包涵体复性方法

包涵体复性方法：

一个有效的、理想的折叠复性方法应具备以下几个特点：活性蛋白质的回收率高；正确复性的产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后应得到浓度较高的蛋白质产品；折叠复性方法易于放大；复性过程耗时较少。（即回收高，易分离，浓度高，易放大，耗时少。）

1. 透析、稀释和超滤复性法：

这三种方法是最传统也是应用最普遍的蛋白质折叠复性方法，复性活性回收率低，而且难于与杂蛋白分离。透析法耗时长，易形成无活性蛋白质聚集体；超滤法在膜上聚集变性（不可逆变性），易造成膜污染；稀释法（直接加入水或缓冲液，放置过夜，缺点是体积增加较大，变性剂稀释速度太快，不易控制）处理量太大，不利于工业放大。

2. 凝胶过滤层析复性

凝胶过滤层析复性又称体积排阻复性(SEC)，是一种广泛应用的层析技术。与常用的稀释复性法相比，凝胶过滤层析复性能在高的起始蛋白浓度下对蛋白进行复性，活性回收率较高，同时又能使目标蛋白得到一定程度的纯化。

凝胶过滤复性时，除了蛋白质在胶粒中的传质和扩散外，蛋白质与介质之间并不发生其它任何作用。复性过程始终发生在溶液中。蛋白质在伸展状态中，每个蛋白质分子的伸展状态都会有差别，而不同伸展状态的蛋白质分子在凝胶颗粒内部扩散所受到的限制也不相同，有的会扩散入颗粒内部深一些，有的会浅一些，这使不同伸展状态的蛋白质分子达到一定程度的分离，这样蛋白质分子问相互作用的机会就大大减少，从而起到一定抑制凝集的作用；即使发生了部分凝集，凝集的蛋白质会附着在胶粒上，而不随着溶液向下运动，这样后面的变性剂可以赶上凝集的蛋白质，使其重新溶解并变性；并且在凝胶过滤中脲等变性剂脱除得相对较慢，这对有些蛋白质的复性是有利的。

在普通凝胶过滤中，变性剂和还原剂的脱除（？？）虽较稀释复性慢，但变性蛋白质仍会经历变性剂浓度突然变化的过程。脲梯度复性是样品上柱前用复性缓冲液平衡柱子，接着使变性剂浓度递减(如从6M 盐酸胍或8M尿素下降到复性缓冲液中预先确定的变性剂的浓度)。此法为蛋白质复性提供了一个较温和的环境，实现了线性去除变性剂，对高浓度变性蛋白质的复性效果十分显著。对初始浓度为17mg／ml的还原变性溶菌酶，在40min内可以得到高达9O%的活性回收率。此外在脲梯度SEC的基础上发展了pH 和脲浓度双梯度SEC法用于蛋白复性，效果很好。

在SEC复性的基础上设计的连续基质辅助蛋白复性系统能使变性蛋白定量地转换成复性的天然态蛋白。此复性方法能够将复性过程中产生的蛋白聚集体再次复性，使蛋白最大程度地得到回收。伴侣溶剂塞(Chaperon solvent plug)SEC复性法在一定程度上解决了变性蛋白进入柱顶端之前发生沉淀这一问题。此外，抗体、小分子添加剂如L一精氨酸和环糊精等共价结合到SEC固定相上也可能会提高某些蛋白的复性效率，同时又能使这些物质得以重复利用，降低生产成本。

3. 高蛋白浓度下的复性方法：

一个成功的复性过程在于能够在高蛋白浓度下仍能得到较高的复性率。一个方法是把变性蛋白缓慢连续或不连续地加入到复性液中。在两次蛋白加入之间，应有足够的时间间隔使蛋白质折叠通过了易聚集的中间体阶段。这是由于完全折叠的蛋白通常不会与正在折叠的蛋白一起聚集。第二种方法是用温度跳跃策略。变性蛋白在低温下复性折叠以减少聚集，直到易聚集的中间体大都转化为不易聚集的后期中间体后，温度快速升高来促进后期中间体快速折叠为蛋白的天然构象。第三种方法是复性在中等的变性剂浓度下进行，变性剂浓度应高到足以有效防止聚集，同时又必须低到能够引发正确复性。

4. 添加促进剂的复性方法：

包涵体蛋白质折叠复性促进剂的促进作用可以分为：稳定正确折叠蛋白质的天然结构、改变错误折叠蛋白质的稳定性、增加折叠复性中间体的溶解性、增加非折叠蛋白质的溶解性。通常使用的添加剂有：a) 共溶剂：如PEG6000~20000，通过与中间体特异的形成非聚集的复合物，可以阻止蛋白质分子间的相互碰撞机会，减少蛋白质的聚集；

b) 去污剂及表面活性剂：如Trition X-100、CHAPs、磷脂、磺基甜菜碱等对蛋白质复性有促进作用，但它们能与蛋白质结合，很难去除；

c) 氧化-还原剂：对于含有二硫键的蛋白，复性过程中应加入氧化还原体系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等，氧化还原系统通过促进不正确形成的二硫键快速交换反应，提高了正确配对的二硫键的产率；

d) 小分子的添加剂：如盐酸胍或尿素、烷基脲、碳酸酰胺类等，都可阻止蛋白聚集，它们的作用可能为：稳定蛋白的活性状态、降低非正确折叠的稳定性、增加折叠中间体的稳定性、增加解折叠状态的稳定性。e、0.4~0.6M L-Arg：L-Arg能使得不正确折叠的蛋白质结构以及不正确连接的二硫键变得不稳定，使折叠向正确方向进行，可大幅度地提高包涵体蛋白质的折叠效率。

e) 添加分子伴侣和折叠酶：分子伴侣是指能够结合和稳定另外一种蛋白质的不稳定构象，并能通过有控制的结合和释放，促进新生多肽链的折叠、多聚体的装配或降解及细胞器蛋白的跨膜运输的一类蛋白质。折叠酶有二硫键异构酶、脯氨酸异构酶等。分子伴侣和折叠酶都能在体外调节蛋白质的正确折叠，提高蛋白质的合成效率。但这类蛋白在折叠复性后要除去，而且十分昂贵，因此采用可回收利用的方法如固定化法为好。

f) 人工伴侣（new）：为模仿分子伴侣而发展的一种方法：首先，变性蛋白被复性液中的去污剂捕获，形成蛋白-去污剂复合体，复合体的形成抑制了蛋白的聚集，然后加入环糊精从复合体中去除去污剂，使得蛋白质正确折叠。

g) 单克隆抗体（new）：待折叠复性的蛋白质的抗体可有效协助复性，但只限于此蛋白才能获得明显的助折叠作用。

h) 其它：多聚离子化合物如肝素可以促进蛋白质的复性，具有稳定天然蛋白质的作用；甘油可以增加黏度，减少分子碰撞的机会，减少错配以提高复性效率；适量的盐浓度可以降低某些带电基团间的斥力，有利于蛋白质的折叠；辅助因子、短链醇、高渗物等能有效的降低聚集体的形成，对蛋白有稳定的作用。

