玉米ZmPR4启动子的克隆及其在小麦幼胚愈伤组织中的活性分析
作物学报ACTA AGRONOMICA SINICA 2010, 36(9): 1605?1609https://www.wendangku.net/doc/ea3538011.html,/zwxb/ ISSN 0496-3490; CODEN TSHPA9E-mail: xbzw@https://www.wendangku.net/doc/ea3538011.html,
本研究由国家重大科技专项(2008ZX08002-001)资助。
*通讯作者(Corresponding author):张增艳, E-mail: zhangzy@https://www.wendangku.net/doc/ea3538011.html, **共同第一作者Received(收稿日期): 2010-05-04; Accepted(接受日期): 2010-07-19.
DOI: 10.3724/SP.J.1006.2010.01605
玉米ZmPR4启动子的克隆及其在小麦幼胚愈伤组织中的活性分析
王爱云1,2庄洪涛2,3,**张增艳2,*张学文3杜丽璞2叶兴国2
1 中南林业科技大学生命科学与技术学院, 湖南长沙 410004;
2 中国农业科学院作物科学研究所 / 农作物基因资源与基因改良国家
重大科学工程/农业部作物遗传育种重点开放实验室, 北京 100081; 3 湖南农业大学生物科学技术学院, 湖南长沙 410128
摘要: 以玉米B73基因组DNA为模板, 通过特异PCR扩增, 克隆出玉米启动子ZmPR4序列。序列分析表明, 该
启动子与AJ969166序列同源性为100%。构建了ZmPR4或玉米泛素基因(Ubiquitin)启动子控制的报告基因GUS的
表达载体。通过基因枪介导法转化小麦幼胚愈伤组织。瞬间表达实验表明, 在小麦幼胚愈伤组织中, 玉米ZmPR4启
动子的本底表达活性明显比Ubi启动子的低, 但经纹枯病菌诱导后, ZmPR4 启动子控制的GUS基因的表达明显增
强。PCR检测结果证实ZmPR4 启动子在小麦愈伤组织中具有表达活性, 能够驱动GUS基因的表达。因此, 玉米
ZmPR4启动子在小麦抗病基因工程育种中具有潜在的应用价值。
关键词:诱导型启动子; 克隆; 愈伤组织; 瞬间表达
Cloning and Activity Analysis of Zea mays ZmPR4 Promoter in Wheat Imma-ture Embryonic Calli
WANG Ai-Yun1,2, ZHUANG Hong-Tao2,3,**, ZHANG Zeng-Yan2,*, ZHANG Xue-Wen3, DU Li-Pu2, and YE Xing-Guo2
1 College of Life Science and Technology, Central South University of Forestry and Technology, Changsha 410004, China;
2 National Key Facility for Crop Gene Resources and Genetic Improvement, Institute of Crop Sciences, Chinese Academy of Agricultural Sciences, Beijing 100081, China;
3 College of Life Science and Technology, Hunan Agricultural University, Changsha 410128, China
Abstract: The ZmPR4 promoter was cloned from genomic DNA of maize inbred line B37 through specific PCR amplification.
