蛋白质的分析方法
蛋白质分析方法
1、微量凯氏（Kjeldahl）定氮法
样品与浓硫酸共热。含氮有机物即分解产生氨（消化），氨又与硫酸作用，变成硫酸氨。经强碱碱化使之分解放出氨，借蒸汽将氨蒸至酸液中，根据此酸液被中和的程度可计算得样品之氮含量。若以甘氨酸为例，其反应式如下：
NH2CH2COOH+3H2SO4——2CO2+3SO2+4H2O+NH3 (1)
2NH3+H2SO4——(NH4)2SO4 (2)
(NH4)2SO4+2NaOH——2H2O+Na2SO4+2NH3 (3)
反应（1）、(2)在凯氏瓶内完成，反应（3）在凯氏蒸馏装置中进行。
为了加速消化，可以加入CuSO4作催化剂，K2SO4以提高溶液的沸点。收集氨可用硼酸溶液，滴定则用强酸。实验和计算方法这里从略。
计算所得结果为样品总氮量，如欲求得样品中蛋白含量，应将总氮量减去非蛋白
氮即得。如欲进一步求得样品中蛋白质的含量，即用样品中蛋白氮乘以6．25即得。
评价：
总氮-非蛋白氮=蛋白质氮——>蛋白质含量
灵敏度低，误差大，耗时长。
2、双缩脲法（Biuret法）
（一）实验原理
双缩脲（NH3CONHCONH3）是两个分子脲经180℃左右加热，放出一个分子氨后得到的产物。在强碱性溶液中，双缩脲与CuSO4形成紫色络合物，称为双缩脲反应。凡具有两个酰胺基或两个直接连接的肽键，或能过一个中间碳原子相连的肽键，这类化合物都有双缩脲反应。
紫色络合物颜色的深浅与蛋白质浓度成正比，而与蛋白质分子量及氨基酸成分无关，故可用来测定蛋白质含量。测定范围为1-10mg蛋白质。干扰这一测定的物质主要有：硫酸铵、Tris 缓冲液和某些氨基酸等。
此法的优点是较快速，不同的蛋白质产生颜色的深浅相近，以及干扰物质少。主要的缺点是灵敏度差。因此双缩脲法常用于需要快速，但并不需要十分精确的蛋白质测定。（二）试剂与器材
1. 试剂：
（1）标准蛋白质溶液：用标准的结晶牛血清清蛋白（BSA）或标准酪蛋白，配制成10mg/ml 的标准蛋白溶液，可用BSA浓度1mg/ml的A280为0.66来校正其纯度。如有需要，标准蛋白质还可预先用微量凯氏定氮法测定蛋白氮含量，计算出其纯度，再根据其纯度，称量配制成标准蛋白质溶液。牛血清清蛋白用H2O 或0.9%NaCl配制，酪蛋白用0．05N NaOH 配制。
（2）双缩脲试剂：称以 1.50克硫酸铜（CuSO4?5H2O）和 6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。此试剂可长期保存。若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
2. 器材：
可见光分光光度计、大试管15支、旋涡混合器等。
（三）操作方法
1. 标准曲线的测定：取12支试管分两组，分别加入0，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升的标准蛋白质溶液，用水补足到1毫升，然后加入4毫升双缩脲试剂。充分摇匀后，在室温（20～25℃）下放置30分钟，于540nm处进行比色测定。用未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照液。取两组测定的平均值，以蛋白质的含量为横座标，光吸收值为纵座标绘制标准曲线。
2、样品的测定：取2～3个试管，用上述同样的方法，测定未知样品的蛋白质浓度。注意样品浓度不要超过10mg/ml。
评价：采用540nm分光光度法测定。测定快速，但是灵敏度差，不精确。
3、Folin—酚试剂法（Lowry法）
（一）实验原理
这种蛋白质测定法是最灵敏的方法之一。过去此法是应用最广泛的一种方法，由于其试剂乙的配制较为困难（现在已可以订购），近年来逐渐被考马斯亮兰法所取代。此法的显色原理与双缩脲方法是相同的，只是加入了第二种试剂，即Folin—酚试剂，以增加显色量，从而提高了检测蛋白质的灵敏度。这两种显色反应产生深兰色的原因是：在碱性条件下，蛋白质中的肽键与铜结合生成复合物。Folin—酚试剂中的磷钼酸盐—磷钨酸盐被蛋白质中的酪氨酸和苯丙氨酸残基还原，产生深兰色（钼兰和钨兰的混合物）。在一定的条件下，兰色深度与蛋白的量成正比。
Folin—酚试剂法最早由Lowry确定了蛋白质浓度测定的基本步骤。以后在生物化学领域得到广泛的应用。这个测定法的优点是灵敏度高，比双缩脲法灵敏得多，缺点是费时间较长，要精确控制操作时间，标准曲线也不是严格的直线形式，且专一性较差，干扰物质较多。对双缩脲反应发生干扰的离子，同样容易干扰Lowry反应。而且对后者的影响还要大得多。酚类、柠檬酸、硫酸铵、Tris缓冲液、甘氨酸、糖类、甘油等均有干扰作用。浓度较低的尿素（0.5%），硫酸纳（1%），硝酸纳（1%），三氯乙酸（0.5%），乙醇（5%），乙醚（5%），丙酮（0.5%）等溶液对显色无影响，但这些物质浓度高时，必须作校正曲线。含硫酸铵的溶液，只须加浓碳酸钠—氢氧化钠溶液，即可显色测定。若样品酸度较高，显色后会色浅，则必须提高碳酸钠—氢氧化钠溶液的浓度1～2倍。
进行测定时，加Folin—酚试剂时要特别小心，因为该试剂仅在酸性pH条件下稳定，但上述还原反应只在pH=10的情况下发生，故当Folin一酚试剂加到碱性的铜—蛋白质溶液中时，必须立即混匀，以便在磷钼酸—磷钨酸试剂被破坏之前，还原反应即能发生。
此法也适用于酪氨酸和色氨酸的定量测定。
此法可检测的最低蛋白质量达5mg。通常测定范围是20~250mg。
（二）试剂与器材
1.试剂
（1）试剂甲：
（A）10克Na2CO3，2克NaOH和0.25克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6?4H2O）。溶解于500毫升蒸馏水中。
（B）0.5克硫酸铜（CuSO4?5H2O）溶解于100毫升蒸馏水中，每次使用前，将50份（A）与1份（B）混合，即为试剂甲。
（2）试剂乙：在2升磨口回流瓶中，加入100克钨酸钠（Na2WO4?2H2O）,25克钼酸钠（Na2MoO4?2H2O）及700毫升蒸馏水，再加50毫升85%磷酸，100毫升浓盐酸，充分混合，接上回流管，以小火回流10小时，回流结束时，加入150克硫酸锂（Li2SO4），50毫升蒸馏水及数滴液体溴，开口继续沸腾15分钟，以便驱除过量的溴。冷却后溶液呈黄色（如仍呈绿色，须再重复滴加液体溴的步骤）。稀释至1升，过滤，滤液置于棕色试剂瓶中保存。使用时用标准NaOH滴定，酚酞作指示剂，然后适当稀释，约加水1倍，使最终的酸浓度为1N左右。
