前脂肪细胞在小肠黏膜下层的生长与增殖
抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法
抑制肿瘤细胞增殖的药物筛选方法 09级生科3班余振洋200900140156 一、【实验原理】 1．关于恶性肿瘤和抗肿瘤药物： 恶性肿瘤是一种常见病，严重威胁着人类的生存质量，被称为人类健康的第一杀手。多年来人类一直在不断的进行抗肿瘤药物的研究，抗肿瘤药物的筛选是整个研究过程中很重要的个环节，而进行药物的筛选首先离不开合理的筛选方法和系统。寻找选择性强、对实体瘤有效的新型抗肿瘤药物，是摆在抗肿瘤药物研究人员面前的重要任务。世界各国对抗肿瘤药物的筛选都非常重视，投入了大量的人力、物力、财力，每年都有大量的化合物(合成药、天然产物和微生物发酵产物)待筛，抗肿瘤药物筛选方法的发展经历了一个探索的过程。 8O年代中期以前，普遍采用的筛选方法是以体内小鼠白血病／淋巴瘤模型P388和L1210为基础的 J，所有化合物在进一步的临床研究之前必须通过这种小鼠肿瘤模型的筛选。即小鼠白血病P388和L1210作为第一轮初筛，能通过第一轮初筛的化合物才能被允许进入第二轮筛选。这种方法有一个很明显的缺陷就是一些在临床上有活性的药物将被筛选掉，无法保证所有具有抗肿瘤作用的药物都能通过筛选。鉴于以前的筛选方法存在较大的缺陷，1985年之后以NCI为首的一些研究单位普遍开始采用针对疾病的筛选方法来代替针对化合物的筛选方法，即放弃体内小鼠筛选，代之为体外代表各种常见实体瘤的人类肿瘤细胞株筛选。这种筛选系统是一种高通量的抗肿瘤筛选体系，其主要优势有两点：其一是多种细胞株初筛有可能筛选出对特殊的人类肿瘤或对特殊组织亚型有活性的物质；其二是这种体外筛选尤其适合于复杂天然产物提取物中有效成份的证实，过去动物筛选需较大量的天然产物，而现在天然产物的需要量就大大减少，可以指导有效成份的进一步分离纯化，使得从天然产物中发现新的抗肿瘤药物更加便利。 2．关于筛选方法： 下面为现阶段较为普遍采用的一些抗肿瘤药物的筛选方法的实验原理。 1）以端粒酶活性为作用靶点筛选抗肿瘤药物 端粒是染色体特殊结构，起着保护染色体的完整和稳定性的作用，端粒酶是一种核糖核蛋白返转录酶，由RNA和蛋白质组成，可以以自身的RNA为模板合成端粒末端。已发现在正常的体细胞和良性肿瘤组织中端粒酶活性是阴性，而在人体恶性肿瘤组织和人的肿瘤细胞株中都表达了很高的活性。因此，认为端粒酶与恶性肿瘤的发生发展有密切的关系，有可能成为肿瘤治疗的靶点。 2）应用快速荧光素测定法筛选抗肿瘤药物 快速荧光素测定法是一种近几年发展起来的应用非常广泛的体外药物敏感性测定方法，其原理为采用一些特殊的荧光染料，对细胞的特定成份进行染色或标记。或通过细胞酶的作用使无荧光性的材料分解或转换为荧光材料，通过测定荧光强度从而测定出活细胞的量。现在普遍采用一种特殊的荧光染 FDAL1u(Fluoreseein diacetate)，在正常情况下它不具有荧光，但当它加人到具有完整细胞膜的肿瘤细胞的营养液中时，由于细胞分泌的水解酶的作用，FDA
小肠与结构与功能(图)
小肠的结构与功能(图) 小肠全长约3~5米，盘曲于腹腔内，上连胃幽门，下接盲肠。是食物消化吸收的主要场所。 小肠全长约3~5米，盘曲于腹腔内，上连胃幽门，下接盲肠。是食物消化吸收的主要场所。 结构 小肠，一般根据形态和结构变化分为三段，分别为十二指肠、空肠和回肠。 十二指肠位于腹腔的后上部，全长25厘米。它的上部（又称球部）连接胃幽门，是溃疡的好发部位。肝脏分泌的胆汁和胰腺分泌的胰液，通过胆总管和胰腺管在十二指肠上的开口，排泄到十二指肠内以消化食物。 空肠连接十二指肠，占小肠全长的2/5，位于腹腔的左上部。回肠位于右下腹，占小肠全长的3/5。空肠和回肠之间没有明显的分界线。
功能 小肠的功能主要分为四部分，分别是：消化功能、吸收功能、分泌功能和运动功能。 消化功能：小肠是食物消化的主要场所。 其消化过程为：肝脏分泌的胆汁和胰腺分泌的胰液经导管流入小肠，与分布在肠壁内的许多肠腺分泌的肠液，共同作用，将食物进一步消化。胆汁不含消化酶，但能将脂肪乳化成脂肪微粒，增加脂肪与消化酶的接触面积，有利于脂肪的消化。胰液和肠液中都含有消化糖类、蛋白质和脂肪的酶，能将食物中复杂的有机物分解成简单的营养成分。 吸收功能：小肠是营养吸收的主要部位。 小肠能吸收葡萄糖、氨基酸、甘油和脂肪酸，以及大部分的水分、无机盐和维生素。 各种营养物质在小肠内的吸收位置不同，一般地，糖类、蛋白质及脂肪的消化产物大部分在十二指肠和空肠内吸收，到达回肠时基本上吸收完毕，只有胆盐和维生素B12在回肠部分吸收。 分泌功能：小肠可以分泌小肠液。 小肠不仅具有吸收功能，而且还具有分泌功能—它能分泌小肠液。小肠的分泌功能主要是由小肠壁粘膜内的腺体（十二指肠腺和肠腺）完成的。正常人每天分泌1～3升小肠液。 小肠液的成分比较复杂，主要含有多种消化酶、脱落的肠上皮细胞以及微生物等。消化酶对于将各种营养成分进一步分解为最终可吸
细胞生长曲线的绘制实验报告
细胞生长曲线的绘制实验报告 篇一：实验五微生物生长量的测定及生长曲线的绘制 一、实验目的 学习了解微生物生长量测定的方法 学习了解细菌生长曲线的绘制方法 学习掌握血细胞计数板的使用方法 微生物生长量的测定 计数法重量法生理指标法 1、显微镜直接计数法 利用血细胞计数板计数 涂片计数 2、活菌菌落计数法 3、滤膜法 细菌生长曲线 将单细胞细菌接种到恒定容积的液体培养基中，不补充营养物或移去培养物，细菌以二分裂方式繁殖，以时间为横坐标，细菌数目的对数值为纵坐标，可画出一条反映细菌在整个培养期间菌数变化规律的曲线，称为生长曲线 篇二：细胞生长曲线的测定 细胞生长曲线的测定 一、实验目的