The promoter cloned had the same sequence as the fragment registered in GenBank under the accession number of AJ969166. Expression vectors driven by ZmPR4 promoter or Ubiquitin promoter were constructed, which harbor GUS gene. The vectors
were bombarded into wheat immature embryogenic calli. Histochemical assays of GUS activity, the ZmPR4 promoter was obvi-
ously expressed in wheat immature embryonic calli, but the expression activity was lower than that of Ubi Promoter. The ZmPR4 promoter could be induced by infection of Rhizoctonia cerealis. PCR assay confirmed the expression of GUS gene driven by ZmPR4 promoter. These results suggest that ZmPR4 promoter has a use potential in molecular breeding of resistance in wheat. Keywords: Inducible promoter; Cloning; Calli; Transient expression
小麦纹枯病是由禾谷丝核菌(Rhizoctonia cerealis Vander Hoeven)或立枯丝核菌(R. solani Kuhn)引起的一种土传真菌病害[1], 常常造成小麦严重减产。近年来, 小麦纹枯病呈现逐年扩展、加重的趋势[2], 选育抗纹枯病的优良小麦新品种是保证小麦稳产、高产的有效途径之一。由于小麦纹枯病菌的寄主范围广, 难以根治。况且, 易于利用的抗纹枯病小麦种质资源匮乏[3], 常规抗病育种难以达到理想的效果。近年来, 随着分子生物学、植物与病原互作研究的深入以及生物技术的发展, 一些抗病及其相关基因相继被克隆, 植物抗病基因工程育种也得到迅速发展[4-12]。因此, 运用高新技术发掘、分离抗病有效基因, 进而通过基因工程创制抗纹枯病小麦新种质与新品种, 对小麦纹枯病的防治具有十分重要的意义。
在植物抗病基因工程中一般使用组成型启动子, 如花椰菜花叶病毒35S启动子或玉米泛素基因(Ubiquitin)启动子。这样的启动子驱动抗病基因在转基因植物各部位和各发育阶段持续过量表达, 虽然可以提高转基因植株的抗病性, 但真正应用于作物遗传改良却存在一些不足, 如容易造成物质和能量的巨大浪费, 甚至影响植物的生长发育[13-16]。因此, 作为转录水平上的重要调控元件—启动子的研究和应用日益受到重视。
玉米的一个病程相关蛋白 4 (pathogenesis-related pro-
1606作物学报第36卷
tein 4, PR4)基因ZmPR4的启动子, 是一个病原诱导型启
动子, 且具有组织特异表达特性。序列分析表明, ZmPR4启动子包含两个与激发子的应答作用相关的顺式作用元件, 即一个W盒和一个ERE顺式作用元件, 以及一些机械创伤诱导基因表达的调控元件[10]。在玉米和水稻中可被真菌侵染、真菌激发子和机械损伤等逆境诱导[10]。Coca 等[10]通过农杆菌介导法将ZmPR4启动子与报告基因GUS 融合的表达载体转入水稻, 组织化学分析表明, GUS基因
在转基因水稻中具有表达活性, ZmPR4启动子可被稻瘟
病菌侵染、真菌激发子和机械损伤诱导, 而且ZmPR4启
动子所驱动的afp基因在水稻根、茎、叶片中较强表达, 在
种子胚乳中几乎不表达[10]。由玉米Ubiqiutin 基因启动子
