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细胞传代培养

细胞传代培养
细胞传代培养

1细胞传代准备工作

1.1细胞传代所需培养液及试剂需提前放置于生物安全柜内预热至室温备用。

1.2细胞传代材料,滴管、移液管、培养器皿、计数板、橡皮乳头。

2细胞传代步骤

2.1人无菌室之前用肥皂洗手,用75%酒精擦拭消毒双手。

2.2细胞传代前先在倒置显微镜下观察细胞形态,确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数观察。

2.3打开超净工作台的紫外灯照射台面30 min左右,关闭超净工作台的紫外灯,打开抽风机清洁空气,除去臭氧。

2.4超净工作台面应整洁,用75%酒精溶液擦净。

2.5贴壁细胞的传代

2.5.1贴壁细胞用滴管或移液管吸去培养器皿中的旧培养液。

2.5.2酌情可用2~3 mL 0.02%EDTA溶液洗去残留的旧培养基。

2.5.3以25ml培养瓶为例,向瓶内加入1ml消化液(胰蛋白酶或与EDTA混合液)轻轻摇动培养瓶,使消化液流遍所有细胞表面。

2.5.4在倒置显微镜下观察,当细胞收回突起变圆或细胞间隙增大后,应立即终至消化。

2.5.5吸除或倒掉消化液,加入少量的含血清的新鲜培养液,终至消化。

2.5.6用弯头滴管,吸取瓶内培养液,反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散,形成细胞悬液。

2.5.7计数,再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养液(7~10ml/大瓶,3~5 mL /小瓶)制成细胞悬液,然后分装到新培养瓶中。盖上瓶盖,适度拧紧后再稍回转,以利于CO2气体的进入,将培养瓶放回CO2培养箱。

2.6半悬浮细胞及悬浮细胞培养的传代

2.6.1半悬浮细胞先用滴管将细胞轻轻吹下来,把细胞悬浮液加入离心管离心(800~1000rpm, 5min),倒掉上清液。

2.6.2把细胞沉淀制成悬液,计数,再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养液移到培养器皿中培养。

2.6.3悬浮细胞直接用滴管或移液管吸入离心管离心(800~1000rpm, 5min),倒掉上清液。

2.6.4把细胞沉淀制成悬液,计数,再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养液移到培养器皿中培养。

2.6.5将培养器皿放回CO2培养箱培养(培养瓶培养需将瓶盖旋开半圈)。

2.6.6操作完毕,填写“细胞培养传代记录”。

3注意事项

3.1传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。每一种细胞使用一套器材。培养用液应严格分开。

3.2每天观察细胞形态,掌握好细胞是否健康的标准:健康细胞的形态饱满,折光性好,生长致密时即可传代。

3.3细胞培养传代吹打要轻柔不用用力过猛同时尽可能不要出现泡沫,这些都对细胞有损伤

一. 传代前准备:

1.预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。

2.用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。

3.正确摆放使用的器械,保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。

4.点燃酒精灯,注意火焰不能太小。

5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶,放入微波炉内高火,8分钟再次消毒。

6.取出预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。

7.从培养箱内取出细胞,注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。

8.打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。

9稍微摇摇,然后从对侧倒掉培养液,用酒精棉球擦拭最后一滴,注意要靠近酒精灯。

二.胰蛋白酶消化;

1.加入消化液:用PBS清洗(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以盖住细胞最好,最佳消化温度是37℃。

2. 显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度,然后让其停止消化。

3.倒掉消化液加入培养液,弃去胰蛋白酶液,加入新鲜的培养液。注意要在对测加入培养液。

三.吹打分散细胞:

1.吹打制悬:用吸管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。

2.吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10ml离心管中。

3.平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心5分钟。

4.弃上清液,加入新培养液:弃去上清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。

四.分装稀释细胞:

1.分装:将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶盖。

2.显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察细胞量,必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应该不低于5×105/ml,最后要做好标记。

五.传代培养:

用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时为一个+,占50%为++,占75%时为+++。

六传代细胞培养注意事项:

1.严格的无菌操作

2.适度消化:消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响,消化过程中应该注意培养细胞形态的变化,一旦胞质回缩,连接变松散,或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。附:0.25% 胰酶(胰蛋白酶,Trypsin)

配方:100ml PBS,0.25g胰酶

步骤:

1先配100mlPBS。

2 称胰酶0.25g。

3 加入PBS中,低速搅拌。

4 调PH7.4。

5 过滤,分装,-20℃保存,4℃短期内用完。

注意:低速很重要,机械搅拌对酶是一种冲击,如果起沫,酶就变性了。低温,防止酶失活;对难消化的细胞,在上述配方中,加入0.02g的EDTA(0.02%)

新手

细胞传代培养:

实验用品:75%酒精,酒精棉球,酒精灯,火柴,离心管(15ml),离心机,吸管,胶帽,倒置显微镜,超净工作台,二氧化碳培养箱,25ml培养瓶(5个),培养瓶盖,大烧杯,镊子,D-Hanks液,胰酶(0.25%),RP1640培养基,小牛血清,滤膜,注射器,24孔板,计数板,盖玻片,记号笔,中性笔,白纸。

实验用品处理:

1、超净工作台:用75%酒精擦拭,放入2中所列物品后40分钟紫外照射。

2、二氧化碳培养箱:将内部托盘,托板,横架,竖架全部拆出来,75%酒精擦拭,放入超净台照射40分钟。箱内部用75%酒精擦拭,托盘内的水为蒸馏水1L加5克硫酸铜。

3、75%酒精,酒精棉球,酒精灯,火柴,大烧杯,滤膜,注射器,24孔板计数板(75%酒精擦拭后),盖玻片,记号笔,中性笔,白纸放到超净工作台内紫外照射40分钟。

4、离心管,胶帽,培养瓶盖115摄氏度高压15分钟,70摄氏度烘箱烤干。D-hanks液115摄氏度高压15分钟,放入超净台中。D-hanks工作液用前过滤。

5、培养瓶,镊子,吸管,121摄氏度高压20分钟,70摄氏度烘干。

6、RP-1640培养基先分装,90ml每瓶,然后使用之前75%酒精擦拭外表面,在二氧化碳培养箱中预热到37摄氏度。

7、胰酶从-20摄氏度拿到4摄氏度融化,,然后放到二氧化碳培养箱中几分钟,使温度达到最佳工作温度,胰酶用前过滤。

8、小牛血清10ml放到4摄氏度融化,然后加入到90ml培养基中,混匀,韩小牛血清培养基用前过滤。

9、离心机,倒置显微镜用75%酒精仔细擦拭,紫外照射40分钟。

细胞的传代培养:

1、倒掉瓶内旧培养液。(倒到大烧杯中,小心不要接触)

2、向25ml 培养瓶内加入lml胰酶消化液,轻轻摇动培养瓶,使消化液流遍所有细胞表面,然后倒掉消化液后再加1-2ml新的消化液,轻轻摇动后,再倒掉大部分消化液,仅留少许进

行消化。(用吸管加消化液)

3、在倒置显微镜下对培养细胞进行观察,当细胞胞质回缩,胞间间隙增大时,加入含有血清的培养基终止消化。(用吸管加培养基)

4、用吸管吸去培养液,反复轻轻吹打瓶壁,制备细胞悬液。吹打的部位应均匀,可按从上打下,从左到右的顺序进行,保证瓶底各个部位的细胞均能被吹到,此外吹打时不能用力过猛,尽量不出现气泡,以免损伤细胞。

5、将吹打后的细胞治愈倒置显微镜下观察,当发现原贴壁细胞均已悬浮于培养液中,成片的细胞已分散成小的细胞团或单细胞,即可终止吹打。

6、收集细胞于离心管中,1000r/min离心3-5分钟,去除上清。(司徒镇强没有这一步)

7、细胞计数(计数四个大方格之细胞总数,再除4,乘以稀释倍数,最后乘以104 ,即为每ml 中细胞悬浮液的细胞数。若细胞位于线上,只计上线与右线之细胞(或计下线与左线之细胞)。),按照1×105-1×106个细胞密度接种于新培养瓶或培养板中。

细胞传代培养的原理及操作步骤,细胞冻存,细胞复苏

细胞传代培养的原理及操作步骤 (一)原理:细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时也将细胞数量扩大,须进行传代再培养。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以,而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 (二)细胞传代培养具体操作 1、细胞:贴壁细胞株 2、操作步骤 1)将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 2)加入0.5-1ml 0.25%胰酶溶液,使瓶底细胞都浸入溶液中。 3)瓶口塞好橡皮塞,放在倒置镜下观察细胞。随着时间的推移,原贴壁的细胞逐渐趋于圆形,在还未漂起时将胰酶弃去,加入10ml培养液终止消化。 观察消化也可以用肉眼,当见到瓶底发白并出现细针孔空隙时终止消化。一般室温消化时间约为1-3分钟。 4)用吸管将贴壁的细胞吹打成悬液,分到另外两到三瓶中,实践培养液塞好橡皮塞,置37℃下继续培养。第二天观察贴壁生长情况。 细胞冻存 1. 实验前准备:细胞室及工作台紫外线照射15min;培养液、PBS、胰酶、小牛血清、DMSO、恒温水 浴箱37℃预热备用;收集对数生长期细胞,在冻存前一天最好换液 2.用吸管吸出培养瓶中的细胞培养液,PBS清洗2遍吸出冲洗液,加入适量胰蛋白酶消化。 3. 适时去掉胰蛋白酶,加入少量新培养液。吸管吸取培养液吹打瓶壁上的细胞,使其成为均匀分散的 细胞悬液。 4. 用吸管将培养液加入冻存管中,离心(1000r/min,10分钟)。 5. 去上清液,加入与细胞悬液等量的冻存液,用吸管轻轻吹打使细胞均匀 6. 冷存管置于4℃10分钟----20℃30分钟----80℃16~18小时(或隔夜)---液氮槽vaporphase长期储 存。-20℃不可超过1h,以防止胞内冰晶过大,造成细胞大量死亡,亦可跳过此步骤直接放入-80℃冰箱中,惟存活率稍微降低一些。 7.记录每一个冷冻管的位置以确保在以后应用时能够找到每一个冷冻管。 细胞复苏 1.室内紫外消毒;培养基、PBS于37℃恒温水浴预热备用。 2.自液氮罐中取出冷冻管,立即放入37℃水槽中快速解冻,离心。 3.去上清,加入培养基,吹打,然后移入培养瓶中,用培养基清洗冻存管,清洗液也移入培养瓶中。 4.于培养瓶中加入适量培养基,放入CO2培养箱中培养 5.记录复苏日期;次日换液。

细胞传代培养

细胞传代培养(胰蛋白酶消化法) 具体操作: 一. 传代前准备: 1.预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 2.用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 3.正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。 4.点燃酒精灯:注意火焰不能太小。 5.准备好将要使用的消毒后的空培养瓶,放入微波炉内高火,8分钟再次消毒。 6.取出预热好的培养用液:取出已经预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 7.从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。 8.打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。 二.胰蛋白酶消化; 1.加入消化液:小心吸出旧培养液,用PBS清洗(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以盖住细胞最好,最佳消化温度是37℃。 2. 显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度。 3.吸弃消化液加入培养液:弃去胰蛋白酶液,注意更换吸管,加入新鲜的培养液。 三.吹打分散细胞: 1.吹打制悬:用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 2.吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10ml离心管中。 3.平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心6-8分钟。 4.弃上清液,加入新培养液:弃去上清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 四.分装稀释细胞: 1.分装:将细胞悬液吸出分装至2-3个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶盖。 2.显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察细胞量,必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。 五.继续培养: 用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时为一个+,占50%为++,占75%时为+++。 传代细胞培养注意事项: 1.严格的无菌操作 2.适度消化:消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响,消化过程中应该注意培养细胞形态的变化,一旦胞质回缩,连接变松散,或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

贴壁细胞传代-消化过程图示.

