谷胱甘肽含量测定

植物生理学模块实验指导

李玲主编

科学出版社

还原型谷胱甘肽含量的测定方法（分光光度计法）

【实验目的】

了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程，学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。

【实验原理】

谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Gly）组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm处具有最大光吸收。因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。

【器材与试剂】

1.实验仪器与用具

研钵、高速冷冻离心机、微量移液枪、离心管、试管、水浴锅、容量瓶（100ml、200ml、1000ml）、分光光度计

2.实验试剂

50g/L三氯乙酸（TCA）溶液（含5mmol/L Na2-EDTA）：称取5g三氯乙酸，用蒸馏水溶解稀释至100ml。再称取186mg Na2-EDTA·2H2O，加入到100ml 50g/L三氯乙酸溶液中溶解。

0.1mol/L磷酸钠溶液缓冲液（pH7.7）：配制方法见附录。

0.1mol/L(pH6.8)磷酸钠缓冲液：配制方法见附录。

4mmol/L二硫代硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）溶液：称取15.8mg DTNB，用0.1mol/L、pH6.8磷酸缓冲液溶解，定容至10ml，混匀，4℃保存。现用现配。

100μmol/L还原型谷胱甘肽标准液：称取3.1mg 还原型谷胱甘肽，加入少量无水乙醇溶解，加蒸馏水定容至100ml。

3.实验材料

同抗坏血酸。

【实验步骤】

1.标准曲线制作

取6支试管，编号，按照表1加入各种试剂，混匀，25℃保温反应10min。以0号管为参比调零，测定显色液在412nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，还原型谷胱甘肽物质的量（μmol）为横坐标，绘制标准曲线。

项目试管号

0 1 2 3 4 5 100μmol/L还原型谷胱甘肽标准液/ml 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0 蒸馏水/ml 1.0 0.8 0.6 0.4 0.2 0 0.1mol/L pH7.7磷酸缓冲液/ml 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 1.0 4mmol/L DTNB试剂/ml 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 0.5 相当于还原型谷胱甘肽物质的量/μmol 0 20 40 60 80 100

2.提取

取材后，称取 2.5g样品置于研钵中，加入5ml经4℃预冷的50g/L三氯乙酸溶液（含5mmol/L Na2-EDTA）,在冰浴条件下研磨成匀浆后，于4℃、12000g离心20min。收集上清液来测定谷胱甘肽含量，测量提取液体积。

3.测定

取1支试管，依次加入1ml蒸馏水、1ml 0.1mol/L 磷酸缓冲液（pH7.7）和0.5ml 4mmol/L DTNB荣毅仁，混匀，即为绘制标准曲线的0号管液。以此溶液作为参比，在波长412nm处对分光光度计进行调零。

另取2支试管，分别加入1ml上清液、1ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH7.7）。向一支试管加入0.5ml 4mmol/L DTNB溶液，另一支试管中加入0.5ml 0.1mol/L磷酸缓冲液（pH6.8），将两支试管置于25℃保温10min。按照制作标准曲线的方法，迅速测定显色液在波长412nm 处的吸光度，分别记作OD s和OD c。重复3次。

【计算结果】

显色反应后，分别记录样品管混合液的吸光度（OD s）和空白对照管反应混合液的吸光度（OD c）。根据吸光度差值，从标准曲线上查出相应的还原型谷胱甘肽量，计算还原型谷胱甘肽含量（μmol/g）。

式中，n为由标准曲线查的的溶液中还原型谷胱甘肽物质的量（μmol）；V为样品提取液总体积（ml）；V s为吸取样品液体积（ml）；m为样品质量（g）。

【注意事项】

1. 在提取样品时，需要沉淀出去蛋白质，以方志蛋白质中所含巯基及相关酶对测定结果的影响。

2.利用本方法还可以测定样品中总谷胱甘肽（GSSG+GSH）和氧化型谷胱甘肽（GSSG）的含量。在谷胱甘肽还原酶（GR）作用下，将GSSG还原成GSH再进行测定和计算。

3. 建议在第一次测定时先做2或3个样品本底对照，如果样品中本底对照和空白对照非

常接近，则说明样品液中不存在干扰物质，可以不再检测样品本底对照。

植物生理学实验课程

《植物生理学实验》课程大纲 一、课程概述 课程名称（中文）：植物生理学实验 （英文）：Plant Physiology Experiments 课程编号：18241054 课程学分：0.8 课程总学时：24 课程性质：专业基础课 前修课程：植物学、生物化学、植物生理学 二、课程内容简介 植物生理学是农林院校各相关专业的重要学科基础课，是学习相关后续课程的必要前提，也是进行农业科学研究和指导农业生产的重要手段和依据。本实验课程紧密结合理论课学习内容，加深学生对理论知识的理解。掌握植物生理学的实验技术、基本原理以及研究过程对了解植物生理学的基本理论是非常重要的。本大纲体现了植物生理学最实用的技术方法。实验内容上和农业生产实践相结合，加强学生服务三农的能力。实验手段和方法上，注重传统、经典技术理论与现代新兴技术的结合，提高学生对新技术、新知识的理解和应用能力。 三、实验目标与要求 植物生理学实验的基本目标旨在培养各专业、各层次学生有关植物生理学方面的基本研究方法和技能，包括基本操作技能的训练、独立工作能力的培养、实事求是的科学工作态度和严谨的工作作风的建立。开设植物生理学实验课程，不仅可以使学生加深对植物生理学基本原理、基础知识的理解，而且对培养学生分析问题、解决问题的能力和严谨的科学态度以及提高科研能力等都具有十分重要的作用。 要求学生实验前必须预习实验指导和有关理论，明确实验目的、原理、预期结果，操作关键步骤及注意事项；实验时要严肃认真专心操作，注意观察实验过程中出现的现象和结果；及时将实验结果如实记录下来；实验结束后，根据实验结果进行科学分析，完成实验报告。 四、学时分配 植物生理学实验课学时分配 实验项目名称学时实验类别备注 植物组织水势的测定3学时验证性 叶绿体色素的提取及定量测定3学时验证性 植物的溶液培养及缺素症状观察3学时验证性 植物呼吸强度的测定3学时设计性 红外CO2分析仪法测定植物呼吸速率3学时设计性选修 植物生长物质生理效应的测定3学时验证性 植物种子生活力的快速测定3学时验证性

植物全氮测定(凯式定氮法)

