荷，在电场中电渗现象极为微小。这些特点，使聚丙烯酰胺特别适于作区带电泳的支持介质。 物 质

分子量范围 适用的凝胶浓度（%） 蛋白质 <104

1~104

4×104~1×105

1~5×105

〉5×105

20-30 15-20 10-15 5-10 2-5 核 酸 <104

104~105

105~2×106 15-20 5-10 2-2.6

电泳仪由两部分组成，即稳压稳流直流电源和缓冲液贮存系统（电泳槽）。板状电泳槽是目前使用最多的电泳槽，凝胶在两块平行的玻璃板中间，因而称板状电泳（slabelectrophoresis）。板状电泳最大的优点是包括标准相对分子质量蛋白质在内的多个样品可以在同一块凝胶上在相同的条件下进行电泳，便于利用各种鉴定方法，直接比较各样品的区带，保证结果的准确可靠；还可以进行双向电泳。另外，板状电泳易散热，其结果便于照相和制干胶。板状电泳槽有垂直板和水平板电泳槽。

聚丙烯酰胺凝胶电泳可以采用不连续系统，这个系统的不连续性表现在以下几个方面：

（1）凝胶层的不连续性：凝胶由上、下两层胶组成，两层凝胶的孔径不同。上层为大孔径的浓缩胶，下层为小孔径的分离胶。

（2）缓冲液离子组成及各层凝胶的pH的不连续性：本实验采用碱性系统，电极缓冲液为pH8.9的Tris一HCL缓冲液，浓缩胶和分离胶缓冲液均为Tris一HCl 缓冲液，但pH值分别为6.7和8.9。

（3）电位梯度的不连续性：由于pH的不连续性，在电场中形成了不连续的电位梯度。（详见后述）

在这样一个不连续的系统里，存在三种物理效应，即电荷效应、分子筛效应和浓缩效应。在这三种效应的共同作用下，待分离的物质很好地分开。下面以本实验要分离的小麦过氧化物酶同工酶为例，分别说明这三种效应的作用：

（1）电荷效应：各种酶蛋白按其所带电荷的种类及数量，在电场作用下向一定电极，以一定速度泳动。

（2）分子筛效应：分子量小，形状为球形的分子在电泳过程中受到阻力较小，移动较快，反之，分子量大，形状不规则的分子，电泳过程中受到的阻力较大，移动较慢。

（3）浓缩效应：待分离样品中的各组分在浓缩胶中会被压缩成层，而使原来很稀的样品得到高度浓缩。其原因如下。①由于两层凝胶孔径不同，酶蛋白向下移动到两层凝胶界面时，阻力突然加大，速度变慢。这样，就在两层凝胶交界处使待分离的酶蛋白区带变窄，浓度升高。②在聚丙烯酰胺凝胶板中，虽然浓缩胶和分离胶用

的都是Tris-HCl缓冲液，但上层浓缩胶的pH为6.7，下层分离胶的pH为8.9。HCL 是强电解质，不管在哪层胶中，HCl几乎都全部电离，Cl-布满整个胶板。待分离的酶蛋白样品加在顶层，浸在pH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液中。电泳一开始，有效泳动率最大的Cl-迅速跑到最前边，成为快离子（前导离子）。在pH6.7条件下解离度仅有0.1-1.0%的甘氨酸有效泳动率最低，跑在最后边，成为慢离子（尾随离子）。这样，快离子和慢离子之间就形成了一个不断移动的界面。在pH6.7条件下带有负电荷的酶蛋白，其有效泳动率介于快慢离子之间，被夹持分布于界面附近，逐渐形成一个区带。由于快离子快速向前移动，在其原来停留的那部分地区成了低离子浓度区，即低电导区。因为电位梯度V、电流强度1和电导率S之间有如下关系：

V＝I / S

所以在电流恒定条件下低电导区两侧就产生了较高的电位梯度。这种在电泳开始后产生的高电位梯度作用于酶蛋白和甘氨酸慢离子加速前进，追赶快离子。本来夹在快慢离子之间的酶蛋白区带，在这个追赶中被逐渐地压缩聚集成一条更为狭窄的区带。这就是所谓的浓缩效应。在此区带中，各种酶蛋白又按其电荷而分成不同层次，在进入分离胶前被逐步分离，形成若干条离得很近但又不同的“起跑线”。当酶蛋白和慢离子都进入分离胶后，pH从6.7变为8.9，甘氨酸解离度剧增，有效迁移率迅速加大到超过所有酶蛋白分子，从而赶上并超过所有酶蛋白分子。此时，快慢离子的界面跑到被分离的酶蛋白之前，不连续的高电位梯度不再存在。于是，此后的电泳过程中，酶蛋白在一个均一的电位梯度和 pH条件下，仅按电荷效应和分子筛效应而被分离。与连续系统相比，不连续系统的分辨率大大提高，因此已成为目前广泛使用的分离分析手段。

蛋白质在PAGE时，它的迁移率取决于它所带的净电荷以及分子大小和形状等因素。蛋白质的净电荷是组成它的氨基酸残基侧链上所有正负电荷的总和。净电荷决定于环境的pH，pHpI时，蛋白质带负电荷.离等电点越远，荷电越多。

尽管聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE）有圆盘（disc）和垂直板（vertical slab）型之分，但两者的原理完全相同。由于垂直板形具有板薄，易冷却，分辨率高，操作简单，便于比较与扫描的优点，而为大多数实验室采用。

三、实验试剂和器材

《生物制药技术》实验指导-实验三、四

《生物制药技术》实验指导 实验三四环素、金霉素的薄层层析鉴定（验证型） 实验目的： 掌握薄层层析的原理，四环素族抗生素的定性鉴定方法。 实验原理： 层析（色谱，chromatograpby）是相当重要、且相当常见的一种技术，在把微细分散的固体或是附着于固体表面的液体作为固定相，把液体（与上述液体不相混合的）或气体作为移动相的系统中（根据移动相种类的不同，分为液相层析和气相层析二种），使试料混合物中的各成分边保持向两相分布的平衡状态边移动，利用各成分对固定相亲和力不同所引起的移动速度差，将它们彼此分离开的定性与定量分析方法，称为层析，亦称色谱法。用作固定相的有硅胶、活性炭、氧化铝、离子交换树脂、离子交换纤维等，或是在硅藻土和纤维素那样的无活性的载体上附着适当的液体。将作为固定相的微细粉末状物质装入细长形圆筒中进行的层析称为柱层析（column chromatography），在玻璃板上涂上一层薄而均的支持物（硅胶、纤维素和淀粉等）作为固定相的称为薄层层析（thin layer chromatography），或者用滤纸作为固定相的纸上层析。层析根据固定相与溶质（试料）间亲和力的差异分为吸附型、分配型、离子交换型层析等类型。但这并不是很严格的，有时常见到其中间类型。此外，近来也应用亲和层析，即将与基质类似的化合物（通常为共价键）结合到固定相上，再利用其特异的亲和性沉淀与其对应的特定的酶或蛋白质。 分配层析在支持物上形成部分互溶的两相系统。一般是水相和有机溶剂相。常用支持物是硅胶、纤维素和淀粉等亲水物质，这些物质能储留相当量的水。被分离物质在两相中都能溶解，但分配系数不同，展层时就会形成以不同速度向前移动的区带。一种溶质在两种互不混溶的溶剂系统中分配时，在一定温度下达到平衡后，溶质在固定相和流动相溶剂中的浓度之比为一常数，称为分配系数。当欲被分离的各种物质在固定相和流动相中的分配系数不同时，它们就能被分离开。分配系数大的移动快（阻力小）。 薄层层析是以薄层材料为支持物，在密闭容器中，样品在其上展开。当斑点不易为肉眼观察时，可利用适当的显色剂，或通过紫外灯下产生荧光的方法进行观察。通过这种展开操作，各成分呈斑点状移动到各自的位置上，再根据Rf值的测定进行鉴定。薄层色谱法具有分离与鉴定的双重功能，通过薄层图谱与对照品的图谱相比较，除了能鉴出有效成分或特征成分外，还以完整的色谱图作为一个整体对制剂加以鉴别。薄层色谱分析法由于简便、快速，能有效地、直观地反映药品地真实性、稳定性，现已成为药物制剂的鉴别和质量控制的行之有效的方法之一。薄层层析是鉴别抗生素的方法之一，层析后进行显色，并绘制层析图谱，根据层析图谱对抗生素进行鉴定。本实验以四环素、金霉素标准品溶液作为对照对发酵液进行鉴定。 材料、试剂和器材： 仪器和设备： 玻璃层析缸；层析板（薄层层析硅胶烟台芝罘区黄务硅胶开发实验厂有售）；吹风机；紫外投射仪；离心机（1.5ml转子） 试剂：