贴壁细胞传代-消化过程图示 贴壁细胞细胞在培养瓶长成致密单层后,继续生长的空间不足,培养基中的营养成份也消耗较多,同时代谢废物也有较多堆积,需要分瓶培养,对细胞进行传代扩增。 对于贴壁不太紧的细胞如293,可以直接吹散后分瓶。而对于贴壁较紧的细胞如CHO,则需要以胰酶消化后再吹散分瓶,一般过程为(以下操作均按无菌操作的要求进行): o将长成致密单层细胞的细胞瓶中原来的培养液弃去; o加入0.25%胰酶溶液,视细胞瓶的大小加入体积为0.5ml或更多,以使充分浸润; o一般消化时间约为1至3分钟,肉眼观察瓶壁半透明的细胞层,当见到出现细针孔空隙时,弃去胰酶溶液,并加入适量的细胞培养液终止消化; o视实验要求分入多瓶继续培养,一般为一传二到一传四的比例。 这里,胰酶消化的程度是一个关键:消化过度则对细胞的活性损伤较大,并有部分细胞漂浮,随弃去的胰酶流失;消化不足则细胞难于从瓶壁上吹下,反复吹打同样也会损伤细胞活性。 影响消化速度的因素较多,主要有胰酶溶液的活性(配制条件、冻存或4℃保存时间长短、是否反复冻融、化冻后存放时间及温度等)、消化时的温度(气温、细胞培养瓶及胰酶溶液的温度)以及所加胰酶溶液的多少等。以笔者的经验,以轻吹或加培养液后轻摇可下较好,但对于经验不太充分的实验者而言是较难判断掌握的。下面将细胞生长及不同消化程度的光学显微镜照片列出以供参考。 所用细胞为CHO贴壁细胞,培养基为含10%小牛血清的DMEM-F12,倒置显微镜10X40, 数码相机300万像素。

取细胞冻存管一支,于40°C水中速融;25ml细胞方瓶中加入含10%COSMIC小牛血清的DMEM-F12培养基10ml,将冻存管中细胞全部洗入瓶中,置37°C 2.5%二氧化碳孵箱中静置培养。4小时后倒去全部培养基以去除冻存液,更换10ml 培养基,同上静置培养。 经24小时培养后,生长情况为: 经48小时培养后,细胞已长成致密单层:

细胞培养操作步骤

培养基的配置:基础培养基500ml+胎牛血清50ml+双抗5ml 冻存液的配置:DMS018ml+胎牛血清2ml。 依次比例酌量配置。 超净工作台常规配置 移液器1套(2.5小20 d、200 pl> 1ml),酒精灯1盏,液器1台,斜架1台, 酒精喷壶 1 个,酒精棉球缸 1 个,污缸 1 个, 常规耗材:培养瓶(50 cm 2),定量移液管(5ml、10ml),枪头(1ml、200小 10 d),培养皿,6/24/48/96孔板,医用脱脂棉球,保种管 所需试剂:gibco高糖培养基,胎牛血清,双抗,DMSO,胰酶,苯扎溴氨,75% 酒精…… 实验前准备: 所需的各项高压后的耗材放于超净工作台内,用酒精喷壶喷洒实验台面,并关闭工作台打开紫外灯照射30min 后开始实验操作。 首次传代前细胞的复苏,首先用一大烧杯盛满37C的温水放于液氮罐旁边,待 细胞株取出后留上端1/3于37C水面上尽最大速摇动管使其在2min内迅速融化。若 种管顶部含有冻存的细胞液在摇动期间用力甩动使其降于管底后再摇动。这一过程可在超净工作台外操作。 实验步骤 一、原代细胞的培养 1. 紫外消毒30min 后关闭紫外灯,开启超净台正常工作状态,用酒精消毒操作者的 双手。 2. 将所需的培养基确保瓶身干净后放于工作台面内,点燃酒精灯,将培养基瓶口用酒 精棉球擦拭后,再将瓶口对准在酒精灯上消毒2-3 次,旋开瓶盖后再次分别消毒瓶口和瓶盖,分别放于酒精灯的两侧。特别是将培养基瓶放于斜架上,瓶口对准酒精灯,且放在距离酒精灯最近的位置,瓶盖置于酒精灯的另一侧。 3. 取1 个高压后的新培养瓶,瓶口在酒精灯上消毒2-3 次,旋开后分别再次消毒瓶 口和瓶盖2-3 次分别放于酒精灯两侧,把保种管在超净台外用酒精棉球擦拭下2/3 后拿进超净台内在酒精灯上消毒保种管口2-3次放于台面左手边,取1ml 移液器快速移动在酒精灯上消毒1-2 次,然后再装上枪头吸取保种管内的细胞液,悬空移入培养瓶内。 4. 拿出1 支高压后的5ml 定量移液管,在酒精灯上灼烧尾部后装于电动移液器上, 再次放于酒精灯上灼烧整个定量移液管管身2-3 次,悬空进入培养基瓶内吸取4ml 培养基再悬空移入培养瓶内,将培养瓶瓶口和瓶盖在酒精灯上消毒2-3 次后拧紧平放,在瓶身做好实验标记。 5. 将培养基瓶口和瓶盖消毒2-3 次后拧紧,熄灭酒精灯,整理实验台面,取出实验试 剂及污缸等,关闭超净工作台。 6?将培养瓶放于28C,5%CO2的培养箱内培养,旋开瓶口少许。注意整个培养箱底托盘内一定要放高压后的水,且定期更换确保无菌。 在CO2培养箱内培养10-12h,瓶盖拧紧后拿出培养箱,置于荧光倒置显微镜下观察细胞贴壁情况,及细胞形态。最后更换培养液。 、培养液的更换

原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项

初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器:培养箱(调整至37℃),培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱(37℃) 材料:动物组织块 试剂:1640培养基(含20%小牛血清),0.25%胰酶,Hank′s液,碘酒 初代消化培养法 1. 准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面,紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局:点燃酒精灯,安装吸管帽。 3. 处理组织:把组织块置于烧杯中,用Hanks液漂洗2~3次,去除血污;如怀疑组织可能污染,可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切:用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块,以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角烧瓶中,结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化:或用恒温水浴,或置于37℃温箱消化均可,消化中每隔20分钟应摇动一次,如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离:在消化过程中见消化液发混浊时,可用吸管吸出少许消化液在镜下观察,如组织已分散成细胞团或单个细胞,立即终止消化,随即通过适宜不锈钢筛,滤掉尚未充分消化开的组织块。低速 (500~1000转/分)离心消化液5分钟,吸出上清,加入适量含有血清的培养液。 7. 计数:用计数板计数,如细胞悬液细胞密度过大,再补加培养液调整后,分装入培养瓶中。对大多数细胞来说,pH要求在7.2~7.4范围,培养液呈微红色,如颜色偏黄,说明液体变酸,可用NaHCO3调整。 8. 培养:置于36.5℃温箱培养,如用CO2温箱培养,瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞,纱布塞易生霉菌,每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切:把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中,用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污,吸静Hanks液,用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布:用弯头吸管吸取若干小块,置于培养瓶中,用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部,小块相互距离以0.5cm为宜,每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶,另瓶底向上,注意翻瓶时勿另组织小块流动,塞好瓶塞,置36.5℃温箱培养2小时左右(勿超过4小时),使小块微干涸。 4. 培养:从微箱中取出培养瓶,开塞,46度斜持培养瓶,箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许,然后缓缓再把培养瓶翻转过来,让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。