（3）标准蛋白质溶液: 精确称取结晶牛血清清蛋白或g—球蛋白，溶于蒸馏水，浓度为2 50mg/ml左右。牛血清清蛋白溶于水若混浊，可改用0.9%NaCl溶液。
2. 器材
（1）可见光分光光度计
（2）旋涡混合器
（3）秒表
（4）试管16支
（三）操作方法
1. 标准曲线的测定：取16支大试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分成两组，分别加入0，0.1，0.2，0.4，0.6，0.8，1.0毫升标准蛋白质溶液（浓度为250mg/ml）。用水补足到1.0毫升，然后每支试管加入5毫升试剂甲，在旋涡混合器上迅速混合，于室温（2 0～25℃）放置10分钟。再逐管加入0.5毫升试剂乙（Folin—酚试剂），同样立即混匀。这一步混合速度要快，否则会使显色程度减弱。然后在室温下放置30分钟，以未加蛋白质溶液的第一支试管作为空白对照，于700nm处测定各管中溶液的吸光度值。以蛋白质的量为横座标，吸光度值为纵座标，绘制出标准曲线。
注意：因Lowry反应的显色随时间不断加深，因此各项操作必须精确控制时间，即第1支试管加入5毫升试剂甲后，开始计时，1分钟后，第2支试管加入5毫升试剂甲，2分钟后加第3支试管，余此类推。全部试管加完试剂甲后若已超过10分钟，则第1支试管可立即加入0.5毫升试剂乙，1分钟后第2支试管加入0.5毫升试剂乙，2分钟后加第3支试管，余此类推。待最后一支试管加完试剂后，再放置30分钟，然后开始测定光吸收。每分钟测一个样品。
进行多试管操作时，为了防止出错，每位学生都必须在实验记录本上预先画好下面的表格。表中是每个试管要加入的量（毫升），并按由左至右，由上至下的顺序，逐管加入。最下面两排是计算出的每管中蛋白质的量（微克）和测得的吸光度值。
2. 样品的测定：取1毫升样品溶液（其中约含蛋白质20~250微克），按上述方法进行操作，取1毫升蒸馏水代替样品作为空白对照。通常样品的测定也可与标准曲线的测定放在一起，同时进行。即在标准曲线测定的各试管后面，再增加3个试管。如上表中的8、9、1 0试管。
根据所测样品的吸光度值，在标准曲线上查出相应的蛋白质量，从而计算出样品溶液的蛋白质浓度。
注意:由于各种蛋白质含有不同量的酪氨酸和苯丙氨酸，显色的深浅往往随不同的蛋白质而变化。因而本测定法通常只适用于测定蛋白质的相对浓度（相对于标准蛋白质）。
评价：
显色后在700nm处采用分光光度法测试。测试灵敏度高，是较为常用的方法。
4、改良的简易Folin—酚试剂法
（一）试剂
1. 试剂甲：碱性铜试剂溶液中，含0.5N NaOH、10%Na2CO3、0.1%酒石酸钾和0.05%硫酸铜，配制时注意硫酸铜用少量蒸馏水溶解后，最后加入。
2. 试剂乙：与前面的基本法相同。临用时加蒸馏水稀释8倍。
3. 标准蛋白质溶液：同基本法。
（二）操作步骤
测定标准曲线与样品溶液的操作方法与基本法相同。只是试剂甲改为1毫升，室温放置10分钟后，试剂乙改为4毫升。在55℃恒温水浴中保温5分钟。用流动水冷却后，在660nm 下测定其吸光度值。
改良的快速简易法，可获得与Folin—酚试剂法（即Lowry基本法）相接近的结果。
评价：
原理与方法三Folin—酚试剂法基本相同，，采用化学反应显色后，在660nm处用分光光度法分析。但更为快速简易。
5、考马斯亮兰法（Bradford法）
（一）实验原理
双缩脲法（Biuret法）和Folin—酚试剂法（Lowry法）的明显缺点和许多限制，促使科学家们去寻找更好的蛋白质溶液测定的方法。
1976年由Bradford建立的考马斯亮兰法（Bradford法），是根据蛋白质与染料相结合的原理设计的。这种蛋白质测定法具有超过其他几种方法的突出优点，因而正在得到广泛的应用。这一方法是目前灵敏度最高的蛋白质测定法。
考马斯亮兰G-250染料，在酸性溶液中与蛋白质结合，使染料的最大吸收峰的位置（lmax），由465nm变为595nm，溶液的颜色也由棕黑色变为兰色。经研究认为，染料主要是与蛋白质中的碱性氨基酸（特别是精氨酸）和芳香族氨基酸残基相结合。
在595nm下测定的吸光度值A595，与蛋白质浓度成正比。
Bradford法的突出优点是：
（1）灵敏度高，据估计比Lowry法约高四倍，其最低蛋白质检测量可达1mg。这是因为蛋白质与染料结合后产生的颜色变化很大，蛋白质－染料复合物有更高的消光系数，因而光吸收值随蛋白质浓度的变化比Lowry法要大的多。
（2）测定快速、简便，只需加一种试剂。完成一个样品的测定，只需要5分钟左右。由于染料与蛋白质结合的过程，大约只要2分钟即可完成，其颜色可以在1小时内保持稳定，且在5分钟至20分钟之间，颜色的稳定性最好。因而完全不用像Lowry法那样费时和严格地控制时间。
（3）干扰物质少。如干扰Lowry法的K+、Na+、Mg2+离子、Tris缓冲液、糖和蔗糖、甘油、巯基乙醇、EDTA等均不干扰此测定法。
此法的缺点是：
（1）由于各种蛋白质中的精氨酸和芳香族氨基酸的含量不同，因此Bradford法用于不
同蛋白质测定时有较大的偏差，在制作标准曲线时通常选用g—球蛋白为标准蛋白质，以减少这方面的偏差。
（2）仍有一些物质干扰此法的测定，主要的干扰物质有：去污剂、Triton X-100、十二烷基硫酸钠（SDS）和0.1N的NaOH。（如同0.1N的酸干扰Lowary法一样）。
（3）标准曲线也有轻微的非线性，因而不能用Beer定律进行计算，而只能用标准曲线来测定未知蛋白质的浓度。
（二）试剂与器材
1. 试剂：
（1）标准蛋白质溶液，用g—球蛋白或牛血清清蛋白(BSA)，配制成1.0mg/ml和0.1 mg/ml的标准蛋白质溶液。
（2）考马斯亮兰G—250染料试剂：称100mg考马斯亮兰G—250，溶于50ml 95%的乙醇后，再加入120ml 85%的磷酸，用水稀释至1升。
2. 器材：
（1）可见光分光光度计
（2）旋涡混合器
（3）试管16支
（三）操作方法
1. 标准方法
（1）取16支试管，1支作空白，3支留作未知样品，其余试管分为两组按表中顺序，分别加入样品、水和试剂，即用1.0mg/ml的标准蛋白质溶液给各试管分别加入：0、0.01、0.