5. 液相色谱（LC）复性法：

液相色谱是一种最有效的纯化蛋白质的方法，已成为基因重组蛋白质纯化的必不可少的手段，现有报道，疏水相互作用色谱（HIC）、离子交换色谱（IEC）、凝胶排阻色谱（SEC）、亲和色谱（AFC）已成功的对变性蛋白进行了复性。与传统的稀释法和透析法相比，液相色谱复性的优点是：

a) 在进样后可很快的除去变性剂；

b) 由于色谱固定相对变性蛋白质的吸附可明显的减少、甚至完全消除变性蛋白质分子在脱离变性剂环境后的分子聚集，从而避免了沉淀的产生，提高蛋白质复性的质量和活性回收率；

c) 在蛋白质复性的同时，可使目标蛋白质与杂蛋白分离达到纯化的目的，使复性和纯化同时进行；

d) 便于回收变性剂，降低废水处理成本

4种色谱法，SEC的分离效果是LC中最差的，盐酸胍会在IEC柱上保留，与蛋白一起洗脱下来，AFC 使用范围窄、所需时间长、价格昂贵，HIC是其中较为理想的。变性蛋白在HIC上的复性机理为：当蛋白质、变性剂和杂蛋白进入HIC系统后，由于变性剂在柱子上的作用力较弱，变性蛋白质的作用力较强，变性剂首先同变性的蛋白质分离，随流动相一起流出色谱柱，又因HIC固定相能提供较常法高出十至数百倍的能量，在变性蛋白质被HIC固定相吸附的同时瞬时除去以水合状态附着在蛋白质表面和与固定相表面接触区域的小分子，而蛋白质的特定的疏水性氨基酸残基与HIC固定相表面作用以形成区域立体结构，接着形成折叠中间体，随着流动相的不断变化，变性蛋白质不断地在固定相表面上进行吸附-解吸附-再吸附，并在此过程中逐渐被复性，形成与天然蛋白质构象相同的蛋白质，并流出色谱柱。HIC固定相是从高盐溶液中吸附变性蛋白质，且与变性剂瞬时分离，不仅大大降低了蛋白质间的聚集作用，还因固定相在分子水平上为变性蛋白提供里很高的能量，使水化的变性蛋白质瞬时失水，并形成局部结构以利于蛋白质从疏水核开始折叠。HIC在蛋白质复性的同时还能与其它杂蛋白进行很好的分离，且HIC柱便宜、快速，故有很好的发展潜力。

还原剂的去除：

还原剂一般和变性剂的去除一起慢慢的氧化去除，使二硫键慢慢形成。但是由于二硫键的形成并不是蛋白质正确折叠所必须的，可以考虑在变性剂完全去除之后，在去除还原剂使已经按照正确的结构相互接近的巯基间形成正确的二硫键。

常用的氧化方法有：

空气氧化法：在碱性条件下通空气，或者加入二价铜离子，能够取得更好的效果，缺点是不易控制氧化还原电势。

氧化还原电对（redox）：常采用GSSG/GSH，通过调整两者的比例来控制较精确的氧化还原电势，也可以在添加了还原剂如BME、DTT的增溶液中直接加入GSSG,如：5mMGSSG/2mM DTT=GSH/GSSG(1.33/1)。

复性效率及检测：

复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，如牛胰RNA酶有12对二硫键，在较宽松的条件下复性效率可以达到95%以上，而有一些蛋白至今没有发现能够对其进行复性的方法如IL-11，很多蛋白的复性效率只有百分之零点几。一般说来，蛋白质的复性效率在20%左右。影响复性效率的因素有蛋白质的复性浓度，变性剂的起始浓度和去除速度、温度、pH、氧化还原电势、离子强度、共溶剂和其他添加剂的存在与否等。根据具体的蛋白性质和需要，可以从生化、免疫、物理性质等方面对蛋白质的复性效率进行检测。其效果检测方法如下：1. 凝胶电泳：一般可以用非变性的聚丙烯酰胺凝胶电泳可以检测变性和天然状态的蛋白质，或用非还原的聚丙烯酰胺电泳检测有二硫键的蛋白复性后二硫键的配对情况。

2. 光谱学方法：可以用紫外差光谱、荧光光谱、圆二色性光谱（CD）等，利用两种状态下的光谱学特征进行复性情况的检测，但一般只用于复性研究中的过程检测。

3. 色谱方法：如IEX、RP-HPLC、CE等，由于两种状态的蛋白色谱行为不同。

4. 生物学活性及比活测定：一般用细胞方法或生化方法进行测定，较好的反映了复性蛋白的活性，值得注意的是，不同的测活方法测得的结果不同，而且常常不能完全反映体内活性。

5. 黏度和浊度测定：复性后的蛋白溶解度增加，变性状态时由于疏水残基暴露，一般水溶性很差，大多形成可见的沉淀析出。

6. 免疫学方法：如ELISA、WESTERN等，特别是对结构决定簇的抗体检验，比较真实的反映了蛋白质的折叠状态。

注意事项：

1.最适pH值范围为8.0-9.0之间；

2. 温度适宜选择4℃；

3. 复性过程蛋白浓度不宜过大，一般为0.1-0.2mg/mL；

4. 复性时间一般为24-36小时（过夜？）；

5. 低分子化合物如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度；脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺

类等，在非变性浓度下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集；Tris对蛋白质复性有促进作用；EDTA 可以防止蛋白降解；

6. 氧化还原体系，如GSH/GSSG、DTT/GSSG、DTE/GSSG等.；

7. 首先要获得较高纯度的包涵体；

8. 包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施；

9. 透析前后均要离心；

10. 透析不能太快；

11. 纯化的最佳条件要摸索；

12. 包含体要彻底洗涤干净，洗涤液中加入适量Triton-X100；

13. 包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性；

14. 复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h ；

15. 复性率的测定时要据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定

16. TritionX100、SDS这一类去垢剂最后不易去除，在制药行业中一般不允许采用。用Triton洗涤

有些包涵体效果不是很好。包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，改变培养条件，再洗涤包涵体，有时

可以在上柱前已经只剩下3-4条杂带，这样后续的纯化就很方便了。

2.常见问题：

1.对于尿素和盐酸胍该怎么选择?

3.

尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作

用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，

尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用

尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的

包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。

盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰

等缺点。

2. 怎样洗涤包涵体？

通常的洗涤方法一般是洗不干净的，可以先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以

一直稀释到合适的浓度，可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，比通

常的直接洗脱效果好。

3. 8M尿素溶解的包涵体溶液应如何保存?

