CTAB法提取真菌(霉菌、酵母)基因组DNA

CTAB法提取真菌（霉菌、酵母）基因组DNA

--试剂配制方法及操作步骤一、试剂配制

（一）2%CTAB 缓冲液：

1、各试剂终浓度：CTAB粉末—— 20g/L

即10×TE：{ Tris-HCl PH8.0——100 mmol/L

EDTA PH8.0 ——20 mmol/L }

NaCl——1.4mol/L

2、配制方法：

(1)配制1L：20g CTAB + 100ml Tris-HCl母液（1m/L）+ 40ml EDTA 母液（0.5m/L）+ 81.816gNaCl定容至1L。

(2)配制100ml：2g CTAB + 10ml Tris-HCl母液（1m/L）+ 4ml EDTA母液（0.5m/L）+ 8.1816gNaCl定容至100ml。

(3)配置1×TE 100ml：10ml Tris-HCl母液（1m/L）+ 4ml EDTA母液（0.5m/L）

（二）巯基乙醇

分装1ml于离心管中，2%CTAB 缓冲液与巯基乙醇以50:1体积混合。

（三）Tris-苯酚、氯仿、异戊醇

1、各试剂浓度：

苯酚/氯仿/异戊醇（25：24：1）

2、配制方法：

Tris-HCl 平衡苯酚与等体积的氯仿/ 异戊醇（24：1）混合均匀，即，移入棕色玻璃瓶中4℃保存。

（四）NaAc和Nacl

1、浓度：3mol/L

2、配制方法：

（1）3M NaAc10ml ：称取 2.46g NaAc，pH 4.0，用ddH2O 定容到10ml；（称量40.8g NaOAc.H2O 置于烧杯中，加入冰醋酸调节调节pH 到5.2 ，定容到100ml）；

（2）5M NaCl 100ml ：称取29.22g NaCl，用ddH2O 定容到100ml称取292.2gNaCl 置于1L 烧杯中，加入约800 ml 的去离子水后搅拌溶解加去离子水将溶液定容到1L 后，适量分成小份高温高压灭菌后，4℃保存。

二、试验准备

(一) 1、高压1.5ml无核酸酶离心管×n个样品、2ml、5ml离心管；

2、高压超纯水500ml（去离子水）用于试剂配制；

3、枪头10μl、200μl、1000μl；

(二) 1、巯基乙醇10μl×n个样品，分装于2ml管；

2、Tris-苯酚500μl×n个样品，分装于5ml管；

3、氯仿480μl×n个样品，分装于5ml管；

4、异戊醇20μl×n个样品，分装于5ml管；

5、70%乙醇1.2ml×n个样品，分装于5ml管；

6、水浴锅65℃预热、37℃预热;

7、NaAc150μl×n个样品，分装于5ml管；

8、-20℃预冷无水乙醇1.1ml×n个样（或异丙醇），800μl×n个样品、氯仿异戊醇(24:1) 500μl×n 个样品；

9、RaseA酶（10mg/ml）解冻；

三、试验步骤

1、2%CTAB裂解液500μl×n个样品，放于65℃水浴锅中预热；

2、真菌悬液离心得到大约100mg真菌组织于2.0 mL离心管；

3、10μl×n个样品巯基乙醇加到预热的2%CTAB裂解液中；

4、每个样品中加510μl CTAB和巯基乙醇混合液，100mg玻璃珠，旋涡震荡研磨裂解30min 或以上（裂解一定要彻底）；

5、放入65℃水浴锅中，保温30~60min，期间轻摇数次（一般20min左右一次，刚投入水浴时可以稍快速的晃动，之后的晃动一定要轻柔）。

6、加入5--10μl（试剂盒用10μl）RNaseA（RNaseA提前拿出融化），10℃离心，升至4000 rpm即停，使RNaseA和溶液充分混合。

7、37℃水浴，消化1h-2h（或过夜）。

8、从水浴锅中取出样品管, 加入1/3 体积的NaAc（3mol/L的NaAc 150μl，或5mol/Lnacl），再加入500μl在-20℃预冷的氯仿/异戊醇（24:1），{或500μl -20℃预冷的Tris- 苯酚：氯仿︰异戊醇（25：24︰1）}，摇均配平，4℃，12000 rpm离心10min。盖好管盖后缓慢上下颠倒摇动5- 10m in，混匀后置于-20℃（-80℃，30min ）3-4h；