掌握测定细胞生长曲线的方法。 二、实验器具 24孔细胞培养板、微量加样器、eppendorf管、吸头、吸头盒、显微镜、细胞计数板、载玻片、盖玻片、吸管、试管架、普通显微镜、细胞悬液、0.4%台盼蓝。 三、实验方法 1. 培养细胞：首先在24孔细胞培养板内分别接种相同数量的细胞，计数并记录接种的细胞悬液密度，接种时间记为0小时。 2. 计数细胞密度：从接种时间算起，每隔24小时计数3孔的细胞密度，算出平均值。为提高准确率，对每孔细胞可计数2-3次，如此操作至第七天结束。 3. 绘制曲线：以培养时间为横坐标、细胞密度为纵坐标，将全部结果在坐标纸上绘图，即得所培养细胞的生长曲线。 篇三：MTT法绘制生长曲线 实验材料： 1，5%FBS-L-DMEM, 5x104个/ml细胞悬液，5mg/mlMTT溶液，DMSO,0.01M PBS,2, 96孔板共7个,酶标仪,50ml离心管，1.5ml离心管，0.22μm滤膜，锡箔纸，MTT工作液 实验步骤： 1，分别选取生长良好的P1、P3、P5代BMSCs消化后制备成细胞悬液，调整细胞密度为5x104/ml。接种到96孔板，每孔接种200μl 细胞悬液进行培养。
综合利用猪小肠粘膜加工肝素钠生产项目
综合利用猪小肠粘膜加工肝素钠生产项目 该项目年产粗品肝素钠3.8吨。新增土地30亩。采用国际先进的生产技术和工艺生产肝素纳，建设厂房7000平方米，其中刮肠车间4000平方米，肝素钠车间3000平方米。购进国内先进的刮肠设备(A22c17型)和配套的制肝素钠设备。主要工艺为：收集肠衣生产过程中废弃的猪小肠粘膜-吸入回转锅炉加温-降温-再加温-吸附-洗脱-干燥-成品。项目建成后，年可综合利用猪小肠粘膜1890吨。该产品国际市场需要巨大，产品供不应求，总投资3700 万元。 河南省漯河市源隆肠衣有限公司是于2001年注册的全国首家肠衣福利企业,中国工商局予以审验合格的以加工肠衣成品、半成品、猪副产品以及猪分割肉，代购代销肉制品加工的企业。公司占地5000余平方米，其拥有两个全新现代的大型操作车间、一个现代仓储管理的仓库和一个专用冷库。公司是按照国家卫生标准设计建设的，具有雄厚的技术力量和丰富的管理经验。 富锦市猪副产品深加工项目 项目背景及概况： 该项目充分利用生猪资源的各部分原料，采用国际领先的生产工艺，将猪内脏利用产业朝生化方面发展。（1）将生猪综合利用，提取得到了高附加值含量的SOD、凝血酶、血红素等生化产品，大大提高生猪的经济效益。（2）对生猪资源进行综合利用开发，采用国际领先的设备和技术加工成超微鲜骨粉、骨蛋白水解物，骨胶原料。（3）猪皮中胶原蛋白的含量可达90%以上，可利用猪皮生产胶原蛋白。 市场需求预测： 动物血、骨等副产品，资源丰富，我国一直没有得到很好的开发利用。目前，我国动物副产品的利用率不超过10%，大量动物血、骨等副产品遭到废弃，造成既浪费资源，又污染环境。动物血、骨是一种优质理想的蛋白质原料，营养颇丰，可开发出数种产品，广泛应用于食品开发、生物工程、医药工业、日用化工工业及饲料工业，产生非常好的经济效益和社会效益，市场前景十分乐观。 富锦市处于三江平原腹部，地势平坦，土质肥沃。全市现有耕地面积782万亩，牧草地80万亩。是传统的生猪养殖地区，当地群众具有较高的积极性，具有较丰富的养殖经验和技术。富锦市有森益屠宰加工厂年屠宰生猪2.5万头，全市的屠宰生猪达4万头，幅射周围市县共可屠宰15万头生猪，可提供大量的猪副产品。 项目建设内容及规模： 本项目拟建设成年产1000吨的猪副产品精深加工制品，包括猪血制品450吨，猪骨制品250吨，猪皮特品300吨。 项目投资规模：项目总投资2300万元，其中：固定资产投资1687.69万元，铺底流动资金612.31万元。 预计经济效益：项目建成后可年销售产品1000吨，年销售收入5335万元，年总成本3908万元，年纯利润520.05万元。
实验：计数法测定细胞生长曲线
实验内容：计数法测定细胞生长曲线 作者：王卫东实验日期：2001.10.24-2001.10.31 实验目的：学习细胞计数的方法；熟悉测定生长曲线的基本原理、方法，了解其应用。 实验原理：一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮后贴壁，随后度过长短不一的潜伏期，即进入大量分裂的指数生长期，在达到饱和密度后，细胞停止 生长，进入平顶期，然后退化衰老。典型的生长曲线即可分为潜伏期、 指数生长期、平顶期及退化衰老四个部分，其中的三个不同生长时相 （潜伏期、指数生长期和平顶期）是每个细胞系所共有的特征。通过 测定生长曲线，不仅可以了解培养细胞生物学特性的基本参数、测定 细胞绝对生长数、判断细胞活力，而且也可用于测定药物等外来因素 对细胞生长的影响。本实验采用计数法测定细胞生长曲线，通过连续 对细胞计数（通常为7d，一般应每次计数3瓶细胞取平均值），然后 以存活细胞数对培养时间作图，即得该种细胞的生长曲线。 仪器、材料和试剂： 培养箱、超净工作台、倒置显微镜、血球计数板 1、仪器：CO 2 2、材料：培养瓶、试管、吸管、移液管、废液缸、HeLa细胞、盖玻片、酒精灯 3、试剂：培养基（含小牛血清）、0.25%胰蛋白酶 实验步骤： 1、细胞悬液制备：取生长良好接近汇合的HeLa细胞，胰酶消化，再加新鲜培 养基制成细胞悬液后计数。 2、接种：根据细胞计数结果，按每瓶5×104个接种细胞（加3mL培养基，实际 接种每瓶5.9×104个）作传代培养（理论上应该每人接种21瓶细胞，每天取3瓶计数，但实际每人只接种7瓶）。 3、计数：24h后开始作细胞计数，以后每隔24h计数一次，连续计数7天。 4、绘图：根据计数结果，绘制HeLa细胞生长曲线。 结果与讨论： 1、细胞计数结果如下：
细胞衰老与肿瘤的发生的研究进展