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生物化学实验知识点整理 实验一 还原糖的测定、实验二 粮食中总糖含量的测定 1.还原糖测定的原理 3,5-二硝基水杨酸与还原糖溶液共热后被还原成棕色的氨基化合物,在550nm 处测定光的吸收增加量，得出该溶液的浓度，从而计算得到还原糖的含量 2.总糖测定原理 多糖为非还原糖，可用酸将多糖和寡糖水解成具有还原性的单糖，在利用还原糖的性质进行测定，这样就可以分别求出总糖和还原糖的含量 3.电子天平使用 4.冷凝回流的作用： 使HCl 冷凝回流至锥形瓶中，防止HCl 挥发，从而降低HCl 的浓度。 5.多糖水解方法： 加酸进行水解 6.怎样检验淀粉都已经水解： 加入1-2滴碘液，如果立即变蓝则说明没有完全水解，反之，则说明已经完全水解。 7.各支试管中溶液的浓度计算 8.NaOH 用量：HCl NaOH n n = 9.不能中途换分光光度计,因为不同的分光光度计的光源发光强度不同 10.分光光度计的原理：在通常情况下，原子处于基态，当通过基态原子的某辐射线所具有的能量（或频率）恰好符合该原子从基态跃迁到激发态所需的能量（或频率）时，该基态原子就会从入射辐射中吸收能量，产生原子吸收光谱。原子的能级是量子化的，所以原子对不同频率辐射的吸收也是有选择的。这种选择吸收的定量关系服从式/E h hc νλ?==。 实验证明，在一定浓度范围内，物质的吸光度A 与吸光样品的浓度c 及厚度L 的乘积成正比，这就是光的吸收定律，也称为郎伯-比尔定律 分光光度计就是以郎伯比尔定律为原理，来测定浓度 11.为什么要水解多糖才能用DNS 因为DNS 只能与还原糖溶液在加热的条件下反应生成棕红色的氨基化合物，不能与没有还原性的多糖反应。 12.为什么要乘以0.9 以0.9才能得到多糖的含量。 13.为什么要中和后再测？ 因为DNS 要在中性或微碱性的环境下与葡萄糖反应 实验三 蛋白质的水解和纸色谱法分离氨基酸、实验四 考马斯亮蓝法测定蛋白质浓度 1.纸色谱分离氨基酸分离原理 由于各氨基酸在固定相（水）和流动相（有机溶剂）中的分配系数不同，从而移动速度不同，经过一段时间后，不同的氨基酸将存在于不同的部位，达到分离的目的。 2.天然氨基酸为L 型 3.酸式水解的优点是：是保持氨基酸的旋光性不变，原来是L 型，水解后还是L 型，由于甘氨酸所有的R 基团是氢原子，所以它不是L 型

生化实验指导

实验1 氨基酸纸层析 一、实验目的 通过对氨基酸的分离和鉴定，掌握纸层析的基本原理及操作方法。 二、实验原理 层析法又称色谱法。是一项重要的分离技术。利用混合物中各组分理化性质的不同，使各组分以不同程度分配在两相中。 层析的种类： 根据原理分为： a 分配层(纸层析) b 吸附层析 c 亲和层析 d 离子交换层析 根据支持物分为： a 纸层析 b 柱层析 c 薄层层析 d 凝胶过滤层析 分配层析的原理： 各种物质在两种互不溶解的溶剂中的分配系数不同，从而达到分离的目的。 分配层析用于分离在水和有机溶剂中都可溶的混合物。 一种物质在两相中达到平衡时，在两相中的浓度之比是一个常数。 物质在流动相里的浓度 物质在固定相里的浓度 纸层析: 分配的过程：一部分溶质随有机相移动离开原点进入无溶质区，并进行重新分配，不断向前移动。随着有机相不断向前移动，溶质不断地在两相间进行可逆的分配。由于各种物质的分配系数不同，随展层溶剂移动的速率也不同，从而达到分离的目的。移动速度可用比移（Rf ）值表示： 色斑中心至上样原点中心的距离 K D = 图1 氨基酸纸层析示意图 R f =

溶剂前缘至上样原点中心的距离 载体：滤纸 固定相：滤纸吸附的水 流动相：水饱和酚 极性：谷氨酸＞丙氨酸＞脯氨酸 对于水－饱和酚的溶剂体系，氨基酸极性越小，KD 值越大，Ｒｆ值也越大，一定时间内随流动相迁移的距离远，反之迁移距离小。 三、实验材料 仪器 ⑴层析缸；⑵层析滤纸；⑶电吹风机；⑸喷雾器；⑹毛细管。 试剂 ⑴氨基酸标准液（6mg/mL）；⑵氨基酸混合液（6mg/mL) ⑶展层剂：水饱和苯酚溶液。 ⑷显色剂：0.3%茚三酮丙酮溶液 四、操作步骤 1、层析滤纸的准备 用铅笔在层析滤纸上距离一端2-3cm处划线并标记点样位置。 2、点样(少量多次) 用毛细管平口端蘸取少量样品溶液，点样于滤纸的相应位置，要求样品斑点直径不超过0.5cm，干燥后再点样，重复3次。 3、展层 将滤纸放入层析缸，使滤纸浸入液面以下，但不要使液面没过点样线。展层50-60分钟，取出，用铅笔绘出前沿线。 4、显色 滤纸吹干，用喷雾器把茚三酮溶液均匀细致地喷洒在滤纸有效面上，吹干。