9、融解后室温（15℃-20℃），离心力10000 x G或12 000 r /m in离心10min；

10、小心地吸出300μl上清液到新的1.5 ml微量离心管（如果后续DNA较少，此部可多吸出点累加），避免含有污染物和抑制剂的乳白色界面，取上清时尽量用剪过的枪头进行操作，过尖的枪头会把DNA 链弄断，加0.6倍体积预冷的异丙醇（或无水乙醇）200μl-300μl，摇均后有絮状物析出；（可放入4℃冰箱过夜）。

注意观察DNA 将从溶液中析出。如溶液中DNA 含量较少, 将会观察到管中含有白色悬浮的DNA 颗粒; 如样品中DNA 含量较高, 则可观察到白色絮丝状的DNA 悬浮于溶液中。

11、4℃，12000 rpm/min离心10min，弃上清（倾倒或移液枪），放入新的离心管中，用70%乙醇漂洗2次，70% 乙醇600μl洗涤沉淀, 振荡起沉淀数秒钟, 5 000 r /min（或者10000 r /min 离心1min）条件下离心去上清液。再重复步骤( 11)洗涤沉淀1次。放置超净台中吹干（或烘箱50℃烘干半小时）。

12、干燥后的DNA 沉淀中, 加入200μl 1×TE缓冲液溶解，可放入4℃冰箱保存（酶活性在4℃或65℃水浴中最低，防止酶降解DNA，未溶解的，可放入65℃水浴中促其溶解，10min后拿出冷却至室温，可重复，直至溶解。（或者在见到无色胶状物附在管壁时, 加入200μl去离子水溶解沉淀的DNA）。

基因组DNA提取方法

1 快速微量提取法A.取1.5ml菌体培养物于一灭菌Ep管中，12000rpm离心1min, 丢去上清夜，收集菌体。 B.加入400ul裂解液（40mMTris-醋酸，20mM醋酸钠,1mMEDTA,1%SDS,pH7.8）混匀,置于37oC水浴1hr。C.然后加入200ul5mol/L的氯化钠溶液，混匀后于13000rpm离心15min。D.取上清液，用苯酚抽提2次，氯仿抽提1次。E.加两倍体积无水乙醇，1/10体积醋酸钾(3M ,pH8.0)，-20度保存1小时后，13000rpm离心15min，弃上清液，沉淀用70%乙醇洗2次；置于室温干燥后，溶于50ulTE 溶液中，置4oC保存备用。 2 蛋白酶/SDS法制备先用10ml含适当抗生素的GBM过夜培养Delftia sp.，第二天4000rpm离心10min收集菌体，用Washing TE （50mmol/LTris-HCl pH8.0,10mmol/LEDTA pH8.0）洗菌体2次，之后将菌体充分悬浮在5ml 1×TE缓冲液中，先后加入0.5ml 5mg/L的蛋白酶、0.5ml 10% SDS，轻轻混匀后50℃放置3h~5h，接着用等体积的Tris饱和苯酚抽提2次，苯酚/氯仿/异戊醇抽提一次，氯仿抽提一次后，乙醇沉淀DNA，用自动移液器吸管头将絮状DNA沉淀块吸附到Ep管中，70%乙醇洗2次，干燥后溶于适当1×TE或ddH2O中。 3 1) 细菌培养：细菌接种于5ml 液体培养基中，37℃摇床（300rpm）培养过液。2) 细菌收集：取1ml培养物于1.5ml EP 管中，室温8000rpm离心5min，弃上清，沉淀重新悬浮于1ml TE（pH8.0）中（用ddH2O 也行)。3) 菌体裂解：加入6μl 50mg/ml的溶菌酶，37℃作用2h。再加2mol/LNaCl50μl，10%SDS 110μl，20mg/ml的蛋白酶K 3μl，50℃作用3h或37℃过夜。（此时菌液应为透明粘稠液体）4) 抽提：菌液均分到两个1.5ml EP管，加等体积的酚∶氯仿∶异戊醇(25∶24∶1)，混匀，室温放置5-10min。12000rpm离心10min。抽提两次。（上清很粘稠，吸取时应小心，最好枪头尖应剪去）5) 沉淀：加0.6倍体积的异丙醇，混匀，室温放置10min。1 2000rpm离心10min。6)洗涤：沉淀用75%的乙醇洗涤。7) 抽（凉）干后，溶于50μl ddH2O中，取2-5μl电泳。作PCR模板用。

