牛布鲁氏菌A19突变株的构建及在BALBc鼠中的免疫保护评估.
微生物学报Acta Microbiologica Sinica 53(11):1213－1220;4November 2013ISSN 0001－6209;CN 11－1995/Q http ://journals．im．ac．cn /actamicrocn
基金项目:自治区高新技术研究发展计划(200911109);国家科技支撑项目(2012BAD13B03);2012年新疆维吾尔自治区博士后资助;农业部公益性行业专项(201103008)
*
通信作者。Tel /Fax :+86-
991-4844713;E-mail :yyyzqok@aliyun．com 作者简介:易新萍(1970－)，女，湖北公安人，博士，主要从事布病诊断技术及疫苗研制。E-mail :yxp0925@sina．com 收稿日期:2013-03-
14;修回日期:2013-05-10牛布鲁氏菌A19突变株的构建及在BALB /c 鼠中的免疫保护评估
易新萍1，叶锋1，姚刚2，谷文喜1，马晓菁1，吴冬玲3，钟旗
1*
1新疆畜牧科学院兽医研究所，乌鲁木齐8300002新疆农业大学动物医学学院，乌鲁木齐
830052
3
新疆天康畜牧生物技术股份有限公司，乌鲁木齐
830032
摘要:【目的】构建牛布鲁氏菌A19-ΔVirB12突变株并免疫BALB /c 鼠，初步评估了其免疫保护效果。【方法】应用PCR 方法扩增A19疫苗株VirB12基因的上下游同源臂序列，构建重组质粒pBK-CMV-SacB-VirB12，将该质粒电击转化至布鲁氏菌A19感受态细胞中，筛选得到布鲁氏菌疫苗株A19的VirB12基因缺失株。以A19疫苗株为参照，应用A19-ΔVirB12疫苗接种BALB /c 小鼠，免疫45d 后布鲁氏菌2308强毒株攻毒，攻毒15d 后取BALB /c 鼠的脾脏进行克脾指数测定和病理组织学检测。Western-blotting 鉴定VirB12蛋白的免疫反应性。【结果】构建了牛布鲁氏菌A19-ΔVirB12突变株，小鼠免疫攻毒后15d ，A19-ΔVirB12免疫组和A19免疫组的克脾指数与对照组之间有显著性差异(P ＜0.05)。A19免疫组与A19-ΔVirB12免疫组之间克脾指数差异不显著(P ＞0.05)。Western blotting 实验表明VirB12蛋白具有免疫反应性。【结论】牛布鲁氏菌A19-ΔVirB12突变株与亲本株A19免疫保护性无明显差异，通过血清学方法可区分疫苗免疫与野生型牛种布鲁氏菌(Brucella abortus )感染动物，具备作为标记疫苗的潜力。关键词:牛布鲁氏菌，A19-ΔVirB12突变株，同源重组，免疫保护中图分类号:S855.12
文献标识码:A
文章编号:0001-6209(2013)11-1213-08布鲁氏菌病(Brucellosis ，简称布病)是由布鲁氏菌(Brucella )感染引起的人兽共患传染病。布病不仅对畜牧业生产造成巨大的经济损失，同时因其可以感染人类，也严重危害了社会公共卫生安全［1］
。近年来，国内外布鲁氏菌病疫情呈上升趋势，引起各
国的广泛关注
［2］
。人主要通过直接或间接接触患
病动物而感染布病，在正确诊断和捕杀患病动物切
断传染源的基础上，动物接种疫苗是公认的能够降低畜间布病发生和传播的最实际、最有效的方法之一
［3］
。因此，布病疫苗的研制一直是布病防控的主
要研究热点。
布鲁氏菌为胞内寄生菌，抗生素对其效果甚微，机体的细胞免疫对抑制布病有至关重要的作用
［4］
。
布病疫苗主要分为灭活疫苗、弱毒活疫苗和突变株
Xinping Yi et al．/Acta Microbiologica Sinica(2013)53(11)
疫苗。其中弱毒活疫苗应用最广泛。我国动物布病防控的主要策略是检疫-扑杀和疫苗免疫接种相结合，现阶段所用疫苗主要有流产布鲁氏菌疫苗株A19、猪布鲁氏菌疫苗株S2和羊布鲁氏菌疫苗株M5。过去几十年来，这些疫苗为动物布病控制提供了重要保障，但也存在毒力较强，可造成部分怀孕母畜流产;无法区分疫苗免疫和自然感染等缺点。为了鉴别自然感染与疫苗免疫接种引起的免疫应答，通过分子生物学技术对布鲁氏菌进行遗传改造而获得具有分子标记的疫苗株是一种有效的途径［5－6］。国内外研究者对牛型布鲁氏菌19号疫苗进行遗传改造，构建了具有分子标记的A19突变株［7－10］，但对这些A19突变株的实际应用未见进一步研究报道。
IV型分泌系统(T4SS)是布鲁氏菌的重要毒力因子，它是由12个不同VirB蛋白构成的贯穿细菌壁和外膜的复合体，分别为VirB1-12［11］。研究表明，VirB与布鲁氏菌在宿主细胞内生存、复制、免疫应答有关［12－14］，研究表明VirB12蛋白可作为一种布鲁氏菌血清学检测标记抗原［15］。本研究应用同源重组方法敲除了布鲁氏菌IV型分泌系统中VirB12基因，获得A19缺失VirB12基因的突变株，即A19-ΔVirB12突变株。以布鲁氏菌VirB12蛋白作为标记抗原来区分布鲁氏菌病疫苗免疫和自然感染的目的，并在动物模型上验证该突变株的安全性和免疫效果，以期为布鲁氏菌病的防治提供技术支持。