植物全氮测定（H 2SO 4-H 2O 2消煮、蒸馏、滴定） 试剂配制 (1)浓H 2SO 4(三级，比重1.84)； (2)30%H 2O 2(二级)。 操作步骤 称取通过0.5mm 筛的烘干植物样品0.5×××~1.××××g ，置于250ml 或300ml 的开氏瓶中，先用少量水冲洗粘附在瓶颈上的样品，然后加8~12ml 浓H 2SO 4，摇匀(最好放置过夜)，放在消煮炉上先小火消煮，待H 2SO 4发白烟后再升高温度，当溶液呈均匀的棕黑色时取下。稍冷后趁热加6~10滴H 2O 2，再加热至微沸，消煮约10分钟，稍冷后趁热重复加H 2O 2，再消煮。如此重复共3~5次，每次添加的H 2O 2应逐次减少，消煮到溶液呈无色或清亮后，再加热约10分钟，除去剩余的H 2O 2。取下，冷却。将消煮液定量地转移入100ml 容量瓶中，用水定容。用无磷钾的滤纸过滤到三角瓶中，或放置澄清后供氮、磷、钾的测定。每批消煮的同时进行空白试验，以校正试剂误差。 蒸馏滴定试剂配制 （1）40%NaOH(约10N ）：称取工业用固体氢氧化钠420克，于硬质玻璃烧杯中，加400毫升蒸馏水溶解，不断搅拌，以防止烧杯底角固结，冷却后倒入细颈玻璃瓶或塑料瓶中，加塞放置几天，虹吸出清液，以去CO 2的蒸馏水稀释至1升，加盖橡皮塞。 （2）硼酸－指示剂液：称取硼酸（H 3BO 3）20克加水900毫升稍稍加热溶解之，冷却后，加入混合指示剂（0.099克溴甲酚绿和0.066克甲基红于玛瑙研钵中，加入少量95%酒精，研磨至指示剂完全溶解为止，最后加95%酒精100mL)20毫升，然后以0.1N NaOH 调节溶液至红紫色(PH 约5.0)，最后加水稀释至1000毫升，使用前将溶液混合均匀，贮在塑料瓶中。 （3）0.01N 硫酸标准溶液：先配制0.1N H 2SO 4溶液，标定后稀释10倍。 0.1N H2SO4溶液的配制和标定：在1000毫升蒸馏水中注入浓H 2SO 4 3毫升,然后用标准碱或硼砂标定之。用Na 2CO 3标定，先将标定剂Na 2CO 3（二级或一级，视要求的准确度而定）装在扁形称量瓶中，在160℃烘干2小时以上。用称量瓶称取0.1600~0.2400克烘干的Na 2CO 3 3份,分别放入250毫升三角瓶，溶于约30毫升水中，加1~2滴溴甲酚绿-甲基红混合指示剂，用配好的0.1N 酸溶液滴定至溶液由绿色变为紫红色，煮沸2~3分钟逐尽CO 2，冷却后继续滴定至溶液突变为葡萄酒红色为终点。同时做空白试验。按下式计算酸溶液的当量浓度（NH ），取3次标定结果的平均值。 ) (05300.0)(20000032V V W V V W N H -?=-?= 式中，W---每份滴定所用的Na 2CO 3 重量(克)； V---标定时所用酸溶液的体积(毫升)；V0---空白试验所用酸溶液的体积(毫升) 滴定操作步骤 吸取待测液5.00~10.00ml(含NH 4-N 约1mg)，注入定氮仪的蒸馏瓶中，另备150毫升容量瓶，内加2%的含混合指示剂的H 3BO 3溶液5毫升，然后将三角瓶置于承接管下端，使承接管口离H 3BO 3液面上约4厘米，此后加入40%NaOH 溶液 毫升，蒸馏15分钟左右，蒸馏液体积达50毫升，即可停止蒸馏，取下三角瓶，洗去蒸馏瓶中的废液，以备再度使用。 另将0.01N(或0.02N)H 2SO 4标准溶液装入滴定管中，滴定硼酸溶液中吸收的氨。滴定过程中颜色变化由蓝绿经蓝紫突变为红色即为滴定终点。 结果计算 100W 0.0140)V -N(V %N 0???=分取倍数，全 式中，N---标准酸溶液的当量浓度； V---测定样品时消耗标准酸的体积(ml)； V0---空白试验消耗标准酸的(ml); 0.0140---N 的毫当量(g)； W---烘干称样重(g)。

GSH含量的测定.doc

主要目的： ——测定物质还原性谷胱甘肽（GSH）的含量。 主要原理： 参照 GSH检测分析试剂盒说明书， 5,5 ’–二硫代–双–（2–硝基苯甲酸）能和 谷胱甘肽（GSH）反应产生 2–硝基– 5–巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（ GSSG）， 由于 2–硝基– 5–巯基苯甲酸是一黄色产物，通过测定其在412 nm处的最大吸 收可确定样品中谷胱甘肽的含量用纯化的谷胱甘肽（GSH）抗体包被微孔板，制 成固相抗体，往包被单抗的微孔中加入谷胱甘肽（GSH），再与HRP标记的谷胱甘 肽（ GSH）抗体结合，形成抗体 - 抗原 - 酶标抗体复合物，经过彻底洗涤后加底物 TMB显色。 TMB在 HRP酶的催化下转化成蓝色，并在酸的作用下转化成最终的黄色。颜色的深浅和样品中的谷胱甘肽（GSH）呈正相关。用酶标仪在412 nm波长下测定吸光度（ OD值），通过标准曲线计算样品中谷胱甘肽（GSH）的含量。

实验室签章

一、试剂 ——谷还原性胱甘肽（ GSH）测定试剂盒（南京建成生物研究所） 二、仪器设备 —— 96 孔酶标板 —— UV-Vis 可见多功能酶标 仪——旋涡混匀器——离心机 ——移液枪及其相应量程枪头

三、实验方法 根据试剂盒说明书具体操作步骤如下: 1.上清液的制备：取稀释后的血清或组织匀浆液 mL，加试剂一应用液 2 mL 混匀， 4000 rpm 离心 10 分钟，取上清液 1 mL 进行显色反应。 2.显色反应：空白管中加入 1 mL 试剂一，标准管加入 20μmol/LGSH标准 液 1 mL，测定管加入上步骤得到的上清液 1 mL，然后各管中分别加入mL 试剂 二、试剂三、 mL 试剂四。 3.混匀，室温静置 5 分钟后，在 412 nm处将酶标板空板进行扫描，准确吸 取 mL 各管反应液加入到新的 96 孔板中，酶标仪测定各孔吸光度（ OD值）。 4.血清中 GSH含量计算公式 GSH含量（ mg/L） 测定 OD值 -空白 OD 值 -3 mmol/L） ×标准品浓度（ 20×10 标准 OD值-空白 OD值 ×GSH分子量（ 307）×样本测试前稀释倍数 组织中 GSH含量公式 测定OD值-空白OD值 -3 GSH含量（mg/gprot ）×标准品浓度（20×10 mmol/L） ×GSH分子量（ 307）×样本测试前稀释倍数÷待测组织匀浆液蛋白浓度 （gprot/L ） 参考文献 Lapshina E A, Sudnikovich E J, Maksimchik J Z, et al. Antioxidative enzyme and glutathione S-transferase activities in diabetic rats exposed to long-term ASA treatment [J]. Life sciences, 2006, 79(19): 1804-1811.