02、0.04、0.06、0.08、0.1ml，然后用无离子水补充到0.1ml。最后各试管中分别加入5. 0ml考马斯亮兰G—250试剂，每加完一管，立即在旋涡混合器上混合（注意不要太剧烈，以免产生大量气泡而难于消除）。未知样品的加样量见下表中的第8、9、10管。
（2）加完试剂2-5分钟后，即可开始用比色皿，在分光光度计上测定各样品在595nm
处的光吸收值A595，空白对照为第1号试管，即0.1mlH2O加5.0mlG—250试剂。
注意：不可使用石英比色皿（因不易洗去染色），可用塑料或玻璃比色皿，使用后立即用少量95%的乙醇荡洗，以洗去染色。塑料比色皿决不可用乙醇或丙酮长时间浸泡。
评价：
化学反应显色后，在595nm处用分光光度法测试。
目前灵敏度最高的蛋白质测定法。干扰物质少。用于不同蛋白质测定时有较大的偏差，这是任何一种方法都无法避免的问题。
生物药物分析知识点总结
题库一 1、什么是药物？ 药物是指用于预防、治疗、诊断人的疾病，有目的地调节人的生理功能并规定有适应证和用法、用量的物质。 2、药物的学科包括哪些？ 药物分析(pharmacenticalanalysis)、药理学(pharmacology)、药剂学(pharmaceutics)、药物化学(pharmacentical chemistry) 3、什么是生物药物？ 生物药物是利用生物体，生物组织或组成生物体的各种成分，综合应用多门学科的原理和方法，特别是采用现代生物技术，进行加工、制造而形成的一大类用于预防、治疗和诊断的药物。广义的生物药物包括：(1)从动植物和微生物中直接提取的各种天然生理活性物质；（2）人工合成或半合成的天然物质类似物。 4、生物药物的性质(Properties of biological) (1)结构相近；(2)药理有效；(3)医疗效果好；(4)浓度低，杂质高；(5)大分子稳定；(6)有一定的敏感性（对热、重金属、酸碱和ph变化等敏感） 5、药典的定义？药典的简称、版本、三部和内容？ （1）定义：记载着各种药品标准和规格的国家法典，是国家管理药品生产与质量的依据，一般由一个国家的卫生行政部门主持编写、实施颁布。 （2）简称：Ch.P （3）版本：1953、1963、1977、1985、1990、1995、2000、2005、2010 （4）三部：中药、化学药、生物制品。 （5）内容：凡例，正文，附录，索引。6、什么是ADME？各代表什么单词？ ADME:药代动力学；A:吸收(absorption);D:分布(distribution);M:代谢(metabolism);E:排泄(excretion) 题库二 1、标准物质的定义 标准物质是一种或多种确定了高稳定度的物理、化学和计量学特性，并经正式批准，可作为标准使用，用来校准测量器具、评价分析方法或给材料赋值的物质或材料。包括化学成分分析标准物质、物理性质与物理化学特性测量标准物质，工程技术特性测量标准物质。 2、精密度控制图及准确度控制图的上下警告限及 上下控制限是怎样定义的？ （1）精密控制图，即均值控制图。以测定结果的平均值X为控制图的中心线，并计算出测量值的标准偏差S，以X ±2S作为上下警告限，用虚线表示；X±3S作为上下控制限绘成。(上警告限：UWL，下警告限：LWL，上控制限：UCL，下控制限：LCL) （2）准确控制图，也称回收率控制图，向不同浓度的样品中加入不同的已知量的标准物，积累测得的回收率数据，计算百分平均回收率品p及其标准偏差sp，以p±2sp为上下警告限，p±3sp为上下控制限。 3、计量、认证、标准化及质量管理的英文 计量：measurement认证：accreditation 标准化：standardization 质量管理：Quality Management QM 4、药物分析论文的发表包括那几个项目?
第三章 蛋白质
3．氨基酸和蛋白质 罗勃特 P.威尔逊 3.1 简介 蛋白质约占鱼类干重的65-75%。鱼类不断利用氨基酸形成新的蛋白质或者替代已有的蛋白质。如果日粮中蛋白质含量过多，只有一部分将被用于形成新的蛋白质，其余的将被转变成能量。 最初的氨基酸实验日粮是根据鸡全卵蛋白、大鳞大麻哈鱼卵蛋白和大鳞大麻哈鱼卵黄蛋白来表示的。根据鸡全卵蛋白氨基酸组成配置的氨基酸实验日粮被用来测定大鳞大麻哈鱼氨基酸定性需求。 3.2 蛋白质需求 3.2.1 总需求 3.2.1.1 有鳍鱼 像其它动物一样，鱼类没有真实的蛋白质需求量，但是需要必需氨基酸和非必要或非必需氨基酸之间很好的平衡。测定的几种鱼类幼鱼的蛋白质需求量总结在表格3.1中。由于没有充分考虑下面这些因素：(a)日粮能量含量(b)日粮蛋白质的氨基酸组成(c)日粮蛋白质的消化，所以一些需求量值估计过高。 同其它动物一样，鱼类最理想的日粮蛋白质水平受到能蛋比平衡，氨基酸组成，测试蛋白的消化，和非蛋白能量来源的影响。实验日粮中能量过量会限制饲料的消耗，像其它动物一样，鱼类摄食是为满足能量需求。在许多鱼类中许多饲料原料的可代谢能量还没有被测定，研究者运用生理燃料值来表示蛋白质需求和日粮能量水平的关系。 表3.1中的数据表明鱼类的蛋白质需求量比其它脊椎动物更高（两到四倍）。用饲料摄入量（每千克体重每天摄入蛋白质克数）和活体重增加（每千克活体重所获得的蛋白质克数）表示时，鱼类的日粮蛋白质需求量并不与其它脊椎动物不同。 3.2.1.2 甲壳纲动物 研究的许多甲壳纲动物的蛋白质需求量很高，范围为日粮干重的30%到60%（表3.3）。这些测定的数据有些估计过高了。甲壳纲动物营养研究很复杂。一些生物体在消化之前同样弄碎食物粒子，这可能会增强消化使得饲料消耗测定很
三种分析蛋白结构域的方法
三种分析蛋白结构域(Domains)的方法 1，SMART入门，蛋白结构和功能分析 SMART介绍 SMART (a Simple Modular Architecture Research Tool) allows the identification and annotation of genetically mobile domains and the analysis of domain architectures. More than 500 domain families found in signalling, extracellular and chromatin-associated proteins are detectable. These domains are extensively annotated with respect to phyletic distributions, functional class, tertiary structures and functionally important residues. Each domain found in a non-redundant protein database as well as search parameters and taxonomic information are stored in a relational database system. User interfaces to this database allow searches for proteins containing specific combinations of domains in defined taxa. For all the details, please refer to the publications on SMART. SMART(，可以说是蛋白结构预测和功能分析的工具集合。