生物化学检验

第二章 1.⑴清蛋白，功能：运输游离脂肪酸、某些激素、胆红素、多种药物（运输载体、运输营养）。 ⑵血浆脂蛋白：乳糜微粒、极低密度脂蛋白、低密度脂蛋白、高密度脂蛋白等，功能:运输胆固醇,甘油三酯,磷酸及脂肪酸。？ 2.急性时相反应：当人体因感染、自身免疫性疾病等组织损伤侵害,诱导炎症,使单核细胞和巨 噬细胞等细胞释放紧急反应性细胞因子，再经血液循环，刺激肝脏细胞产生触珠蛋白、铜蓝蛋白、C-反应蛋白（CRP）等，使其血浆中浓度显著升高,而血浆前清蛋白、清蛋白、转铁蛋白浓度则出现相应下降,此炎症反应过程,称之为急性时相反应(APR)。该过程中出现的蛋白质统称为急性时相反应蛋白(APP)。 3.⑴前清蛋白(PA)：在SPE（正常血清蛋白电泳）中显示在清蛋白前方故而得名,主要包括视黄 醇结合蛋白(RBP)和甲状腺素转运蛋白(TTR)，两者均由肝脏合成. ⑵PA生理功能：PA为转运蛋白和组织修补材料。RBP转运视黄醇，TTR转运T4 。 ⑶PA临川意义：①属负性APP；②作为营养不良的指标（PA200~400mg/L为正常）； ③作为肝脏功能不全的指标。 4.⑴触珠蛋白(Hp)又称为结合珠蛋白，在SPE中位于α2区带。 ⑵生理功能:①能与红细胞中释放出的游离血红蛋白结合，每分子Hp结合两分子Hb； ②防止Hb从肾丢失而为机体有效地保留铁,并能避免Hb对肾脏的损伤。 ⑶临川意义:连续观察可用于监测溶血是否处于进行状态。 5.铜蓝蛋白(Cp)，肝实质细胞合成的单链多肽。 6.转铁蛋白(Tf)：临川意义：用于贫血的鉴别诊断，缺铁性低血色素贫血时，Tf代偿性合成增加。 7. C-反应蛋白(CRP)： 其临床意义：CRP是一个被认识的APP(急性时相反应蛋白)。CRP是非特异性指标，主要用于结合临床监测疾病：①筛查微生物感染；②评估炎症性疾病的活动度；③监测系统性红斑狼疮、白血病和外科手术后并发的感染；④新生儿败血症和脑膜炎的监测；⑤监测肾移植后的排斥反应。 8.⑴蛋白质测定一般利用以下蛋白质特有的结构或性质：①重复的肽链结构；②酪氨酸和色氨酸残基对酚试剂反应或紫外光吸收；③与色素结合的能力；④沉淀后借浊度或光折射测定。 ⑵凯氏定氮法：是公认的参考方法，用于标准蛋白质的定值和校正其他方法。 ⑶双缩脲法：是临床常用常规方法。 ⑷直接紫外吸收法：用于较纯的酶、免疫球蛋白等蛋白质测定。 第三章 1.血糖：是指血液中的葡萄糖。空腹血糖浓度相对恒定在3.89~6.11mmol/L（70~110mg/dl） 2.降低血糖的激素：胰岛素由胰腺的胰岛B（β)细胞所产生的多肽激素。 3.升高血糖的激素：胰高血糖素由A(α)细胞分泌的一种多肽。 其功能作用: ①促进肝糖原分解和糖异生；②促进脂肪动员；③分泌主要受血糖浓度调节。 4.高血糖指空腹血糖浓度超过7.0mmol/L,若超过肾糖阈值(8.9-10mmol/L)时则出现尿糖。 5.糖尿病(DM)：是一组由于胰岛素分泌不足或（和）胰岛素作用低下而引起的代谢性疾病， 其特征是高血糖症。 6.糖尿病的诊断标准：①DM的典型症状（如多食、多饮、多尿和无原因体重减轻等），同时随机

污水处理生化调试技术方案

污水处理生化调试技术方案 一污泥的培养 方法有同步与异步培养与接种,同步是培奍与驯化同时进行或交替进行，异步是先培后驯化，接种是利用类似污水的剩余污泥接种。 活性污泥可用糞便水经曝气培养而得，因为粪便污水中，细菌种类多，本身含有的营养丰富，细菌易于繁殖。?通常为了缩短培菌周期，我们会选择接种培养。?先说粪便水培菌?具体步骤:?将经过过滤的粪便水投入曝气池,再用生活污水或河水稀释，至BOD约为3００-400，进行连续曝气。这样过二,三天后,为补充微生物的营养物质和排除由微生物产生的代谢产物,应进行换水,换水根据操作情况分为间断和连续操作。?１.间断操作：?当第一次加料曝气并出现模糊的活性污泥绒絮后,就可停止曝气，使混合液静止沉淀，经1－１.５小时后排放上清液,把排放的上清液约占总体积的60-７0%。?然后再加生活污水和粪便水,这时的粪便水可视曝气池内的污泥量来调整,这样一直下去，直至ＳV达到30%。一般需2周，水温低时时间要延长。 在每次换水时，从停止曝气,沉淀到重新曝气的总时间要控制在２小时之内为宜?成熟的污泥应具有良好的混凝，沉降性能，污泥内有大量的菌胶菌和终生?纤毛类原生动物，如钟虫,等枝虫,盖纤虫等,并可使污水的生化需氧量去除率达90%左右 2.连续操作：?在第一次加料出现绒絮后,就不断地往曝气池投加生活污水或河水,添加粪便水的控制原则与间断投配相同。往曝气池的投加的水量,应保证池内的水量能每天更换一次,随着培奍的进展，逐渐加大水量使在培养后期达到每天更换二次。在曝气池出水进入二次沉淀池后不久(0．5-1）就开始回流污泥,污泥的回流量为曝气池进水量的5０%?驯化的方法：可在进水中逐渐增加被处理的污水的比例，或提高浓度,使生物逐渐适应新的环境开始时，被处理污水的加入量可用曝气池设计负荷的20-３0%，达到较好的处理效率后,再继续增加，每次以增加设计负荷的１0-20％为宜，每次增加负荷后，须等生物适应巩固后再继续增加，直至满负荷为止。?如果被处理工业污水中,缺氮和磷以及其它营养物时，可根据BOD：N：P为100:5:1的比例来调整。?个人认为在此阶段，必要的超赿管路要具备，工艺没设计的可用消防管代替。 而且各种分析要跟上去,和种参数需及时测定,特别是镜检,因为有经验的人可能通过镜检和数据就可以很好的完成任务,另外良好的心理素质也比较重要,有些现象要果断处理,有些则需等侍再认定上面是异步法,同步就是在污泥培养过程中，不断加入工业污水，使污泥在增长过程中逐渐适应工业污水的环境，这样虽可缩短培养和驯化的时间,但在这一过程中发生的问题，又缺实践经验则难以判断问题出在哪一个环节上。 若有条件,就是接种培养，这样可缩短时间，若是相似的污水的污泥,更可提高驯化效果。 二、试运行

生化实验操作考核要点(新)