实验五 细胞的传代培养

实验5 细胞的传代培养 一、实验目的 熟练掌握动物细胞的传代培养法。 二、实验原理 哺乳动物细胞的传代培养是几乎所有细胞生物学实验的基础。当细胞在培养瓶中长满后就需要将其稀释分种成多瓶,细胞才能继续生长,这一过程就叫传代。传代培养可获得大量细胞供实验所需。 三、仪器、材料与试剂 1仪器 CO2培养箱,倒置显微镜,超净台 2材料 培养瓶,试管,移液管,巴斯德吸管,废液缸,75%酒精棉球,酒精灯,细胞。 3试剂 完全培养基(RPMLl640或DMEM),0.25%胰蛋白酶,D-Hanks液。 四、实验步骤 1.入无菌室之前用肥皂洗手,用75%酒精擦拭消毒双手。 2.倒置显微镜下观察细胞形态,确定细胞是否需要传代及细胞需要稀释的倍数。将培养用液置37℃下预热。 3.超净台台面应整洁,用75%酒精溶液擦净。 4.打开超净台的紫外灯照射台面20min左右,关闭超净台的紫外灯,打开抽风机清洁空气。 5.点燃酒精灯,取出无菌试管,刻度吸管;安上橡皮头;插在无菌试管内。 6.打开细胞培养瓶,过酒精灯火焰后斜置于酒精灯旁的架子上。 7.倒掉培养细胞的旧培养基。酌情可用2-3mL Hanks液洗去残留的旧培养基,或用少量胰酶涮洗一下。 8.加入胰酶消化液,盖好瓶盖后在倒置显微镜下观察,当细胞收回突起变圆时立即翻转培养瓶,使细胞脱离胰酶,然后将胰酶倒掉。注意勿使细胞提早脱落入消化液。

9.加入少量的新鲜培养基,反复吹打消化好的细胞使其脱壁并分散,再根据分传瓶数补加一定量的含血清的新鲜培养基(7-10mL/大瓶,3-5mL/小瓶)制成细胞悬液,分装到新培养瓶中。盖上瓶盖,适度拧紧后再稍回转,以利于CO2气体的进入,将培养瓶放回CO2培养箱。 10.对悬浮培养细胞,步骤7-9不做。可将细胞悬液进行离心去除旧培养基上清,加入新鲜培养基,然后分装到各瓶中。 五、注意事项 1.传代培养时要注意无菌操作并防止细胞之间的交叉污染。所有操作要尽量靠近酒精灯火焰。每次最好只进行一种细胞的操作。培养用液应严格分开。 2.每天观察细胞形态,掌握好细胞是否健康的标准:健康细胞的形态饱满,折光性好,生长致密时即可传代。 3.如发现细胞有污染迹象,应立即采取措施,一般应弃置污染的细胞,如果必须挽救,可加含有抗生素的BSS或培养基反复清洗,随后培养基中加入较大量的抗菌素,并经常更换培养基等。 六、实验报告 1.试述传代培养的步骤和注意事项,并指出哪些是关键步骤? 2.细胞传代培养的目的是什么?

细胞传代培养标准操作规程

创作编号: GB8878185555334563BT9125XW 创作者:凤呜大王* 细胞传代培养(消化法)标准操作规程 一、原理 细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时也将细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养)。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以,而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 二、材料和试剂 1. 无菌磷酸生理缓冲液(PBS) 2. 胰酶-EDTA溶液(0.05%胰酶-0.53mM EDTA-4Na): 以10ml分装于15 ml 无菌离心管中,保存于–20℃,使用前放在37℃水槽回温。 3. 新鲜培养基 4. 无菌吸管/离心管/培养瓶 三、操作步骤 1. 传代前准备 (1)预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 (2)用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 (3)正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。 (4)点燃酒精灯:注意火焰不能太小。 (5)准备好将要使用的消毒后的空培养瓶。

(6)取出预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。(7)从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。 (8)打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。 2. 胰蛋白酶消化 (1)加入消化液:小心吸出旧培养液,用PBS清洗(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以盖住细胞最好,最佳消化温度是37℃。 (2)显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度。 (3)吸弃消化液加入培养液:弃去胰蛋白酶液,注意更换吸管,加入新鲜的培养液。 3. 吹打分散细胞 (1)吹打制悬:用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 (2)吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10ml离心管中。 (3)平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心6-8分钟。 (4)弃上清液,加入新培养液:弃去上清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 4. 分装稀释细胞 (1)显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察细胞量,必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。 (2)分装:将细胞悬液吸出分装至2~3个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶盖。 (3)继续培养:用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。 5. 悬浮型细胞的传代 (1)吸出细胞培养液,放入离心管中,离心1000 rpm 5 分钟。

常规细胞培养方法

常规细胞培养方法(原代培养和传代培养)初代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器:培养箱(调整至37℃),培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱(37℃) 材料:动物组织块 试剂:1640培养基(含20%小牛血清),0.25%胰酶,Hank′s 液,碘酒 初代消化培养法

1.准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面,紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2.布局:点燃酒精灯,安装吸管帽。 3.处理组织:把组织块置于烧杯中,用Hanks液漂洗2~3次,去除血污;如怀疑组织可能污染,可先置于含有青链霉素的混合液中3 0~60分钟。 4.剪切:用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块,以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角烧瓶中,结扎瓶口或塞以胶塞。 5.消化:或用恒温水浴,或置于37℃温箱消化均可,消化中每隔20分钟应摇动一次,如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6.分离:在消化过程中见消化液发混浊时,可用吸管吸出少许消化液在镜下观察,如组织已分散成细胞团或单个细胞,立即终止消化,随即通过适宜不锈钢筛,滤掉尚未充分消化开的组织块。低速(500 ~1000转/分)离心消化液5分钟,吸出上清,加入适量含有血清的培养液。