简单点说，就是 集合了一些工具，可以预测蛋白的一些二级结构。如跨膜区（Transmembrane segments），复合螺旋区（coiled coil regions），信号肽（Signal peptides），蛋白结构域（PFAM domains）等。 SMART前该知道的 1，SMART有两种不同的模式：normal 或genomic 主要是用的数据库不一样。Normal SMART, 用的数据库 Swiss-Prot, SP-TrEMBL 和 stable Ensembl proteomes。Genomic SMART, 用全基因组序列。详细列表：，一些名词解释 进行时 可以直接用各个数据库蛋白的ID。如Uniprot/Ensembl??ID / Accession number (ACC)。或是直接蛋白序列。运行SMART也可选择signal peptides、PFAM domains等的预测，勾上就是。看下图 SMART结果 运行后的结果用图表表示。其实运行后的结果都有明确的解释。详细请看下面。
蛋白质序列分析
蛋白质序列、性质、功能和结构分析 基于网络的蛋白质序列检索与核酸类似，从NCBI或利用SRS系统从EMBL 检索。 1、疏水性分析 ExPASy的ProtScale程序（https://www.wendangku.net/doc/e614111336.html,/cgi-bin/protscale.pl）可用来计算蛋白质的疏水性图谱。输入的数据可为蛋白质序列或SWISS-PROT数据库的序列接受号。也可用BioEdit、DNAMAN等软件进行分析。 2、跨膜区分析 蛋白质跨膜区域分析的网络资源有： TMPRED：https://www.wendangku.net/doc/e614111336.html,/software/TMPRED_form.html PHDhtm: http:www.embl-heidelberg.de/Services/sander/predictprotein/predictpro tein.html MEMSAT: ftp://https://www.wendangku.net/doc/e614111336.html, 3、前导肽和蛋白质定位 一般认为，蛋白质定位的信息存在于该蛋白自身结构中，并且通过与膜上特殊受体的相互作用得以表达。这就是信号肽假说的基础。这一假说认为，穿膜蛋白质是由mRNA编码的。在起始密码子后，有一段疏水性氨基酸序列的RNA片段，这个氨基酸序列就称为信号序列（signal sequence）。 蛋白质序列的信号肽分析可联网到http://genome.cbs.dtu.dk /services/SignalP/或其二版网址 http://genome.cbs.dtu.dk/services/SignalP-2.0/。该服务器也提供利用 e-mail进行批量蛋白质序列信号肽分析的方案 （http://genome.cbs.dtu.dk/services /SignalP/mailserver.html），e-mail 地址为signalp@ genome.cbs.dtu.dk。 蛋白质序列中含有的信号肽序列将有助于它们向细胞内特定区域的移动，如前导肽和面向特定细胞器的靶向肽。在线粒体蛋白质的跨膜运输过程中，通过线粒体膜的蛋白质在转运之前大多数以前体形式存在，它由成熟蛋白质和N端延伸出的一段前导肽或引肽（leader peptide）共同组成。迄今有40多种线粒体蛋白质前导肽的一级结构被阐明，它们约含有20~80个氨基酸残基，当前体蛋白跨膜时，前导肽被一种或两种多肽酶所水解转变成成熟蛋白质，同时失去继续跨膜能力。前导肽一般具有如下性质：①带正电荷的碱性氨基酸（特别是精氨酸）含量较丰富，它们分散于不带电荷的氨基酸序列中间；②缺失带负电荷的酸性
蛋白质结构解析的方法对比综述 (1)
蛋白质结构解析的方法对比综述 工程硕士李瑾 摘要：到目前为止，蛋白质结构解析的方法主要是两种，x射线衍射法和NMR法，这两种方法各有优点和不足。 关键词：x射线衍射法 NMR法 到目前为止，蛋白质结构解析的方法主要是两种，x射线衍射法和NMR法。其中X射线的方法产生的更早，也更加的成熟，解析的数量也更多，第一个解析的蛋白的结构，就是用x晶体衍射的方法解析的。而NMR方法则是在90年代才成熟并发展起来的。这两种方法各有优点和不足[1]。 首先是X射线晶体衍射法。该方法的前提是要得到蛋白质的晶体。通常是将表达目的蛋白的基因经PCR扩增后克隆到一种表达载体中，然后转入大肠杆菌中诱导表达，目的蛋白提纯之后摸索结晶条件，等拿到晶体之后，将晶体进行x射线衍射，收集衍射图谱，通过一系列的计算，得到蛋白质的原子结构[2]。 x射线晶体衍射法的优点是：速度快，通常只要拿到晶体，最快当天就能得出结构，另外不受肽链大小限制，无论是多大分子量的蛋白质或者RNA、DNA，甚至是结合多种小分子的复合体，只要能够结晶就能够得到其原子结构。所以x射线方法解析蛋白的关键是摸索蛋白结晶的条件。该方法得到的是蛋白质分子在晶体状态下的空间结构，这种结构与蛋白质分子在生物细胞内的本来结构有较大的差别。晶体中的蛋白质分子相互间是有规律地、紧密地排列在一起的，运动性较差；而自然界的生物细胞中的蛋白质分子则是处于一种溶液状态，周围是水分子和其他的生物分子，具有很好的运动性。而且，有些蛋白质只能稳定地存在于溶液状态，无法结晶[2]。 核磁共振NMR（nuclear magnetic resonance）现象很早就被科研人员观察到了，但将这种方法用来解析蛋白质结构，却是近一二十年的事情。NMR法具体原理是对水溶液中的蛋白质样品测定一系列不同的二维核磁共振图谱，然后根据已确定的蛋白质分子的一级结构，通过对各种二维核磁共振图谱的比较和解析，在图谱上找到各个序列号氨基酸上的各种氢原子所对应的峰。有了这些被指认的峰，就可以根据这些峰在核磁共振谱图上所呈现的相互之间的关系得到它们所对应的氢原子之间的距离。[3]可以想象，正是因为蛋白质分子具有空间结构，在序列上相差甚远的两个氨基酸有可能在空间距离上是很近的，它们所含的氢原子所对应的NMR峰之间就会有相关信号出现[4] 。通常，如果两个氢原子之间距离小于0.5纳米的话，它们之间就会有相关信号出现。一个由几十个氨基酸残基组成的蛋白质分子可以得到几百个甚至几千个这样与距离有关的信号，按照信号的强弱把它们转换成对应的氢原子之间的距离，然后运用计算机程序根据所得到的距离条件模拟出该蛋白质分子的空间结构。该结构既要满足从核磁共振图谱上得到的所有距离条件，还要满足化学上有关原子与原子结合的一些基本限制条件，如原子间的化学键长、键角和原子半径等[4]。 NMR解析蛋白结构常规步骤如下：首先通过基因工程的方法，得到提纯的目的蛋白，在蛋白质稳定的条件下，将未聚合，而且折叠良好的蛋白样品（通常是1mM－3mM，500ul，PH6－7的PBS）装入核磁管中，放入核磁谱仪中，然后由写好的程序控制谱仪，发出一系列的电磁波，激发蛋白中的H、13N、13C原子，等电磁波发射完毕，再收集受激发的原子所放出的“能量”，通过收集数据、谱图处理、电脑计算从而得到蛋白的原子结构[5] [6]。 用NMR研究蛋白质结构的方法，可以在溶液状态进行研究，得到的是蛋白质分子在溶液中的结构，这更接近于蛋白质在生物细胞中的自然状态[7]。此外，通过改变溶液的性质，还可以模拟出生物细胞内的各种生理条件，即蛋白质分子所处的各种环境，以观察这些周围环境的变化对蛋白质分子空间结构的影响。在溶液环境中，蛋白质分子具有与自然环境中类