1材料和方法
1.1材料
1.1.1菌株和质粒:
实验中使用的菌株和质粒见表1。
表1．本研究使用的菌株和质粒
Table1．Strains and plasmids in this study
No．Strain or plasmid Description Source
1pGEM-TEasy Vector Cloning vector Promega Company
2pIB279Containing SacB plasmid Academy of Military Medical Sciences 3pBK-CMV Suicide plasmid Strata gene Biotech Company
4DH5a Escherichia coli competent cells Dingguo Biotech Company of Beijing 5A19Brucella abortus strain Institute of Veterinary Drug Control 62308Brucella abortus strain Institute of Veterinary Drug Control
1.1.2主要试剂:Brucella Broth培养基和Brucella Agar 培养基购自美国BD公司，培养基配方参照文献［16］;Taq酶、dNTP、PCR mix购自北京庄盟生物技术有限公司;限制性内切酶购自Fermentas公司;质粒提取和胶回收试剂盒购自Promega公司。布鲁氏菌抗原购自中国疾病预防控制中心传染病研究所;氨苄青霉素、卡那霉素购自Sigma公司。
1.1.3实验动物:BALB/c雌鼠购自新疆实验动物研究中心，许可证号:SCXK(新)2003－0002。BALB/c雌鼠饲养于新疆天康畜牧生物技术股份有限公司三级生物安全实验室的负压隔离笼具中。1.2引物
根据Brucella abortus的VirB12基因(ORF12)序列(GenBank，AF226278)和SacB基因序列(GenBank，NC-000964)设计相应的引物，见表2．
1.3自杀质粒构建
以A19基因组为模板，以VirB12-S-F和VirB12-S-R为引物PCR扩增布鲁氏菌VirB12基因上游同源臂;以VirB12-X-F和VirB12-X-R为引物PCR扩增VirB12基因下游同源臂;以pIB279质粒(含SacB基因)基因组为模板，以SacB-F和SacB-R 为引物PCR扩增SacB基因。将PCR扩增片段分别与pGEM-TEasy载体连接，转化、筛选、PCR鉴定阳性克隆质粒，即pT-VirB12-S、pT-VirB12-X和pT-SacB质粒，送上海英骏生物公司测序。SalⅠ和Bam HⅠ同时双酶切pBK-CMV载体和pT-SacB克隆质粒，纯化回收SacB片段与p BK-CMV载体片段，连接，转化，筛选阳性重组质粒pBK-CMV-SacB，双酶切及PCR(SacB)鉴定。参照上述步骤依次将VirB12基因上游同源臂和下游同源臂连接到pBK-CMV-SacB重组质粒上，分别应用Bam HⅠ/Xho I、Xho I/XbaⅠ双酶切和PCR方法鉴定筛选重组质粒，获得自杀质粒pBK-CMV-ΔVirB12-SacB。
4121
易新萍等:牛布鲁氏菌A19突变株的构建及在BALB/c鼠中的免疫保护评估．/微生物学报(2013)53(11)
表2．引物序列
Table2．Primer sequence
Primer Sequence(5’→3’)Size of amplification or amplification product/bp Restriction site introduced
VirB12-S-F ggatcc TGTTGCTCTTTCTCTTTGTCGTG
2300Bam HⅠ
VirB12-S-R ctcgag TAACCAATGTGCGCATT Xho I
VirB12-X-F ctcgagTGGATATCGAAATTTTA
2030Xho I
VirB12-X-R tctagaAGATGAGGAAACCAGA XbaⅠ
SacB-F gtcgac ATGAACATCAAAAAGTTTGC
1422SalⅠ
SacB-R ggatcc TTATTTGTTAACTGTTAATTG Bam HⅠVirB12-F GTCAGCTTCTCGCCAACACAAG
713/ VirB12-R CGTCGGA ACCGCT CTATAGGTC
1.4A19-ΔVirB12突变株构建及筛选鉴定
参照文献［17］方法制备A19感受态细胞。将自杀质粒pBK-CMV-ΔVirB12-SacB电击转化到A19感受态细胞中，电击转化液于37?180r/min振荡培养24h。将转化液涂于含有卡那霉素(kanamycin，kan r)(50μg/mL)的布氏琼脂培养基平板上，37?5%CO
2
条件下培养3d。挑取平板上转化子于37?250r/min振荡培养48h，适当稀释培养物并涂布于添加5%蔗糖的布氏琼脂培养基平板上，37?培养4d。平板上长出的菌落以VirB12-F 和VirB12-R为引物进行PCR鉴定，将PCR鉴定正确的阳性菌落命名为A19-ΔVirB12。