植株全氮、全磷、全钾的测定

植株全氮、全磷、全钾的测定 一、待测液的制备（H2SO4—H2O2消煮法） 二、植株全氮的测定（H2SO4—H2O2消煮，蒸馏法） 三、植株全磷的测定（H2SO4—H2O2消煮，钒钼黄比色法） 四、植株全钾的测定（H2SO4—H2O2消煮，火焰光度法 一、待测液的制备（H2SO4—H2O2消煮法） 1 H2SO4—H2O2消煮原理 植物样品在浓H2SO4溶液中，经过脱水、碳化、氧化等一系列的作用后，易分解的有机物则分解，然后再加入H2O2，H2O2在热的浓H2SO4溶液中会分解出新生态氧，具有强烈的氧化作用，可继续分解没被H2SO4破坏的有机物，使有机态氮全部转化为无机铵盐。同时，样品中的有机磷也转化为无机磷酸盐，故可用同一消煮液分别测定N、P、K（植株中K以离子态存在）。 2 主要仪器： 万分之一电子天平、0.5 mm筛、三角瓶（50ml）或消煮管、移液管（5、10ml）+吸耳球、弯颈小漏斗、消煮炉、吸管、漏斗、无磷钾滤纸、容量瓶（100ml） 2 试剂： 浓硫酸（GB T625）：化学纯、比重1.84 30%H2O2（GB 6684）：阴凉处存放 3 操作步骤 称取烘干、磨细的植物样品(过0.5 mm筛)0.19g，置于50ml三角瓶（或消煮管）底部（勿将样品粘附在瓶颈上），加浓硫酸5mL，摇匀（最好放置过夜），瓶口盖一弯颈小漏斗，在电炉上先缓缓加热，待浓硫酸分解冒大量白烟时再升高温度（在消煮炉上先250℃消煮—温度稳定后计时，时间约30min，待浓硫酸分解冒大量白烟时再升高温度至400℃）。消煮至溶液呈均匀的棕黑色时，取下三角瓶，稍冷后提起弯颈漏斗，滴加30%H2O210滴，并不断摇动三角瓶。再加热(微沸)约7-10 min，取下，稍冷后重复滴加30%H2O25~10滴，再消煮。如此反复进行3-5次，每次添加的H2O2应逐次减少，消煮至溶液呈无色或清亮后，再加热5-10min（以赶尽剩余的H2O2)，取下三角瓶冷却，用少量水冲洗漏斗，洗液流入三角瓶中。将消煮液无损地洗入100 ml容量瓶中，用水定容，摇匀。过滤或放置澄清后供氮、磷、钾测定。 二、植株全氮的测定（H2SO4—H2O2消煮，蒸馏法） 1、方法原理 蒸馏过程的反应： （NH4)2SO4 + NaOH → Na2SO + 2NH3 + 2H2O NH3 + H2O → NH4OH NH4OH + H3BO3→ NH4·H2BO3 + H2O 滴定过程的反应： NH4·H2BO3 + H2SO4→（NH4)2SO4 + 2H3BO3 2、主要仪器、试剂 （1）主要仪器：万分之一电子天平、移液枪(2ml)、移液管（5、10ml）、三角瓶（50、150ml）、容量瓶（100、1000ml）、量筒、研钵、酸式滴定管、pH仪、定氮仪 （2）需用的试剂： 40%NaOH溶液（10mol/L氢氧化钠溶液）：称取40g氢氧化钠（GB 629分析纯）溶于100ml水中 硫酸（GB 625—77）：分析纯，0.005mol/L硫酸（将0.01mol/L硫酸标准溶液用水稀释一倍）或0.01mol/L盐酸标准溶液 0.02mol/L硫酸标准溶液：量取浓硫酸（C.R）2.83ml，加蒸馏水稀释至5000ml，此为0.02mol/L的（1/2H2SO4）标准溶液，然后用标准碱或硼砂标定之，将0.02mol/L的（1/2H2SO4）标准溶液用水稀释4倍。 硼酸—指示剂溶液：

植物生理生化测定

2.1.8转基因植株在盐胁迫下的超氧化物歧化酶(SOD)活性测定 将转基因植株与非转基因对照植株继代于含有0.5% NaCl的MS固体培养上进行胁迫培养，培养条件为27±1℃，每天13 h、3000 lux光照。胁迫培养4 w后，取其叶片测定其SOD 活性，每个样品设3次重复，求其平均数，并进行多重比较。 2.1.8.1主要试剂及配方 （1）0.1 mol/l pH 7.8磷酸钠（Na2HPO4-NaH2PO4）缓冲液 A液（0.1 mol/l Na2HPO4溶液）：称取Na2HPO4·12H2O 7.163 g，用少量蒸馏水溶解后定容至200 ml，4℃冰箱中保存备用； B液（0.1 mol/l NaH2PO4溶液）：称取NaH2PO4·2H2O 0.780 g，用少量蒸馏水溶解后定容至50 ml，4℃冰箱中保存备用； 取上述A液183 ml与B液17ml充分混匀后即为0.1 mol/l pH 7.8的磷酸钠缓冲液，4℃冰箱中保存备用。 （2）0.026 mol/l甲硫氨酸（Met）磷酸钠缓冲液 称取甲硫氨酸（C5H11NO2S）0.388 g，用少量0.1 mol/l pH 7.8的磷酸钠缓冲液溶解后，再用相同磷酸钠缓冲液定容至100 ml，现用现配，4℃冰箱中保存可用1～2 d。 （3）7.5 × 10-4 mol/l NBT溶液 称取NBT（C40H30Cl2N10O6）0.153 g，用少量蒸馏水溶解后，定容至250 ml，现用现配，4℃冰箱中保存可用2～3 d。 （4）含1.0 μmol/l EDTA的20 μmol/l核黄素溶液 A液：称取EDTA 0.003 g，用少量蒸馏水溶解； B液：称取核黄素0.075 g，用少量蒸馏水溶解； C液：合并A液和B液，定容至100 ml，此溶液即为含0.1 mmol/l EDTA的2 mmol/l 核黄素溶液，避光保存（可用黑纸将装有该液的棕色瓶包好），4℃冰箱中可保存8～10 d，当测定SOD酶活时，将C液稀释100倍，即为含1.0 μmol/l EDTA的20 μmol/l核黄素溶液。 （5）含2% PVP的0.05 mol/l pH7.8磷酸钠缓冲液 取0.1 mol/l pH7.8的磷酸钠缓冲液50 ml，加入2 g PVP（聚乙烯吡咯烷酮），充分溶解后移入100 ml容量瓶中用蒸馏水定容至刻度，充分混匀，4℃冰箱中保存备用。 2.1.8.2提取及测定方法 （1）称取1.0 g样品叶片于预冷的研钵中，加入4 ml预冷的提取介质（含2% PVP的0.05 mol/l pH7.8磷酸钠缓冲液），冰浴研磨匀浆，转入10 ml离心管，并用提取介质定容至