【实验操作考核要点】 一、目的要求 1．掌握组织样品的制备方法，了解其注意事项。 2．了解肝糖原提取、糖原和葡萄糖鉴定与蒽酮比色测定糖原含量的原理和注意事项，掌握其操作方法。 3．正确操作使用刻度吸管和可调微量移液器。 4．熟练运用溶液混匀的各种方法（视具体情况，采用合适的混匀方法）。 5．正确掌握溶液转移的操作。 6．正确操作使用分光光度计。 二、操作考核内容 按百分制计。 1．吸量管操作（20分）； 2．可调式微量移液器操作（20分）； 3．溶液混匀操作（视具体情况，采用合适的混匀方法）（15分）； 4．溶液转移操作（10分）； 5．分光光度计比色操作（25分）。 6．整体表现（10分）。 三、操作考核标准 （一）吸量管操作（20分，每项操作5分） 1．执管 要求右手拿吸量管，左手拿橡皮球，只能用食指而不能用拇指按压吸量管上口来调节吸取液量的刻度；吸液、排液整个操作过程吸量管应始终保持垂直。 2．坐姿 要求腰、背保持竖直，看刻度时眼睛保持平视。 3．吸取溶液 吸量管插入液面深度约0.5cm，不能一插到底，也不能插入过浅而吸进空气致使溶液进入橡皮球内；调控吸量管吸取液量的刻度时，吸量管尖应离开液面靠在容器内壁上。 4．排出液体

吸量管尖应靠上受纳容器内壁，让管内溶液自然流出。不能用橡皮球吹压，而且在流净后吸量管尖停靠受纳容器内壁至少3秒。 （二）可调式微量移液器操作（20分，每项操作5分） 1．设定容量值 转动加样器的调节旋钮，反时针方向转动旋钮，可提高设定取液量。顺时针方向转动旋钮，可降低设定取液量。在调整设定移液量的旋钮时，不要用力过猛，并应注意使取液器显示的数值不超过其可调范围。 2．吸液 （1）选择合适的吸头安放在取液套筒上，稍加扭转压紧吸嘴使之与套筒之间无空气间隙； （2）把按钮压至第一停点，垂直握持加样器,使吸头浸入液面下2~3毫米处,然后缓慢平稳地松开按钮，吸入液体，等一秒钟，然后将吸头提离液面，贴壁停留2-3秒，使管尖外侧的液滴滑落。 3．放液 （1）将吸头口贴到容器内壁底部并保持100°~40°倾斜； （2）平稳地把按钮压到第一停点，等一秒钟后再把按钮压到第二停点以排出剩余液体； （3）压住按钮，同时提起加样器，使吸头贴容器壁擦过，再松开按钮。按吸头弹射器除去吸头。 4．压放按钮时保持平稳；加样器不得倒转；吸头中有液体时不可将加样器平放。取液器吸嘴为一次性使用。实验完毕，将取液器读数调至最大量程值，竖立放于支架上。 （三）溶液的混匀（操作流程中下划实线的三处，每项操作5分，共15分）1．肝糖原的提取与鉴定操作中，肝匀浆上清液中加5ml 95%乙醇后的混匀最好用倾倒混匀，也可用滴管或吸量管吸、吹混匀，或用玻璃棒搅拌混匀。 2．肝糖原定量测定中，肝组织消化液沸水浴后全部转入100 ml容量瓶，加水至刻线后的混匀应采用倒转混匀。 3．肝糖原定量测定中，加蒽酮溶液后的混匀，可将试管倾斜约45o再作旋转混匀。因蒽酮溶液（浓硫酸配制）比重大于样品水溶液很多，一加入便沉于管

生物化学实验4

食品生物化学实验要求 1. 学生做实验前必须写好实验预习报告，做好实验预习，无实验预习报告者不许 进入实验室。每大组实验人数 28-29 人， 4 人一小组。 2. 实验试剂的配制，现场由教师指导，学生操作完成。学生在试剂配制过程中， 掌握试剂配置的基本步骤，基本方法和注意事项。 3. 实验室所有设备都必须按说明书使用，器皿要小心使用，按规范要求操作，如 有损坏，照价赔偿。 4. 卫生要求：每次试验完毕小组成员务必将本试验台及地面收拾整洁，器皿摆放 整齐有序，如哪组成员发现没有搞好自己组的环境卫生，这次试验的所有组员的实验报告都会扣分。 一、 10 食品科学食品生物化学实验项目表 1. 淀粉的显色、水解和老化（ 4 学时） 2. 蛋白质的功能性质（ 4 学时） 3. 牛奶中酪蛋白等电点测定和氨基酸的分离鉴定（ 4 学时） 4. 或果胶的提取（ 4 学时） 5. 酶的性质实验（ 4 学时） 实验总课时： 16 学时 二、食品生物化学实验指导书 实验一淀粉的显色、水解和老化 一、实验目的和要求 1 、了解淀粉的性质及淀粉水解的原理和方法。 2 、掌握淀粉水解的条件和产物的实验方法。 3 、淀粉的老化原理和方法 二、实验原理 1 、淀粉与碘的反应直链淀粉遇碘呈蓝色，支链淀粉遇碘呈紫红色，糊精遇碘呈 蓝紫、紫、橙等颜色。这些显色反应的灵敏度很高，可以用作鉴别淀粉的定量和定性的方法，也可以用它来分析碘的含量。纺织工业上用它来衡量布匹退浆的完全度，它还可以用来测定水果果实（如苹果等）的淀粉含量。

近年来用先进的分析技术（如X 射线、红外光谱等）研究碘跟淀粉生成的蓝色物，证明碘和淀粉的显色除吸附原因外，主要是由于生成包合物的缘故。直链淀粉是由α - 葡萄糖分子缩合而成螺旋状的长长的螺旋体，每个葡萄糖单元都仍有羟基暴露 在螺旋外。碘分子跟这些羟基作用，使碘分子嵌入淀粉螺旋体的轴心部位。碘跟淀粉的这种作用叫做包合作用，生成物叫做包合物。 在淀粉跟碘生成的包合物中，每个碘分子跟 6 个葡萄糖单元配合，淀粉链以直径0.13 pm 绕成螺旋状，碘分子处在螺旋的轴心部位。 淀粉跟碘生成的包合物的颜色，跟淀粉的聚合度或相对分子质量有关。在一定的聚合度或相对分子质量范围内，随聚合度或相对分子质量的增加，包合物的颜色的变化由无色、橙色、淡红、紫色到蓝色。例如，直链淀粉的聚合度是 200 ～ 980 或 相对分子质量范围是 32 000 ～ 160 000 时，包合物的颜色是蓝色。分支很多的支 链淀粉，在支链上的直链平均聚合度 20 ～ 28 ，这样形成的包合物是紫色的。糊 精的聚合度更低，显棕红色、红色、淡红色等。下表就是淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色。 表 2-1 淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色 葡萄糖单位的聚合度 3.8 7.4 12.9 18.3 20.2 29.3 34.7 以上 包合物的颜色无色淡红红棕红紫色蓝紫色蓝色 淀粉跟碘生成的包合物在 pH=4 时最稳定，所以它的显色反应在微酸性溶液里最明显。 2 、淀粉的水解淀粉是一种重要的多糖，是一种相对分子量很大的天然高分子化 合物。虽属糖类，但本身没有甜味，是一种白色粉末，不溶于冷水。在热水里淀粉颗粒会膨胀，有一部分淀粉溶解在水里，另一部分悬浮在水里，形成胶状淀粉糊。淀粉进入人体后，一部分淀粉收唾液所和淀粉酶的催化作用，发生水解反应，生成麦芽糖；余下的淀粉在小肠里胰脏分泌出的淀粉酶的作用下，继续进行水解，生成麦芽糖。麦芽糖在肠液中麦芽糖酶的催化下，水解为人体可吸收的葡萄糖，供人体组织的营养需要。反应过程为：（ C 6 H 12 O 5 ）m → (C 6 H 10 O 5)n → C 12 H 22 O 11 → C 6 H 12 O 6 淀粉糊精麦芽糖葡萄糖 葡萄糖是淀粉最重要的下游产品之一，工业生产中常常使用玉米淀粉水解来加工结晶葡萄糖。 3 、淀粉的老化淀粉加入适量水，加热搅拌糊化成淀粉糊（α - 淀粉），冷却或 冷冻后，会变得不透明甚至凝结而沉淀，这种现象称为淀粉的老化。将淀粉拌水制