1.5毒力测定
生理盐水分别将布氏琼脂培养基上培养72h 的A19-ΔVirB12和A19的培养物洗下，稀释成每毫升含10亿CFU菌的悬液，腹股沟注射体重20－22g的BABL/c小鼠各5只，每只0.2mL，14d剖杀，无菌取脾脏，称重，灭菌PBS研磨脾脏制成乳剂，分别按原液、1?100稀释液和1?10000稀释液进行细菌分离、计数。计算每只BALB/c鼠每克脾脏的载菌量(CFU/g)并取其平均值，SPSS11.5软件，t 检验(P＜0.05)进行统计学分析。
1.6免疫保护性
取110只6周龄的雌性BALB/c鼠，随机分为3组。参照文献［18］方法，分别将A19和A19-ΔVirB12以5.0?104CFU/只腹腔接种BALB/c鼠，即A19组(36只)、A19-ΔVirB12组(38只)。PBS 对照组(36只)接种0.01mol/L PBS1.0mL。免疫后每周每组取3只BALB/c鼠眼球采血，分离血清，检测免疫抗体。第45天，2308毒株以 3.0?104CFU/只的剂量攻毒所有BALB/c鼠。攻毒后第15天无菌取脾脏，PBS研磨，细菌分离并菌落计数，计算BALB/c鼠克脾指数，应用SPSS11.5软件进行方差检验统计学分析。
1.7VirB12蛋白的Western blotting鉴定
以纯化的VirB12重组蛋白作为抗原，以1.6中分离的鼠抗血清为一抗，以山羊抗鼠HRP-IgG为二抗进行Western blotting分析，试验方法和步骤参照文献［19］。
1.8组织病理变化
免疫攻毒后第15天剖杀BALB/c鼠，多聚甲醛固定A19组、A19-ΔVirB12组和PBS对照组BALB/ c鼠肝脏、脾脏组织。组织脱水、透明、浸蜡和包埋，常规方法制备石蜡切片，HE染色，镜检，观察组织病理变化。
2结果
2.1自杀质粒pBK-CMV-ΔVirB12-SacB的酶切鉴定
用XbaⅠ和Sal I双酶切自杀质粒，得到大小约为5750bp的DNA条带，该条带与SacB基因和VirB12基因上下游同源臂片段大小的理论值相符; Bam HⅠ和XhoⅠ双酶切自杀质粒，得到约为2300 bp的DNA条带，与VirB12基因上游同源臂片段大小的理论值相符;用XbaⅠ和Xho I双酶切自杀质粒，得到与VirB12基因下游同源臂DNA条带，片段大小与2030bp的目的片段相符;Bam HⅠ和Sal I双酶切自杀质粒，得到与SacB基因理论值相符的1422bp的DNA条带;上述的双酶切实验验证构建的自杀质粒pBK-CMV-ΔVirB12-SacB是完全正确的(图1)。
2.2A19-ΔVirB12突变株的PCR鉴定
A19-ΔVirB12突变株的PCR扩增目的片段大小
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)
图1．自杀质粒pBK-CMV-SacB-VirB12酶切鉴定Figure 1．Identification of pBK-CMV -SacB-VirB12by restriction enzyme digestions．M1，DNA Marker Ⅵ;M2，DNA Marker Ⅲ;lane 1，Products of pBK-CMV -SacB-VirB12with Xba Ⅰand Xho I digestion ;lane 2，Products of pBK-CMV -SacB-VirB12with Bam H Ⅰand Xho Ⅰdigestion ;lane 3，Products of pBK-CMV -SacB-VirB12with Bam H Ⅰand Sal I digestion ;lane 4，Products of pBK-CMV -SacB-VirB12with Xba Ⅰand Sal I digestion．
为236bp ，A19株PCR 扩增目的片段为713bp (图2)
。
图2．A19-ΔVirB12突变株的PCR 鉴定
Figure 2．Identification of A19-ΔVirB12mutant strain by PCR．M ，DNA Marker ;lane1，A19-ΔVirB12mutant strain ;lane 2，Blank control ;
lane 3，A19strain．
2.3A19-ΔVirB12突变株毒力测定
分别将A19-ΔVirB12和A19以1.0?109
CFU
腹股沟注射BALB /c 鼠，
15d 无菌取脾脏分离布鲁氏菌。表3结果表明A19-ΔVirB12突变株每克脾脏
载菌量低于1.0?106
CFU ，表明A19-ΔVirB12突变
株为弱毒株。SPSS 11.5软件的t 检验表明，A19-ΔVirB12的每克脾脏载菌量与A19差异显著(P ＜0.05)，表明A19-ΔVirB12标记株毒力弱于A19株。
表3．A19株和A19-ΔVirB12株毒力测定
Table 3．Determination of virulence of A19and A19-ΔVirB12strains