细胞衰老与肿瘤的发生的研究进展 广东药科大学公共卫生学院卫生检验与检疫15 戚嘉铭 【摘要】近几年，细胞衰老成为一种针对癌细胞永久性生长的治疗肿瘤新途径，一直是细胞生物学家的研究重点。研究发现，细胞衰老可以作为阻碍癌细胞致癌的抑制机制。原因在于癌基因诱导具有双向性，癌基因的活化可以诱导细胞衰老。但研究发现，细胞衰老同样可能促使癌细胞的增值。 【关键词】细胞衰老肿瘤癌细胞 细胞衰老是生物体中普遍存在的一种永久性生长抑制现象，能够防止老化的或非正常细胞的进一步生长，对抗细胞的无限增殖能力而对机体起到保护作用。因此，死亡的细胞衰老与无限增殖的癌细胞一直都是细胞生物学家们致力研究的重点。本文主要是描述探究决定细胞走向衰老还是转为癌细胞的因素的相关研究进展。 1、细胞衰老:一种阻碍癌细胞致癌的机制 在多种衰老细胞中,某些抑癌基因的过表达会引起细胞进入衰老程序,细胞绕过衰老途径是其永生化及癌变的必要条件,因而细胞复制性衰老是抑制肿瘤的一种可能机制.这样对衰老细胞的研究将为肿瘤的预防和治疗方法提供新的策略[12]。细胞衰老是人体防癌的机制之一,研究细胞衰老对于抗肿瘤是很有意义的,同时为打开抗肿瘤药物治疗和新药的研发提供了依据。 1961年,Hayflick在体外培养成纤维细胞的研究中发现,正常二倍体细胞在体外条件下增殖分裂50~70代即进入一种衰老的状态,无法进一步传代培养,但仍然存活.正常的动物细胞无论是在体内生长还是在体外生长,其分裂次数总存在一个"极限值",此值被称为"Hayflick"极限,亦称最大分裂次数[11].研究表明，恶性肿瘤细胞系会发生自发性老化,其程度与细胞系种类有关.短期饥饿培养会明显增加老化细胞所占的比率,提示饥饿诱发细胞老化可能是抗肿瘤治疗的又一快速、简单且有效的途径[13]。 2、癌基因诱导的双向性 在人部分的肿瘤中都发现有癌基因的活化，癌基因的活化被认为是导致肿瘤发生的重要原因。然而，在野生型细胞内，癌基因的活化可以诱导细胞衰老，称为癌基因诱导的细胞衰老(oncogene-induced senescence, OIS)[1]。癌基因诱导的衰老( OIS)是指癌基因突变所产生的异常增殖信号，通过MAPK和PI3 K信号通路，使细胞处于生长停
肿瘤的发生与发展
肿瘤的发生与发展 肿瘤的定义：肿瘤是机体在各种致瘤因素作用下，局部组织的细胞在基因水平上失去对其生长的正常调控，导致克隆性异常增生而形成的新生物，常表现为局部肿块。 过程：局部组织的细胞—基因突变—细胞异常增生—新生物—局部肿块 发病机制：肿瘤的发病是一个多因素、多步骤参与的过程。 恶性肿瘤的病因（尚未完全了解）， 1.环境因素：化学，物理，生物因素 2.机体因素 化学致癌 化学致癌物：目前认为凡接触引起人或动物形成肿瘤的化学物质，称为化学致癌物（chemical carcinogen）。目前发现对动物有致癌作用的化学物质已达2000余种，其中有些可能和人类肿瘤的形成有关 分类：1。作用分式：直接致癌物，间接致癌物，促癌物 2.与肿瘤的关系：肯定致癌物，可疑致癌物，潜在致癌物 ? 1.直接致癌物：进入机体后与细胞直接作用，诱导细胞癌变的化学物质。 ? 2.间接致癌物：进入体内经微粒体氧化酶活化，变成具有致癌作用的化学物质 ? 3.促癌物：能促进其他致癌物诱发肿瘤形成的化学物质 ? 4.肯定致癌物（defined carcinogen）经流行病学调查确定，临床医师和科学工 作者都承认对人和动物有致癌作用，其致癌作用具有剂量反应关系的化学致癌物。 ? 5.可疑致癌物（suspected carcinogen）具有体外转化能力，而且接触时间和发 病率相关，动物致癌实验阳性，结果不恒定，且缺乏流行病学方面的证据。 ? 6.潜在致癌物（potential carcinogen）是在动物实验中可获得某些阳性结果， 但在人群中尚无资料证明对人具有致癌性的物质。 １、化学致癌物的作用点：为细胞的癌基因和抑癌基因 ２、作用：使癌基因激活，抑癌基因失活。 １、累积作用:(summation effect) 是指两种或多种致癌物同时或相继作用于机体，其复合效应等于单独作用之和２、协同作用:(synergistiic effect) 机体同时暴露于几种致癌物中其致癌作用高于个单独致癌物作用之和 常见的化学致癌物：多环芳香烃类，芳香胺与偶氮染料，亚硝胺类 化学致癌例子。苯胺染料：膀胱癌，烟草：肺癌，黄曲霉素：肝癌 物理致癌 1.电离辐射是最主要的物理性致癌因素 2.放射性同位素：镭、铀、氡等放射性同位素 3.紫外线：皮肤癌，着色性干皮病 病毒致癌 1/3为DNA病毒，2/3为RNA病毒 ?一、乳头状瘤病毒与宫颈癌（HPV） ?二、乙型肝炎病毒与肝癌（HBV） ?三、EB病毒与鼻咽癌和Burkit肉瘤（EBV） ?四、HTL V与人类T细胞白血病（HTL V） 致瘤性DNA病毒
脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料中生长因子的 定量检测