不同蛋白质水平的日粮对奶牛生产性能的影响
毕业论文 （2011届） 题目：不同蛋白质水平的日粮对奶牛生产性能 的影响 学院农学院 专业动物科学 年级 2007 级 学生学号 12007241517 学生姓名眭丹 指导教师张巧娥 2011年5月10日
不同蛋白质水平的日粮对奶牛生产性能的影响 摘要 本试验选用30头体况、年龄、胎次相近、健康的荷斯坦奶牛,采用完全随机单位组试验设计，随机分为三组, 每组10头。饲喂三种不同蛋白质水平的日粮, (试验I、II、III组CP分别为 16.7%、 18.6%、 20.6%)，来研究对奶牛生产性能的影响。试验结果表明：随着日粮蛋白质水平的增加，奶牛的干物质采食量和产奶量增加，乳脂率和乳蛋白率反而降低，且三组间差异显著（P<0.05）；乳糖随日粮蛋白水平的增加而升高（P<0.05），对乳中尿素氮无明显影响（P>0.05）。 关键词: 蛋白质水平产奶量乳成分荷斯坦奶牛
Effects of different dietary protein levels on performance of dairy cows in diet Abstract 30 similar body condition, age, parity, healthy Holstein cows were randomly divided into 3 groups of 10 head in this experiment adopting completely random design. 3 different protein levels in diet(CP 16.7%, 18.6%, 20.6% in experiment I, II III group repectively) were fed to study effects on performance of dairy cows.The results were shown that dry matter intake and milk yields were increased, fat contents and protein contents were decreased cows with dietary protein level was increased, which were significant different in the three groups (P<0.05). Lactose increased significantly (P <0.05), urea nitrogen in milk had no effect (P> 0.05) with increasing dietary protein level. Key words:Different protein levels Milk yields Milk composition Holstein cows
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目录 关于Advansta 关于Advansta 样品制备 Afyon 电泳与染色 AdvanStain Scarlet Visio 蛋白质转印 FLASHBlot Transfer Buffer AdvanStain Ponceau 检测 WesternBright ECL & Spray WesternBright Quantum WesternBright Sirius WesternBright MCF & MCF-IR ELISABright 其它 WesternBright ChemiPen Afyon TM Afyon SDS-PAGE样品制备试剂盒能够快速高效地浓缩蛋白质样品，去除缓冲液中可能干扰电泳的成分。只需不到10 min，样品即可用于SDS-PAGE或免疫印迹。Afyon的操作手册非常简单，可以作为最常用的蛋白质 电泳样品制备的工具。? 快速去除干扰电泳的缓冲液成分 (GuHCl, urea, Ammonium sulfate, etc)? 不到10 min，蛋白质样品即可上样? 安全，无毒性，无需DMSO ? 比超滤或透析等方法更加快捷 ? 兼容下游的SDS-PAGE和Western Blot 特点 Afyon 与Western Blotting能够很好地兼容。上图所示为两组Western Blotting实验，样本为A431细胞的抽提物。图a检测GAPDH，图b检测SRC，泳道2为A431细胞的抽提物，泳道3为稀释的细胞抽提物，泳道4为将稀释抽提物用Afyon浓缩后的样品。Western Blot采用荧光标记的二抗进行检测。可见，a和b中的泳道3均无信号，泳道2和4均可以检测 到靶蛋白的信号，信号强度用数字标出。 美国Advansta公司成立于2005年，总部位于加利福尼亚州，是专业的生命科学试剂制造商，致力于研发高效易用的蛋白质分析试剂。 Advansta的公司使命是：成为全球领先的蛋白质分析试剂的研发者与制造商。 其研发团队具有相当扎实的化学分析与蛋白质分析的应用背景，公司的旗舰产品之一为Western Blotting实验配套的相关试剂，其中 WesternBright化学发光底物产品线仅2014年一年就有超过200篇的文献引用量，并获得越来越多的全球使用者的青睐，被评为市场上最灵敏的化学发光底物。 订购信息高效样本制备试剂盒 货号描述 规格R-03018-B10Non-reducing protein sample loading buffer (2X) 1 mL K-02101-010Afyon SDS-PAGE Sample Preparation Kit 10 rxns K-02101-025 Afyon SDS-PAGE Sample Preparation kit 25 rxns 12233455677899101010 样品制 备
蛋白质结构分析原理及工具-文献综述
蛋白质结构分析原理及工具 （南京农业大学生命科学学院生命基地111班） 摘要：本文主要从相似性检测、一级结构、二级结构、三维结构、跨膜域等方面从原理到方法再到工具，系统地介绍了蛋白质结构分析的常用方法。文章侧重于工具的列举，并没有对原理和方法做详细的介绍。文章还列举了蛋白质分析中常用的数据库。 关键词：蛋白质；结构预测；跨膜域；保守结构域 1 蛋白质相似性检测 蛋白质数据库。由一个物种分化而来的不同序列倾向于有相似的结构和功能。物种分化后形成的同源序列称直系同源，它们通常具有相似的功能；由基因复制而来的序列称为旁系同源，它们通常有不同的功能[1]。因此，推测全新蛋白质功能的第一步是将它的序列与进化上相关的已知结构和功能的蛋白质序列比较。表一列出了常用的蛋白质序列数据库和它们的特点。 表一常用蛋白质数据库 网址可能有更新 氨基酸替代模型。进化过程中，一种氨基酸残基会有向另一种氨基酸残基变化的倾向。氨基酸替代模型可用来估计氨基酸替换的速率。目前常用的替代模型有Point Accepted Mutation (PAM)矩阵、BLOck SUbstitution Matrix (BLOSUM)矩阵[2]、JTT模型[3]。 序列相似性搜索工具。序列相似性搜索又分为成对序列相似性搜索和多序列相似性搜索。成对序列相似性搜索通过搜索序列数据库从而找到与查询序列相似的序列。分为局部联配和全局联配。常用的局部联配工具有BLAST和SSEARCH，它们使用了Smith-Waterman 算法。全局联配工具有FASTA和GGSEARCH，基于Needleman-Wunsch算法。多序列相似性搜索常用于构建系统发育树，这里不阐述。表二列举了常用的成对序列相似性比对搜索工具