控制的afp基因在水稻各组织器官中均有较强表达[10]。因此, 从转基因作物的农艺性状和生物安全性等方面综合考虑, ZmPR4启动子是一个有潜在应用价值的启动子。尽管该启动子在水稻抗稻瘟病研究中已有报道[10], 但在小麦
中的应用未见报道。本文从玉米自交系B73中克隆出ZmPR4启动子序列, 并分析了其在小麦幼胚愈伤组织中
的表达活性, 以期为小麦抗病分子育种提供新的启动子。1材料与方法
1.1 植物材料及菌株、载体
小麦品种扬麦12的幼胚由中国农业科学院作物科学
研究所小麦分子育种组提供, 玉米自交系B73种子由中
国农业科学院作物科学研究所玉米组提供。
ZmPR4 启动子是根据已知序列AJ969166设计引物
从玉米B73基因组中扩增获得。pMD18-ZmPR4、感受态
大肠杆菌Top10、克隆载体pMD18-T、pAHC25、pUC19均由中国农业科学院作物科学研究所小麦分子育种组提供。
1.2 ZmPR4启动子的克隆和测序
根据GenBank公布的ZmPR4基因启动子序列(AJ969166), 设计1对特异PCR引物ZmPR4P-U: 5′-ACA CCCTTCATCCCATAC-3′和ZmPR4P-L: 5′-AGCTGCTAC TTGCTTCTG-3′, 以玉米B73基因组为模板, 从中扩增ZmPR4基因启动子。扩增条件为94℃预变性3 min; 然后94 45 s, 50 45 s , 72 105 s,
℃℃℃共33个循环; 最后72℃延伸10 min。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳分离, 回收扩增片段, 纯化后插入pMD18-T载体, 热激转化大肠杆
菌Top10菌株感受态细胞。
由中国农业科学院作物科学研究所测定ZmPR4启动
子序列, 利用DNAMAN软件中的Alignment 程序进行启动子序列分析和比对。
1.3表达载体构建
pAHC25(图1)包含pUbi::GUS的表达盒, 作为瞬时
表达实验的对照。
根据ZmPR4启动子序列测定结果, 设计1对特异PCR引物(P3: 5′-gcaagcttACACCCTTCATCCCATAC-3′, 下画线部分为Hin d III酶切位点和P4: 5′-ttcccgggAGCTG CTACTTGCTTCTG-3′, 下画线部分为Sma I酶切位点), 以质粒pMD18-ZmPR4为模板, 扩增ZmPR4启动子, 琼脂糖电泳后回收并纯化扩增片段, 用Sma I和Hin d III双酶切扩增片段、回收Hin d III-ZmPR4-Sma I。用Sma I和Hin d III部分消化单子叶表达载体质粒pAHC25, 回收大约7.7 kb的载体目标片段, 然后用T4 DNA连接酶将其与Hin d III-ZmPR4-Sma I相连接, 获得pZmPR4::GUS表达载体(图1), 以研究ZmPR4启动子在小麦中瞬时表达活性。
1.4基因枪法转化小麦幼胚愈伤组织
将扬麦12幼胚愈伤组织转移到高渗透培养基(SD2培养基附加0.2 mol L?1甘露醇, 0.2 mol L?1山梨醇)上, 渗透处理4~6 h, 将愈伤组织放置在培养皿中央直径约 2.5 cm范围内, 每盘培养皿50块愈伤组织。用直径110 μm 金粉分别包裹pZmPR4::GUS、pUbi::GUS质粒, 采用PDS- 1000/He 基因枪(Bio-Red公司), 选择1 100 Psi的可裂膜, 载样距靶材料6 cm进行轰击。轰击后在高渗培养基中继续培养约16~18 h, 再转入SD2培养基恢复培养2 d。
转化48 h后, 植物表达载体pZmPR4::GUS转化的愈伤组织用沾有纹枯病菌液的滤纸覆盖24 h, 进行病原菌侵染诱导; 另外剩余的一半愈伤组织和用植物表达载体pUbi::GUS转化的愈伤组织则用沾有MS培养液的滤纸覆盖相同时间, 作为研究非诱导情况下启动子的本底表达活性; 用未转基因扬麦12的愈伤组织作为阴性对照。
1.5小麦愈伤组织GUS组织化学染色分析