生物化学检验试题

生物化学检验试题 一、单选题（本题满分30分，每小题1分） 1. 被大量钙、镁离子污染的玻璃器皿可用下列哪种洗涤剂洗涤（） A、合成洗涤剂 B、铬酸洗液 C、尿素洗液 D、EDTANa2 2. 静脉采血时，止血带压迫时间过长，会导致血清下列哪种物质含量降低（） A、总蛋白 B、胆固醇 C、胆红素 D、钾 3. 参考值范围一般以多少可信限为界（） A、90% B、95% C、98% D、99% 4. 离子强度（I）与电泳速度（V）及分辨力的关系是（） A、I大，V快，分辨力差 B、I小，V快，分辨力好 C、I大，V慢，分辨力好 D、I小，V慢，分辨力差 5. 血清钾的正常参考值是（） A、～L B、～L C、～L D、135～145mmol/L 6. 血液CO2的主要形式是（） A、Hb- NHCOOH B、Pr- NHCOOH C、HCO3－ D、物理溶解 7. 血清尿素测定下列哪一种方法属于直接法（） A、二乙酰一肟法 B、波氏法 C、电量法 D、电极法 8. 胆色素中无色的物质是（） A、胆红素 B、胆绿素 C、胆素原 D、胆素 9. 正常人血液的pH为（） A. 7.3± B. ±0.5 C. ± D. ± 10. 血浆阴离子间隙（AG）是指（） A. 血浆阳离子减去阴离子 B. 血浆Na+减去Cl—与HCO3— C. 血浆阴离子减去阳阴离子 D. 血浆Cl—与HCO3—减去Na+ 11. 新购置的玻璃仪器需用下列哪种溶液浸泡2～6h（） A、浓盐酸 B、浓硫酸 C、LHCl D、铬酸洗液 1211. OGTT成人口服葡萄糖量一般为（） A、50g B、75g C、100g D、150g 13. 下列哪型高脂蛋白血症易发生冠心病（） A、Ⅰ型 B、Ⅱa型 C、Ⅲ型 D、Ⅳ型 14. 甲状腺激素中活性最强的是（） A、MIT B、DIT C、T3 D、T4 15. 下列哪种蛋白质的测定对原发性肝癌有诊断价值（） A、Hp B、pA C、AFP D、TRF 16. 采用酶联—紫外连续监测法测定血清ALT活性，所用的工具酶是（） A、AST B、MDH C、LDH D、GLDH 17. 谷胱甘肽过氧化物酶组成的必需微量元素是（） A. 锌 B. 硒 C. 锰 D. 铬 18. 酶法测定血清胆固醇，试剂中加入胆酸钠的作用是（） A、激活CEH B、激活ChOD C、激活POD D、促进胆固醇从脂蛋白中释放 19. 1分子Hb可结合（） A、2O2 B、O2 C、4O2 D、4O 20. 载脂蛋白A1主要存在于（）

2015高级生物化学及实验技术试题答案

高级动物生化试题 问答题： 1. 简述非编码RNA（non-coding RNA）的种类、结构特点及其主要功能。 非编码RNA的种类结构和功能 1tRNA转运RNA（transfer RNA，tRNA） 结构特征之一是含有较多的修饰成分，核酸中大部分修饰成分是在tRNA中发现的。修饰成分在tRNA分子中的分布是有规律的，但其功能不清楚。5’末端具有G（大部分）或C。3’末端都以ACC的顺序终结。有一个富有鸟嘌呤的环。有一个反密码子环，在这一环的顶端有三个暴露的碱基，称为反密码子（anticodon）.反密码子可以与mRNA链上互补的密码子配对。有一个胸腺嘧啶环。tRNA具有三叶草型二级结构以及“L”型三级结构，tRNA 的不同种类及数量可对蛋白质合成效率进行调节。tRNA负责特异性读取mRNA中包含的遗传信息，并将信息转化成相应氨基酸后连接到多肽链中。 tRNA为每个密码子翻译成氨基酸提供了结合体，同时还准确地将所需氨基酸运送到核糖体上。鉴于tRNA在蛋白质合成中的关键作用，又把tRNA称作第二遗传密码。tRNA还具有其他一些特异功能，例如，在没有核糖体或其他核酸分子参与下，携带氨基酸转移至专一的受体分子，以合成细胞膜或细胞壁组分；作为反转录酶引物参与DNA合成；作为某些酶的抑制剂等。有的氨酰-tRNA还能调节氨基酸的生物合成。 2rRNA核糖体RNA（ribosomal RNA, rRNA） 核糖体RNA是细胞中最为丰富的RNA，在活跃分裂的细菌细胞中占80%以上。

他们是核糖体的组分，并直接参与核糖体中蛋白质的合成。核糖体是rRNA 提供了一个核糖体内部的“脚手架”，蛋白质可附着在上面。这种解释很直接很形象，但是低估了rRNA在蛋白质合成中的主动作用。较后续的研究表明，rRNA并非仅仅起到物理支架作用，多种多样的rRNA可起到识别、选择tRNA以及催化肽键形成等多种主动作用。例如：核糖体的功能就是,按照mRNA的指令将氨基酸合成多肽链。而这主要依靠核糖体识别tRNA 并催化肽键形成而实现。可以说核糖体是一个大的核酶( ribozyme)。而核糖体的催化功能主要是由rRNA来完成的,蛋白质并没有直接参与。 3 tmRNA tmRNA主要包括12个螺旋结构和4个“假结”结构，同时还包括一 个可译框架序列的单链RNA结构。tmRNA中H1由5’端和3’端两个末端形成，与tRNA的氨基酸受体臂相似。H1和H2的5’部分之间有一个由10-13nt 形成的环，类似tRNA中的二氢尿嘧啶环，称为“D”环。H3和H4，H6和H7，H8和H9，H10和H11之间分别形成Pk1，pK2，pK3，pK4。H4和H5之间则由一段包含编码标记肽ORF的单链RNA连接。H12由5个碱基对和7nt 形成的环组成，类似tRNA中的TΨC臂和TΨC环，称为“T”环。tmRNA 结构按照功能进行划分可分为tRNA类似域（TLD）和mRNA类似域（MLD），TLD主要包括H1,H2,H12,“D”环和“T”环，MDL则包括ORF和H5，这两部分分别具有类似tRNA和mRNA的功能。tmRNA是一类普遍存在于各种细菌及细胞器（如叶绿体，线粒体）中的稳定小分子RNA。它具有mRNA分子和tRNA分子的双重功能，它在一种特殊的翻译模式——反式翻译模式中发挥重要作用。同时，它与基因的表达调控以及细胞周期的调控等生命过程密切相关，是细菌体内蛋白质合成中起“质量控制”的重要分子之一。识别翻译或读码有误的核糖体，也识别那些延迟停转的核糖体，介导这些有问