7.计数:用计数板计数,如细胞悬液细胞密度过大,再补加培养液调整后,分装入培养瓶中。对大多数细胞来说,pH要求在7.2~7. 4范围,培养液呈微红色,如颜色偏黄,说明液体变酸,可用NaHC O3调整。 8.培养:置于36.5℃温箱培养,如用CO2温箱培养,瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞,纱布塞易生霉菌,每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1.剪切:把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中,用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污,吸静Hanks液,用眼科剪反复剪切1mm 3块为止。 2.摆布:用弯头吸管吸取若干小块,置于培养瓶中,用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部,小块相互距离以0.5cm为宜,每一2 5ml培养瓶底可摆布20~30块。 3.轻轻翻转培养瓶,另瓶底向上,注意翻瓶时勿另组织小块流动,塞好瓶塞,置36.5℃温箱培养2小时左右(勿超过4小时),使小块微干涸。 4.培养:从微箱中取出培养瓶,开塞,46度斜持培养瓶,箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许,然后缓缓再把培养瓶翻转过来,让培养液

T细胞培养标准操作规程

百利药业生物药研发部 标准操作规程 题目:293T细胞传代培养操作规程 编号:SOP-M-e-003- 制定者:(签名)日期:年月日批准者:(签名)日期:年月日生效日期:年月日

题目:293T细胞培养操作规程 1 目的 293T细胞是常用于包装和扩增病毒载体的工具细胞,因此做好293T细胞的培养,为保证相关实验的正常进行提供必要条件。 2 适用范围本部门293T细胞培养 3 操作方法 将移液器和移液枪、15ml离心管、离心管架、75cm2新的细胞培养瓶放于生物安全柜中,按照生物安全柜的标准操作规程,将生物安全柜的紫外开启半小时。 将含10%胎牛血清和100U/ml双抗的DMEM及PBS放于37℃水浴锅中预热。 培养箱中取出,先用75% 3.2.1将已长到80%-90%的293T细胞培养瓶从37℃,5%的CO 2 的酒精喷洒于瓶表面,将细胞培养瓶旋转放于生物安全柜中,用无菌的移液管吸净其中的培养基,加5ml的预热的PBS洗涤一次,吸净PBS。 3.2.2将含%tyption用PBS稀释两陪到五倍,向该75cm2的细胞瓶中加入3ml稀释好的%tyption,让其充分平铺于细胞表面。盖好瓶盖,将细胞瓶放在显微镜下观察,直到细胞变圆,加含10%胎牛血清的DMEM终止反应,用移液管轻轻将瓶上的细胞吹下,将细胞液移到15ml无菌的离心管中,1000rpm离心3分钟。 3.2.3将离心上清吸弃掉,用手指轻轻拍打离心管底将底部细胞分散开,再加3mlDMEM 培养基将分散的细胞重悬稀释开,取一定量的细胞液进行n倍稀释后计数,按照细胞计数标准操作规程进行。 3.2.4计数好之后细胞传代密度按照2~5×104个细胞/cm2进行传代培养,每个75cm2的 培养箱中培养。 培养瓶中加10mlDMEM培养基,放于37℃,5%的CO 2 3.2.5 24小时后观察细胞状态,待细胞长到80%-90%时进行下一次传代培养。

细胞传代实验报告

细胞传代培养 一.实验目的 初步掌握哺乳动物细胞的原代培养与传代培养的基本操作过程,为生物技术在医学上的 应用打下基础。 二、原理 从生物体中取出某种组织或细胞,模拟体内生理条件,在人工培养条件下使其生存、生 长、繁殖或传代,这一过程称为细胞培养。细胞培养技术的最大优点是使我们得以直接 观察 活细胞,并在有控制的环境条件下进行实验,避免了体内实验时的许多复杂因素,还可 以与 体内实验互为补充,可同时提供大量生物性状相同的细胞作为研究对象,耗费少,比较 经济, 因此成为生物学研究的重要手段。 细胞培养可分为原代培养和传代(继代)培养。直接从体内获取的组织细胞进行首次培养 为 原代培养;当原代培养的细胞增殖达到一定密度后,则需要做再培养,即将培养的细胞 分散 后,从一个容器以1:2或其他比率转移到另一个或几个容器中扩大培养,为传代培养, 传 代培养的累积次数就是细胞的代数。 细胞培养是一种程序复杂、要求条件多而严格的实验性工作。所有离体细胞的生长都受 温度、渗透压、ph值、无机盐影响,消毒、配液等均有严格的规范和要求,特别是无菌 操 作是细胞培养成败的关键。 三、材料和试剂 1、细胞:293细胞株 2、试剂:0.25%胰酶、1640培养基(含10%小牛血清) 3、仪器和器材:倒置显微镜,培养箱、电动枪,培养板,吸液枪,5ml玻璃吸管、酒精 灯等 四、操作步骤 1、将长满细胞的培养板中原来的培养液吸去。 2、加入1~2ml 0.25%胰酶溶液,使板底细胞都浸入溶液中。 3、马上吸走胰酶液,再次加入2ml左右的胰酶,同样马上吸去,再加入几滴胰酶放入 培养箱中消化几分钟 4、用吸管将贴壁的细胞反复吹打成悬液,再按照观察的生长情况确定的传代比例传代 5.根据确定的比例来取需要的量(剩余的细胞拿来做细胞计数),加入4ml左右的培养液 6.前后左右的来回震荡使细胞分散均匀后,将培养板放入培养箱 7.收拾整理超净台 附:消化液配制方法: 称取2.5克胰酶蛋白酶,加入100ml10xpbs+纯水溶解到1l,滤器过滤除菌,4℃保存, 用前可在37℃下回温。 10x pbs配方:na2hpo4(14.2g) kh2po4(2.32g) nacl(80g) kcl(2.02g) (调至ph=7.4) 五、实验结果

《细胞实验》02 原代细胞培养和传代培养的方法

原代细胞培养和传代培养的方法 原代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器:培养箱(调整至37℃),培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱(37℃) 材料:动物组织块 试剂:1640培养基(含20%小牛血清),0.25%胰酶,Hank′s液,碘酒 初代消化培养法 1. 准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面,紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局:点燃酒精灯,安装吸管帽。 3. 处理组织:把组织块置于烧杯中,用Hanks液漂洗2~3次,去除血污;如怀疑组织可能污染,可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切:用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块,以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角烧瓶中,结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化:或用恒温水浴,或置于37℃温箱消化均可,消化中每隔20分钟应摇动一次,如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离:在消化过程中见消化液发混浊时,可用吸管吸出少许消化液在镜下观察,如组织