参考Jefferson的方法[17], 将处理后的愈伤组织浸泡在X-GLUC染色液(0.1 mol L?1 Na2HPO4/NaH2PO4缓冲液pH 7.0, 10 mmol L?1 EDTA, 5 mmol L?1铁氰化钾和亚铁氰化钾, 0.1 mg mL?1 X-Gluc, 0.1% TritonX-100, 20%甲醇)中, 37℃保温过夜, 次日取出, 用70%乙醇漂洗2次后, 用蒸馏水清洗, 体式显微镜(LEICA M165FC)下观察并拍照。统计愈伤组织总数, GUS+愈伤组织数和GUS+蓝点总数, 并计算愈伤组织瞬间表达率(GUS+愈伤组织数/观察愈伤
组织总数×100%)和平均蓝点数(GUS+蓝点总数/观察愈伤组织总数) 。
1.6分子检测
参照王关林等[18]提取愈伤组织基因组DNA作为GUS基因PCR检测的模板。根据质粒中GUS基因序列设计引物: Gus1: 5′-GGGATCCATCGCAGCGTAATG-3′和Gus2: 5′-GCCGACAGCAGCAGTTTCATC-3′, 预期扩增
片段大小约为563 bp。PCR 扩增体系为20 μL, 扩增程序为: 94℃预变性5 min; 94 1 min, 61 1 min, 72 1 min,
℃℃℃
共30个循环; 最后72℃后延伸10 min。用扬麦12为阴性对照, 质粒pZmPR4::GUS作为阳性对照, 反应结束后, 扩增产物在1.0 %琼脂糖凝胶上电泳, 观察结果。
2结果与分析
2.1启动子ZmPR4 的克隆
用玉米自交系B73基因组DNA为模板, 进行PCR
第9期
王爱云等: 玉米ZmPR4启动子的克隆及其在小麦幼胚愈伤组织中的活性分析 1607
图1 植物表达载体pZmPR4∷GUS 结构
Fig. 1 Structure of plant expression vector pZmPR4∷GUS
扩增, 扩增出一条约1.4 kb 特异条带, 电泳检测目的片段, 并切胶回收, 经pMD18-T 载体连接后转化到大肠杆菌中, 通过菌落PCR 、PCR 产物电泳检测, 结果表明在阳性菌落中扩增到与PCR 扩增产物大小相同的DNA 片段。
对ZmPR4P 测序分析表明, 利用ZmPR4P-U/ZmPR4P- L 引物, 从玉米品种B73基因组DNA 中克隆到原ZmPR4启动子(AJ969166)的第47至第1429位核苷酸序列, 两序列一致性达到100% (图2)。
2.2 瞬时表达载体的鉴定
用Sma I 和Hin d III 部分酶切植物表达载体pZmPR4:: GUS, 琼脂糖凝胶电泳检测结果表明, 一些阳性克隆质粒样品中均切出1.9 kb 左右的GUS 基因片段, 说明GUS 基因片段已经插入并连接到载体上。测序表明, 插入片段大小与位置完全正确。
2.3 小麦愈伤组织GUS 基因组织化学染色
用植物组成型表达载体质粒pUbi::GUS 和诱导表达载体质粒pZmPR4::GUS 转化的小麦愈伤组织, 分别有36块和14块显现蓝色斑点, 瞬间表达率为70.6%和30.4%,
平均蓝点数为1.75和0.80, 而未转基因扬麦12的愈伤组织则检测不到蓝色斑点, 说明ZmPR4启动子在小麦愈伤组织中有表达活性。当用纹枯病菌处理pZmPR4::GUS 转化的小麦愈伤组织时, 有25块显现蓝色斑点, 瞬间表达率为58.1%, 平均蓝点数为1.30。斑点面积、斑点数和着色强度均高于pZmPR4::GUS 对应的本底表达(图3), 说明ZmPR4启动子在小麦中受纹枯病菌诱导后表达活性增加。 2.4 转基因小麦愈伤组织的PCR 检测
转ZmPR4::GUS 基因小麦愈伤组织的X-Gluc 染色蓝色斑点组织与pZmPR4::GUS 阳性对照中均扩增出约563 bp 的GUS 基因特异带(图4), 表明ZmPR4::GUS 基因的确通过基因枪转入到扬麦12基因组中。
3 讨论
目前报道的转基因作物中, 导入的外源基因大多数由强表达的组成型启动子驱动高效表达, 亦即在植物的所有部位和所有发育阶段都高效表达, 既增加了植株的代谢负担, 又造成了物质和能量的巨大浪费。因此, 研
1608作物学报第36卷
图2克隆的与GenBank中ZmPR4启动子(AJ969166)的核苷酸序列比较
Fig. 2 Alignment of cloned and original ZmPR4 promoter sequences (AJ969166)
黑色示100%同源性。Black boxes represent 100% identity.