在4度放置半个月，都没什么问题。在室温放置超过48小时，可能会对目的蛋白有影响，因为尿素在碱性条件下可使一些氨基酸酰基化，所以早些处理BI溶液比较好。

4. 包涵体复性有什么原则？

低浓度，平缓梯度，低温。

5. 复性时的蛋白浓度是？

一般使用浓度为0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白在低浓度时不稳定，很容易变性。

6. 复性中蛋白析出是怎么回事？该怎么处理？

出现蛋白析出，肯定是条件变化太剧烈了。复性应该采取复性液浓度和PH值逐渐变化的方法，例如根据包涵体的溶液成分，每隔1个PH或浓度值配置一种溶液，逐步透析到正常。此外

透析时必须浓度极低，条件温和，使蛋白质能够正确折叠。但是复性的比率应该很低。

若加变性剂尿素可加到2M，盐酸胍可加到1-1.5M；

另外可将甘油浓度增加，范围可在≤30%，且在复性样品中也可加适量甘油。

包涵体的形成以及处理方法

包涵体的形成以及处理方法 1 包涵体形成的原因 (1)表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体L2]。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确配对，过多蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。(2)重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，真核糖蛋白无法糖基化使中问体溶解度下降，导致不溶解包涵体形成]。(3)重组蛋白分泌序列的存在阻碍折叠，导致错误折叠分子的产生。(4)重组蛋白的氨基酸组成，一般来说含硫氨基酸越多越容易形成包涵体。(5)包涵体形成动力学研究表明，包涵体是由部分变性的中阃体聚合而成。因此，任何影响中间体稳定的因素，如pH值(pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体)离子强度和温度都可以引起蛋白聚合反应。(6)在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。(7)有报道认为，丰富的培养基有利于活性蛋白质的表达，当培养条件不佳时，容易形成包涵体? 。 包涵体的处理 包涵体的形成具有有利的一面，也有不利的一面。有利的一面是包涵体的形成去除了几乎全部的细胞内可溶性蛋白质。同时，因包涵体形成避免了蛋白水解酶对表达产物的降解而大大提高产率，通常其表达量可占菌体总蛋白的10％～30％，甚至高达50％。不利的一面是溶解包涵体进行复性折叠的过程中需要加变性剂和去垢剂，而引起蛋白质的不可逆修饰以及性质改变，这些试剂价格昂贵，且复性的操作过程不好控制；另一方面复性过程常伴有蛋白质水解和沉淀，有些还形成异构体【s] 5。因此复性是蛋白质工程中最关键、最复杂的问题。包涵体

的处理一般有如下几个步聚。 破碎细菌细胞 提取包涵体时，首先要裂解细菌，为了防止在裂解细菌的过程中目的蛋白质变性，常常采取一些保护措施：合适的缓冲体系，如磷酸盐缓冲液、Tris缓冲液、柠檬酸缓冲液；加 入保护剂，如还原剂DTT(2一巯基苏糖醇)、2一巯基乙醇；加防止水解酶作用的试剂，如酶的抑制剂、EDTA(乙二胺四乙酸)。破菌的方法很多，主要包括以下几种：(1)渗透破碎法： 这种方法是在低渗条件使细胞溶胀而破碎。(2)冷热交替法：把待碎样品投人90℃左右水中维持数分钟后取出投入冰浴内，可使大部分细胞破碎。可用于提取蛋白质和核酸。 (3)反复冻融法：把待碎样品冷却到一2O℃，冻固后取出，缓慢解冻，如此反复操作，细胞内液结冰膨胀而使细胞胀破导致部分细胞及胞内的颗粒破碎，但也可使生物活性物质失活。这种方法虽简单方便，但对温度变化敏感的蛋白质却不宜采用。(4)超声波法：使用超声波仪使细胞膜上所受张力不均而使细胞破碎。根据不同待碎样品采用不同频率，不同时间；另外，超声波处理时溶液温度升高会使不耐热的物质失活，因此使用时为防止温度升高，除间歇开机外，还需人工降温。避免溶液内存在气泡，这样会使蛋白质变性【6】。(5)溶菌酶处理法：多用于破坏大肠杆菌等微生物的细胞壁。在每毫升含2亿个细胞的悬液中加100 g至1 mg溶菌酶，37℃保温10 min，或者室温作用30 min，细胞就破坏了。 洗涤包涵体 洗涤包涵体前先8 000 r／rain，412离心15 rain，可使大多数包涵体沉淀，

包涵体的纯化和复性总结

板块一、大肠杆菌 （这里讨论的大肠杆菌为非分泌到培养基中的重组蛋白，是否有重组蛋白分泌到培养基中的工程菌我没有见过。） 一、关于菌体的量 大肠杆菌表达的基因工程蛋白是纯化人员最方便获得的原料，对纯化工艺开发来说几乎没有原料方面的限制。常看到有战友用个几毫升的菌液去做纯化，对此我十分不解，同样要做，为什么不多做点呢？很少的菌体会给纯化带来一些难以估计的问题，工艺的重复性和放大往往出现问题。因此，要做个好工艺就多发酵表达一些菌体吧。我做纯化时，初始工艺摸索用的菌体量一般为10g左右。 二、关于是否包涵体表达 包涵体的定义我就不讲了。我要讲的是，一个基因工程蛋白是否是包涵体表达的说法本身就不完全准确。至于包涵体在电镜下的晶体颗粒表现等等对我们纯化来说毫无意义，我相信做纯化工艺的人没有谁去看这个电镜，也不关心。我们判断的依据只是SDS-PAGE，目的蛋白在破菌沉淀中，我们就认为是包涵体表达，但这是一个似是而非的结论。看着没问题，实际上是有毛病的。关键在于你用的是什么破菌缓冲液！有些蛋白在用缓冲液A破菌时是在破菌沉淀中，而用缓冲液B破菌时却在破菌上清中。缓冲液A和B的差别可能只是pH上相差1-2个单位。那么它是包涵体表达还是可溶上清表达呢？ 说这个问题主要在于有些战友往往非常在意他的目标蛋白是否包涵体表达。