不同蛋白质水平的日粮对奶牛生产性能的影响
.. . … 毕业论文 （2011届） 题目：不同蛋白质水平的日粮对奶牛生产性能 的影响 学院农学院 专业动物科学 年级2007 级 学生学号 学生眭丹 指导教师巧娥
2011年5月10日 不同蛋白质水平的日粮对奶牛生产性能的影响 摘要 本试验选用30头体况、年龄、胎次相近、健康的荷斯坦奶牛,采用完全随机单位组试验设计，随机分为三组, 每组10头。饲喂三种不同蛋白质水平的日粮, (试验I、II、III组CP分别为16.7%、18.6%、20.6%)，来研究对奶牛生产性能的影响。试验结果表明：随着日粮蛋白质水平的增加，奶牛的干物质采食量和产奶量增加，乳脂率和乳蛋白率反而降低，且三组间差异显著（P<0.05）；乳糖随日粮蛋白水平的增加而升高（P<0.05），对乳中尿素氮无明显影响（P>0.05）。 关键词: 蛋白质水平产奶量乳成分荷斯坦奶牛
Effects of different dietary protein levels on performance of dairy cows in diet Abstract 30 similar body condition, age, parity, healthy Holstein cows were randomly divided into 3 groups of 10 head in this experiment adopting pletely random design. 3 different protein levels in diet(CP 16.7%, 18.6%, 20.6% in experiment I, II III group repectively) were fed to study effects on performance of dairy cows.The results were shown that dry matter intake and milk yields were increased, fat contents and protein contents were decreased cows with dietary protein level was increased, which were significant different in the three groups (P<0.05). Lactose increased significantly (P <0.05), urea nitrogen in milk had no effect (P> 0.05) with increasing dietary protein level.
结构变构和蛋白表达水平
结构变构和蛋白表达水平。 尽管多数研究是结构变异和mRNA表达水平的变化，确定这些涉及到的蛋白质水平如何变化是至关重要的。最近在秀丽隐杆线虫，果蝇和不同的哺乳动物物种中的几项研究，已经通过测量的mRNA和蛋白水平之间的相关性解决了这一问题。这些研究报道mRNA 和蛋白水平总体相关性，尤其是在哺乳动物之间的，其中基因组范围不超过40 ％的蛋白质丰度可以通过mRNA的丰度进行说明，虽然翻译率比例增大时或影响这些消耗因素都考虑在内。因此，在mRNA拷贝数的变化所造成的变化不一定是在蛋白水平的相应变化的结果，作为蛋白质水平的转录后调控，翻译控制另外调节，蛋白质折叠和稳定性，以及高阶的调节基因和蛋白质之间的相互作用。在这种不完全相关中，研究所负责的QTL定位蛋白丰度（pqtls）发现了许多基因位点，不是由eQTL映射观察到的。尽管mRNA水平和蛋白表达之间的不完全相关，从eQTL研究结果可以方便建立变异细胞系和有机体的表型结构之间的联系。例如，eQTL映射已链接的乙二醛1（GLO1 ）的重复到小鼠品系特异性焦虑行为和结构变体相关eQTLs也已成功连结至代谢性状的小鼠，包括体重和胆固醇水平。 连接结构的变异与表型 桥接结构变体和表型之间的水平差距，需要精确的结构变体的信息，并且要负责观察到识别元件的性状。这尤其对于许多功能元件相交结构变体具有挑战性。 确定结构变异断点和等位基因状态 结构变异经常发生在重复富含序列，最近节段性重复在基因组区域。因此，映射断点可以并发降低信号与噪音比的高通量基因组学技术。此外，结构变异可以产生于复杂的变化，涉及众多断点。巨大的染色体改建，称为染色体变异，其中几十到几百的断点被认为构成一个单一的结构，结构变体戏剧性的形成时，构成这样的复杂性的结构是一个极端的例子。虽然在最初观察几种类型的癌症中，证明类似的事件在种属之间已经呈现。划定的结构变体，包括这种复杂的重排的精细尺度结构，是通过促进配对末端DNA排序进展数据分析的。 除了断点精度，等位基因结构变异状态的知识也是至关重要的。据估计，常见11 ％以上的基因座的窝藏，遗传结构变体是多等位基因的改变;即，各基因座进行多个独立或并发的DNA重排事件。在最近复制的基因组区域分配的位点的拷贝数的形式与夹层等结构变异的表型贡献具有相当大的问题。尽管如此，少数情况下反复重复的功能意义已经阐明。例如，在AMY1轨迹，该基因编码唾液淀粉酶的2至10已被检测到，这与蛋白质丰度成比例地关联，并显示与食用淀粉人口特异性的关联。最近开发的计算方法为同源基因的特异性复制基因分型，使用短的高通量测序数据读取也应促进在其他区域的基因组拷贝数状态的特定性状的推理。 映射最小的关键区域 在查明所影响的结构的基因组区域变型中，剩余的挑战是确定内部或周围的结构变体是与功能相关的基因。在所造成的罕见的基因疾病的情况下，递归结构的变异，具有相同的表型，表现为患者的基因组重排的映射，但不同的，部分重叠的变异，被用来确定最小的基因组重叠临界区域。最小的临界区域映射的值一般最大化，具有由重叠的和非相同的断点表型患者的可用性。使用这样的原理有助于描绘了可能是致病的基因组区域，对于观
生物药物分析方法研究与进展
生物药物分析方法研究与进展 生物药物是指运用物理学、化学、生物化学、生物技术和药学等学科的原理和方法从生物体、生物组织、细胞、体液等制造的一类用于预防、治疗和诊断的制品，包括生物技术药物和原生物制药。随着基因工程技术的迅速发展，基于重组DNA技术、细胞和发酵技术基础上的生物技术药物制造业已经取得了巨大进步，并正在成为当今药物领域发展的前沿1。 以美、日、欧为代表的生物技术领先国家在生物药物生产与销售上取得较大的发展2。以美国为例，生物技术药物1999-2008年10年间平均年增长率8.3%，其中2006、2007年分别净利91亿和36亿美元，2008年收入达880.5亿美元，比上期增长11.5%，2008年生物技术药物占全部医药收入的20.6%。我国生物制药也与世界生物技术同步发展，近10年来生物制药生产与销售每年平均增长达29.7%。 基因工程技术目前是实现生物药物制备的主要途径，它通过对核酸分子的插入、拼接与重组而使遗传物质重新组合，采用病毒、细菌、质粒或其它载体将目的基因转移到新的宿主细胞系统，并实现目的基因在新的宿主细胞系统内的复制和表达。采用基因工程技术生产的生物药物包括有重组蛋白质类药物、多肽类、单克隆抗体、疫苗和治疗基因等，除疫苗和治疗基因外，其余生物药物均属于生物大分子药物，也是目前分析化学研究的主要领域之一，因此本章主要介绍蛋白质类药物、多肽类药物及单克隆抗体类药物等生物大分子相关的分析方法及其发展前景。 与化学药物相比，蛋白质多肽类等药物具有分子量大、结构复杂、稳定性差（如蛋白质容易发生水解、氧化、沉淀、变性等）等特点，使得这类生物药物分子的分析面临着诸多挑战。分析方法的发展可以为这类药物的分析解决三个方面的问题。一是蛋白质及多肽类药物的药代动力学的研究必须有相应的分析方法。由于这类药物在体内存在大量结构相似的内源性物质，给体内药物分析的灵敏度、特异性与准确性带来了很大挑战；二是在体外药物分析方面，建立标准化的方法与设立可靠的标准品是实现药物质量控制的关键；三是 1