Strain Inoculation method CFU of inocuation Days postchallenge /d Mean weight of spleen /g Number of bacteria per gram spleen /(CFU /g )A19
Inguinal injection 1.0?109150.26 2.61?0.32?105a A19-ΔVirB12
Inguinal injection
1.0?109
15
0.22
1.97?0.20?105b
The difference between data with the different small letter within a row is significant (P ＜0.05)．
2.4A19-ΔVirB12免疫小鼠抗体检测
图3结果表明，A19和A19-ΔVirB12免疫
BALB /c 鼠均能诱导动物机体产生免疫应答，A19与A19-ΔVirB12免疫抗体在BALB /c 鼠内消长曲线趋向基本一致，没有明显的差异。在第2周可以检测到抗体，
第3至第4周抗体滴度维持在较高水平，随后抗体滴度下降，第6周至第7周抗体水平低于1?50或基本检测不到抗体(图3)
。
图3．布鲁氏菌特异性抗体消长曲线
Figure 3．Specific antibody response curve of Brucella．
2.5免疫保护力
世界卫生组织(WHO )1997年确定了评估突
变株免疫保护能力的标准，根据攻强毒株后特定时间内小鼠脾或肝脏的载菌量变化做出疫苗保护力的判断
［20］
。攻毒后第15天剖杀BALB /c 鼠，无
菌取脾脏分离细菌。SPSS 11.5软件方差检验分析表明，
A19免疫攻毒组与A19-ΔVirB12免疫攻毒组之间克脾指数差异不显著(P ＞0.05)。A19免疫攻毒组与A19-ΔVirB12免疫攻毒组和PBS 对照组之间克脾指数差异显著(P ＜0.05)。A19组(n =15)有3只BALB /c 鼠脾脏分离到布鲁氏菌。A19-ΔVirB12组(n =17)有4只BALB /c 鼠脾脏分离到布鲁氏菌。PBS 对照组(n =15)中15只BALB /c 鼠均分离到布鲁氏菌。表5结果表明攻毒15d 后，
A19-ΔVirB12与A19株对布鲁氏菌2308毒株有较好的保护抵抗力，A19-ΔVirB12株
的免疫保护力与A19株相当。
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表5
BALB /c 鼠免疫保护实验结果
Table 5
The results of protective immunity in BALB /c
Group Number ofBALB /c
brucella of 2308load log (CFU /g spleen )
Ratio of isolation brucella in BALB /c
A19group 15 3.445?0.207a 3/15A19-ΔVirB12group 17 3.022?0.165a 4/17PBS control group
15
6.156?0.325b
15/15
The difference between data with the different small letter within a column is significant (P ＜0.05)，and the difference between data with the same small letter within a column is not significant (P ＞0.05)．
2.6VirB12重组蛋白Western blotting 鉴定提纯VirB12重组蛋白，经SDS-PAGE 和
Western blotting 分析，结果显示VirB12重组蛋白可与A19疫苗免疫的小鼠血清反应，出现大小
约
图4．VirB12蛋白的Western blotting 分析
Figure 4．Western blotting of VirB12protein．M ，Protein Marker ;lane l ，Negative control (PBS );lane 2，A19;lane 3，A19-ΔVirB12．
23kDa 的特异性目的条带。VirB12重组蛋白与A19-ΔVirB12和PBS 免疫的小鼠血清均不反应(图4)，结果表明VirB12重组蛋白具有良好的反应原性。2.7
组织病理变化
布鲁氏菌2308强毒株攻毒PBS 对照组和A19-ΔVirB12免疫组BALB /c 鼠，
15d 取肝脏和脾脏进行病理组织学切片检查，结果表明，PBS 对照攻毒组的肝脏和脾脏比A19-ΔVirB12免疫攻毒组有明显的病理变化。A19-ΔVirB12免疫攻毒组BALB /c 鼠脾脏出现轻微的脾小梁延伸、
增宽现象，肝细胞有轻度水肿和增生;PBS 对照攻毒组BALB /c 鼠脾脏内出现多个巨噬细胞;肝细胞部分区域出现炎性细胞浸润(图5)。病理组织切片结果进一步表明，A19-ΔVirB12疫苗具有较好的免疫保护力