图3转基因小麦愈伤组织GUS的组织化学染色结果
Fig. 3 Histochemical stain of GUS in transgenic wheat calli after different treatments
A: 肉眼观察结果; B: 体式显微镜下观察结果(10×20)。1: 含质粒pUbi::GUS的转基因小麦愈伤组织; 2: 含质粒pZmPR4::GUS的转基因小麦愈伤组织; 3: 含质粒pZmPR4::GUS的转基因小麦愈伤组织经纹枯病菌液诱导24 h。箭头示GUS +幼胚愈伤组织。
A: normal observation; B: observation under stereoscope. 1: transgenic wheat calli with pUbi::GUS; 2: transgenic wheat calli with pZmPR4::GUS;
3: transgenic wheat calli with pZmPR4::GUS treated with Rhizoctonia cerealis after 24 h. Arrows represent GUS +immature embryonic calli.
第9期王爱云等: 玉米ZmPR4启动子的克隆及其在小麦幼胚愈伤组织中的活性分析1609
图4转基因小麦愈伤组织中GUS基因的PCR分析
Fig. 4 PCR analysis of GUS in transgenic wheat calli
M: 100 bp DNA ladder; CK: 水; P: pZmPR4::GUS; WT: 阴性对照(扬麦12); 1–2: 转ZmPR4::GUS基因的小麦X-Gluc染色蓝色斑点组织。M: 100 bp DNA ladder; CK: H2O; P: pZmPR4::GUS; WT: negative control (Yangmai 12); 1 and 2: ZmPR4::GUS transgenic wheat blue calli.
究组织特异性启动子和诱导型启动子具有重要的理论和实践意义。
据Coca等[10]报道, ZmPR4启动子是诱导型启动子。在水稻中, 通过病原诱导, ZmPR4 启动子能驱动GUS报告基因表达, 并且该启动子仅在病原侵袭部位有活性。另外, ZmPR4 启动子也能被真菌激动子、机械创伤激活。功能分析表明, ZmPR4启动子在水稻和玉米中的表现一样, 均具有相当保守的病原诱导表达特征。但是, 到目前为止, 在小麦中是否也存在ZmPR4类似的蛋白启动子还未见报道, ZmPR4 启动子在小麦中是否具有表达活性也还没有见报道。
通过启动子与GUS报告基因的融合能够快速对启动子的活性作定性鉴定。将上述融合结构在小麦愈伤组织中瞬间表达, 可快速进行启动子活性的研究。本研究从玉米自交系B73中克隆出ZmPR4启动子大部分序列, 通过在小麦幼胚愈伤组织中瞬间表达和PCR检测等分析, 证实了该ZmPR4 启动子序列在小麦中具有表达活性, 此外, 纹枯病菌处理转基因小麦愈伤组织后, 该愈伤组织中GUS 染色表现出蓝色斑点数增加, 且颜色加深, 说明来自玉米基因组的ZmPR4 启动子表达可受纹枯病菌诱导, 可以作为潜在的抗纹枯病小麦基因工程的启动子。
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玉米ZmPR4启动子的克隆及其在小麦幼胚愈伤组织中的活性分析
作者：王爱云， 庄洪涛， 张增艳， 张学文， 杜丽璞， 叶兴国， WANG Ai-Yun， ZHUANG Hong-Tao， ZHANG Zeng-Yan， ZHANG Xue-Wen， DU Li-Pu， YE Xing-Guo
作者单位：王爱云,WANG Ai-Yun(中南林业科技大学生命科学与技术学院,湖南长沙410004;中国农业科学院作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程/农业部作物遗传育种重点开放实验室,北京100081)， 庄洪
涛,ZHUANG Hong-Tao(中国农业科学院作物科学研究所/农作物基因资源与基因改良国家重大科学工程/农业部
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