植物样全氮测定方法

植物全氮的测定 （半微量蒸馏法） 1 适用范围 适合于各种植物样品消煮液中氮的定量。 2 方法原理 植物中的含氮化合物，利用浓硫酸及少量的混合催化剂，在强热高温处理下分解，使氮素转变成NH4+,当加入NaOH呈强碱性，pH超过10时，NH4+全部变为NH3而逸出，经过蒸馏用硼酸液吸收，再用酸标准溶液滴定（溴甲酚绿和甲基红作混合指示剂，其终点为桃红色），由酸标准液的消耗量计算出氨量。 3 试剂 （1）混合催化剂：硫酸钾100g，硫酸铜10g，硒1g，研磨成粉，混合均匀 （2）浓硫酸[1.84g/cm3] （3）10mol/L氢氧化钠溶液：400g氢氧化钠放入1L的烧杯中，加入500mL蒸馏水，冷却后，定容至1L，混匀，储于塑料瓶中。 （4）混合指示剂：溶解0.099g的溴甲酚绿和0.066g甲基红于100mL的乙醇（95%）中。 （5）20g/L H3BO3-指示剂溶液：溶解20g硼酸于950mL的热蒸馏水中，冷后，加入20mL的混合指示剂，稀释成1L。 （6）酸标准溶液〔c（1/2H2SO4）=0.02mol/L〕：先配制〔c（1/2H2SO4）=0.1mol/L〕硫酸溶液，稀释五倍。 4 仪器设备 （1）消煮管 （2）半微量定氮蒸馏器 （3）半微量滴定管 5 操作步骤 （1）样品的消煮 称取烘干、磨碎（0.25mm）植物样0.3000-0.5000g,置于消煮管中，加混合 加速剂1.8g，滴加几滴蒸馏水湿润样品，再加浓硫酸5mL，小心摇匀后， 盖上小漏斗，置消煮炉，400摄氏度消煮一小时。将消煮液洗入50mL容量 瓶中，用水定容，摇匀待测。 （2）蒸馏定氮 检查蒸馏装置是否漏气和管道是否洁净后，吸取定容后的消煮液5.00～ 10.00mL（V2，含NH４-N约1mg），注入半微量蒸馏器的内室。另取150ml 三角瓶，内加5ml 2% H３ＢＯ３-指示剂溶液，放在冷凝管下端，管口置于 H3BO3液面以上3～4cm处，然后向蒸馏器内慢慢加入约3mL 400g/L NaOH溶 液（若为包括硝态氮的待测液，应加约6mL的400g/L NaOH溶液），通入 蒸气蒸馏（注意开放冷凝水，勿使馏出液的温度超过40℃）。待馏出液体 积约达50～60mL时，停止蒸馏，用少量已调节至pH4.5的水冲洗冷凝管末 端。用酸标准溶液滴定馏出液至由蓝绿色突变为紫红色（终点的颜色应和

植物全磷、全氮、全钾的测定方法

一、植物全氮测定 （一）H2SO4-H2O2消煮法 1、适用范围 本方法不包括硝态氮的植物全氮测定,适合于含硝态氮低的植物样品的测定。 2、方法提要 植物中的氮、磷大多数以有机态存在,钾以离子态存在。样品经浓H2SO4和氧化剂H2O2消煮,有机物被氧化分解,有机氮和磷转化成铵盐和磷酸盐,钾也全部释出。消煮液经定容后,可用于氮、磷、钾的定量。采用H2O2为加速消煮的氧化剂,不仅操作手续简单快速,对氮、磷、钾的定量没有干扰,而且具有能满足一般生产和科研工作所要求的准确度。但要注意遵照操作规程的要求操作,防止有机氮被氧化成N2气或氮的氧化物而损失。 3、试剂 （1）硫酸(化学纯,比重1.84); （2）30% H2O2(分析纯)。 4、主要仪器设备。消煮炉，定氮蒸馏器。 5、操作步骤 称取植物样品(0.5mm)0.3～0.5g(称准至0.0002g)装入100ml开氏瓶或消煮管的底部,加浓H2SO45ml,摇匀(最好放置过夜),在电炉或消煮炉上先小火加热,待H2SO4发白烟后再升高温度,当溶液呈均匀的棕黑色时取下。稍冷后加班10滴H2O2(3),再加热至微沸,消煮约7～10min,稍冷后重复加H2O2,,再消煮。如此重复数次,每次添加的H2O2应逐次减少, 消煮至溶液呈无色或清亮后,再加热10min,除去剩余的H2O2。取下冷却后,用水将消煮液无损地转移入100ml容量瓶中,冷却至室温后定容(V1)。用无磷钾的干滤纸过滤,或放置澄清后吸取清液测定氮、磷、钾。每批消煮的同时,进行空白试验,以校正试剂和方法的误差。 6、注释 （1）所用的H2O2应不含氮和磷。H2O2在保存中可能自动分解,加热和光照能促使其分解,故应保存于阴凉处。在H2O2中加入少量 H2SO4酸化,可防止H2O2分解。 （2）称样量决定于NPK含量,健状茎叶称0.5g,种子0.3g,老熟茎叶可称1g,若新鲜茎叶样,可按干样的5倍称样。称样量大时,可适当增加浓H2SO4用量。 （3）加H2O2时应直接滴入瓶底液中,如滴在瓶劲内壁上,将不起氧化作用,若遗留下来还会影响磷的显色。 （二）水杨酸-锌粉还原- H2SO4-加速剂消煮法 1、适用范围 包括销态氮的植物全氮测定,适合于硝态氮含量较高的植物样品的测定。 2、方法原理 样品中的硝态氮在室温下与硫酸介质中的水杨酸作用,生成硝基水杨酸,再用硫代硫酸钠及锌粉使硝基水杨酸还原为氨基水杨酸.然后按 H2SO4-加速剂消煮法进行消煮法进行消煮样品,使样品中全部氮转化为铵盐。 3、试剂 （1）固体Na2S2O3; （2）还原锌粉(AR); （3）水杨酸-硫酸:30g水杨酸溶于1L浓硫酸中。也可以该用含苯酚的浓硫酸:40g苯酚溶于1L浓硫酸中。 4、仪器设备。同上。 5、操作步骤 称取磨细烘干样品(过0.25mm筛)0.1000～0.2000g或新鲜茎叶样品1.000～2.000g,置于100ml开氏瓶或消煮管中,先用水湿润内样品(烘干样),然后加水杨酸-硫酸10ml,摇匀后室温放置30min,加入Na2S2O3约1.5g,锌粉0.4g和水10ml,放置10 min,待还原反应完成后,加入混合加速剂2g,按土壤全氮测定方法进行消煮, 消煮完毕,取下冷却后,用水将消煮液无损地转移入100ml容量瓶中,冷却至室温后定容(V1)。用于滤纸过滤,或放置澄清后吸取清液测定氮。每批消煮的同时,进行空白试验,以校正试剂和方法的误差。 （三）消煮液中铵的定量(凯氏法) 1、适用范围。适合于各种植物样品消煮液中氮的定量。 2、方法原理