甚至还有包涵体表达就用专门的包涵体蛋白纯化方法等等。 我们应该关心的是目标蛋白在什么缓冲体系下是可溶的，在什么缓冲体系下是不溶的！不要让包涵体这个概念给你误导。 三、关于表达量 我们常常在发表的文章上看到，我这个工程菌的目标蛋白的表达量达到菌体总蛋白的30%、50%等等。我要说都是文章的作者在忽悠。不知道他们是如何定量的，用的最多的大概就是SDS-PAGE的扫描分析吧。且不说一个SDS-PAGE不能表现出所有的菌体蛋白，电泳的染色方法、染色脱色强度、照片的曝光强度、扫描分析时的条带选择等等无不对这个百分比影响巨大。在公司的QC部门做的对此应该最有体验，20%的条带要它变成30%又有何难？我的观点是对待表达量的描述不可定量，只能定性。如用：很低、较低、中等、较高、很高等来描述。 有一个指标与表达量密切相关，那就是单位体积的菌体量。两者的乘积才是单位体积发酵液的目标蛋白产率。 与表达量相关的指标还有纯化倍数、纯化收率等，这些指标我们也常常在发表的文章中看到。同样，我也认为都是不准确的。除非你用的是活性测定的方法，用蛋白活性收率来表征。 纯化工艺的难易有时候也与表达量相关，表达量高时往往纯化也方便的多。所以，尽量提高你的目标蛋白表达量不只是基因工程上游和产量的问题，还是纯化工艺开发的问题。 四、菌体破碎

蛋白质复性方法

包涵体表达的蛋白的复性 摘要综述了包涵体形成、包涵体分离和溶解、包涵体折叠复性的方法、复性产率低下的主要因素以及通过分子伴侣、低分子量添加物等的应用而提高了蛋白质复性产率。 关键词包涵体蛋白质复性 Abstract Strategies for decreasing the formation of inclusion bodies, isolation and resolution of inclusion bodies, refolding of inclusion body proteins and the cause of decreased refolding yields were included. Renaturation yield of recombinant protein have been improved by using some additives, such as molecular chaperone, small molecules. Key words inclusion body , protein , renaturation 外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。

一、包涵体： 包涵体的定义、组成与特性： 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为，具有很高的密度（约ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR 等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。[1] 包涵体的形成： 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以

蛋白质复性方法及其注意事项

蛋白质复性方法及其注意事项 蛋白前期准备 (1)査阅U标蛋白相关文献，了解其等电点，标签等注意点。 (2)如果日标蛋白易降解，可在纯化时加l-2mMDTT,全程低温，及时处理. (3 )透析Buffer得选择可参考文献。 蛋白复性 包涵体：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊得生物大分子，它们 致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性得结构称 为包涵体(Indus! on Bod i es? I B)。 在E、co li中累积得重组蛋白会迅速地以包涵体形式被沉淀出来，这些包 涵体蛋白就是丧失生物活性得不可溶得错误折叠蛋白得聚集体. 包涵体得处理一般包括这么儿步:包涵体得洗涤、溶解、纯化及复性。 如果过表达蛋0在包涵体中，那么通常有两个选择可以考虑：(2)退一步/尤化 表达条件；(2)接受包涵体并采取策略来将蛋白溶解以及复性?这里主要考虑第二 种方案。 包涵体得洗涤 破碎细胞都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物 降解，导致天然物质量得减少,加入蛋0酶抑制剂等，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于U得物质得提取。 2mM EDTA, 2mM D 洗涤Buf f e r :50mM T r i s -H CI (pH8、0), TJr 1 5 0 mM NaCI, l%Tn t on X—1 0 0, Img/ml Lwupe p t in^ Img/ml P epstat in, ImM TCER 超声时用40— 6 0 ml裂解液'因为我们得超声仪很适合用1 0 0 ml小烧 杯，装4 0-60m I裂解液，这样能让超声头离液面不高不低，不会洒出来、菌 多就延长超声时间(全程冰浴)? 包涵体得溶解 I、对于尿素与盐酸M得选择: 尿素与盐酸属中强度变性剂，易经透析与超滤除去。它们对包涵体氢键有

包涵体的纯化和复性总结--最全的前人经验

包涵体的纯化和复性总结 二、包涵体的洗涤? 1、包涵体的洗涤问题? 通常的洗涤方法一般是洗不干净的，我以前是这么做的，先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，你可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，我觉得比通常的直接洗脱效果好。? 包涵体一般难溶解，所以你要注意未溶解的部分，你可以跑电泳对比，因为有时候难溶解的就是你的目标蛋白，所以每次处理都要把上清和沉淀跑电泳对比，免得把目标蛋白弄丢了。 此外刚处理完的包涵体好溶解。冷冻后难溶解，溶解也需要长点时间，也需要大量的溶剂。如果说是不少不溶解的不是你要的，那就不用管了。? 2、如何得到比较纯的包涵体? 对于包涵体的纯化，包涵体的前处理是很重要的。 包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和?NP40等加EDTA 和还原剂2-巯基苏糖醇（DTT）、β-巯基乙醇等反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50?mM?NaCL。这样提取的包涵体纯度至少可达50%以上，而且可保持元结构。也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜，使用的还原剂为0.1-5mM。EDTA为0.1-0.3?mM。去垢剂如Triton?X-100、脱氧胆酸盐和低浓度的变性剂如尿素充分洗涤去除杂质,这一步很重要,因为大肠杆菌外膜蛋白Omp?T(37?KDa)在4-8mol/L尿素中具有蛋白水解酶活性,在包涵体的溶解和复性过程中可导致重组蛋白质的降解。? 对于尿素和盐酸胍的选择： 尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素8-10M，盐酸胍6-8M。尿素溶解包涵体较盐酸胍慢而弱，溶解度为70-90%，尿素在作用时间较长或温度较高时会裂解形成氰酸盐，对重组蛋白质的氨基进行共价修饰，但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。 盐酸胍溶解能力达95%以上，且溶解作用快而不造成重组蛋白质的共价修饰。但它也有成本高、在酸性条件下易产生沉淀、复性后除去可能造成大量蛋白质沉淀和对蛋白质离子交换色谱有干扰等缺点。? 包涵体最后的纯化，一般是离子交换，疏水，或者是亲和层析，亲和层析尤其是金属螯合层析用得比较广泛，而纯化的效果也不错，通常是一步就能达到纯度为95%以上的包涵体。? 8M高浓度尿素溶解后离心获得的包涵体溶解液，放在4度冰箱过夜后出现沉淀，这种现象我也在实验中遇到过;开始感觉很奇怪，后来发现是我们的冰箱的温控出了问题实