酵母菌DNA的提取

酵母DNA提取方法 方法一： 石英砂法 1、5000rpm×5min 收集过夜培养的菌体（5ml左右），于200μL 裂解液(50 mmol/ L Tris-HCl pH 8.0 , 180 mmol/ LEDTA pH 8.0 , 1 % SDS , 现配)中，加入3/10 总体积石英砂在涡流混合器上振荡13min，每隔4min 将离心管取出用力甩几下，然后65℃水浴10min。 2、加入200μL 5mol/L KAc，冰浴8min； 3、12000rpm×5min 转移上清至新的离心管中； 4、加入 3 mol/L NaAc 35μl，加入异丙醇200μL混匀后冰浴8min，12000rpm×5min收集沉淀； 5、200μL TE 溶解，加入RNase10μL，65℃水浴10min； 6、加入200μL 氯仿－异戊醇（24:1）,抽提； 7、温柔地取上清150μL ，加入20μL 3 mol/L NaAc 及375μL 无水乙醇，混匀后 12000rpm×8min 收集DNA； 8、70% 乙醇洗涤沉淀，吹干后TE 溶解，-20℃保藏。 方法二： 蜗牛酶法 1. 接种于5 ml的YEPD培养基中在25℃-28℃振荡培养12-16 h。 2. 3500 rpm离心5min沉淀细胞，用1ml 的无菌水洗涤一次，再加0.5ml solution Ⅰ(1M 山梨醇，0.1M EDTA, pH=7.5)重悬。 3. 转移细胞至1.5 ml 的离心管中，加入0.1蜗牛酶(30mg/ml)溶液，37℃保温30-60min, 以获得原生质体。 4. 最大转速离心1min以沉淀细胞，用500ulsolutionⅡ(50mMTris-HCl, 20mM EDTA,pH=7.4)溶液悬浮，然后加入50μl 10% SDS, 混合65℃保温30min。 5. 加入200μl 5M 醋酸钾，放于冰上30 min。 6. 最大转速离心15min，转移上清液至新的离心管中，用等体积的异丙醇沉淀DNA。 7. 室温下放置5min，离心10min，用70%的乙醇洗涤一次，真空干燥，用50ul pH=7.4 TE溶液溶解。