植物生理生化指标测定

小黑豆相关生理指标测定 1.表型变化：鲜重、株高、主根长和叶面积 鲜重：取处理好的植株，擦干根和叶表面水分，测量整株植物的重量，每个测6个重复。 株高：取处理好的植株，测量从根和茎分隔处到植株最高点的高度，记录，每个测6个重复。 主根长：取处理好的植株，测量从根和茎分隔处到主根最远点长度，记录，每个测6个重复。 叶面积：取处理好的植株，选择第二节段的叶片，测量叶面积，叶面积测量方法是测每个叶片最宽处长度作为叶的长，测叶片最窄处长度作为叶的宽，叶片长和宽的乘积即为叶表面积。每个测6个重复。 2.总蛋白、可溶性糖、丙二醛（MDA）和H2O2含量测定 样品处理：取0.5g样品（叶片要去除叶脉、根要先用清水清洗干净），速在液氮中冻存，在遇冷的研钵中加液氮研磨，然后加入1.5ml的Tris-HCl（pH7.4）抽提，将抽提液转移到2ml的EP管中，于4℃，12000rpm离心15min，取上清，保存在-20℃下，上清液可用于总蛋白、丙二醛（MDA）、可溶性糖和H2O2含量测定。 总蛋白测定（Bradford法）：样品反应体系（800ul H2O+200ul Bradford+5ul 样品），空白对照为（800ul H2O+200ul Bradford）。测定后带入标准曲线Y=32.549X-0.224(Y代表蛋白含量，X代表OD595)，计算得出蛋白含量。 可溶性糖测定：样品反应体系（1ml蒽酮+180ul ddH2O+20ul样品提取液）；空白对照（1ml蒽酮+180ul ddH2O），测定OD625后带入标准曲线：Y=0.0345X+0.0204(Y代表OD625，X代表可溶性糖含量（ug）) 蒽酮配方：称取100mg蒽酮溶于100ml稀硫酸（76ml浓硫酸+30mlH2O）.注意：浓硫酸加入水中时，一点一点递加，小心溅出受伤。 丙二醛（MDA）测定：在酸性和高温条件下，丙二醛可与硫代巴比妥（TBA）反应生成红棕色的3,5,5-三甲基恶唑2,4-二酮，在532nm处有最大吸收波长，但该反应受可溶性糖的极大干扰，糖与TBA的反应产物在532nm处也有吸收，但其最大吸收波长在450nm处。采用双组分分光光度法，可计算出MDA含量。MDA的计算公式为：MDA（umol/L）=6.45OD532-0.56OD450. 反应体系为：400ul 0.6%TBA+350ul H2O+50ul样品，80℃水浴10min后，测OD532和OD450。对照用Tris-HCl. 0.6%TBA配方：称取硫代巴比妥0.6g，溶于少量1M NaOH中，待其完全溶解后用10%TCA（称取10gTCA三氯乙酸，溶于100ml蒸馏水中，待其溶解即可）定容至100ml。 H2O2测定（二甲酚橙法）：样品反应体系（82ul溶液A+820ul溶液B （A:B=1:10）+150ul样品提取液），30℃水浴30min，测OD560。标准曲线为:Y=0.01734X-0.0555(Y代表OD560，X代表H2O2含量)

谷胱甘肽含量测定

【实验目的】 了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代谢过程，学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。 【实验原理】 谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Gly）组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm处具有最大光吸收。因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。 【器材与试剂】 1.实验仪器与用具 研钵、高速离心机、移液管、离心管、试管、分光光度计 2.实验试剂 还原型谷胱甘肽标准液；偏磷酸溶液；磷酸溶液缓冲液（pH7）；二硫代硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）溶液；蒸馏水。 3.实验材料 小麦叶片 【实验步骤】 1.标准曲线制作 取7支试管，编号，按照下表加入各种试剂，混匀，25℃保温反应10min。以1号管为参比调零，测定显色液在412nm处的吸光度。以吸光度为纵坐标，还原型谷胱甘肽物质的量（μmol）为横坐标，绘制标准曲线。 试管号 试剂（ml） 1 2 3 4 5 6 7 10μg/ml GSH标准液0 0.1 0.2 0.4 0.6 0.8 1.0

蒸馏水 2.0 1.9 1.8 1.6 1.4 1.2 1.0 pH7磷酸缓冲液 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 4.0 DTNB试剂0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 0.4 GSH浓度μg/2ml 0 1 2 4 6 8 10 2.提取 取材后，称取0.2g样品置于研钵中，加入少量5%偏磷酸研磨成匀浆后，定容至6ml, 8000转离心10min。收集上清液来测定谷胱甘肽含量，测量提取液体积。 3.测定 取上清液2ml，显色，操作同标准曲线。重复3次。 显色反应后，分别记录样品管混合液的吸光度和空白对照管反应混合液的吸光度。根据吸光度差值，从标准曲线上查出相应的还原型谷胱甘肽量，计算还原型谷胱甘肽含量（μmol/g）。 4.计算 GSH含量（μmol/g）=（C x×V t）/ （FW×V S） 式中，C x为2ml样品中GSH的含量（μg）；V t为样品提取液总体积（ml）；V s为显色时样品液体积（ml）；FW为样品质量（g）。 【实验结果】 1.标准曲线 试管编号 1 2 3 4 5 6 7 GSH浓度（μg/2ml）0 1 2 4 6 8 10 吸光度值A 0 0.067 0.134 0.314 0.452 0.579 0.723 以GSH浓度（μg/2ml）为横坐标，吸光度值为纵坐标，建立标准曲线。