包涵体复性注意事项和常见问题解析

活性蛋白整体方案包涵体复性注意事项和常见问题解析 包涵体复性注意事项 1)最适pH值范围为8.0-9.0之间； 2)温度适宜选择4℃； 3)复性过程蛋白浓度不宜过大，一般为0.1-0.2mg/mL； 4)复性时间一般为24-36小时； 5)低分子化合物如L-Arg有助于增加复性中间产物的溶解度；脲、盐酸胍、烷基脲、以及碳酸酰胺类等，在 非变性浓度下是很有效的促进剂，都可阻止蛋白聚集；Tris对蛋白质复性有促进作用；EDTA可以防止蛋白降解； 6)首先要获得较高纯度的包涵体； 7)包涵体溶解要彻底，一般应使溶解液体量较大，不要怕蛋白被稀释，要有助溶措施； 8)透析前后均要离心； 9)包含体要彻底洗涤干净，洗涤液中加入适量Triton-X100； 10)包含体溶解后装入透析袋在复性液中复性； 11)复性完毕在低浓度的缓冲液中连续缓慢透析12-24h； 12)复性率的测定时要据变性蛋白和非变性蛋白的光学性质不同测定 13)TritionX100、SDS这一类去垢剂最后不易去除，在制药行业中一般不允许采用。用Triton洗涤有些包涵体 效果不是很好。包涵体洗涤是纯化极为重要的一步，改变培养条件，再洗涤包涵体，有时可以在上柱前已经只剩下3-4条杂带，这样后续的纯化就很方便了。 14)复性时的蛋白浓度一般为0.1-1mg/ml，太高的浓度容易形成聚体沉淀，太低的浓度不经济，而且很多蛋白 在低浓度时不稳定，很容易变性。 包涵体复性常见问题分析 包涵体复性原则 低浓度，平缓梯度，低温。n(O5~0q8D; 怎样洗涤包涵体？ 通常的洗涤方法一般是洗不干净的，可以先把包涵体用6M盐酸胍溶解充分，过滤除去未溶解的物质，注意留样跑电泳，然后用水稀释到4M,离心把沉淀和上清分别跑电泳，如此类推可以一直稀释到合适的浓度，可以找到一个合适去除杂质的办法，其实这就是梯度沉淀的方法，比通常的直接洗脱效果好。 对于尿素和盐酸胍该怎么选择 尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度

包涵体纯化全过程(3)

一、包涵体的纯化和复性总结（二） 二、[ 2008-2-25 14:25:00 | By: 飞鸿 ] 三、关于包涵体的纯化是一个令人头疼的问题，包涵体的复性已经成为生物制药的瓶颈，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，内容比较庞杂 一、菌体的裂解 1、怎样裂解细菌？ 细胞的破碎方法 1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。 4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等

细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 这是标准配方: 裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml 溶菌酶。(溶菌酶在这个pH范围内比较好发挥作用) 但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很粘. protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体. 如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了. 但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间. 沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的loading buffer.loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的. "取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE. 这个方法

重组蛋白包含体的复性

重组蛋白包含体的复性 [摘要]：重组蛋白在大肠杆菌中的高表达往往导致形成包含体。不可溶、无生物活性的包含体必须经过体外变复性才可得到生物活性蛋白。变复性实验是建立在蛋白质体外折叠机制的基础上的。近年来，随着对蛋白质折叠机制的认识，发展了不少促进蛋白折叠和二硫键氧化来提高活性蛋白产率的复性办法。 [关键词]：蛋白折叠、包含体、复性、二硫键形成 Abstract：Expression of recombinant proteins in Escherichia coli often results in the formation of insoluble inclusion bodies. Active protein can be recovered by solubilization of inclusion bodies followed by renaturation of the solubilized protein. The process of renaturation is established in the understanding to the mechanism of protein folding in vitro. In recent years, With the understanding of mechanisms of protein folding, many renaturation methods were developed, which can increase the yield of active proteins. Key word: protein folding、inclusion body 、renaturation 、the forming of disulfide bond 大肠杆菌表达系统以其操作简便，遗传背景清楚，大规模发酵成本低成为目前最常用的外源蛋白表达系统。它为许多具有药用和工业应用价值的真核生物蛋白质的获得提供了方便。但是，重组蛋白的高表达往往导致形成不溶的、没有生物活性的包含体（如人生长激素、人胰岛素和尿激酶）。 包含体的形成意味可溶性重组蛋白质的重大损失，必须经过体外变复性才能得到生物活性蛋白。如果能解决包含体的复性问题，它将是大量生产重组蛋白的最有效的途径之一。近年来对蛋白质折叠过程的深入研究使重组蛋白的体外复性取得了一系列的新进展。文章中，我们在蛋白质折叠机制的基础上，简述了重组蛋白体外复性的研究进展。 1. 蛋白质的体内折叠 细胞内的新生肽链的折叠是分阶段的，从相邻氨基酸的相互作用开始，多肽链的出现引起二级结构的形成，最后形成三级结构。Baldwin综述了蛋白质折叠起始的三种可能因素：疏水作用，二级结构及某些特殊作用力(如二硫键)[1]。实验证明，细胞内二硫键的形成速度要明显快于细胞外，而且在翻译结束之前二硫键也能够形成[2]。 近年来的一些研究表明，很多真核蛋白质的折叠和装配受到其他蛋白或酶的严格调控。在真核细胞中，蛋白可能与分子伴侣（chaperon）或折叠酶（foldase）共表达且表达量很低；也可能进行翻译后修饰分泌出去。现在已知的参与新生肽链折叠的蛋白有两类：一类是催化蛋白特定异构化的酶，限制蛋白质折叠的速度，如催化正确二硫键形成的二硫键异构酶（PDI蛋白）[3]、催化脯氨酸异构反应的脯氨酸顺反异构酶（PPI）[4]等，它们称为折叠酶，另一类辅助蛋白能与多肽链短暂暴露疏水区结合，从而防止不正确的聚集作用和错误的装配，称为分子伴侣。 重组蛋白在大肠杆菌中的折叠环境迥异于它们的天然环境－－真核细胞。蛋白酶、氧化还原电位、PH和蛋白浓度等性质都不同[5]，而且，原核细胞不具备糖基化的功能，也没有

蛋白质、包涵体复性

目录 一、脲和盐酸胍在包涵体蛋白质纯化中的作用 二、包涵体变复性 三、包涵体洗涤纯化——7~10 四、包涵体提出、纯化和复性

一、

二、包涵体变复性 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等。 基本信息 中文名称 包涵体变复性 复性方法 稀释复性 原因 基因工程菌的表达产率过高 包涵体变性 破菌洗涤溶解 目录 1包涵体 2包涵体变性 3包涵体复性 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1μm，具有很高的密度(约1.3mg/mL)，无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。 包涵体的形成原因 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1.基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2.重组蛋白的氨基酸组成:一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 3.重组蛋白所处的环境:发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4.重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。