珠磨法提取酵母基因组

利用海砂提取酵母基因组 1、挑GS115单菌落接种于50mL三角瓶6mLYPD培养基中，摇两瓶。将30℃，200r/min，培养过夜（16~18h）的酵母细胞分别吸取1.5mL菌液放在1.5mL EP 管中，共8管，12000r/min，5min，离心收集细胞； 2、用无菌水将细胞悬浮（借助10uL枪头），洗细胞，12000r/min，5min，离心；再次用无菌水洗细胞，只洗表面，去上清； 3、加入200uL（0.275g）海砂，200uL裂解液，200uL酚氯仿（25:24），将细胞悬浮（借助10uL枪头），然后涡旋震荡1min，放在冰上1min，重复四次； 4、12000r/min，5min，离心，吸取上清液（260uL），两管合一管，共4管，每管520uL，加入等体积的酚氯仿（酚265uL，氯仿255uL），颠倒混匀，去蛋白，12000r/min，5min，离心； 5、吸取上清液（500uL），加入等体积的酚氯仿（酚255uL，氯仿245uL），颠倒混匀，去蛋白，12000r/min，5min，离心； 6、吸取上清液（480uL），加入等体积的酚氯仿（酚245uL，氯仿235uL），颠倒混匀，去蛋白，12000r/min，5min，离心； 7、吸取上清液（460uL），加入2倍体积（920uL）的无水乙醇，放在—80℃，30min； 8、12000r/min，5min，离心，去上清，加入400uL体积的70%乙醇，用手弹起沉淀，洗涤，12000r/min，5min，离心，去上清，再次加入400uL体积的70%乙醇，只洗表面，去上清，将DNA自然晾干； 9、用20uL的超纯水溶解DNA，加入1uLRNaseA，37℃，消化30min； 10、取5uLDNA溶液，用1%琼脂糖凝胶跑电泳。 试剂配方： 1、1M Tris-Hcl(pH 8.0)：配50mL Tris碱：6.06g 水：50mL 用浓盐酸约2.1mL调pH至8.0, 2、0.5M EDTA(pH 8.0)：配50mL

酵母基因组DNA快速提取试剂盒(离心柱型)操作方法及步骤说明书

酵母基因组DNA 快速提取试剂盒 目录号：DN20 适用范围： 适用于快速提取各种酵母基因组DNA 试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成 保存 50次 平衡液 室温 5 ml 缓冲液YB 室温 20 ml 结合液CB 室温 11 ml 抑制物去除液IR 室温 25 ml 漂洗液WB 室温 15 ml 第一次使用前按说明加指定量乙醇 洗脱缓冲液EB 室温 15 ml Lytic Enzyme -20℃ 2.5 ml 蛋白酶K 粉（可选）20mg/ml -20℃ 20mg 吸附柱AC 室温 50个 收集管（2ml ） 室温 50个 本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。 储存事项: 目录编号 包装单位 DN2001 50次 DN2031 50次（带蛋白酶K ，带Lytic Enzyme ）

1.结合液CB或者抑制物去除液IR低温时可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴 几分钟帮助重新溶解，恢复澄清透明后冷却到室温即可使用。 2.为避免降低活性，方便运输，提供蛋白酶K为冻干粉状（20mg），收到后，可短 暂离心后，加入1毫升灭菌水溶解配制成20mg/ml溶液，因为反复冻融可能会降低酶活性，因此溶解后立即按照每次使用量分装冻存，－20℃保存。 3.Lytic Enzyme为蜗牛酶甘油储液，因此比较粘稠，请小心取用，－20℃保存。蜗 牛酶是从蜗牛的嗦囊和消化道中制备的混合酶，它含有纤维素酶，果胶酶，淀粉酶，蛋白酶等20多种酶。适合破碎溶解各种酵母的细胞壁。 4.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时 盖紧盖子。 产品介绍： 该试剂盒采用DNA吸附柱和独有的溶液系统，适合于从多种来源的酵母培养物中快速简单地提取基因组DNA。约3ml处于指数生长期的酵母培养液一般一次抽提可纯化出10-15μg的高质量的基因组DNA。纯化DNA产物可直接用于PCR、酶切和杂交等实验。酵母细胞经lytic Enzyme处理去除细胞壁后，独特的结合液/蛋白酶K迅速裂解细胞和灭活细胞内核酸酶，然后基因组DNA在高离序盐状态下选择性吸附于离心柱内硅基质膜，再通过一系列快速的漂洗－离心的步骤，抑制物去除液和漂洗液将细胞代谢物，蛋白等杂质去除，最后低盐的洗脱缓冲液将纯净基因组DNA从硅基质膜上洗脱。 产品特点： 1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口世界著名公司特制吸附膜，柱与柱之间吸附 量差异极小，可重复性好。克服了国产试剂盒膜质量不稳定的弊端。 2.不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。 3.快速，简捷，单个样品裂解后操作一般可在30分钟内完成。