Material Sciences 材料科学, 2018, 8(5), 595-602 Published Online May 2018 in Hans. https://www.wendangku.net/doc/e55267529.html,/journal/ms https://https://www.wendangku.net/doc/e55267529.html,/10.12677/ms.2018.85070 Quantitative Detection of Growth Factors in Porcine Small Intestinal Submucosa Matrix Materials Yang Zhang1, Leilei Xia1, Jianping Gao2, Fumin Men1, Xiaolong Zheng1, Jinhui Zhang1, Yi Chen1*, Bo Zhao1* 1Beijing Biosis Healing Biological Technology Co., Ltd., Beijing 2State Key Laboratory of Biochemical Engineering, Institute of Process Engineering, CAS, Beijing Received: May 4th, 2018; accepted: May 20th, 2018; published: May 28th, 2018 Abstract In this study, three growth factors including basic fibroblast growth factor (FGF2), transforming growth factor β1 (TGFβ1) and vascular endothelial growth factor (VEGF) in two SIS products (VIDASIS TM and Biodesign?) were quantified by enzyme linked immune sorbent assay (ELISA) kit through the preliminary treatment of liquid nitrogen freezing and grinding technology which was aimed to release the growth factors from the tissue. Results showed that contents of TGFβ1, VEGF and FGF2 in VIDASIS TM were 8375 ± 2125 pg/g, 5486 ± 1043 pg/g and 3990 ± 1372 pg/g respec-tively; while the corresponding contents in Biodesign? were 11517 ± 1331 pg/g, 5432 ± 272 pg/g and 5417 ± 947 pg/g. Keywords Porcine Small Intestinal Submucosa, Acellular Matrix, Transforming Growth Factor, Basic Fibroblast Growth Factor, Vascular Endothelial Growth Factor 脱细胞猪小肠粘膜下层基质材料中生长因子的定量检测 张扬1，夏磊磊1，高建萍2，门福民1，郑晓龙1，张晋辉1，陈毅1*，赵博1* 1北京博辉瑞进生物科技有限公司，北京 2中国科学院过程工程研究所生化工程国家重点实验室，北京 *通讯作者。
M TT 比色法测定细胞生长曲线 - 资料中心 - 生物在线
M TT比色法测定细胞生长曲线 郝新保 张利朝 殷 缨 韩秀珍 陶秦渝 郝晓柯 张盈华(第四军医大学唐都医院中心实验室 西安710038) 关键词 细胞生长曲线 M T T比色法 中图号 Q28 在有关肿瘤细胞生物学的研究中,我们常常要测定细胞的生长状态,制作细胞生长曲线,以往的方法是取少量细胞在镜下或计数仪中计数,然后标注在坐标纸上,制作出细胞生长曲线.这种方法对同一样品要求计数几次取平均值,不但操作繁琐、费时,更主要的是误差较大,可达到20%～30%[1],包括取样误差、计数误差等.为了能简便、准确地测定细胞数,我们建立了基于M T T比色法的细胞生长曲线制作方法. 1 材料和方法 1.1 试剂 R P M I1640培养基为G I BCO公司产品,小牛血清为杭州四季青产品,M T T为SERV E产品,其它试剂均为国产. 1.2 仪器 HL22029P型酶标自动分析仪为国营二六二厂产品,P rofile ,E lite型流式细胞仪为美国COUL T ER 公司产品. 1.3 细胞培养 选用人乳腺癌细胞系SK2BR23.细胞培养在含10%小牛血清的R P M I1640培养基中,37℃,5% CO 2. 1.4 镜下计数测定细胞数 细胞消化后悬浮在一定量的培养基中,用计数板按常规方法在倒置显微镜下计数,每个样品测三次,取平均值. 1.5 流式细胞仪计数 细胞消化后悬浮在一定量的培养基中,取0.2m l细胞过滤后用流式细胞仪自动计数. 1.6 M T T比色法计数 M T T比色法计数为间接计数,先要做出细胞的标准曲线,然后根据欲测样品的A值计算出相应的细胞数. 1.6.1 制作标准曲线 准备细胞悬液,从1×107细胞 200Λl 孔开始在96孔板中倍比稀释至1×102细胞 孔,每个稀释度三孔细胞,培养板置37℃培养4h后细胞贴壁,每孔中加入20Λg M T T继续培养4h,然后吸出150Λl培养液,加入等量DM SO,37℃20m in,570nm处测定吸光度[2],用二六二厂酶标自动分析仪程序绘出细胞标准浓度曲线. 1.6.2 制作生长曲线 调整细胞的浓度,按2×103 孔接种在96孔板中,置37℃培养,每天用M T T比色法测定3孔细胞的A值,在标准曲线上计算出相应的细胞数,即可绘出细胞的生长曲线. 郝新保,男,32岁,讲师,主治医师2 结果 2.1 细胞数与A值的标准曲线 根据各稀释度的A值制作细胞浓度的标准曲线, 如图1. 图1 SK2BR23细胞浓度的标准曲线 2.2 肿瘤细胞的M T T比色法生长曲线 根据每天测定的三孔细胞的A值在标准曲线上求得其对应的细胞数,7～10d 后即可绘制细胞生长曲线,如图2. 图2 SK2BR23细胞的生长曲线 2×;--0.2×;…20×. 2.3 细胞接种密度对生长曲线的影响 当细胞接种密度较低(2×102 孔)和较高(2×104 孔)时,对细胞生长曲线的形状有一定的影响,如图2. 2.4 M T T比色法与镜下计数法及流式细胞仪计数法的比较 为了比较M T T比色法和镜下计数法制作的细胞生长曲线,用流式细胞仪的计数结果作为参照,结果表明M T T 比色法与流式细胞仪计数结果更接近,明显优于镜下计数法的结果. 3 讨论 从结果可以看出,用M T T比色法制作细胞生长