生化制品技术实验指导

《生化制品技术》实验大纲 一、实验目的 本实验是《生化制品技术》课程的配套实验，目的是增加学生对生物药物及生物技术制药的感性认识及提高学生的实验操作能力。要求学生熟悉并掌握生物药物的制备过程和生物技术制药的基本操作方法。 二、适用专业及层次 适用于生物制药技术专业学生 三、实验内容和学时分配

实验一牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备 一、实验目的 1.掌握盐析法的原理和操作。 2.掌握等电点沉淀法的原理和基本操作。 二、实验原理 乳蛋白素是一种广泛存在于乳品中，合成乳糖所需要的重要蛋白质。牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白（caseins），酪蛋白在pH4.8左右会沉淀析出，但乳蛋白素在pH3左右才会沉淀。利用此一性质，可先将pH降至4.8，或是在加热至40℃的牛奶中加硫酸钠，将酪蛋白沉淀出来。酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中除去脂类杂质。将去除掉酪蛋白的滤液的pH调至3左右，能使乳蛋白素沉淀析出，部分杂质即可随澄清液出去。在经过一次pH沉淀后，即可得粗乳蛋白素。 三、实验器材 烧杯（250ml和100ml）、玻璃试管（10mm×100mm）、离心管（50ml）、磁力搅拌器、pH计、离心机、水浴锅。 四、试剂和材料 脱脂牛乳或低脂牛乳、无水硫酸钠、0.1mol/L HCL、0.1mol/L NaOH、滤纸、pH试纸、浓盐酸、乙酸缓冲溶液0.2mol/L （pH4.6）、乙醇。 五、操作步骤

1.盐析或等电点沉淀制备酪蛋白 （1）将50ml牛乳倒入250ml烧杯中，于40℃水浴中加热并搅拌。 （2）向上述烧杯中缓缓加入（约10min内分次加入）10g无水硫酸钠，再继续搅拌10min（或加热到40℃，再在搅拌下慢慢地加入50ml40℃左右的乙酸缓冲液，直到pH达到4.8左右，将悬浮液冷却至室温，放置5min）。 （3）将溶液用细布过滤，分别收集沉淀和滤液。沉淀悬浮于30ml乙醇中，倾于布氏漏斗中，过滤出去乙醇溶液，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移出，在表面皿上摊开以除去乙醇，干燥后得到的是酪蛋白。准确称重。 2.等电点沉淀法制备乳蛋白素 （1）将制备酪蛋白操作步骤（3）所得滤液置于100ml烧杯中，一边搅拌，一边利用pH计以浓盐酸调整pH至3±0.1。 （2）将溶液倒入离心管中，6000r/min离心15min，倒掉上层液。 （3）在离心管内加入10ml去离子水，振荡，使管内下层物重新悬浮，并以0.1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至8.5～9.0（以pH试纸或pH计判定），此时大部分蛋白质均会溶解。 （4）将上述溶液以6000r/min离心10min，上层液倒入50ml烧杯中。 （5）将烧杯置于磁搅拌加热板上，一边搅拌，一边利用pH计以0.1mlo/L 盐酸调整pH至3±0.1。 （6）将上述溶液以6000r/min离心10min，倒掉上层液。取出沉淀干燥，并称重。 六、结果与讨论 1.计算出每100ml牛乳所制备出的酪蛋白数量，并与理论产量（3.5g）相

《分子生物学检验技术》实验指导

《分子生物学检验技术》实验指导 【实验目的】 把握动物组织DNA提取的方法； 把握紫外分光光度法检测、鉴定DNA浓度和纯度的方法。 【实验原理】 获得相当纯度和完整性的基因组DNA，可用于DNA酶切图谱、多态性分析、基因诊断、构建基因组文库等。因此，DNA样品质量的好坏将直截了当关系到实验的成败。较理想的DNA样品应达到以下三点要求：①不应存在对酶有抑制作用的有机溶剂和过高浓度的金属离子；②最大程度地降低蛋白质、多糖和脂类分子的污染；③排除RNA分子的污染和干扰。 DNA以核蛋白形式存在于细胞中，提取DNA的原则是即要将DNA与蛋白质、脂类和糖类等成分分离，又要保持DNA分子的完整。本实验中，用阴离子去垢剂十二烷基磺酸钠（SDS）消化破裂细胞膜、核膜，并使组织蛋白变性沉淀，DNA从核蛋白中游离分开；为操纵组织中脱氧核糖核酸酶（DNase）对DNA的降解，加入柠檬酸钠或乙二胺四乙酸二钠（EDTA－Na2）以除去兴奋该酶的金属离子，SDS也能使DNase变性失活；蛋白酶K可水解蛋白质，消化D NA酶；分离后的DNA用饱和酚/氯仿抽提除去蛋白质，接着用氯仿抽提以除去DNA溶液中微量酚的污染；最后用无水乙醇沉淀DNA，得到欲提取的基因组DNA。

260nm处DNA有最大吸取峰，测DNA的A260，可运算其浓度。而蛋白质在280nm处有最大吸取峰，可测定A260nm/A280nm比值，检测DNA的纯度，该比值介于1.8~2.0之间。 【实验器材和试剂】 1、动物 小白鼠 2、设备 移液器、台式离心机、水浴箱、陶瓷研钵等；751紫外分光光度计、石英比色皿、洗瓶、滤纸等。 3、试剂 （1）基因组DNA提取试剂盒（北京康为世纪生物科技公司）：包括Buffer CL、Buffer PP、Buffer GE、RNase A、Proteinase K （7）生理盐水，4℃贮存 （8）无水乙醇、70%乙醇 【操作步骤】 1、制备肝匀浆 迅速处死小白鼠，称取新奇肝脏组织50 mg，用预冷生理盐水洗去血液，滤纸吸干后剪碎组织，将剪碎组织放于组织匀浆器或研钵中研磨，同时加入300 μl Buffer CL。将肝匀浆液放入EP管，加入1.5 μl蛋白酶K，漩涡震荡10 s，55℃孵育直到组织溶解（约1小时）。 2、提取DNA （1）加入1.5 μl RNase A，颠倒混匀，37℃孵育15-60 min。

基础生物化学实验.

生物化学实验 实验基本原理 1 有效数字计算（结合电子天平的应用等） 加减法： 进行数字加减时，最后结果所保留的小数点后的位数应与参与运算的各数中小数点后位数最少者相同，其尾数“四舍五入”。如：0.124+1.2345+12.34=13.6979，应取13.70。 乘除法： 进行数字乘除时，最后结果的有效数字应与参与运算的各数中有效数字位数最少者为准，而与小数点的位数无关，其尾数“四舍五入”。如：1.23×0.12=0.1476,应取0.15。 2 误差分析 误差为实验分析的测定值与真实值之间的差值。误差越小，测定值越准确，即准确度越高。误差可用绝对误差和相对误差表示。 绝对误差= 测定值- 真实值 相对误差= 绝对误差÷真实值×100% 一般用相对误差表示结果的准确度，但因真实值是并不知道的，因此实际工作中无法求出分析的准确度，只得用精确度来评价分析的结果。 3 偏差分析（结合“可溶性蛋白或赖氨酸实验”要求掌握） 精确度表示在相同条件下，进行多次实验的测定值相近的程度。一般用偏差来衡量分析结果的精确度。偏差也有绝对偏差和相对偏差两种表示方法。 绝对偏差= 单次测定值- 算术平均值（不计正负号） 相对偏差= 绝对偏差÷算术平均值×100%