不同蛋白质水平的日粮对奶牛生产性能的影响
不同蛋白质水平的日粮对奶牛生产性能的影响 -标准化文件发布号：（9556-EUATWK-MWUB-WUNN-INNUL-DDQTY-KII
毕业论文 （ 2011届） 题目：不同蛋白质水平的日粮对奶牛生产性 能的影响 学院农学院 专业动物科学 年级 2007 级 学生学号 学生姓名眭丹 指导教师张巧娥 2011年5月10日
不同蛋白质水平的日粮对奶牛生产性能的影响 摘要 本试验选用30头体况、年龄、胎次相近、健康的荷斯坦奶牛,采用完全随机单位组试验设计，随机分为三组, 每组10头。饲喂三种不同蛋白质水平的日粮, (试验I、II、III组CP分别为 %、 %、 %)，来研究对奶牛生产性能的影响。试验结果表明：随着日粮蛋白质水平的增加，奶牛的干物质采食量和产奶量增加，乳脂率和乳蛋白率反而降低，且三组间差异显著（P<）；乳糖随日粮蛋白水平的增加而升高（P<），对乳中尿素氮无明显影响（P>）。 关键词: 蛋白质水平产奶量乳成分荷斯坦奶牛
Effects of different dietary protein levels on performance of dairy cows in diet Abstract 30 similar body condition, age, parity, healthy Holstein cows were randomly divided into 3 groups of 10 head in this experiment adopting completely random design. 3 different protein levels in diet(CP %, %, % in experiment I, II III group repectively) were fed to study effects on performance of dairy results were shown that dry matter intake and milk yields were increased, fat contents and protein contents were decreased cows with dietary protein level was increased, which were significant different in the three groups (P<. Lactose increased significantly (P <, urea nitrogen in milk had no effect (P> with increasing dietary protein level. Key words: Different protein levels Milk yields Milk composition Holstein cows
蛋白分析
Gi：40644130 allene oxide cyclase 【Niootiana tabacum】 丙二烯氧化环化酶(allene oxide cyclase, AOC) Gi：140083805 cytosolic class II small heatshock protein HSP17.5 【Rosa hybrid cultivar】 Gi：289487897 Lasoorbate peroxidasa 【Bruguiera gymnorhiza】 比如是核糖体16S, 18S，或ITS等DNA序列，一般在Blast n 中搜索，到底是用megablast，discontiguous megablast还是blastn要根据你的序列与数据库序列的相似性，一般首先用blastn，它对相似性要求较低，可发现大量相似序列，如果进一步要求，再选择megablast 等。但是注意blastn搜索数据库对核酸序列相似性要求较高，如果序列保守性不高，比如新的RNA病毒的基因组序列，可能很难得到结果，这时需要用blastp 或Blast x等。 如果是编码蛋白的基因序列，可先将其翻译成蛋白（注意，一条序列理论上有六种编码可能）然后分别去blastp搜索蛋白数据库，当然，你也可直接将其在Blast x中搜索，Blast x会自动将六种编码可能分别翻译后搜索蛋白数据库。 Blastp/PSI-Blast/PHI-BLAST都是蛋白序列与蛋白序列之间的Blast比对。 1，Blastp: 标准的蛋白序列与蛋白序列之间的比对 Standard protein BLAST is designed for protein searches. Blastp用于确定查询的氨基酸序列在蛋白数据库中找到相似的序列。跟其它的Blast程序一样，目的是要找到相似的区域。 2，PSI-BLAST : 敏感度更高的蛋白序列与蛋白序列之间的比对 PSI-BLAST is designed for more sensitive protein-protein similarity searches. Position-Specific Iterated (PSI)-BLAST，是一种更加高灵敏的Blastp程序，对于发现远亲物种的相似蛋白或某个蛋白家族的新成员非常有效。当你使用标准的Blastp比对失败时，或比对的结果仅仅是一些假基因或推测的基因序列时（"hypothetical protein" or "similar to..."），你可以选择PSI-BLAST重新试试。 3，PHI-BLAST : 模式发现迭代BLAST PHI-BLAST can do a restricted protein pattern search. PHI-BLAST, 模式发现迭代BLAST, 用蛋白查询来搜索蛋白数据库的一个程序。仅仅找出那些查询序列中含有的特殊模式的对齐。 PHI的语法详细介绍看这里：https://www.wendangku.net/doc/e614111336.html,/blast/html/PHIsyntax.html The syntax for patterns in PHI-BLAST follows the conventions of PROSITE. When using the stand-alone program, it is permissible to have multiple patterns in a file separated by a blank line between patterns. When using the Web-page only one pattern is allowed per query.