细胞凋亡与肿瘤
细胞凋亡与肿瘤 巴桑卓玛 (西藏大学医学院基础医学研究所) 摘 要 细胞凋亡是一种进化保守的细胞死亡形式,不仅在正常的生理状态具有重要作用,而且与多种疾病的发生发展密切相关。近年来研究认为,细胞凋亡异常可能与肿瘤发生有关。凋亡调控基因已被看作是一类新的肿瘤发生相关基因。肿瘤的发生,是由于细胞增殖与细胞凋亡之间的平衡失调的结果,细胞凋亡在肿瘤生长过程中起负调控作用,因此研究抑制多种肿瘤细胞增殖并诱导细胞凋亡而对正常细胞影响不大是肿瘤治疗的新思路。 关键词 细胞凋亡 诱导 治疗 肿瘤 多细胞机体,包括人,均存在着细胞增殖与死亡的平衡,以维持机体的稳态,二者是一个矛盾的两个方面,此矛盾的运动发展推动着机体的生、老、病、死。传统的肿瘤研究者关注的首先是细胞的增殖。肿瘤细胞是永生性细胞,如何抑制肿瘤细胞的无限增殖能力,是他们首先考虑的问题。然而,机体还存在另一普遍现象,即死亡。细胞的死亡有两种形式,一种是病理性死亡,称为坏死(necrosis)。它是由于局部缺血、高热、理化因素及微生物的侵袭所致的细胞急速死亡。其重要的特点是细胞肿胀、溶解、释放出裂解产物,使周围组织产生炎症反应。另一种是生理性死亡———凋亡(apoptosis)。 1 细胞凋亡与一般的死亡有很大的不同,主要表现以下几个方面 形态学特征:细胞凋亡是细胞在生物体发育过程中,在一定诱导条件下接受指令而发生的程序化事件,是导致最终自我消亡的生命活动。发生时首先是染色质的凝集,嗜碱性染色增强,然后细胞核崩解,此时线粒体保持形态正常,最后细胞体积缩小,一部分细胞质和核碎片进入由膜包被的程序死亡小体,它们从细胞表面出芽脱落,并被组织专职巨噬细胞、上皮细胞吞噬。由于细胞内容物不泄漏,因而没有炎症反应。 生化特征:染色质降解,核小体间连接DNA部位被降解,产生寡聚核小体DNA 片段,即180-200bp整数倍的不同长度的DNA片断。 细胞凋亡的化学信号:在细胞程序死亡时出现快速持续的Ca2+浓度上升。如在胞质钙离子载体tributyrin和抗-CD3抗体诱导的胸腺细胞凋亡中就发现有钙离子浓度升高的现象。研究发现Ca2+增加与A TP一起作用于染色质,使原来折叠的很紧的染色质变松散,露出亲水部分,以便脱氧核糖核酸酶(Dnase)水解。Danson (1993)发现Ca2+可以参与Ca-calmokulin dependent phospatase作用,产生凋亡。Wornonicz提出Ca2+可以直接作用于核内转录因子引起凋亡。另外Ca2+还可活化
细胞生长曲线
一细胞生长曲线： A、目的：学习细胞生长曲线的测定方法，观察细胞生长基本规律。 B、背景知识 细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。 原理（选填项目）： 细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。 C、材料 （一）仪器 1.净化工作台 2.离心机 3.恒温水浴箱 4.冰箱（4℃、-20℃） 5.倒置相差显微镜 6.培养箱（37℃、5%CO2、饱和湿度） （二）玻璃器皿 1.吸管（弯头） 2.培养瓶 3.玻璃瓶（250ml、100ml） 4.废液缸 （三）塑料器皿 1.吸头 2.枪头 3.24培养板 4.胶塞 （四）其他物品 1.微量加样枪
2.红血球计数 板（五）试剂 1.D-Hanks液 2.小牛血清 3.R PMI1640 4.双抗（青霉素、链霉素） 5.0.08%胰酶 （四）、操作步骤 1.取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液； 2. 计数，精确地将细胞分别接种于21～30个大小一致的培养瓶内或培养孔（以24孔培养板为宜），每瓶或孔细胞总数要求一致，加入培养液的量也要一致。 3. 每天或每隔一天取出3瓶（孔）细胞进行计数，计算均值。培养3～5d常要给未计数的细胞换液。 4.以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），描绘在半对数座标纸上，连接成曲 线后即成该细胞的生长曲线。 9 （五）、注意事项 1．细胞生长曲线虽然最为常用，但有时其反映数值不够精确，可有20～30%的误差，需结合其它指标进行分析。 2．现在很多实验室利用培养板采用MTT法进行生长曲线测定，较为简便。 3．标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，再经过几天 的潜伏适应期，然后进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后到达衰老。 4．在生长曲线上细胞数量增加1倍时间称为细胞倍增时间，可以从曲线上换算出。 二、四唑盐试验（ MTT）比色试验 （一）、目的 学习四唑盐比色试验，检测细胞存活和生长情况。
抗肿瘤药物对细胞增殖及凋亡的影响