酵母基因组DNA提取试剂盒操作方法及步骤说明书

试剂盒组成、储存、稳定性： 试剂盒组成保存50次100次200次 酵母裂解液室温15 ml 30 ml 60 ml 蛋白沉淀液室温 5 ml 10 ml 20 ml DNA溶解液室温 5 ml 5 ml 10 ml 本试剂盒在室温储存12个月不影响使用效果。 储存事项: 1.环境温度低时酵母裂解液中某些去污剂成份会析出出现浑浊或者沉淀，可在37℃ 水浴加热几分钟，轻轻旋摇，即可恢复澄清，不要剧烈摇晃，以免形成过量的泡沫。 2.蛋白沉淀液可能出现析出和沉淀，可以在37℃水浴几分钟帮助重新溶解，如果不 能完全溶解，也不影响使用效果，直接取用上层溶液即可。 3.避免试剂长时间暴露于空气中产生挥发、氧化、pH值变化，各溶液使用后应及时 盖紧盖子。 产品介绍： 本试剂盒用于快速的从酵母中提取基因组DNA。在针对酵母细胞特点配制的酵母裂解液作用下，酵母细胞被裂解释放出基因组DNA，然后蛋白沉淀液选择性沉淀去除蛋白，最后纯净的基因组DNA通过异丙醇沉淀并重溶解于DNA溶解液。 产品特点： 1.不需要使用有毒的苯酚、氯仿等试剂。 2.快速，简捷，整个过程可在1个小时内完成。

3.结果稳定，产量高（比离心柱型的产量高一倍以上），OD260/OD280典型的比值 达1.7～1.9，长度可达50Kb-150kb，可直接用于PCR，Southern-blot和各种酶切反应以及文库构建。 操作步骤：（实验前请先阅读注意事项） 1.吸取1.5ml 酵母培养物到一个1.5ml离心管；12,000rpm离心2分钟，尽可能弃 上清，必要时候可以用枪吸去。 2.高速涡旋振荡，打散重悬酵母细胞团。 3.加入300μl酵母裂解液，涡旋振荡混匀，或者用1毫升的枪头反复吹打混匀。 酵母细胞的重悬分散对下一步裂解非常重要，必须充分分散重悬。 4.将裂解物放置在70℃水浴15-30分钟。 如果产量低，可以适当提高水浴温度和延长水浴时间，中间可以涡旋振荡混匀几次帮助裂解。 5.冰上至少5分钟使回复到室温。 6.在回复到室温的裂解物内加入100μl蛋白沉淀液后，在涡旋振荡器上高速连续振 荡混匀20秒。混匀后可能见到一些小的蛋白团块。冰浴5分钟。 7.13,000rpm离心5-10分钟。这时应该可以见到管底蛋白沉淀，也可能见到一些蛋 白沉淀漂浮在液体表面。 8.小心缓慢吸取上清到一个新的1.5ml离心管中，不要吸到沉淀。 吸取上清时，注意不要吸到管底的和漂浮在液体表面的蛋白沉淀。如果不小心将蛋白沉淀转入新的离心管中，可再次离心2分钟后取上清。 9.加入等体积的室温异丙醇（约400μl），颠倒30次混匀或者直到出现絮状DNA沉 淀（或者白色浑浊沉淀）。

酵母基因组DNA提取试剂盒使用说明

酵母基因组DNA提取试剂盒使用说明 货号:D1900 规格:50T/100T 保存:室温(15℃-25℃)干燥保存，复检期12个月，2℃-8℃保存时间更长。 试剂盒内容：50T100T RNase A1m11ml×2 蛋白酶1m11ml×2 酵母破壁酶 1.25m1 2.5m1 β-巯基乙醇300ul600ul 山梨醇Buffer25m150m1 溶液A10ml20ml 溶液B10ml20ml 漂洗液15m115ml×2 洗脱液10ml20ml 吸附柱50个100个 收集管50个100个 说明书1份1份 产品简介: 本试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，提取酵母基因组DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料为本公司特有新型材料，能够高效专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组DNA片段大，纯度高，