包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程

包涵体纯化蛋白复性的方法操作流程返回：包涵体复性常见问题分析与解决 包涵体的纯化和复性总结 包涵体折叠复性的方法应具备以下几个特点：较高的活性蛋白质回收率；复性产物易于与错误折叠蛋白质分离；折叠复性后能够得到较高浓度的蛋白；折叠复性方法易于放大等。蛋白复性的过程通常分为以下几个步骤： 包涵体的洗涤 包涵体在溶解之前需要进行洗涤，包涵体中主要含有重组蛋白，但也有一些杂质，如一些外膜蛋白、质粒DNA等，这些杂质会与包涵体粘连在一起，可以通过洗涤去除大多数杂质，但无法将杂蛋白去除干净。 包涵体的洗涤通常选用浓度较低的变性剂，如2M尿素在50mM Tris，pH7.0-8.5，1mM EDTA中洗涤包涵体。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。同时，因为去垢剂的洗涤能力会随溶液离子强度升高而加强，所以在洗涤包涵体时可加入低浓度的尿素或高浓度的NaCl，使包涵体的纯度达到50%以上。 包涵体的溶解 变性剂如尿素、盐酸胍，主要是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白分子间的各种化学键，使多肽延伸。盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能溶解尿素不

溶的包涵体。SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等也可以破坏蛋白内的疏水键，溶解一些包涵体蛋白质。 另外，从某些含有半胱氨酸的蛋白质中分离出的包涵体，通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键，这就还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT）、二硫赤藓糖醇、半胱氨酸等。这种还原性试剂能够同半胱氨酸形成各种二硫化物中间体，也会被复性用的二硫化物置换试剂所取代。二硫键的形成和断裂是可逆的，直到最有利的蛋白二硫键形成，这个平衡才会被破坏。 常用变性剂对比 尿素（8-10M） 较盐酸胍慢而弱，溶解度 为70-90% 用尿素溶解具有不电离，呈中 性，成本低，蛋白质复性后除去不会 造成大量蛋白质沉淀 溶解的包涵体可选用多种色谱 法纯化 盐酸胍（6-8M） 溶解能力达95%以上，且 溶解作用快而不造成重组蛋白 质的共价修饰 成本高、在酸性条件下易产生沉 淀、复性后除去可能造成大量蛋白质 沉淀 对蛋白质离子交换色谱有干扰 包涵体的复性 复性是指通过去除变性剂使目标蛋白从完全伸展的变性状态恢复到正常的折叠结构，同时去除还原剂确保二硫键正常形成。一般在尿素浓度4M左右时复性过程开始，到2M左右时结束；盐酸胍可以从4M开始，到1.5M 时结束。复性方法主要采用稀释复性，透析复性和柱上复性，具体对比如下：

包涵体复性(课堂参照)

我用透析法复性蛋白,但出现了好多沉淀,后面我要用Ni柱来纯化,我现在不知道复性后怎么 处理?把沉淀弃掉吗?谁来帮帮我吧! 我用透析法复性蛋白,但出现了好多沉淀,后面我要用Ni柱来纯化,我现在不知道复性后怎么 处理?把沉淀弃掉吗?谁来帮帮我吧! 首先，可以再多加一点透析液看看能否将之溶掉，这样可以减少由于免疫共沉淀的原因而与杂质一起沉淀的蛋白。 再次如果你的蛋白已经复性，并且能很好的溶解的话，那么沉淀要么是杂质，要么是不能复性的蛋白，我认为可以离心去除。 出现絮状沉淀是很正常的现象，因为透析本身就是一个复性的过程，那些出现絮状的沉淀就是一些不能够复性成为天然结构的一些目的蛋白和一些杂蛋白，而这些都是我们所不需要的。所以说出现絮状沉淀是正常的也是我们希望看到的。 至于出现沉淀的原因不外乎条件变化太剧烈了，建议不要让透析的条件变化太剧烈了，主要是PH的浓度的变化和样品中一些其他东西如尿素的浓度变化。 如果楼主透析样品中出现太多的沉淀，甚至于跑胶中基本没有带了，那么建议楼主换一种透析液来用，如用TGE也就是传说中的万金油来试试，我一直用的是这种透析液，效果很不错。TGE配法如下： 50mM Tris 0.5mM EDTA 50mM Nacl 5%或10％甘油 如果有条件加入1％的甘氨酸或精氨酸和谷胱甘肽会更好些。 沉淀可以拿来重溶，但是重溶的可行性不大，也就是重新溶解的可能性不大 谢谢您们的回答,我再试试.我还想问一下是先过柱后复性还是先复性后过柱那种方法好?我查资料怎么都不一样.还有我纯化的蛋白浓度比较底,能不能浓缩一下,我后面作免疫动物实验,怎样保存蛋白较好?包涵体能放多久不出现问题? 如透析液用TGE的话,一次透析,还是也要分步,要不要调PH或是浓度? 046 wrote: 谢谢您们的回答,我再试试.我还想问一下是先过柱后复性还是先复性后过柱那种方法好?我查资料怎么都不一样.还有我纯化的蛋白浓度比较底,能不能浓缩一下,我后面作免疫动物实验,怎样保存蛋白较好?包涵体能放多久不出现问题? 先过柱後复性。 蛋白浓度较低可以浓缩一下，浓缩方法有很多，简单一点的可以用PEG包埋，就是将蛋白

什么是包涵体

包涵体即表达外源基因的宿主细胞，可以是原核细胞，如大肠杆菌；也可以是真核细胞，如酵母细胞、哺乳动物细胞等。包涵体是病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。多为圆形、卵圆形或不定形。一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成；少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物，不含病毒粒子。 包涵体（inclusion body） 基因工程定义：在某些生长条件下，大肠杆菌能积累某种特殊的生物大分子，它们致密地集聚在细胞内，或被膜包裹或形成无膜裸露结构，这种水不溶性的结构称为包涵体（Inclusion Bodies，IB）。 病毒在增殖的过程中，常使寄主细胞内形成一种蛋白质性质的病变结构，在光学显微镜下可见。多为圆形、卵圆形或不定形。一般是由完整的病毒颗粒或尚未装配的病毒亚基聚集而成；少数则是宿主细胞对病毒感染的反应产物，不含病毒粒子。有的位于细胞质中（如天花病毒包涵体），有的位于细胞核中（如疱疹病毒），或细胞质、细胞核中都有（如麻疹病毒）。有的还具有特殊名称，如天花病毒包涵体叫顾氏（Guarnieri）小体，狂犬病毒包涵体叫内基氏（Negri）小体。 特性 一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，难溶于水，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。 形成 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1、表达量过高，研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。因此有人采用共表达分子伴侣的方法以增加可溶蛋白的比例。 在基因重组技术得到迅速发展之前，研究者就已经发现，细胞内人工引入反常的蛋白质（这些蛋白质可以看作是细胞的外源蛋白质），这些蛋白质会堆积起来形成不溶的形式。这些蛋白质聚集的形态是明显的球形，这些球形的物质全部是蛋白质，并且通过非共价键的作用力形成，必须使用变性剂如十二烷基硫酸钠（SDS）或者盐酸胍才能溶解。自从基因工程的蛋白质在大肠杆菌表达以后，人们逐渐发现这些外源蛋白质基因在细胞中的过量表达同样形成不溶性的状态。