抗肿瘤药物对细胞增殖及凋亡的影响 【摘要】 本实验室自主创新实验。本实验主要有药物对细胞对细胞增长速率的影响，药物对细胞周期时相分布及细胞凋亡的影响和细胞凋亡的形态学观察等三个内容。通过本次实验我们了解了细胞生物学研究的基本思路和理解设计实验的基本原则的同时通过实际操作，理解了细胞增值与凋亡在有机体正常生命活动中的作用及意义，掌握细胞增值与凋亡分析的基本方法。 一、药物对细胞对细胞增长速率的影响 【实验原理】 1.细胞生长曲线：一般细胞传代之后，经过短暂的悬浮然后贴壁，随后度过潜伏期进入指数生长期。在细胞到达包和密度后，停止生长，进入平顶期，然后退化衰亡。典型的生长曲线可分为潜伏期，指数增长期，稳定期和衰退期。以存活细胞数对培养时间作图，及得生长曲线，生长曲线常用与测定药物等外来因素对细胞生长的影响。 2.利用MTT比色法测定药物等外来因素对细胞生长的影响： 黄色的MTT能被活细胞线粒体脱氢酶还原成不溶鱼水的蓝紫色产物——formazan,后者被溶解所呈现的色度反映出活生活细胞的代谢水瓶，死亡细胞则没有脱氢酶活性。Formazan产生的量与活细胞数成正比。 【实验步骤】 1.溶液的配制： ①MTT母液 ②裂解液 ③药物与对照组：A（对照），B，C，D 实验步骤： 2.细胞制备： 取对数生长期的细胞，用胰酶消化计数，配制悬液浓度为2.5~3×10 个/ml。
3.细胞的接种（96孔板）： 设定调零组，对照组，假药组（8个平衡孔），每孔加入200ul细胞悬液。 4.加药处理：细胞贴壁后，弃培养基，换等体积的药液。 5.对细胞生长情况进行测定： ①配制MTT使用液：无血清的5ml培养基中加入600ulMTT母液避光混匀。②待测细胞孔，弃去培养基，每孔加100ulMTT使用液。没有细胞的孔同样重复上述操作，作为调零孔，继续培养。 6.第二天，每孔加入100ul裂解液，调零孔中也加 7.下午取出孔板，用移液器充分混匀，每孔取出150ul样品，转移到检测板中。用考热的针头挑破孔中的气泡，用酶标仪读取OD值。 8.计算每种药物的生长抑制率（细胞生长抑制率=（1—药物组OD值/细胞对照组OD值）×100%） 二、药物对细胞周期时相分布及细胞凋亡的影响 【实验原理】 流式细胞仪(Flow Cytometer):是集激 光技术、电子物理技术、光电测量技术、计算机技术、细胞荧光化学技术以及单克隆抗体技术为一体的高科技细胞分析仪。流式细胞术(Flow Cytometry，FCM):利用流式细胞仪对处于快速直线流动状态中的细胞或亚细胞结构进行多参数、快速的定量分析和分选的技术。 2.PI荧光探针的特性： PI（碘化丙啶）为定量细胞化学的荧光染料，能插入双链DNA和RNA的碱基对之间，每隔5个碱基插入一个PI分子。如样品经RNA酶消化后，样品中的
MTT法绘制生长曲线
MTT实验 实验材料： 1，5%FBS-L-DMEM, 5x104个/ml细胞悬液，5mg/mlMTT溶液，DMSO,0.01M PBS, 2, 96孔板共7个,酶标仪,50ml离心管，1.5ml离心管，0.22μm滤膜，锡箔纸，MTT 工作液（1ml/管） 实验步骤： 1，分别选取生长良好的P1、P3、P5代BMSCs消化后制备成细胞悬液，调整细胞密度为5x104/ml。接种到96孔板，每孔接种200μl细胞悬液进行培养（每孔1x104 细胞）。 2，培养16-48后，每天选择6个培养孔各自加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，37℃继续孵育。 3，孵育4h后终止培养，吸出孔内上清，此时应该倾斜96孔板，用枪头小心的将上清液吸去，不可吸去下面的结晶颗粒，慢慢吸去。每孔加入150μlDMSO,室温振 荡10min，使结晶充分溶解，于试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照1 孔。
注意事项： 【1】1, 两种方法分离小型猪骨髓间充质干细胞的比较 分别取两组0,1,3代细胞，制成1x103的细胞悬液，接种到96孔板，每孔细胞悬液200微升，置37℃、5%CO2饱和湿度孵箱内孵育，各组每24小时分别取出4孔，每孔加入MTT（2mg/ml）20微升37℃孵育，4h后吸弃孔内培养液，每孔加入150微升分析纯的二甲基亚砜，移至酶联免疫检测仪上振荡10min,用分光光度计在492nm波长处测定每孔的吸光度值（OD492），以OD(492)值为纵坐标，时间为横坐标绘制生长曲线 【2】来自：SD大鼠骨髓间充质干细胞体外分离培养的实验研究 大鼠MSCs生长曲线测定：为了定量测定大鼠BMSCs的生长状况，对来源于同一动物的原代细胞进行连续培养。分别选取生长良好的P1、P3、P5代BMSCs消化后制备成细胞悬液，调整细胞密度为5x104/ml。接种到96孔板，每孔接种200μl细胞悬液进行培养（每孔1x104细胞）。次日起每天选择6个培养孔各自加入MTT溶液（5mg/ml）20μl，37℃继续孵育4h后终止培养，吸出孔内上清，每孔加入150μlDMSO,室温振荡10min，使结晶充分溶解，于试验孔平行设不加细胞只加培养液的空白对照1孔。在酶标仪上选择570nm波长，以空白孔调零，测定各孔吸光度（A）值，连续测7天，以时间为横轴，A值为纵轴绘制细胞生长曲线。
细胞周期调控与肿瘤发生