质量稳定可靠。使用本试剂盒提取的基因组DNA可用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。 操作步骤: 使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 1、取酵母细胞(不超过5×107ce l1s)，12000rpm离心1min.，尽量吸除上清。 2、酵母细胞壁的破除：向酵母菌体中加入470ul山梨醇Buffer。充分悬浮菌休，加入25ul酵母破壁酶和5ulβ-巯基乙醇，充分混匀。30℃处理1-2h.，期间可颠倒离心管混匀数次。 3、12000rpm离心lmin，弃上清，收集沉淀。 4、向沉淀中加入200ul溶液A，充分悬浮沉淀，向悬浮液中加入20ul(10mg/ml)的RNase A，充分颠倒混匀，室温放置10min。 5、加入20ul(10mg/ml)的蛋白酶K，充分颠倒混匀。65℃水浴消化15-30min，消化期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全为止。 6、加入200ul溶液B，再加入200ul无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响DNA的提取，可将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，室温放置2min。 7、12000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 8、向吸附柱中加入700ul漂洗液(使用前请先检查是否己加入无水乙醇)。12000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 9、向吸附柱中加入500ul漂洗液，12000rpm离心l min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。

酵母基因组DNA提取试剂盒(离心柱型)

酵母基因组DNA提取试剂盒（离心柱型） GK1091 50 Preps GK1092 100 Preps GK1093 20 Preps 一.试剂盒组成 Components GK1091 50 Preps GK1092 100 Preps GK1093 20 Preps gDNA Recovery Column 2.0-ml Collection Tube LysisY buffer Digestion Solution(a) Wash Solution(b) PB Solution Ext Solution Elution Buffer(c) TE(pH8.0) Boiled RNase A Proteinase K(d) Lyticase(e) Buffer CBS 50 50 10 ml 20 ml 12 ml 20 ml 20 ml 10 ml 15 ml 240 ul 250 ul 250 ul 15ml 100 100 20 ml 40 ml 24 ml 40 ml 40 ml 20 ml 25 ml 480 ul 500 ul 500 ul 30ml 20 20 10 ml 8 ml 12 ml 8 ml 8 ml 10 ml 15 ml 120 ul 100 ul 100 ul 6ml protocol 1 1 1 (a)Digestion Solution低温时可能出现沉淀，请于55℃适当加温溶解后使用，不会影响实验结果。 (b) 首次使用前，必须在Wash Solution瓶中加入4倍体积的无水乙醇，充分混匀后使用。每次使用后将瓶 盖盖紧，以保持Wash Solution中的乙醇含量。如果发现Wash Solution由于运输或保管不当造成体积严重不准，请用量筒定容后再加入4倍体积的无水乙醇。 (c)Elution Buffer为2.5 mM Tris-HCl, pH8.5，请4℃保存。TE (pH8.0) 或者水（pH>7.0）均可以使用，但是 DNA的洗脱效率通常要低20%左右。 (d)Proteinase K分装冻存，不得将Proteinase K直接加到Digestion Solution中，以免酶失活。 (e)请于-20℃分装保存Lyticase，减少反复冻融的次数，以免酶失活。 二．产品简介 酵母细胞有一层坚硬的细胞壁，妨碍了研究人员从酵母细胞中快速有效地分离提取基因组DNA。本试剂盒提供可以高效酶解酵母细胞壁的Lyticase和能够特异结合DNA的离心吸附柱，用于提取酵母细胞中的基因组DNA。同时本产品对经典的SDS裂解液进行了改良，并使用PB Solution与Ext Solution处理细胞裂解液，再经过能高效、专一吸附DNA的离心柱吸附后，可最大限度去除杂质蛋白以及脂类物质。 三．主要用途 从酵母等真菌中小规模抽提基因组DNA。 四．主要特点 1.离心吸附柱内硅基质膜全部采用进口特制吸附膜，柱与柱之间吸附量差异极小，重复性好。 2.不需要使用有毒的苯酚等试剂，也不需要乙醇沉淀等步骤。 3.快速，简捷，单个样品操作一般可在2小时内完成。 4.多次柱漂洗确保提取酵母基因组的高纯度，OD260/OD280典型的比值达1.7～1.9，长度可达50Kb～ 100kb，可直接用于PCR， Southern-blot和各种酶切反应。 五．需自备试剂 无水乙醇