例如：分析某一材料糖含量，共重复测定5次，其结果分别为：16.1%，15.8%，16.3%，16.2%，15.6%，用来表示精确度的偏差可计算如下： 分析结果算术平均值个别测定的绝对偏差（不计正负） 16.1% 0.1% 15.8% 0.2% 16.3% 16.0% 0.3% 16.2% 0.2% 15.6% 0.4% 平均绝对偏差=（0.1%+0.2%+0.3%+0.2%+0.4%）÷5 = 0.2% 平均相对偏差= 0.2÷16.0×100% = 1.25% 在实验中，有时只做两次平行测定，这时就应用下式表达结果的精确度： 两次分析结果的差值÷平均值×100% 4 实验结果的表述：实验结果可用列表法（“影响酶作用的因素”常用）和作图法（综合实验用）表示。 第1章分光光度技术 分光光度技术是光学（光谱）分析技术的一种，它是利用物质的特征吸收光谱来对不同物质进行定性和定量分析的一项技术。我们将重点介绍紫外光-可见光分光光度法。 一、紫外光-可见光分光光度法的基本原理 1、讨论的波长范围：200～400nm的紫外光区和400～760nm的可见光区。 人肉眼可见的光线称可见光，波长范围在400～760nm；

生化制品技术实验指导教学内容

生化制品技术实验指 导

《生化制品技术》实验大纲 一、实验目的 本实验是《生化制品技术》课程的配套实验，目的是增加学生对生物药物及生物技术制药的感性认识及提高学生的实验操作能力。要求学生熟悉并掌握生物药物的制备过程和生物技术制药的基本操作方法。 二、适用专业及层次 适用于生物制药技术专业学生 三、实验内容和学时分配

实验一牛奶中酪蛋白和乳蛋白素粗品的制备 一、实验目的 1.掌握盐析法的原理和操作。 2.掌握等电点沉淀法的原理和基本操作。 二、实验原理 乳蛋白素是一种广泛存在于乳品中，合成乳糖所需要的重要蛋白质。牛奶中主要的蛋白质是酪蛋白（caseins），酪蛋白在pH4.8左右会沉淀析出，但乳蛋白素在pH3左右才会沉淀。利用此一性质，可先将pH降至4.8，或是在加热至40℃的牛奶中加硫酸钠，将酪蛋白沉淀出来。酪蛋白不溶于乙醇，这个性质被利用来从酪蛋白粗制剂中除去脂类杂质。将去除掉酪蛋白的滤液的pH 调至3左右，能使乳蛋白素沉淀析出，部分杂质即可随澄清液出去。在经过一次pH沉淀后，即可得粗乳蛋白素。 三、实验器材 烧杯（250ml和100ml）、玻璃试管（10mm×100mm）、离心管（50ml）、磁力搅拌器、pH计、离心机、水浴锅。 四、试剂和材料 脱脂牛乳或低脂牛乳、无水硫酸钠、0.1mol/L HCL、0.1mol/L NaOH、滤纸、pH试纸、浓盐酸、乙酸缓冲溶液0.2mol/L （pH4.6）、乙醇。 五、操作步骤 1.盐析或等电点沉淀制备酪蛋白

（1）将50ml牛乳倒入250ml烧杯中，于40℃水浴中加热并搅拌。 （2）向上述烧杯中缓缓加入（约10min内分次加入）10g无水硫酸钠，再继续搅拌10min（或加热到40℃，再在搅拌下慢慢地加入50ml40℃左右的乙酸缓冲液，直到pH达到4.8左右，将悬浮液冷却至室温，放置5min）。 （3）将溶液用细布过滤，分别收集沉淀和滤液。沉淀悬浮于30ml乙醇中，倾于布氏漏斗中，过滤出去乙醇溶液，抽干。将沉淀从布氏漏斗中移出，在表面皿上摊开以除去乙醇，干燥后得到的是酪蛋白。准确称重。 2.等电点沉淀法制备乳蛋白素 （1）将制备酪蛋白操作步骤（3）所得滤液置于100ml烧杯中，一边搅拌，一边利用pH计以浓盐酸调整pH至3±0.1。 （2）将溶液倒入离心管中，6000r/min离心15min，倒掉上层液。 （3）在离心管内加入10ml去离子水，振荡，使管内下层物重新悬浮，并以0.1mol/L氢氧化钠溶液调整pH至8.5～9.0（以pH试纸或pH计判定），此时大部分蛋白质均会溶解。 （4）将上述溶液以6000r/min离心10min，上层液倒入50ml烧杯中。 （5）将烧杯置于磁搅拌加热板上，一边搅拌，一边利用pH计以 0.1mlo/L盐酸调整pH至3±0.1。 （6）将上述溶液以6000r/min离心10min，倒掉上层液。取出沉淀干燥，并称重。 六、结果与讨论 1.计算出每100ml牛乳所制备出的酪蛋白数量，并与理论产量（3.5g）相比较。求出实际获得率（%）。

运动生物化学实验指导

运动生物化学实验指导 实验一实验基本技术操作 一、实验目的 （一）了解实验室规则及注意事项。 （二）学习运动生物化学实验常用仪器的使用及清洗方法。 （三）学习721型分光光度计的使用方法。 二、实验原理 运动生物化学是研究人体运动时体内的化学变化。运动生物化学的实验方法基本上是化学的方法，用定量及定性的分析方法来观察机体内物质代谢的规律，所以实验时必须做到定性的洁净及定量的精确，因此实验取样要准确、样品要无污染。 对于相同物质和相同波长的单色光来说，溶液的光密度和溶液的浓度呈正比。配制各种浓度的CuSO4溶液，然后在780nm波长下比色，测定各种浓度的CuSO4溶液吸光度值，并制作曲线图。 三、实验器材 试管、CuSO4溶液、蒸馏水、721分光光度计、移液管、吸耳球等。 四、实验步骤 （一）玻璃仪器的清洗。 （二）使用移液管的移液操作及721分光光度计的使用。 取4支大试管，编号，按表7-1进行操作： 表7-1 CuSO4溶液的测定 以CuSO4溶液浓度为横坐标，吸光度值为纵坐标，将3种不同浓度的CuSO4溶液的光密度值分别点在坐标纸上，通过3点绘制成曲线图，并对实验结果进行分析。 五、注意事项 （一）玻璃仪器清洗后注意检查，管壁不能留有水珠。 （二）使用移液管吸取液体时一定要缓慢平稳，不要太快、太猛。 六、作业与思考 （一）玻璃仪器的清洗有哪些基本要求？ 实验二血红蛋白的测定 血红蛋白（Hb）是红细胞中的一种重要蛋白质，1分子的Hb是由4分子的亚铁血红素和1分子的珠蛋白结合而成的。 Hb的主要生理功能是运输氧气（O2）、二氧化碳（CO2）和对酸性物质（H+）起缓冲作用，参与体内的酸碱平衡调节。运动时机体需氧增加，故血红蛋白增加，有利于为组织提供氧气，促进物质的有氧代谢和带走CO2，而且也能起中和酸性的作用。如果血红蛋白下降，氧供应减少，影响运动能力。 运动员安静时血红蛋白值与正常人没有明显差异。一般人Hb的正常值男性为120-160g/L；女性110-150g/L。临床上常用判断贫血的标准，即成年男性低于120 g/L；成年女性低于110 g/L；而14岁以下的少年、儿童，不论男女，均以低于120 g/L作为贫血。