细胞周期调控与肿瘤发生 细胞周期(cell cycle)是细胞生命活动的基本过程,指从细胞分裂结束开始,到下一次细胞分裂结束为止的过程,DNA合成和细胞分裂是细胞周期的两个主要事件。在进化过程中,细胞发展并建立了一系列的调控机制,以确保细胞周期严格有序地交替和各时期依次有序变更。细胞的调控机制主要以蛋白质的相互作用为基础，以信号传递引起一系列级联反应为主要过程，以对整个过程的监督和控制为主要表现形式。 人们对细胞周期的调控是从MPF的发现开始的。最初，人们对MPF有以下两种解释： 1、细胞分裂期（M期）细胞中的一种能够使染色体凝集的因子，称为细胞促分裂因子（mitosis-promoting factor,MPF）或M期促进因子(M-phase-promoting factor,MPF)。 2、成熟的卵细胞中的一种可以诱导卵母细胞成熟的物质，称为卵细胞促成熟因子（matuation-promoting factor,MPF）。 但是，随着对MPF的深入研究，科学家又给出了新的解释：MPF是一种能够促进细胞有丝分裂或G2/M转换的周期蛋白激酶，含有两个亚单位，一个是催化亚单位，一个是调节亚单位。催化亚单位的激酶活性要通过与调节亚单位的结合才能体现出来。MPF的调节亚单位就是细胞周期蛋白（cyclin）。 cyclin是一类随细胞周期变化周而复始出现和消失的蛋白质。目前，人们已相继克隆和分离数十种cyclin，这些不同的cyclin在细胞周期中表达的时期不同，执行的功能各异。但各种周期蛋白之间有共同的结构特点，即均含有一段约100个氨基酸残基的保守序列，称为周期蛋白框（cyclin box）。周期蛋白框介导cyclin 与CDK（周期蛋白依赖性蛋白激酶）的结合，不同的周期蛋白框识别不同的CDK，组成不同的周期蛋白-CDK复合体，表现不同的CDK激酶活性。M期cyclin白分子的近N端含有一段9个氨基酸组成的特殊序列，称为破坏框（destruction box），参与泛素介导的周期蛋白A和B的降解。G1期cyclin分子的C端含有一段特殊的序列，可能与G1期cyclin的更新有关。 而周期蛋白依赖性蛋白激酶（cyclin-dependent kinase，CDK），是蛋白质激酶家族中的一员，有三个重要的功能域，其中第二功能域结合cyclin，和cyclin 协同作用，是细胞周期调控中的重要因子。CDK可以和cyclin结合形成异二聚体，其中CDK为催化亚基，cyclin为调节亚基，不同的cyclin-CDK复合物，通过CDK活性调节不同底物磷酸化，从而实现对细胞周期的调控。 在细胞周期中，CDK激酶的活性受到多种因素的综合调节。cyclin与CDK 的结合是CDK激酶活性的必要条件和先决条件，但并不是充分条件。如果仅仅是cyclin和CDK的结合，并不能激活CDK激酶的活性，因为激酶活性的体现还需要激酶本身的修饰（如磷酸化和去磷酸化）及一些细胞周期蛋白依赖性激酶抑制因子（CDK inhibition,CDKI，可以通过抑制CDK激酶的活性，对细胞周期起负调控作用）的去除等。 细胞周期是一个高度有序的运转过程。如前所述,它的正确运转是在适宜的环境中通过对cyclin-CDK复合物的活性进行精确调控来实现的。cyclin、CDK 的异常表达、CDK抑制因子的缺失等都将使细胞周期发生紊乱,细胞的增殖失控,最终发生癌变。 肿瘤是一类以细胞生长和增殖失控为主要特征的疾病,细胞在增殖、分化和
肿瘤细胞生物学特性
组织培养肿瘤细胞生物学特性 肿瘤细胞与体内正常细胞相比，不论在体内或在体外，在形态、生长增值、遗传性状等方面都有显著的不同。生长在体内的肿瘤细胞和在体外培养的肿瘤细胞，其差异较小，但也并非完全相同。培养中的肿瘤细胞具以下突出特点： （－）形态和性状 培养中癌细胞无光学显微镜下特异形态，大多数肿瘤细胞镜下观察比二倍体细胞清晰，核膜、核仁轮廓明显，核糖体颗粒丰富。电镜观察癌细胞表面的微绒毛多而细密，微丝走行不如正常细胞规则，可能与肿瘤细胞具有不定向运动和锚着不依赖性有关。 （二）生长增殖 肿瘤细胞在体内具有不受控增殖性，在体外培养中仍如此。正常二倍体细胞在体外培养中不加血清不能增殖，是因血清中含有很细胞增殖生长的因子，而癌细胞在低血清中（2％～5％）仍能生长。已证明肿瘤细胞有自泌或内泌性产生促增殖因子能力。正常细胞发生转化后，出现能在低血清培养基中生长的现象，已成为检测细胞恶变的一个指标。癌细胞或培养中发生恶性转化后的单个细胞培养时，形成集落（克隆）的能力比正常细胞强。另外癌细胞增殖数量增多扩展时，接触抑制消除，细胞能相互重叠向三维空间发展，形成堆积物。 （三）永生性 永生性也称不死性。在体外培养中表现为细胞可无限传代而不凋亡（Apoptosis）。体外培养中的肿瘤细胞系或细胞株都表现有这种性状，体内肿瘤细胞是否如此尚无直接证明。因恶性肿瘤终将杀死宿主并同归于尽，从而难以证明这一性状的存在。体外肿癌细胞的永生性是否能反证它在体内时同样如此？也尚难肯定。从近年建立细胞系或株的过程说明，如果永生性是体内肿瘤细胞所固有的，肿瘤细胞应易于培养。事实上，多数肿瘤细胞初代培养时并不那么容易。生长增殖并不旺盛；经过纯化成单一化瘤细胞后，也大多增殖若干代后，便出现类似二倍体细胞培养中的停滞期。过此阶段后才获得永生性，顺利传代生长下去。从而说明体外肿瘤细胞的永生性有可能是体外培养后获得的。从一些具有永生性而无恶性性的细胞系，如NIH3T3、Rat－1、10T1/2等细胞证明，永生性和恶性（包括浸润性）是两种性状，受不同基因调控，但却有相关性。可能永生性是细胞恶变的阶段。至少在体外是如此。 （四）浸润性 浸润性是肿瘤细胞扩张性增殖行为，培养癌细胞仍持有这种性状。在与正常组织混合培养时，能浸润入其它组织细胞中，并有穿透人工隔膜生长的能力。
MTT法绘制生长曲线