。
图5．2308毒株攻毒BALB /c 鼠的病理组织切片(400?)
Figure 5．Histopathological changes of A19-ΔVirB12-immunized mice after challenge with 2308strain (400?)．A1:The spleen of PBS control group ;A2:The spleen of A19group ;A3:The spleen of A19-ΔVirB12group ;B1:The liver of PBS control group ;B2:The liver of A19group ;B3:The liver of A19-ΔVirB12group．
7
121
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3讨论
目前，对畜间布鲁氏菌病的防治主要依赖接种疫苗。减毒活疫苗A19株在防治牛布鲁氏菌病方面取得明显的效果。本研究以A19为亲本株，利用同源重组技术对A19疫苗株实施改造，敲除了布鲁氏菌四型分泌系统(T4SS)中VirB12基因，获得了具有布鲁氏菌病诊断标记的A19-ΔVirB12标记疫苗株，为建立区分动物布病免疫和自然感染的鉴别诊断方法奠定了理论基础。
布鲁氏菌的Ⅳ型分泌系统(T4SS)是继脂多糖之后又一个关键的致病力因子，T4SS由12个可跨膜蛋白的多蛋白复合物家族组成，VirB操纵子编码布鲁氏菌的T4SS，与布鲁氏菌细胞内生存繁殖有关［21］，T4SS突变会大大的衰减布鲁氏菌在体外培养模式中的胞内生存。VirB12蛋白是由VirB12基因编码的一个布鲁氏菌宿主定植蛋白，分子量约为17kDa，在细菌与宿主的相互作用中起作用。研究证明，VirB12在牛种布鲁氏菌感染中是一种免疫原性蛋白，而且该基因在小鼠感染牛种布鲁氏菌的过程中均有表达，但在T4SS中并不是必需蛋白［22］。本研究以A19株为参照，A19-ΔVirB12突变株免疫BALB/c鼠，抗体水平检测结果表明，A19-ΔVirB12突变株和A19株在BALB/c鼠体内都诱导机体产生了免疫应答，而且产生的免疫应答强弱和体内持续时间无显著差异。Western blotting分析进一步证明A19-ΔVirB12株免疫小鼠不产生VirB12特异性抗体，而且敲除A19的VirB12基因对其免疫原性无明显影响。研究结果更进一步证明VirBl2可作为布病血清学检测标记抗原，为A19-ΔVirB12标记疫苗株的研发应用提供了科学的理论依据。
布鲁氏菌是一种胞内感染细菌，机体对胞内寄生菌的免疫清除以细胞免疫为主。本研究中体液免疫结果显示A19-ΔVirB12与亲本株A19的抗体增长趋势是一致的，IgG的含量随着免疫时间的延长而增加，相同时期A19-ΔVirB12诱导产生的IgG含量与亲本株A19相当，在第6周抗体水平低于1:25或基本检测不到抗体。研究表明，在第6周S19接种的小鼠对布鲁氏菌可以建立起较强的细胞免疫反应［23－24］。因此，本研究选择疫苗接种后的第45天(第6－7周)对免疫的BALB/c鼠攻毒来评价A19-ΔVirB12突变株的免疫保护效力。实验结果表明，攻毒15d后，与PBS对照组相比，A19-ΔVirB12免疫攻毒组和A19免疫攻毒组的克脾指数差异显著(P＜0.05)，但A19-ΔVirB12免疫攻毒组和A19免疫攻毒组之间的克脾指数差异不显著(P＜0.05)。实验结果说明VirB12蛋白的缺失几乎不影响A19-ΔVirB12疫苗株的免疫保护效力，A19-ΔVirB12突变株能诱导小鼠对布鲁氏菌产生细胞免疫反应。肝脏和脾脏病理组织切片结果进一步证实A19-ΔVirB12与A19株对布鲁氏菌2308毒株均具有较好的保护抵抗力，而且A19-ΔVirB12株的免疫保护力与A19株相当。
综上所述，本研究对A19-ΔVirB12突变株在BALB/c鼠体内毒力、抗体水平、组织切片和免疫保护效力的测定，研究数据显示A19-ΔVirB12突变株在BALB/c鼠体内毒力有所降低，免疫保护效力在BALB/c鼠体内与亲本菌株A19无显著差异。初步证实构建的A19-ΔVirB12疫苗株可以采用常规的血清学方法进行区分自然感染和疫苗免疫，为布鲁氏菌标记疫苗的进一步研究提供了技术支撑，但A19-ΔVirB12突变株在靶动物体内免疫效力如何还需从靶动物内及其细胞免疫应答方面进一步评价证实。
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Construction of Brucella abortus A19-ΔVirB12mutant and evaluation of its protective efficacy against2308strain challenge in BALB/c mice
Xinping Yi1，Feng Ye1，Gang Yao2，Wenxi Gu1，Xiaojing Ma1，Dongling Wu3，
Qi Zhong1*