包涵体变性、复性及纯化

一、菌体的裂解 1、怎样裂解细菌？ 细胞的破碎方法 1.高速组织捣碎：将材料配成稀糊状液，放置于筒内约1/3体积，盖紧筒盖，将调速器先拨至最慢处，开动开关后，逐步加速至所需速度。此法适用于动物内脏组织、植物肉质种子等。 2.玻璃匀浆器匀浆：先将剪碎的组织置于管中，再套入研杆来回研磨，上下移动，即可将细胞研碎，此法细胞破碎程度比高速组织捣碎机为高，适用于量少和动物脏器组织。 3.超声波处理法：用一定功率的超声波处理细胞悬液，使细胞急剧震荡破裂，此法多适用于微生物材料，用大肠杆菌制备各种酶，常选用50-100毫克菌体/毫升浓度，在1KG至10KG 频率下处理10-15分钟，此法的缺点是在处理过程会产生大量的热，应采取相应降温措施，时间以及超声间歇时间、超声时间可以自己调整，超声完全了菌液应该变清亮，如果不放心可以在显微镜下观察。对超声波及热敏感的蛋白和核酸应慎用。 4.反复冻融法：将细胞在-20度以下冰冻，室温融解，反复几次，由于细胞内冰粒形成和剩余细胞液的盐浓度增高引起溶胀，使细胞结构破碎。 5.化学处理法：有些动物细胞，例如肿瘤细胞可采用十二烷基磺酸钠（SDS）、去氧胆酸钠等细胞膜破坏，细菌细胞壁较厚，可采用溶菌酶处理效果更好，我用的浓度一般为1mg/ml。无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，加入二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；加入碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，加入苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使这些条件都要适合于目的物质的提取。 这是标准配方: 裂解液：50mM Tris-HCl(pH8.5~9.0), 2mM EDTA, 100mM NaCl, 0.5% Triton X-100, 1mg/ml溶菌酶。(溶菌酶在这个pH范围内比较好发挥作用) 但我个人的经验是:如果你裂解细菌是为了提取蛋白的话,而且蛋白的分子量又小于20kd的话,尽量减少溶菌酶的用量,会引入溶菌酶这种杂蛋白.一般配60ml裂解液用药匙匙柄盛一点就够.判断裂解好坏的标准是,溶液很粘. protocol是10ml-50ml缓冲液(菌体洗涤液,裂解液等)/1g湿菌体. 如果只做一个鉴定,我觉得100-200ml菌就够了. 但凡超声,我都用60ml裂解液,因为我们的超声仪(现代分子生物学实验技术录象里的那种)很适合用100ml小烧杯,装60ml裂解液,这样能让超声头离液面不高不低,不会冒泡泡,也不会洒出来.菌多我就延长超声时间. 沉淀,也就是包涵体沉淀了,如果要上柱纯化,一定要先用4M尿素洗涤一下再用8M尿素溶解.如果不上柱,只是跑跑电泳,可以直接用8M尿素溶解以后,离心取上清,加入适量体积的loading buffer.loading buffer对于包涵体的溶解能力是较弱的. "取200微升菌液，离心后直接加上样buffer，100度3分钟后上样，然后SDSPAGE. 这个方法到底能不能溶解细菌中的包涵体? "

包涵体的复性

外源基因在大肠杆菌中的高表达常常导致包涵体的形成，虽然包涵体具有富集目标蛋白质、抗蛋白酶、对宿主毒性小等优点，但包涵体蛋白质的复性率一般都很低,而分子伴侣、低分子量添加物等在复性过程中的应用及新的复性方法的建立都大大提高了重组蛋白质复性产率。 一、包涵体： 1.1包涵体的定义、组成与特性： 包涵体是指细菌表达的蛋白在细胞内凝集，形成无活性的固体颗粒。一般含有50%以上的重组蛋白，其余为核糖体元件、RNA聚合酶、内毒素、外膜蛋白ompC、ompF和ompA等，环状或缺口的质粒DNA，以及脂体、脂多糖等，大小为0.5-1um，具有很高的密度（约1.3mg/ml），无定形，呈非水溶性，只溶于变性剂如尿素、盐酸胍等。NMR等新技术的应用表明包涵体具有一定量的二级结构，他们可能在复性的启动阶段中具有一定的作用。[1] 1.2包涵体的形成： 主要因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，或环境不适，无法形成正确的次级键等原因形成的。 1.2.1、基因工程菌的表达产率过高，超过了细菌正常的代谢水平，由于细菌的δ因子的蛋白水解能力达到饱和，使之表达产物积累起来。研究发现在低表达时很少形成包涵体，表达量越高越容易形成包涵体。原因可能是合成速度太快，以至于没有足够的时间进行折叠，二硫键不能正确的配对，过多的蛋白间的非特异性结合，蛋白质无法达到足够的溶解度等。 1.2.2、重组蛋白的氨基酸组成：一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关。 1.2.3、重组蛋白所处的环境：发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时容易形成包涵体。 1.2.4、重组蛋白是大肠杆菌的异源蛋白，由于缺乏真核生物中翻译后修饰所需酶类和辅助因子，如折叠酶和分子伴侣等，致使中间体大量积累，容易形成包涵体沉淀。 1.2.5、蛋白质在合成之后，于中性pH或接近中性pH的环境下，其本身固有的溶解度对于包涵体的形成比较关键，即是说，有的表达产率很高，如Aspartase和Cyanase,表达产率达菌体蛋白的30%,也不形成包涵体，而以可溶形式出现。[2] 1.2.6、在细菌分泌的某个阶段，蛋白质分子间的离子键、疏水键或共价键等化学作用导致了包涵体的形成。 1.3包涵体破菌、分离、洗涤及溶解 1.3.1基因工程菌发酵液，经离心浓缩后，可用：机械破碎、超声破碎：单纯超声破碎，在小规模下且菌量较少的情况下效果较好，由于能量传递和局部产热等原因，很难用于大体积细胞悬液的破碎，这样部分未破碎细胞与包涵体混在一起，给后期纯化带来困难。因此，在较大规模纯化时先用溶菌酶破碎细菌的细胞膜，再结合超声破碎方法，可显著提高包涵体的纯度和回收率。以及化学方法破碎使细菌裂解,然后以5000-20000g 15min离心，可使大多数包涵体沉淀，与可溶性蛋白分离。 1.3.2洗涤：为了除去包涵体上粘附的杂质，如膜蛋白或核酸，应用洗涤液洗涤包涵体，通常用低浓度的变性剂,过高浓度的尿素或盐酸胍会使包涵体溶解，如2M尿素在50mM Tris pH7.0-8.5左右,1mM EDTA中洗涤。此外可以用温和去垢剂TritonX-100洗涤去除膜碎片和膜蛋白。[3] 1.3.3溶解：一般用强的变性剂如尿素（6-8M）、盐酸胍（GdnHCl 6M），通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。或用去垢剂，如SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物、Sarkosyl等，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。Kandula Suntha等人用TritonX-100来溶解Zymononas mobilis levansucrase包涵体蛋白。另外，