已分散成细胞团或单个细胞,立即终止消化,随即通过适宜不锈钢筛,滤掉尚未充分消化开的组织块。低速(500~1000转/分)离心消化液5分钟,吸出上清,加入适量含有血清的培养液。 7. 计数:用计数板计数,如细胞悬液细胞密度过大,再补加培养液调整后,分装入培养瓶中。对大多数细胞来说,pH要求在7.2~7.4范围,培养液呈微红色,如颜色偏黄,说明液体变酸,可用NaHCO3调整。 8. 培养:置于36.5℃温箱培养,如用CO2温箱培养,瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞,纱布塞易生霉菌,每次换液时需要换新塞。 初代组织块培养法 1. 剪切:把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中,用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污,吸静Hanks液,用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布:用弯头吸管吸取若干小块,置于培养瓶中,用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部,小块相互距离以0.5cm为宜,每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。 3. 轻轻翻转培养瓶,另瓶底向上,注意翻瓶时勿另组织小块流动,塞好瓶塞,置36.5℃温箱培养2小时左右(勿超过4小时),使小块微干涸。 4. 培养:从微箱中取出培养瓶,开塞,46度斜持培养瓶,箱瓶底脚部轻轻注入培养液少许,然后缓缓再把培养瓶翻转过来,让培养液慢慢覆盖附于瓶地上的组织小块。置温箱中静止培养。待细胞从组织块游出数量增多后。再补加培养液。 传代培养法 原理 细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时 也将细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养)。传代培养也是一种将细胞种保存下去

常规细胞培养方法(原代培养和传代培养)

原代上皮细胞与原代成纤维细胞培养的分离纯化 2010-12-02 10:29 来源:PriCells 点击次数:335 关键词:上皮细胞成纤维细胞培养分离纯化 分享到:收藏夹腾讯微博新浪微博开心网 PriCells- 原代上皮细胞与原代成纤维细胞培养的分离纯化 原代细胞、传代细胞绝大多数都呈混合生长,既有上皮样细胞又有纤维样细胞,纤维样细胞又包括成纤维细胞、肌细胞、骨细胞、滑膜细胞等。混杂的细胞会直接影响实验结果。 在体外培养原代细胞时,为了保证实验结果的可靠性、一致性、稳定性、和可重复性,要求采用单一种类细胞来进行实验,这样才能对某一细胞的功能、形态等变化进行一系列研究,因而培养细胞的纯化就成为实验研究的重要一步,甚至需要从混杂的细胞群中分离出单个细胞来进行培养和开展实验研究。 一、原代细胞增殖优势纯化方法:

自然纯化是利用某一种类细胞的增殖优势,在长期传代过程中靠自然淘汰法,不断排挤其他生长慢的细胞,靠自然增殖的潜力,最后留下生长优势旺盛的细胞,达到细胞纯化的目的。但这种方法常无法按照需要和实验要求及研究目的来选择细胞。此法花费时间长,留下的往往是成纤维细胞。仅有那些恶变的肿瘤细胞或突变的细胞可以通过此方法而保留下来的,不断纯化而建立细胞系。 二、原代细胞常用纯化方法: 人工纯化是利用人为手段造成对某一细胞生长有利的环境条件,抑制其他细胞的生长从而达到纯化细胞的目的。 1 、细胞时间差酶消化法: 酶消化法是比较常用的纯化方法,不仅对贴壁细胞可行,能利用上皮细胞和成纤维细胞对胰蛋白酶的耐受性不同,是两者分开,达到纯化的目的;另外对贴壁细胞与半贴壁细胞及黏附细胞间的分离纯化也是十分有效的。

原代细胞培养和传代培养的方法及其注意事项

原代培养 原理 将动物机体的各种组织从机体中取出,经各种酶(常用胰蛋白酶)、螯合剂(常用EDTA)或机械方法处理,分散成单细胞,置合适的培养基中培养,使细胞得以生存、生长和繁殖,这一过程称原代培养。 仪器、材料及试剂 仪器:培养箱(调整至37℃),培养瓶、青霉素瓶、小玻璃漏斗、平皿、吸管、移液管、纱布、手术器械、血球计数板、离心机、水浴箱(37℃)材料:动物组织块 试剂:1640培养基(含20%小牛血清),0.25%胰酶,Hank′s液,碘酒 原代消化培养法 1. 准备:取各种已消毒的培养用品置于净化台面,紫外线消毒20分钟。开始工作前先洗手、75%酒精擦拭手至肘部。 2. 布局:点燃酒精灯,安装吸管帽。 3. 处理组织:把组织块置于烧杯中,用Hanks液漂洗2~3次,去除血污;如怀疑组织可能污染,可先置于含有青链霉素的混合液中30~60分钟。 4. 剪切:用眼科剪把组织切成2~3毫米大小的块,以便于消化。加入比组织块总量多30~50倍的胰蛋白酶液,然后一并倒入三角烧瓶中,结扎瓶口或塞以胶塞。 5. 消化:或用恒温水浴,或置于37℃温箱消化均可,消化中每隔20分钟应摇动一次,如用电磁恒温搅拌器消化更好。消化时间依组织块的大小和组织的硬度而定。 6. 分离:在消化过程中见消化液发混浊时,可用吸管吸出少许消化液在镜下观察,如组织已分散成细胞团或单个细胞,立即终止消化,随即通过适宜不锈钢筛,滤掉尚未充分消化开的组织块。低速(500~1000转/分)离心消化液5分钟,吸出上清,加入适量含有血清的培养液。 7. 计数:用计数板计数,如细胞悬液细胞密度过大,再补加培养液调整后,分装入培养瓶中。对大多数细胞来说,pH要求在7.2~7.4范围,培养液呈微红色,如颜色偏黄,说明液体变酸,可用NaHCO3调整。 8. 培养:置于36.5℃温箱培养,如用CO2温箱培养,瓶口需用纱布棉塞或螺旋帽堵塞,纱布塞易生霉菌,每次换液时需要换新塞。 原代组织块培养法 1. 剪切:把组织小块置于小烧杯或青霉素小瓶中,用Hanks液漂洗二三次以去掉表面血污,吸静Hanks液,用眼科剪反复剪切1mm3块为止。 2. 摆布:用弯头吸管吸取若干小块,置于培养瓶中,用吸管弯头把组织小块摆布在培养瓶底部,小块相互距离以0.5cm为宜,每一25ml培养瓶底可摆布20~30块。