1Institute of Veterinary Research，Xinjiang Academy of Animal science，Urumuqi830000，China
2College of Animal Medicine，Xin Jiang Agricultural University，Urumuqi830052，China
3Xinjiang Tiankang Animal Biotechnology Co．Ltd．，Urumqi830032，China
Abstract:［Objective］A19-ΔVirB12deletion mutant of Brucella abortus was constructed by using homologous recombination technology．BALB/c mice were vaccinated intraperitoneally with the mutant to evaluate protective efficacy against Brucella abortus2308challenge．［Method］A SacB gene was amplified by PCR from pIB279plasmid．The sequences upstream and downstream of the VirB12gene were amplified by PCR from Brucella abortus A19．These three PCR products were subsequently inserted into pBK-CMV vector，namely pBK-CMV-SacB-VirB12．This construct was transformed into Brucella abortus A19．The A19-ΔVirB12mutants were obtained by Kan r and5%sucrose selection．Six-week-old female BALB/c mice were distributed into three treatment groups，includingA19-ΔVirB12group，A19group and PBS control group．BALB/c mice were vaccinated intraperitoneally at a dose of5.0?104CFU．At the45-dayspost-immunization，all of mice were challenged with2308strain．Fifteen days after thechallenge，the levels of infection were expressed as means of the log10CFU/spleen values．The histological changes were assessed among the groups．［Results］Compared with PBS control group，the A19-ΔVirB12deleted mutant had astatistically significant protection against2308 challengesimilar to A19strain．Western blotting showed that A19-ΔVirB12mutant did not express VirB12protein．［Conclusion］The A19-ΔVirB12deleted mutantelicits a strong protective immunity，and may becomea promising vaccine candidate．
Keywords:Brucella abortus，A19-ΔVirB12mutant strain，homologous recombination，protective immunity
(本文责编:王晋芳)
Supported by the High-tech Development Project of Xinjiang(200911109)，by the National Science＆Technology Pillar Program (2012BAD13B03)，by the Postdoctoral Funding of Xinjiang in2012and by the Special Fund for Agro-scientific Research in the Public Interest (201103008)
*Corresponding author．Tel/Fax:+86-991-4844713;E-mail:yyyzqok@aliyun．com
Received:14March2013/Revised:10May2013
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