生物化学实验重点试题

一、解词 1、总氮量水中各种形态无机和有机氮的总量 2、酶的抑制作用是指在某个酶促反应系统中，某种低相对分子质量的物质加入后，导致酶活力降低的过程。 3、酶的最适温度酶催化活性最高时的温度 4、蛋白质的等电点每个蛋白都存在一个pH使它的表面净电荷为零即等电点 5、盐析增加中性盐浓度使蛋白质、气体、未带电分子溶解度降低的现象 6、蛋白质变性蛋白质在某些物理和化学因素作用下其特定的空间构象被改变，从而导致其理化性质的改变和生物活性的丧失6、酶的专一性酶对底物及其催化反应的严格选择性通常酶只能催化一种化学反应或一类相似的反应 7、激活剂能提高酶活性的物质大部分是离子或简单的有机化合物 8、抑制剂凡能使酶催化活性下降而不引起酶蛋白变性的物质 9、酶催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体 二、填空 1、球蛋白可在半饱和中性硫酸铵溶液中析出，清蛋白可在高盐浓度溶液中析出。 2、在PH3.0、和9.5时的电场中，卵清蛋白（PI4.6）移动方向分别为负移 动，正移动。 3、唾液淀粉酶的最适温度是37 4、还原糖与本乃狄试剂共热现象生成生成砖红色沉淀。 5、维生素C也称抗坏血酸，它具有很强还原性 6、用苔黑酚浓盐酸溶液可以鉴定核糖核酸 7、当溶液的PH低于蛋白质等电点时，蛋白质分子带正电荷；当溶液的 PH大于蛋白质等电点时，蛋白质分子带负电荷； 10．凯氏定氮法测定蛋白质含量消化终点颜色为清澈的蓝紫色色。 11．蛋白质变性的实质是空间结构被破坏。 12．常用的RNA提取方法有苯酚法、、高盐法等。 13、维持蛋白质亲水胶体稳定的因素是蛋白质颗粒表面的电荷层 和水化膜、 14、蛋白质在等电点时，主要以两性离子离子形式存在；当溶液的P H＞PI 时，蛋白质分子以负离子形式存在；当溶液的P H＜PI时，蛋白质分子带正离子形式存在。 15、蛋白质分子中氮的平均含量为 5.16% ，样品中的蛋白质含量常以测 氮量乘以 6.25 、即 6 。 三、选择 1、盐析法沉淀蛋白质的原理( ) A 与蛋白质结合成不溶性蛋白盐 B 次级键断裂蛋白质的构象改变 C 中和电荷，破坏水化膜 D 调节蛋白质溶液的等电点 2、以下哪项不是酶的特性（） A 酶是生物催化剂，催化效率极高 B 易受Ph，温度等外界因素的影响 C 能加速化学反应但不改变反应平衡点 D 有高度特异性 3、RNA和DNA的最大紫外吸收值是在（） A 280nm B 260nm C 510nm D 620nm 4、．凯氏定氮法使用的混合催化剂硫酸钾-硫酸铜配比为（） A 1:3 B 5:1 C 3:1 D 1:1

食品生物化学实验

食品生物化学实验要求 1.学生做实验前必须写好实验预习报告，做好实验预习，无实验预习报告者不 许进入实验室。每大组实验人数28人，4人一小组。 2.实验试剂的配制，现场由教师指导，学生操作完成。学生在试剂配制过程中， 掌握试剂配置的基本步骤，基本方法和注意事项。 3.实验室所有设备都必须按说明书使用，器皿要小心使用，按规范要求操作， 如有损坏，照价赔偿。 4.卫生要求：每次试验完毕小组成员务必将本试验台及地面收拾整洁，器皿摆 放整齐有序，如哪组成员发现没有搞好自己组的环境卫生，这次试验的所有组员的实验报告都会扣分。 一、10食品科学食品生物化学实验项目表 1. 淀粉的显色、水解和老化（4学时） 2. 蛋白质的功能性质（4学时） 3. 牛奶中酪蛋白等电点测定和氨基酸的分离鉴定（4学时） 4. 或果胶的提取（4学时） 5. 酶的性质实验（4学时） 实验总课时：16学时

二、食品生物化学实验指导书 实验一淀粉的显色、水解和老化 一、实验目的和要求 1、了解淀粉的性质及淀粉水解的原理和方法。 2、掌握淀粉水解的条件和产物的实验方法。 3、淀粉的老化原理和方法 二、实验原理 1、淀粉与碘的反应直链淀粉遇碘呈蓝色，支链淀粉遇碘呈紫红色，糊精遇碘呈蓝紫、紫、橙等颜色。这些显色反应的灵敏度很高，可以用作鉴别淀粉的定量和定性的方法，也可以用它来分析碘的含量。纺织工业上用它来衡量布匹退浆的完全度，它还可以用来测定水果果实（如苹果等）的淀粉含量。 近年来用先进的分析技术（如X射线、红外光谱等）研究碘跟淀粉生成的蓝色物，证明碘和淀粉的显色除吸附原因外，主要是由于生成包合物的缘故。直链淀粉是由α-葡萄糖分子缩合而成螺旋状的长长的螺旋体，每个葡萄糖单元都仍有羟基暴露在螺旋外。碘分子跟这些羟基作用，使碘分子嵌入淀粉螺旋体的轴心部位。碘跟淀粉的这种作用叫做包合作用，生成物叫做包合物。 在淀粉跟碘生成的包合物中，每个碘分子跟6个葡萄糖单元配合，淀粉链以直径0.13 pm绕成螺旋状，碘分子处在螺旋的轴心部位。 淀粉跟碘生成的包合物的颜色，跟淀粉的聚合度或相对分子质量有关。在一定的聚合度或相对分子质量范围内，随聚合度或相对分子质量的增加，包合物的颜色的变化由无色、橙色、淡红、紫色到蓝色。例如，直链淀粉的聚合度是200～980或相对分子质量范围是32 000～160 000时，包合物的颜色是蓝色。分支很多的支链淀粉，在支链上的直链平均聚合度20～28，这样形成的包合物是紫色的。糊精的聚合度更低，显棕红色、红色、淡红色等。下表就是淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色。 表 2-1 淀粉的聚合度和生成碘包合物的颜色 淀粉跟碘生成的包合物在pH=4时最稳定，所以它的显色反应在微酸性溶液里最明显。 2、淀粉的水解淀粉是一种重要的多糖，是一种相对分子量很大的天然高分子化合物。虽属糖类，但本身没有甜味，是一种白色粉末，不溶于冷水。在热水里淀粉颗粒会膨胀，有一部分淀粉溶解在水里，另一部分悬浮在水里，形成胶状淀粉糊。淀粉进入人体后，一部分淀粉收唾液所和淀粉酶的催化作用，发生水解反应，生成麦芽糖；余下的淀粉在小肠里胰脏分泌出的淀粉酶的作用下，继续进行水解，生成麦芽糖。麦芽糖在肠液中麦芽糖酶的催化下，水解为人体可吸收的葡萄糖，供人体组织的营养需要。反应过程为：（C6H12O5）m→(C6H10O5)n→C12H22O11→C6H12O6 淀粉糊精麦芽糖葡萄糖