文档库

最新最全的文档下载
当前位置:文档库 > 实验二 质粒DNA的提取及酶切(板书)

实验二 质粒DNA的提取及酶切(板书)

实验二质粒DNA的提取及酶切

(8学时,6小时)

一、实验目的:通过本实验学习和掌握碱裂解法提取和酶切质粒的技术与方法。

二、实验原理:碱裂解法提取质粒是根据共价闭合环状质粒DNA与线性染色体DNA之间在拓扑学上的差异而达到分离目的。环状闭合的质粒DNA在限制性内切酶的作用下成为线状质粒DNA,内切酶能识别DNA分子中某一特定的核苷酸序列。

三、仪器、材料、试剂

(一)仪器:1、恒温摇床2、台式离心机3、高压灭菌锅4、振荡器

(二)材料:1、含PUC-18质粒的大肠杆菌2、乙二胺四乙酸(EDTA)

3、三羟甲基氨基甲烷(Tris) 4.葡萄糖 5.氢氧化钠(NaOH) 6.十二烷基硫酸钠(SDS) 7、乙酸钾(KAc) 8、冰醋酸(HAc) 9、盐酸(HCl) 10、Tris饱和酚11、氯仿12、异戊醇13、乙醇1

4、胰RNA酶1

5、氨苄青霉素

16、离心管

(三)试剂:1、溶液І (pH8.0) 2、溶液Ⅱ3、溶液Ш4、TE缓冲液(pH8.0)

5、0.5mol/LEDTA

6、氯仿:异戊醇(V:V=24:1)

7、Tris饱和酚:氯仿:异戊醇(V:V:V=25:24:1)

8、70%乙醇

9、胰RNA酶10、ECOR I酶

四、实验步骤

(一)质粒DNA的提取

1、先在3mL LB液体培养基中加入3uL羧苄青霉素(终浓度50ug/mL),然后接入一个含puc-18质粒的大肠杆菌单菌落,37℃震荡培养过夜。

2、取过夜培养的菌液1mL加入1.5mL离心管中,4000r/min,倒出培养液,将所有菌体细胞收集在一个离心管中。

3、加入100µl溶液І于含菌体细胞的小指管中,旋涡震荡将细菌沉淀悬浮,室温

放置10min。

4、加入200µl溶液Ⅱ(新鲜配置),轻轻混匀内容物,溶液逐渐变清亮后加入溶液

Ш(千万不可用旋涡震荡器,裂解时间不超过5min)。

5、加入150µl溶液Ш(冰上预冷),盖紧管口,轻轻混匀数次。冰上放置15min

让质粒DNA复性(千万不可用旋涡震荡器)。

6、12000r/min离心10min,将上清转至另一1.5mL离心管中。

7、向上清中加入等体积饱和酚:氯仿:异戊醇溶液,旋涡混匀,12000r/min离

心5min,将上清转至另一1.5mL小指管中。(注意用枪取,记着取多少)8、向上清中加入等体积氯仿:异戊醇,旋涡混匀,12000r/min离心5min,将上

清转移到另一个1.5mL离心管中。

9、向上清中加入2倍体积无水乙醇,旋涡混匀后,室温放置30min。12000r/min

离心10min,吸去上清液。

10、用200µl 70%乙醇洗涤质粒DNA沉淀1次(12000r/min离心5min),吸去上清液,空气中干燥。

免费下载Word文档免费下载: 实验二 质粒DNA的提取及酶切(板书)

(共2页)