植株全氮磷钾测定方法

植株全氮的测定 1 主题内容与适用范围 本标准规定了植株全氮测定的硫酸-过氧化氢消煮、碱化后蒸馏定氮的方法。 本标准适用于禾本科植株全氮含量的测定。 2引用标准 GB/T 603 化学试剂试验方法中所用制剂及制品的制备 GB/T6682 分析实验室用水规格和试验方法 NY/T 297-1995 有机肥料全氮的测定 3 方法原理 植株样品用浓硫酸加双氧水消煮，使有机氮转化为铵盐。铵盐经碱化后形成氨，经蒸馏将氨吸收到硼酸溶液中。以甲基红—溴甲酚绿为指示剂，用标准酸滴定，测定植株中的全氮含量（不包括全部硝态氮）。 4 试剂 所有试剂除注明者外，均为分析纯。分析用水应符合GB/T 6682分析实验室用水规格和试验方法三级水的规格。 4.1 硫酸（GB/T 625）。 4.2 30%过氧化氢（GB 6684）。 4.3氢氧化钠：40%，（m/V）溶液 称取40g氢氧化钠（GB 629 分析纯）溶于100mL水中。 4.4硼酸：2%（v/m）溶液 20g硼酸（GB 628）溶于1L约60℃去离子水中，冷却后再用稀碱调节溶液pH至4.5。使用前每升硼酸溶液中加入甲基红-溴甲酚绿混合指示剂20mL，并用稀酸或稀碱调节至微红色，此时该溶液的PH值为4.5。 4.5甲基红-溴甲酚绿混合指示剂 0.5g溴甲酚绿(HG 3-1220)和0.1g甲基红(HG 3-958)于研钵中，加少量95%乙醇研磨至指示剂全溶为止，最后加95%的乙醇至100mL。 4.6硫酸标准液[c（1/2 H2SO4）=0.02mol/L]（GB 601）。 5 仪器 通常实验室仪器和 5.1消煮管：50mL或100mL。 5.2消煮炉或可调电炉：1000W。 5.3弯颈小漏斗：￠2cm。 5.4 凯氏定氮仪：全自动或半自动。 5.5分析天平：感量为0.1mg。 5.6移液管：5，10mL。 6 检试样的制备 取风干的实验室待测样品充分混匀后，按四分法缩减至100g，粉碎，籽粒全部通过0.

植物生理生化指标测定(精)

小黑豆相关生理指标测定 1. 表型变化:鲜重、株高、主根长和叶面积 鲜重 :取处理好的植株,擦干根和叶表面水分,测量整株植物的重量,每个测 6个重复。 株高 :取处理好的植株,测量从根和茎分隔处到植株最高点的高度,记录,每个测6个重复。 主根长 :取处理好的植株,测量从根和茎分隔处到主根最远点长度,记录,每个测6个重复。 叶面积 :取处理好的植株,选择第二节段的叶片,测量叶面积,叶面积测量方法是测每个叶片最宽处长度作为叶的长, 测叶片最窄处长度作为叶的宽, 叶片长和宽的乘积即为叶表面积。每个测 6个重复。 2. 总蛋白、可溶性糖、丙二醛(MDA 和 H2O2含量测定 样品处理:取 0.5g 样品(叶片要去除叶脉、根要先用清水清洗干净 ,速在液氮中冻存,在遇冷的研钵中加液氮研磨,然后加入 1.5ml 的 Tris-HCl (pH7.4 抽提, 将抽提液转移到 2ml 的 EP 管中, 于 4℃, 12000rpm 离心 15min , 取上清, 保存在 -20℃下,上清液可用于总蛋白、丙二醛(MDA 、可溶性糖和 H2O2含量测定。 总蛋白测定(Bradford 法 :样品反应体系(800ul H2O+200ul Bradford+5ul样品 , 空白对照为(800ul H2O+200ul Bradford 。测定后带入标准曲线 Y=32.549X-0.224(Y代表蛋白含量, X 代表 OD595 ,计算得出蛋白含量。 可溶性糖测定:样品反应体系(1ml 蒽酮 +180ul ddH2O+20ul样品提取液 ; 空白对照 (1ml 蒽酮 +180ul ddH2O , 测定 OD625后带入标准曲线 : Y=0.0345X+0.0204(Y代表 OD625, X 代表可溶性糖含量(ug

植物全氮、全磷、全钾含量的测定

实验报告 课程名称：土壤学实验指导老师：倪吾钟成绩：__________________ 实验名称：植物全氮、全磷、全钾含量的测定 同组学生姓名：余慧珍 一、实验目的和要求 二、实验内容和原理 三、实验材料与试剂四、实验器材与仪器 五、操作方法和实验步骤六、实验数据记录和处理 七、实验结果与分析八、讨论、心得 一、 实验目的和要求 1. 掌握植物样品消煮液制备方法； 2. 掌握植物全氮、磷、钾的测定与结果分析。 二、 实验内容和原理 1. 植物样品消煮——H 2SO 4-H 2O 2消煮法 在浓H 2SO 4溶液中，植物样品经过脱水、碳化、氧化等作用后，易分解的有机物则分解。再加入H 2O 2 ，H 2O 2在热浓H 2SO 4溶液中会分解出新生态氧，具有强烈的氧化作用，可继续分解没被H 2SO 4破坏的有机物，使有机态氮全部转化为无机铵盐。同时，样品中的有机磷也转化为无机磷酸盐，植株中K 以离子态存在。故可用同一消煮液分别测定N 、P 、K 。 2. 植株全氮的测定——靛酚蓝比色法 经消煮待测液中氮主要以铵态氮存在，被测物浸提剂中的NH 4+，在强碱性介质中与次氯酸盐和苯酚反应，生成水溶性染料靛酚蓝，其深浅与溶液中的NH 4+－N 含量呈正比，线性范围为0.05-0.5mg/l 之间。 3. 植株全磷的测定——钒钼黄比色法 经消煮待测液中磷主要以磷酸盐存在，在酸性条件下，正磷酸能与偏钒酸和钼酸发生反应，形成黄色的三元杂多酸—钒钼磷酸[1]。溶液黄色稳定，黄色的深浅与磷的含量成正相关。 4. 植株全钾的测定——火焰光度计法 消煮待测液中难容硅酸盐分解，从而使矿物态钾转化为可溶性钾。待测液中钾主要以钾离子形式存在，用酸溶解稀释后即可用火焰光度计测定。