细胞传代培养标准操作规程

细胞传代培养(消化法)标准操作规程 一、原理 细胞在培养瓶长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时也将细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养)。 传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。悬浮型细胞直接分瓶就可以,而贴壁细胞需经消化后才能分瓶。 二、材料和试剂 1. 无菌磷酸生理缓冲液(PBS) 2. 胰酶-EDTA溶液(0.05%胰酶-0.53mM EDTA-4Na): 以10ml分装于15 ml无菌离心管中,保存于–20℃,使用前放在37℃水槽回温。 3. 新鲜培养基 4. 无菌吸管/离心管/培养瓶 三、操作步骤 1. 传代前准备 (1)预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37℃水浴锅内预热。 (2)用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 (3)正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。 (4)点燃酒精灯:注意火焰不能太小。 (5)准备好将要使用的消毒后的空培养瓶。 (6)取出预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 (7)从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。 (8)打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。 2. 胰蛋白酶消化 (1)加入消化液:小心吸出旧培养液,用PBS清洗(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶液),注意消化液的量以盖住细胞最好,最佳消化温度是37℃。

(2)显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度。 (3)吸弃消化液加入培养液:弃去胰蛋白酶液,注意更换吸管,加入新鲜的培养液。 3. 吹打分散细胞 (1)吹打制悬:用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 (2)吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10ml离心管中。 (3)平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心6-8 分钟。 (4)弃上清液,加入新培养液:弃去上清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 4. 分装稀释细胞 (1)显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察细胞量,必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应该不低于5×105/ml。最后要做好标记。 (2)分装:将细胞悬液吸出分装至2~3个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶盖。(3)继续培养:用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO2培养箱中继续培养。传代细胞2小时后开始贴附在瓶壁上。 5. 悬浮型细胞的传代 (1)吸出细胞培养液,放入离心管中,离心1000 rpm 5 分钟。 (2)吸掉上清液,加入适量之新鲜培养基,混和均匀后,依稀释比例转移至新的培养瓶中,以正常培养条件培养。 注意事项: 1.严格的无菌操作。 2.适度消化:消化的时间受消化液的种类、配制时间、加入培养瓶中的量等诸多因素的影响,消化过程中应该注意培养细胞形态的变化,一旦胞质回缩,连接变松散,或有成片浮起的迹象就要立即终止消化。

细胞培养传代冻存复苏操作规程自编

细胞培养程序 材料 A、仪器 1. 净化工作台, 2. 离心机, 3. 恒温水浴箱, 4. 冰箱(4℃) 5. 倒置相差显微镜, 6. CO2培养箱, 7. 振荡混合仪 8. 酶联免疫检测仪,9. 移液枪,10. 电磁力搅拌机,11. 微孔滤器 B、玻璃器皿 1. 吸管, 2. 小烧杯(100ml), 3. 废液缸, C、塑料器皿 1. 吸头, 2. 枪头, 3. 96孔培养板, 4. 15ml离心管, 5. 50ml离心管, 6. 胶塞, D、其他物品 1. 微量加样枪, 2. 红血球计数板, F、试剂 1. D-Hanks液, 2. 小牛血清, 3. RPMI1640, 4. 双抗(青霉素、链霉素), 5. 0.25%胰酶, 6.0.025% EDTA 7. 二甲基亚砜(DMSO), 8. MTT溶液:称取250mgMTT,放入小烧杯中,加50ml培养液或平衡盐溶液在电磁力搅拌机上搅拌30min,用0.22um的微孔滤器除菌,分装,4℃保存备用,两周内有效。 一、原代细胞培养或细胞株(系)复苏培养: (一)细胞原代培养 1.贴壁细胞培养法: 1)、组织块培养法 将所取得的组织用含青霉素、链霉素400U/ml和400ug/ml的生理盐水漂洗2此,5分钟/次。取出组织尽可能的取出液滴,置青霉素小瓶中,加两滴小牛血清,用剪刀尽可能将其剪碎,用吸管将其泥状的组织点种在培养瓶壁,倒置于37°、5%CO2条件下30分钟后将培养瓶正置,从培养瓶的一端缓缓加入完全培养液(小

牛血清15%、青霉素、链霉素各100U、100ug/ml),使组织块有培养液与其接触为准,轻轻放置于37°培养。待24小时候补液。 或小块放置后,轻轻翻转培养瓶,使瓶底朝上,然后于瓶内加入适量培养基盖好瓶塞,将瓶倾斜放置在37℃温箱内。培养2~4小时,待小块贴附后,将培养瓶缓慢翻转平放,静置培养,动作要轻,严禁摇动和来回振荡,以防由于冲动而使小块漂起而造成培养失败,若组织块不易贴壁可预先在瓶壁涂一薄层血清、胎汁或鼠尾胶原等。开始培养时培养基不宜多,以保持组织块湿润即可,培养24小时后再补液,培养3~5天时可换液,一方面补充营养,一方面去除代谢产物和漂浮小块所产生的毒性作用。 其他方法:消化分离法、器官培养略 2.悬浮细胞培养法 对于悬浮生长的细胞,如白血病细胞、淋巴细胞、骨髓细胞、胸水和腹水中的癌细胞和免疫细胞无需消化,可采用低速离心分离,直接培养,或经淋巴细胞分层液分离后接种培养。 (二)细胞株(系)细胞复苏培养 细胞复苏的主要操作步骤 (1)佩戴眼镜和手套,从液氮罐中取出安瓿或冷冻管。 (2)迅速放入38℃水浴中,并不时摇动,在1分钟内使其完全融化。 (3) 然后在无菌下取出细胞。冻存管用75%酒精擦拭消毒后,打开盖子,用吸管将细胞悬液注入离心管中,再滴加10ml培养液。 (4)在1000r/min速度下离心5~10分钟,弃去上层液,加入适量培养液后接种于培养瓶中,接种浓度1×109/L,置37℃温箱静置培养,次日更换一次培养液,继续培养,观察生长情况。若细胞密度较高,及时传代。或无需离心直接将细胞加入瓶中,并加入培养基贴壁培养12~24小时后,充去上清,换入新鲜培养基继续培养。加入的培养液的量依冻存的细胞数量,如果冻存数量为106,则稀释10倍使细胞达到105即可。 注意事项 在细胞复苏操作时,应注意融化冻存细胞速度要快,可不时摇动安瓿或冷冻管,使之尽快通过最易受损的温度段(-5~0℃)。这样复苏的冻存细胞存活率高,生