酵母核糖核酸的提取及测定

酵母核糖核酸的提取及测定 一、实验背景及目的 核糖核酸(RNA)和它的降解物核苷酸、核苷及其衍生物在生物化学、医药、食品添加剂、农业等领域有着广泛的应用。比如能够促进作物的生长，在水稻、小麦、柑橘及多种蔬菜生产中应用，取得了明显的增产效果。像鸟苷酸(GMP)和肌苷酸(IMP)还是强力助鲜剂，胞苷酸(CMP)和尿苷酸(UMP)可作为生产治疗癌症、肝炎及冠心病等药物的原料。而利用微生物资源提取氨基酸、核苷酸等生物小分子，具有成本低、非化学合成、无毒、无害的特点。[1] 随着啤酒等发酵行业的快速发展，产生了相应的大量发酵副产物，如何利用这些副产物，既做到不污染环境，还能产生良好的经济效益，一直是研究的热点。而啤酒废酵母中RNA 含量达6%~8%，是生产RNA的较好原料，此外，抽提后的菌体蛋白质(占干菌体的50%)还具有很高的利用价值。所以利用啤酒废酵母生产RNA形成了非常有益的产业链。[2] 本实验目的就是学习从酵母中提取RNA的方法并掌握其测定手段。 二、实验原理 微生物是工.业上大量生产核酸的原料，其中以酵母最为理想，酵母核酸中主要是RMA (2.67~10.0%)，DNA很少(0.03~0.516%)，菌体容易收集，RMA也易于分离。RMA提制过程是先使RNA从细胞中释放，并使它和蛋白质分离，然后将菌体除去，再根据RNA等电点在pH2. 0~2.5的特点，将体系pH调至其等电点，使之沉淀，进行离心收集。 提取RNA的方法很多，在工业生产上常用的是稀碱法和浓盐法。稀碱法利用碱使细菌细胞壁水解，使RNA释放出来，浓盐法是在加热条件下，利用高浓度的盐改变细胞膜的通透性，使RNA释放出来，RNA 钠盐易溶于水，在含盐的菌体溶液中，RVA有较高的溶解度。二者均通过控制温度使蛋白质变性沉淀，通过离心将RNA及蛋白质和酵母菌体分离，进而在等电点沉淀RNA，从而达到提取目的。本实验采用浓盐法(10% NaCl),是食品医药卫生领域制备RNA 制剂的经典方案。[1][3] 核酸不论是DNA还是RNA,都是由核普酸组成的多聚核苷酸化合物，而核甘酸是由戊糖、碱基和磷酸构成，三个组份是以等分子比例存在。所以测定核酸的含员，只需测定组成核苷酸的任一成份，如磷、糖或碱基，便可相应计算山核酸的含量。 目前测定核酸含量的方法主要有: 1、定磷法，测量RNA和DNA:无机消化法。(蛋白质含量测定:凯氏定氮法) 2、戊糖测定法，测RNA: 苔黑酚法 3、脱氧戊糖测定法，测DNA:二苯胺法 4、紫外吸收法测定RNA和IDNA:碱基平面的共轭双键在紫外区具特异光吸收 后三种都是设计利用的比色法。 本实验采用紫外吸收法来测定并计算所获制品RNA的含量，再计算收率。 三、实验材料，仪器和试剂 1.材料:干酵母片粉 2.仪器:低温冷冻离心机（Eppendorf 5804R离心机）、恒温烘箱（202-2AB型，天津市泰斯特仪器有限公司）、电子天平（FA1004 上皿电子天平，上海精科）、紫外分光光度计（WFZ UV-2000型，尤尼柯仪器有限公司）、小台秤。(记录厂家及型号); pH计(本次实验:精密试纸pH0.5-5.0,精密试纸pH5.0-9.0) 主要器皿:移液器、研钵、三角瓶、容量瓶、烧杯 3.试剂: 10%NaCl、6MHCl、 95%乙醇(分析纯)、3~5%的氨水、RNA沉淀剂。 RNA沉淀剂：取0.5克钼酸铵，加水193ml，加7mL 70%过氯酸，总体积200ml. (70%过氯酸即高氯酸，原液浓度即是70%)。