GSH-Px活力的测定SOP

主要目的： ——测定物质谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px ）活力。 主要原理： ——谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px ）可以促使过氧化氢（H 2O 2）与还原性谷胱甘肽（GSH ）反应生成H 2O 及氧化性谷胱甘肽（GSSG ）,谷胱甘肽过氧化物酶的活力可用其酶促反应的速度来表示，测定此酶促反应中还原型谷胱甘肽的消耗，则可求出酶的活力。 H 2O 2+2GSH 2H 2O+GSSG GSH-Px 的活力以催化GSH 的反应速度来表示，由于这两个底物在没有酶的条件下，也能进行氧化还原反应（称为非酶促反应），所以最后计算此酶活力时必须扣除非酶促反应引起的GSH 减少的部分。而GSH 含量的测定可以跟据GSH 和二硫代二硝基苯甲酸作用生成5-硫代二硝基苯甲酸阴离子呈现较稳定的黄色，在412nm 处测其吸光度即可计算出 实验室签章 GSH-Px

一、试剂 ——谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）测定试剂盒（南京建成生物研究所） 二、仪器设备 ——96孔酶标板 ——UV-Vis可见多功能酶标仪 ——旋涡混匀器 ——离心机 ——水浴锅 ——移液枪及其相应量程枪头

三、实验方法 根据试剂盒说明书具体操作步骤如下: 1. 非酶管和酶管各加入1 mmol/LGSH 0.2 mL ，酶管加入稀释后的待测血清和组织匀浆液0.2 mL ，37 oC 水浴预温5分钟，酶管和非酶管分别加入试剂一应用液0.1 mL ，37 oC 水浴准确反应5分钟，酶管和非酶管分别加入试剂二应用液2 mL ，同时非酶管加入待测细胞上清液0.2 mL 。混匀，3500-4000转/分，离心10分钟，取上清1 mL 作显色反应。 2. 空白管加入1 mL GSH 标准品溶剂应用液，标准管加入1 mL 20 μmol/LGSH 标准液，非酶管和酶管各加入上一步骤1 mL 上清液，然后空白管、标准管、非酶管和酶管各加入1 mL 试剂三应用液，0.25 mL 试剂四应用液和0.05 mL 试剂五应用液。 3. 混匀，室温静置15分钟后，在412 nm 处将酶标板空板进行扫描，准确吸取 0.2 mL 各管反应液加入到新的96孔板中，酶标仪测定各孔吸光度（OD 值）。 4. 血清中GSH-Px 活力计算公式 GSH-Px 活力（U/mgprot ）--OD = 非酶管值酶管OD 值标准管OD 值空白管OD 值 ×标准品浓度（20 μmol/L ）×稀释倍数 组织中GSH-Px 活力计算公式 GSH-Px 活力（U/mgprot ） --OD =非酶管值酶管OD 值标准管OD 值空白管OD 值×标准品浓度×min 稀释倍数（5）反应时间（5) ÷[取样量（0.2 mL ）×待测组织蛋白浓度（mgprot/ mL ）] 参考文献 Oliveira Lazarin M, Ishii-Iwamoto E L, Yamamoto N S, et al. Liver mitochondrial function and redox status in an experimental model of non-alcoholic fatty liver disease induced by monosodium L-glutamate in rats [J]. Experimental and molecular pathology, 2011, 91(3): 687-694.

植物样品全氮磷钾测定

植株全氮、磷、钾测定方法 一、植物全氮测定 （一）H2SO4-H2O2消煮法 1、适用范围 本方法不包括硝态氮的植物全氮测定,适合于含硝态氮低的植物样品的测定。 2、方法提要 植物中的氮、磷大多数以有机态存在,钾以离子态存在。样品经浓H2SO4和氧化剂H2O2消煮,有机物被氧化分解,有机氮和磷转化成铵盐和磷酸盐,钾也全部释出。消煮液经定容后,可用于氮、磷、钾的定量。采用H2O2为加速消煮的氧化剂,不仅操作手续简单快速,对氮、磷、钾的定量没有干扰,而且具有能满足一般生产和科研工作所要求的准确度。但要注意遵照操作规程的要求操作,防止有机氮被氧化成N2气或氮的氧化物而损失。 3、试剂 （1）硫酸(化学纯,比重; （2）30% H2O2(分析纯)。 4、主要仪器设备。消煮炉，定氮蒸馏器。 5、操作步骤 称取植物样品(称准至装入100ml开氏瓶或消煮管的底部,加少量水润湿，加浓H2SO45ml,摇匀(最好放置过夜),盖上弯劲漏斗，在电炉或消煮炉上先小火加热,待H2SO4发白烟后再升高温度,当溶液呈均匀的棕黑色时取下。稍冷后加1-5滴H2O2(3),再加热至微沸,消煮约7～10min,稍冷后重复加H2O2,,再消煮。如此重复数次,每次添加的H2O2应逐次减少, 消煮至溶液呈无色或清亮后,再加热10min,除去剩余的H2O2。取下冷却后,用水将消煮液无损地转移入100ml容量瓶中,冷却至室温后定容(V1)。每批消煮的同时,进行空白试验,以校正试剂和方法的误差。

6、注释 （1）所用的H2O2应不含氮和磷。H2O2在保存中可能自动分解,加热和光照能促使其分解,故应保存于阴凉处。在H2O2中加入少量H2SO4酸化,可防止H2O2分解。 （2）称样量决定于NPK含量,健状茎叶称,种子,老熟茎叶可称1g,若新鲜茎叶样,可按干样的5倍称样。称样量大时,可适当增加浓H2SO4用量。 （3）加H2O2时应直接滴入瓶底液中,如滴在瓶劲内壁上,将不起氧化作用,若遗留下来还会影响磷的显色。 （4）上机分析准备的试剂 指示剂溶液：取10ml指示剂储备液加入500ml容量瓶，加入4ml磷酸盐缓冲液。用蒸馏水定容。在分析前一天准备此试剂。（一般1L能分析200个样品） 4mol/LNaOH :在蒸馏水中溶解80g氢氧化钠并稀释定容至500ml.（一般1L能分析200个样品） 1000ppm N储备液;在1000ml容量瓶中溶剂氯化铵，并稀释定容。 分析标线梯度：0、5、10、15、20、25ppm （二）水杨酸-锌粉还原- H2SO4-加速剂消煮法 1、适用范围 包括销态氮的植物全氮测定,适合于硝态氮含量较高的植物样品的测定。 2、方法原理 样品中的硝态氮在室温下与硫酸介质中的水杨酸作用,生成硝基水杨酸,再用硫代硫酸钠及锌粉使硝基水杨酸还原为氨基水杨酸.然后按H2SO4-加速剂消煮法进行消煮法进行消煮样品,使样品中全部氮转化为铵盐。 3、试剂