细胞传代标准操作规程版

细胞传代培养SOP(消化法) 具体步骤如下: 1. 传代前准备: 1.1预热培养用液:把已经配制好的装有培养液、PBS液和胰蛋白酶的瓶子放入37C水浴锅内预热。 1.2 用75%酒精擦拭经过紫外线照射的超净工作台和双手。 1.3 正确摆放使用的器械:保证足够的操作空间,不仅便于操作而且可减少污染。 1.4 点燃酒精灯:注意火焰不能太小。 1.5 准备好将要使用的消毒后的空培养瓶,放入微波炉内高火,8 分钟再次消毒。 1.6 取出预热好的培养用液:取出已经预热好的培养用液,用酒精棉球擦拭好后方能放入超净台内。 1.7 从培养箱内取出细胞:注意取出细胞时要旋紧瓶盖,用酒精棉球擦拭显微镜的台面,再在镜下观察细胞。 1.8 打开瓶口:将各瓶口一一打开,同时要在酒精灯上烧口消毒。 2. 胰蛋白酶-EDTA消化: 2.1加入消化液:小心吸出旧培养液,用PBS清洗(冲洗),加入适量消化液(胰蛋白酶-EDTA液),注意消化液的量以盖住细胞最好,最佳消化温度是37T < 2.2 显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察消化细胞,若胞质回缩,细胞之间不再连接成片,表明此时细胞消化适度。 2.3 吸弃消化液加入培养液:弃去胰蛋白酶液,注意更换吸管,加入新鲜的培养液。 3. 吹打分散细胞: 3.1 吹打制悬:用滴管将已经消化细胞吹打成细胞悬液。 3.2吸细胞悬液入离心管:将细胞悬液吸入10ml离心管中。 3.3 平衡离心:平衡后将离心管放入台式离心机中,以1000转/分钟离心6-8 分钟。 3.4弃上清液,加入新培养液:弃去上清液,加入2ml培养液,用滴管轻轻吹打细胞制成细胞悬液。 4. 分装稀释细胞: 4.1 分装:将细胞悬液吸出分装至2-3 个培养瓶中,加入适量培养基旋紧瓶盖。 4.1 显微镜下观察细胞:倒置显微镜下观察细胞量,必要是计数。注意密度过小会影响传代细胞的生长,传代细胞的密度应该不低于5X 105/ml。最后要做好标记。 5. 继续培养: 用酒精棉球擦拭培养瓶,适当旋松瓶盖,放入CO培养箱中继续培养。传代细胞 2 小时后开始贴附在瓶壁上。当生长细胞铺展面积占培养瓶底面积25%时

BHK-21传代细胞培养

BHK-21 传代细胞培养 BHK 是仓鼠肾细胞 [原理] 细胞在培养瓶壁上长成致密单层后,已基本上饱和,为使细胞能继续生长,同时也将细胞数量扩大,就必须进行传代(再培养)。传代培养也是一种将细胞种保存下去的方法。同时也是利用培养细胞进行各种实验的必经过程。 [材料和试剂] 1、细胞:贴壁BHK-21 细胞株 2、试剂:0.25%胰蛋白酶、配制好的DMEM 培养液、小牛血清、双抗溶液、7.5%碳酸氢钠 3、仪器和器材:倒置显微镜,培养箱、培养瓶、胶塞、量筒、注射器、针头、酒精灯、污物缸等[操作步骤] 1、应需要计算好培养液的总用量,按10%的比例加入血清,按1%的比例加入双抗。用7.5% 的碳酸氢钠调PH 至7.0~7.2 左右。 2、将长满细胞的培养瓶中原来的培养液弃去。 3、加入0.25%胰酶溶液,使瓶底细胞都浸入溶液中为宜。 4、瓶口塞好胶塞,平放在实验台上。约2~3 分钟会看到贴壁细胞层出现细针孔空隙,赶紧 将胰酶弃去,加入少量培养液终止消化。 5、用注射器将贴壁的细胞反复吹打,使其均匀分散成悬液,再加入足量的培养液,分成两 到三瓶。塞好胶塞,置37 C温箱中继续培养。 细胞培养常用溶液的配制 青、链霉素溶液 青霉素钠盐(80万IU /瓶)5瓶 链霉素(100万IU /瓶)4瓶 将两者溶于400ml0.9 %的无菌生理盐水,分装小瓶,-20C保存。双抗在培养基中

的终浓度为100IU/ml 为宜。 二、7.5%碳酸氢钠溶液的配制 称取碳酸氢钠7.5g ,加入超纯水使总体积为100ml 。高压灭菌,分装于小瓶中,4C 贮存。 三、1%酚红溶液的配制 首先配制1mol/L的NaOH溶液。称取NaOH4.0 g,加入100ml超纯水,使NaOH 完全溶解,在室温或4C贮存(最好现用现配)。配制好NaOH溶液后,再称取1.0 g酚红置研钵中,加1mol/L的NaOH (不多于7.0ml),研磨使酚红完全溶解,加超纯水至100ml,高压消毒,在室温或4 C贮存。 四、0.25%胰蛋白酶溶液的配制 氯化钠8.0g 氯化钾0.2g 柠檬酸钠(Na3C6H5O7?5H2O) 1.12g 磷酸二氢钠(NaH 2PO4?2H2O)0.056g 碳酸氢钠 1.0g 葡萄糖 1.0g 胰蛋白酶( 1 :250) 2.5g 超纯水加至1000ml 放4C冰箱过夜,待胰蛋白酶充分溶解后,用0.2um微孔滤膜过滤除菌,分装于小瓶中,-20 C保存。 四、GIBCO 的低糖DMEM 粉剂配制: 1. 将干粉培养基倒入一干净的大容器内,先加入约终体积一半的超纯水;用水洗包装袋面 2 次,倒入培养液中,以保证所有干粉都溶解成培养液。磁力搅拌或人工搅拌使之完全溶解。 2. 根据包装袋上的说明补加所需量的丙酮酸钠、谷氨酰胺。 3. 加水定容到终体积。 4. 用无菌0.2um滤膜过滤除菌,分装于无菌血清瓶中, 4 C冰箱保存。同时将少量滤液装 到无菌瓶或接种细菌培养基,37C培养,48小时以后检查有无细菌生长。

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