谷氨酸生产菌B44的基因工程构建

第２７卷第２期２００６年４月

河南工业大学学报（自然科学版）

ＪｏｕｒｎａｌｏｆＨｅｎａｎＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ（ＮａｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅＥｄｉｔｉｏｎ）

Ｖ０１．２７．Ｎｏ．２

Ａｐｒ．２００６

文章编号：１６７３－２３８３（２００６）０２－００７７－０４

谷氨酸生产菌Ｂ４４的基因工程构建

周盛１，武波２，李家洲１

（１．广西玉林师范学院，广西玉林５３７０００；２．广西大学生命科学院，广西南宁５３００００）

摘要：从大肠杆菌Ｅ．ｃｏｌｉＫ－１２中通过ＰＣＲ扩增出磷酸果糖激酶编码基因（ｐｆｋＡ），将其与表达载体ｐＣＭＶＴＮＴＴＭｖｅｃｔｏｒ连接构建成重组质粒ｐＫｕ一１，转化谷氨酸棒杆茵Ｂ４，并得到表达．酶活性测定表明，ｐｆｋＡ基因在受体茵Ｂ４４中得到表达水平为（１２８．６－４－０．８６）Ｕ／ｇ蛋白，解除了磷酸果糖激酶对已经改造的谷氨酸的整个代谢途径的限制．同时，转化茵对糖转化率比Ｂ４高１０．６４％，产酸率高１７．１％．

关键词：ＰＣＲ克隆；表达载体；代谢途径

中图分类号：ＴＳ２０１．３文献标识码：Ｂ

０前言

在谷氨酸生产中，依谷氨酸棒杆菌代谢途径…（如图１所示），将出发菌株Ｂｌ不必要的代谢途径１２２（经诱变阻断了ａ一酮戊二酸到琥珀酰ＣｏＡ和乙醛酸两条代谢途径）切断后，诱变获得细胞渗漏型甘油缺陷菌株Ｂ４，以便让谷氨酸有效外漏，解除因代谢途径改变后细胞内代谢产物谷氨酸过度积累，而产生的反馈抑制，诱变菌株Ｂ４谷氨酸产量有一定提高，与出发菌株Ｂ１相比产酸率提高１８．６％和糖转化率提高１２．３％．但在整个谷氨酸代谢途径中ｂＪ，ＥＭＰ途径中的１一磷酸果糖激酶是限制整个代谢的关键酶，故必须增大磷酸果激酶剂量，增加整个代谢途径的物流量１４Ｊ，以达到解除磷酸果糖激酶对已经改造的Ｂ４的谷氨酸整个代谢途径的限制，从而提高糖的转化率和谷氨酸的产量．人们对谷氨酸棒杆菌的分子生物学研究不多，而对大肠杆菌了如指掌，从系统发育研究表明，大肠杆菌和谷氨酸棒杆菌较为接近，尤其是其中的磷酸果糖激酶．故本研究直接以大肠杆菌磷酸果激酶编码基因ｐｋｆＡ取代谷氨酸棒杆菌磷酸

收稿日期：２００５—１ｌ－２９

基金项目：广西玉林师范学院重点科研项目（０５ＺＤＨＳ０３）

作者简介：周盛（１９７２一），男，广西忻城县人，讲师，从事发酵与基因工程研究．果糖激酶编码基因，将其连到表达载体ｐＣＭＶＴＮＴＴＭｖｅｃｔｏｒ，连接构建成重组质粒Ｋｕ一１，导入谷氨酸棒杆菌Ｂ４．以达到解除磷酸果糖激酶对已经改造的Ｂ４谷氨酸整个代谢途径的限制，增加整个代谢途径的物流量Ｌ５Ｊ．研究结果表明，大肠杆菌磷酸果糖激酶在谷氨酸棒杆菌的代谢中发挥一定作用．

图１谷氨酸生物合成途径

１材料与方法

１．１菌株和质粒（见表１）

１．２培养基和培养条件

１．２．１完全培养基

葡萄糖０．１％，牛肉膏１．０％，蛋白胨１．０％，氯化钠０．５％，琼脂２．０％。

１．２．２基本培养基

（ＮＨ４）２Ｓ０４１ｇ，Ｋ２ＨＰ０４１０．５ｇ，ＫＨ２Ｐ０４４．５ｇ，

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