MTT法绘制生长曲线 一细胞生长曲线： A、目的：学习细胞生长曲线的测定方法，观察细胞生长基本规律。 B、背景知识 细胞生长曲线是观察细胞生长基本规律的重要方法。只有具备自身稳定生长特性的细胞才适合在观察细胞生长变化的实验中应用。因而在细胞系细胞和非建系细胞生长特性观察中，生长曲线的测定是最为基本的指标。 原理（选填项目）： 细胞生长曲线的测定一般可利用细胞计数法进行。 C、材料 （一）仪器 1. 净化工作台 2. 离心机 3. 恒温水浴箱 4. 冰箱（4℃、-20℃） 5. 倒置相差显微镜 6. 培养箱（37℃、5%CO2、饱和湿度） （二）玻璃器皿 1. 吸管（弯头） 2. 培养瓶 3. 玻璃瓶（250ml、100ml） 4. 废液缸 （三）塑料器皿 1. 吸头 2. 枪头 3. 24培养板 4. 胶塞 （四）其他物品 1. 微量加样枪 2. 红血球计数板 （五）试剂 1. D-Hanks液 2. 小牛血清 3. RPMI1640 4. 双抗（青霉素、链霉素） 5. 0.08%胰酶 （四）、操作步骤 1. 取生长状态良好的细胞，采用一般传代方法进行消化，制成细胞悬液； 2. 计数，精确地将细胞分别接种于21～30个大小一致的培养瓶内或培养孔（以24孔培养板为宜），每瓶或孔细胞总数要求一致，加入培养液的量也要一致。 3. 每天或每隔一天取出3瓶（孔）细胞进行计数，计算均值。培养3～5d常要给未计数的细胞换液。
4. 以培养时间为横轴，细胞数为纵轴（对数），描绘在半对数座标纸上，连接成曲线后即成该细胞的生长曲线。 9 （五）、注意事项 1．细胞生长曲线虽然最为常用，但有时其反映数值不够精确，可有20～30%的误差，需结合其它指标进行分析。 2．现在很多实验室利用培养板采用MTT法进行生长曲线测定，较为简便。3．标准的细胞生长曲线近似“S”形，一般在传代后第一天细胞数有所减少，再经过几天的潜伏适应期，然后进入对数生长期，达到平台期后生长稳定，最后到达衰老。 4．在生长曲线上细胞数量增加1倍时间称为细胞倍增时间，可以从曲线上换算出。 二、四唑盐试验（MTT）比色试验 （一）、目的 学习四唑盐比色试验，检测细胞存活和生长情况。 （二）、原理和背景。 四唑盐是一种能接受氢原子的染料，简称MTT。活细胞的线粒体中的琥珀脱氢酶能使外源性的MTT还原为难溶性的蓝紫色结晶物并沉积在细胞中，而死细胞无此功能。二甲基亚砜能溶解细胞中的紫色结晶物，用酶联免疫检测仪在490nm波长处测定其光吸收值，可间接反映细胞数量。在一定细胞数范围内，MTT结晶物形成的量与细胞数成正比。 （三）、材料 A、仪器 1. 净化工作台 2. 离心机 3. 恒温水浴箱 4. 冰箱（4℃） 5. 倒置相差显微镜 6. CO2培养箱 7. 振荡混合仪 8. 酶联免疫检测仪 9. 移液枪 10. 电磁力搅拌机 11. 微孔滤器 B、玻璃器皿 1. 吸管 2. 小烧杯（100ml） 3. 废液缸 C、塑料器皿 1. 吸头 2. 枪头 3. 96孔培养板 4. 15ml离心管 5. 50ml离心管
肿瘤分子生物学新选.
肿瘤（tumor）是一类疾病的总称，它们的基本特征是细胞增殖与凋亡失控，扩张性增生形成新生物。肿瘤可分为良性肿瘤（benign tumor）和恶性肿瘤（malignant tumor）。良性肿瘤生长缓慢，虽可增长至相当大的体积，但仍保留正常细胞的某些特性，通常在瘤体外有完整的包膜，手术切除后患者预后良好。绝大多数良性肿瘤基本上是无害的，不引起或很少引起宿主损伤。 恶性肿瘤统称为癌症（cancer），它不同于良性肿瘤的最重要的特性是能侵袭周围组织，疾病晚期癌细胞发生远端转移，破坏受侵袭的脏器，最终使机体衰亡，但如能在侵袭转移前切除癌瘤，一般预后明显改善。 2、癌细胞的恶性生物学特征 （1）失去了对中止细胞增殖信号和细胞分化信号的反应，并可传出自主的细胞生长、增殖信号。 （2）逃避了细胞凋亡和衰老，是细胞永生。当正常细胞受到严重损伤和营养缺乏时，就发生凋亡并自动解体；而癌细胞并不一定会发生凋亡。体外培养的正常细胞，即使没有受到损伤，约分裂50后也会自动停止分裂，最终细胞死亡（细胞衰老）；而癌细胞能无限制地增殖，获得了永生化。这可能与调控细胞凋亡基因的缺陷和端粒酶恢复活性相关。 （3）失去细胞的区域性限制，具有了侵袭和转移能力。例如在体外培养的正常细胞中增殖至彼此接触时，就停止生长和分裂（结出抑制），故细胞呈单层生长，而癌细胞失去了接触抑制，继续分裂而呈多层重叠生长；同时癌细胞表面的识别能力和黏着性发生了改变，使癌细胞不能像不同的正常组织细胞那样保持彼此分开，而能侵入临近组织。 （4）自主的血管生成能力，这保证了肿瘤体积增大后和新形成转移肿瘤的血液供应，以维持癌细胞生长和增殖之所需。 上述这些癌细胞的恶性特性，使它们能在没有增殖信号的情况下，自主地无限制增殖，当达到一定的体积时就可能侵袭邻近组织，癌细胞还可能脱落进入血液和淋巴液，发生远端转移并扩增，最终导致宿主死亡。 3、癌的单克隆起源和异质性 除少数例外，癌是原始的、单个癌细胞增殖的后代，即癌为单克隆起源。这一观点已被普遍接受，部分是依据来自X染色体上基因表达的观察。妇女有两条X染色体，在卵裂的后期其中一条X染色体随机失活，如一位基因杂合子的妇女患癌，若是多克隆起源，癌细胞则可能有两种等位基因表达的产物；若是单克隆起源，则癌细胞仅有一种等位基因表达产物，而研究结果证实了癌为单克隆起源。 由于与DNA修复和细胞分裂等一系列相关基因的缺陷，使癌细胞基因组和染色体的稳定性下降，于是在肿瘤演进过程中，就可能不断产生新的癌细胞干系，它们彼此间免疫系统和治疗等因子作用下，如不能被全部杀灭，就可能选择了恶性程度更高的癌细胞干系，它们继续重复突变、扩增和选择的过程，给治疗带来困难。 二、癌基因 癌基因是正常细胞基因即原癌基因（proto-oncogene）的一种转化形式。它编码具有显性转化性质的调节蛋白，即改变了的单拷贝序列能转化整个细胞，而另一正常序列不能阻断这种转化能力。 1. 原癌基因的蛋白质产物 （1）生长因子growth factor 生长因子刺激静止期或G0期细胞进入细胞周期。这一有丝分裂应答需要两个生长因子互补群之间的协同作用。第一互补群是“感受性因子”（competence factors），如PDGF、