包涵体的复性总结

包涵体的复性总结 关于包涵体的复性是一个令人头疼的问题，已经成为生物制药的瓶颈，包涵体的复性前期准备工作尤为重要，关于包涵体的处理一般包括这么几步：菌体的破碎、包涵体的洗涤、溶解、复性以及纯化，实验内容比较庞杂、繁琐。 一、菌体的裂解 菌体的破碎方法很多：高速组织捣碎、玻璃匀浆器匀浆、超声波处理法、反复冻融法、化学处理法。无论用哪一种方法破碎组织细胞，都会使细胞内蛋白质或核酸水解酶释放到溶液中，使大分子生物降解，导致天然物质量的减少，不同的菌体蛋白需要加入不同的抑制剂：二异丙基氟磷酸（DFP）可以抑制或减慢自溶作用；碘乙酸可以抑制那些活性中心需要有疏基的蛋白水解酶的活性，苯甲磺酰氟化物（PMSF）也能清除蛋白水解酶活力，但不是全部，而且应该在破碎的同时多加几次；另外，还可通过选择pH、温度或离子强度等，使用这些条件时都要适合于目的物质的提取。 在实验室研究多采用超声波处理法和匀浆器匀浆法。 二、包涵体的洗涤 通常的洗涤方法一般是难以洗干净的，包涵体中主要含有重组蛋白,但也含有一些细菌成分,如一些外膜蛋白、质粒ＤＮＡ和其它杂质。洗涤常用1%以下的中性去垢剂，如Tween、Triton、Lubel和NP40等加EDTA反复多次进行，因去垢剂洗涤能力随溶液离子强度升高而加强，在洗涤包涵体时可加50 mM NaCL。也可用低浓度的盐酸胍或尿素/中性去垢剂/EDTA/还原剂等洗去包涵体表面吸附的大部分不溶性杂蛋白。洗涤液pH以与工程菌生理条件相近为宜。根据不同的菌体选用与之相应的洗涤液，比如：2 M尿素+50mm Tris-HCl+0.2 mM NaCl +1%Triton x-100+2mmEDTA PH8.0，再用缓冲洗涤一次。此外，刚处理完的包含体好溶解，冷冻后难溶解，且溶解时间和比例都会加大。 三、包涵体的溶解 强的变性剂如尿素、盐酸胍，是通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展，SDS、正十六烷基三甲基铵氯化物等去垢剂，可以破坏蛋白内的疏水键，也可溶解一些包涵体蛋白质。另外，对于含有半胱氨酸的蛋白质，分离的包涵体中通常含有一些链间形成的二硫键和链内的非活性二硫键。还需加入还原剂，如巯基乙醇、二硫基苏糖醇（DTT），常用浓度2—10 mm。 另外，尿素和盐酸胍属中强度变性剂，易经透析和超滤除去。它们对包涵体氢键有较强的可逆性变性作用，所需浓度尿素6—8M，盐酸胍5—6M。一般来讲，盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，它能使尿素不能溶解的包涵体溶解，尿素的溶解度为70—90%，而且尿素分解的异氰酸盐能导致多肽链的自由氨基甲酰化，特别是在碱性pH值下长期保温时。但用尿素溶解具有不电离，呈中性，成本低，蛋白质复性后除去不会造成大量蛋白质沉淀以及溶解的包涵体可选用多种色谱法纯化等优点，故目前已被广泛采用。 四、包涵体的复性 包含体的复性是一个非常复杂的过程，除与蛋白质复性的过程控制相关外，还在很大程度上与蛋白质本身的性质有关，有些蛋白非常容易复性，在较宽松的条件

重组蛋白质复性

重组包涵体蛋白质复性 邹平 基因工程技术的发展掀开了人类生命科学研究的崭新篇章，开辟了现代生物工业发展的新纪元。重组DNA技术为大规模生产目标蛋白质提供了可能，E.coli以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低和蛋白表达水平高等优点，是生产重组蛋白的首选表达系统。但外源基因在E.coli中的高表达常常导致包涵体的形成，如何高效地复性包涵体蛋白是基因工程技术面临的一个难题。随着人类基因组计划的完成和蛋白组计划的实施，人们将会更多地面临这一问题的挑战。 一、包涵体蛋白 1、包涵体的形成 包涵体主要是因为在重组蛋白的表达过程中缺乏某些蛋白质折叠的辅助因子，而无法形成正确的次级键等原因形成的；也可能是外源基因合成速度太快，没有足够的时间进行折叠、二硫键不能正确的配对、过多的蛋白间的非特异性结合、蛋白质无法达到足够的溶解度等；重组蛋白质的一级结构也与包涵体形成有关，一般说含硫氨基酸越多越易形成包涵体，而脯氨酸的含量明显与包涵体的形成呈正相关；重组蛋白所处的环境不适，发酵温度高或胞内pH接近蛋白的等电点时易形成包涵体。 2、减少包涵体形成的策略 降低重组菌的生长温度，是减少包涵体形成的最常用的方法。低生长温度降低了无活性聚集体形成的速率和疏水相互作用；细菌生长缓慢溶氧水平低，也可减少包涵体的形成。 在培养重组菌中供给丰富的培养基，创造最佳培养条件，如供氧充足、合适pH等，以减少包涵体的形成。 添加可促进重组蛋白质可溶性表达的生长添加剂，增加细胞的渗透压。 在低的诱导剂条件下培养重组菌，减少重组蛋白表达量，也可减少包涵体的形成。 利用硫氧还蛋白融合表达或与目标蛋白共表达，得到可溶性目的蛋白。筛选合适的宿主菌，使表达的重组蛋白可溶。 3、包涵体破菌、分离、洗涤 常用高压匀化或机械、化学和酶相结合的方法破碎含包涵体的宿主菌细胞 ,再将破碎液通过低速离心或过滤除去可溶蛋白后获得包涵体。包涵体中除了目的蛋白外还含有脂类、脂多糖、核酸和杂蛋白等成分，而这些成分会影响包涵体蛋白的复性，故去折叠前应洗涤包涵体，以去除杂质。 4、包涵体的溶解去折叠 一般用强的变性剂如尿素、盐酸胍，通过离子间的相互作用，打断包涵体蛋白质分子内和分子间的各种化学键，使多肽伸展。盐酸胍优于尿素，因为盐酸胍是较尿素强的变性剂，