植物生理指标检测方法

植物组织中可溶性糖含量的测定 在作为营养物质主要是指可溶性糖和淀粉。它们在营养中的作用主要有：合成纤维素组成细胞壁；转化并组成其他有机物如核苷酸、核酸等；分解产物是其他许多有机物合成的原料，如糖在呼吸过程中形成的有机酸，可作为NH 3 的受体而转化为氨基酸；糖类作为呼吸基质，为作物的各种合成过程和各种生命活动提供了所需的能量。由于碳水化合物具有这些重要的作用，所以是营养中最基本的物质，也是需要量最多的一类。 Ⅰ蒽酮法测定可溶性糖 一、原理 糖在浓硫酸作用下，可经脱水反应生成糠醛或羟甲基糠醛，生成的糠醛或羟甲基糠醛可与蒽酮反应生成蓝绿色糠醛衍生物，在一定范围内，颜色的深浅与糖的含量成正比，故可用于糖的定量测定。 该法的特点是几乎可以测定所有的碳水化合物，不但可以测定戊糖与己糖含量，而且可以测所有寡糖类和多糖类，其中包括淀粉、纤维素等（因为反应液中的浓硫酸可以把多糖水解成单糖而发生反应），所以用蒽酮法测出的碳水化合物含量，实际上是溶液中全部可溶性碳水化合物总量。在没有必要细致划分各种碳水化合物的情况下，用蒽酮法可以一次测出总量，省去许多麻烦，因此，有特殊的应用价值。但在测定水溶性碳水化合物时，则应注意切勿将样品的未溶解残渣加入反应液中，不然会因为细胞壁中的纤维素、半纤维素等与蒽酮试剂发生反应而增加了测定误差。此外，不同的糖类与蒽酮试剂的显色深度不同，果糖显色最深，葡萄糖次之，半乳糖、甘露糖较浅，五碳糖显色更浅，故测定糖的混合物时，常因不同糖类的比例不同造成误差，但测定单一糖类时，则可避免此种误差。 糖类与蒽酮反应生成的有色物质在可见光区的吸收峰为 620 nm ，故在此波长下进行比色。 二、实验材料、试剂与仪器设备 （一）实验材料 任何植物鲜样或干样。 （二）试剂 1. 80 ％乙醇。 2. 葡萄糖标准溶液（100 μg/mL ）：准确称取100 mg 分析纯无水葡萄糖，溶于蒸馏水并定容至100 mL ，使用时再稀释 10 倍（ 100 μg/mL ）。 3 ．蒽酮试剂：称取 1.0 g 蒽酮，溶于 80% 浓硫酸（将 98% 浓硫酸稀释，把浓硫酸缓缓加入到蒸馏水中） 1000 mL 中，冷却至室温，贮于具塞棕色瓶内，冰箱保存，可使用 2 ～ 3 周。 （三）仪器设备 分光光度计，分析天平，离心管，离心机，恒温水浴，试管，三角瓶，移液管（ 5 、 1 、0.5 mL ），剪刀，瓷盘，玻棒，水浴锅，电炉，漏斗，滤纸。 三、实验步骤 1. 样品中可溶性糖的提取称取剪碎混匀的新鲜样品0.5 ～ 1.0 g （或干样粉末 5 ～100 mg ），放入大试管中，加入15 mL 蒸馏水，在沸水浴中煮沸20 min ，取出冷却，过滤入100 mL 容量瓶中，用蒸馏水冲洗残渣数次，定容至刻度。 2. 标准曲线制作取 6 支大试管，从 0 ～ 5 分别编号，按表 24-1 加入各试剂。 表 24-1 蒽酮法测可溶性糖制作标准曲线的试剂量 将各管快速摇动混匀后，在沸水浴中煮10 min ，取出冷却，在620 nm 波长下，用空白调零测定光密度，以光密度为纵坐标，含葡萄糖量（ μg ）为横坐标绘制标准曲线。 3 ．样品测定取待测样品提取液 1.0 mL 加蒽酮试剂 5 mL ，同以上操作显色测定光密度。重复 3 次。

谷胱甘肽含量测定

植物生理学模块实验指导 玲主编 科学 还原型谷胱甘肽含量的测定方法（分光光度计法） 【实验目的】 了解植物组中中抗坏血酸-谷胱甘肽循环代过程，学习还原型谷胱甘肽含量的测定原理和方法。 【实验原理】 谷胱甘肽是有谷氨酸（Glu）、半胱氨酸（Gly）组成的天然三肽，是一种含巯基（—SH）的化合物，广泛存在于动物组织、植物组织、微生物和酵母中。谷胱甘肽能和5,5’-二硫代-双-（2-硝基苯甲酸）（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）反应产生2-硝基-5-巯基苯甲酸和谷胱甘肽二硫化物（GSSG）。2-硝基-5-巯基苯甲酸为一黄色产物，在波长412nm处具有最大光吸收。因此，利用分光光度计法可测定样品中谷胱甘肽的含量。 【器材与试剂】 1.实验仪器与用具 研钵、高速冷冻离心机、微量移液枪、离心管、试管、水浴锅、容量瓶（100ml、200ml、1000ml）、分光光度计 2.实验试剂 50g/L三氯乙酸（TCA）溶液（含5mmol/L Na 2 -EDTA）：称取5g三氯乙酸，用蒸馏水溶 解稀释至100ml。再称取186mg Na 2-EDTA·2H 2 O，加入到100ml 50g/L三氯乙酸溶液中溶解。 0.1mol/L磷酸钠溶液缓冲液（pH7.7）：配制方法见附录。 0.1mol/L(pH6.8)磷酸钠缓冲液：配制方法见附录。 4mmol/L二硫代硝基苯甲酸（5,5’-dithiobis-2-nitrobenoic acid，DTNB）溶液：称取15.8mg DTNB，用0.1mol/L、pH6.8磷酸缓冲液溶解，定容至10ml，混匀，4℃保存。现用现配。