酵母基因组DNA大量提取试剂盒使用说明

酵母基因组DNA大量提取试剂盒使用说明 货号：D1910 规格：10T 保存：室温(15℃-25℃)干燥保存，复检期12个月，2℃-8℃保存时间更长。 试剂盒内容：D1910-10T保存 RNase A1m1×5-20℃ 蛋白酶K1ml×5-20℃ 酵母破壁酶 1.25m1×5-20℃ β-巯基乙醇 1.5m12-8℃ 山梨醇Buffer125m1RT 溶液YA50ml RT 溶液YB50ml RT 漂洗液15ml×2RT 洗脱液20m1RT 吸附柱10个RT 收集管20个RT 说明书1份 产品简介： 酵母基因组DNA大量提取试剂盒采用可以特异性结合DNA的离心吸附柱和独特的缓冲液系统，提取酵母基因组DNA。离心吸附柱中采用的硅基质材料，能够高效专一吸附DNA，可最大限度去除杂质蛋白及细胞中其他有机化合物。提取的基因组DNA片段大，纯度高，质量稳定可靠。使用本试剂盒提取的基因组DNA可用于各种常规操作，包括酶切、PCR、文库构建、Southern杂交等实验。

操作步骤： 使用前请先在漂洗液中加入无水乙醇，加入体积请参照瓶体上的标签。所有离心步骤均为使用台式离心机在室温下离心。 1、在离心管中收集酵母细胞20-40ml(不超过109ce l1s)，10000rpm离心1min，尽量吸除上清。 2、酵母细胞壁的破除：向酵母菌体中加入9ml山梨醇Buffer。充分悬浮菌体，加入600ul 酵母破壁酶和100ulβ-巯基乙醇，充分混匀。30℃处理1-2h，期间可颠倒离心管混匀数次。 3、10000rpm离心lmin，弃上清，收集沉淀。 4、向沉淀中加入5ml溶液YA，充分悬浮沉淀，向悬浮液中加入500ul的RNase A(10mg/ml)，充分颠倒混匀，室温放置10min。 5、加入500ul的蛋白酶K(10mg/ml)，充分颠倒混匀。65℃水浴消化30-60min，消化期间可颠倒离心管混匀数次，直至样品消化完全为止。 6、加入5ml溶液YB，再加入5ml无水乙醇，充分颠倒混匀，此时可能会出现絮状沉淀，不影响DNA的提取，可将溶液和絮状沉淀都加入吸附柱中，室温放置2min。 7、10000rpm离心2min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 8、向吸附柱中加入7ml漂洗液(使用前请先检查是否己加入无水乙醇)。10000rpm离心1min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 9、向吸附柱中加入7ml漂洗液，10000rpm离心l min，弃废液，将吸附柱放入收集管中。 10、10000rpm离心2min，将吸附柱敞口置于室温或50℃温箱放置数分钟，目的是将吸附柱中残余的漂洗液去除，否则漂洗液中的乙醇会影响后续实验如酶切、PCR等。 11、将吸附柱放入一个干净的离心管中，向吸附膜中央悬空滴加1-2ml经65℃水浴预热的洗脱液，室温放置5min，10000rpm离心l min。 12、离心所得洗脱液再加入吸附柱中，10000rpm离心2min，即可得到高质量的基因组DNA。注意事项：