蛋白质表达的性质
蛋白质表达的性质 关键词：大肠杆菌，细胞，试剂，标准物质，北京标准物质网 1.所需要的蛋白表达量如果只是需要少量蛋白，比如筛选一系列点突变体的酶活性，酶学检测可以在大肠杆菌粗提物中进行，采用多数通用表达质粒即可，没有必要花很大精力去优化方案来提高表达量。如果实验蛋白需要量大，就有必要尝试不同宿主载体系统和纯化方法，从中找出大批量表达蛋白的可行方案。外源蛋白水平与生理状态下的内源蛋白相仿，有助于蛋白功能或蛋白相互作用研究。 2.表达蛋白的可溶性在抗体制备时不一定要求蛋白可溶，而研究蛋白功能时可溶性蛋白是关键。利用大肠杆菌表达的融合蛋白常常形成包涵体，相对容易进行纯化，不易被降解。若需要的是可溶性蛋白，可以采用降低复性温度，降低表达水平，改变携带蛋白和尝试不同宿主菌株等方法提高蛋白溶解性。 3.表达蛋白的稳定性在大肠杆菌中表达的外源蛋白尤其是真核蛋白常常稳定性不足。将融合蛋白以包涵体形式表达，或者采用缺失已知蛋白酶的大肠杆菌菌株作为宿主，可减少不稳定蛋白质的降解。由于不同菌株内蛋白酶的水平不同，对于某一特定融合蛋白来说，尝试不同菌株有助于提高蛋白稳定性。 4.蛋白质分子量在哺乳动物细胞中，不加标签的外源蛋白和内源蛋白由于分子量相同在免疫印迹上难以区分，表达融合蛋白有助于两者的区分。一般来说小于5kD或者大于100kD的蛋白表达比较困难。蛋白越小，越容易被内源蛋白水解酶所降解，在这种情况下可以采取融合蛋白表达，在每个单体蛋白之间设计蛋白水解或者是化学断裂位点。如果蛋白较小，可以加入GST、Trx、MBP等较大的标签蛋白可能促进蛋白正确折叠：如果蛋白大于60kD则建议用6×His、HA等较小的标签。对于结构研究清楚的大蛋白可以根据实验目的表达截短蛋白(truncated protemin)，如果是为抗体制备，一定要保证截取抗原性较强的部分。 5.是否需要活性蛋白如果蛋白表达的目的仅仅是获得一些制备抗体的材料，就没有必要获得活性蛋白。如果目的蛋白表达是用于功能研究，那么保持或者恢复蛋白的活性是非常重要的，纯化难易相对不重要。如果需要表达具有生物学功能的膜蛋白或分泌性蛋白，例如细胞膜表面受体或细胞外的激素和酶，则更需要利用真核细胞表达。当表达蛋白是用于结构研究，最好是以可溶性蛋白的形式。在不同大肠杆菌菌株尝试表达蛋白，减少体内蛋白异常折叠，尽可能减少体外变性从而保持正常蛋白构象。
蛋白质分析应用
蛋白质快速检测仪测定乳及乳制品中蛋白质 背景介绍： 蛋白质是生命现象中最基本的物质基础，具有调节生理功能，充当药物分子、维生素、矿物质与微量元素的载体等功能。食用乳及乳制品是人体摄入蛋白质的重要途径之一。但一些不法分子为了获取经济利益，向乳制品中添加含氮量高的无机物质(如三聚氰胺、尿素、硝酸铵等)以提高蛋白质的含量，严重影响乳制品的质量和人们的身体健康。凯氏定氮法是我国用于蛋白质测定的常规检测方法，它是通过样品消解将样品中所有氮元素转化为氨，通过H2SO4或HCL标准溶液进行滴定，实现样品中蛋白质的测定，完成一个样品的整个分析过程至少需要2 h。从其原理可知，样品消解后所有氮元素均转化为氨，故该法无法区分蛋白质氮与非蛋白质氮。杜马斯燃烧法是国际上常用于蛋白质含量测定的方法。样品燃烧后生成的氮氧化物在钨上还原为分子氮，分子氮由二氧化碳载气运送到TCD热导检测器，氮含量引发一种电子测量信号，经过标准物质独立校正被测样品中氮含量，然后转换为蛋白质的含量。从原理上看，如不对样品进行预处理，该方法与凯氏定氮法同样也无法区分蛋白质氮和非蛋白质氮。 蛋白质快速检测仪原理和结构： 将某些有机试剂适量加入到含有蛋白质的溶液中时，有机试剂与蛋白质相互作用生成不溶性化合物(这些有机试剂可称为蛋白质试剂)，离心分离不溶性化合物，未与蛋白质反应的有机试剂仍存在溶液中。通过定量加入的有机试剂，借助蛋白质快速检测仪检测有机试剂吸光度的变化，可测定出样品中蛋白质的含量。因为溶液吸光度与有机试剂的浓度成正比，当蛋白质存在时，溶液中有机试剂浓度降低，其溶液吸光度也降低，降低程度与蛋白质浓度相关。 结果与讨论： 考察了不同温度对蛋白质含量测定的影响。在温度17～40℃范围内，温度对GDYN一200S蛋白质快速检测仪测定样品中蛋白质(标准值3．07％)无影响。考察了蛋白质试剂与蛋白质反应时间对测定结果的影响，结果表明，在室温条件下，搅拌l min样品中的蛋白质可与蛋白质试剂发生特异性反应；同时考察蛋白质试剂反应后上清液的稳定性，在2 h内测定的A和B两牛奶样品的蛋白质含量保持不变。整个蛋白质测定过程仅需5～10 min，与凯氏定氮法2～3 h相比，检测时间显著缩短。考察了GDYN一200S 蛋白质快速检测仪对样品测定结果的重复性。对A、B两牛奶样品蛋白质含量重复测定11次，其测定结果的精密度分别为O．9％和O．5％，表明GDYN一200S蛋白质快速检测仪测定结果具有良好的精密度。从蛋白质检测仪原理可知，检测信号为蛋白质试剂反应前后吸光度变化值。向蛋白质试剂中添加一定量的三聚氰胺、尿素、甘氨酸、硝酸铵等非蛋白氮物质，以验证非蛋白氮是否干扰蛋白质的测定，结果如表3所示。通过紫外一可见分光光度计扫描可知，三聚氰胺、尿素、甘氨酸、硝酸铵等添加物在483 nm处均无吸收，当加入蛋白质试剂时，未见不溶性化合物生成，蛋白质试剂溶液吸光度也未发生变化，表明三聚氰胺、尿素、甘氨酸、硝酸铵等未与蛋白质试剂反应，不影响蛋白质的测定。将研制的GDYN 一200S蛋白质快速检测仪应用到新鲜乳、市售纯牛奶、牛奶饮料(核桃、燕麦、红枣)、奶粉(包括牛初乳粉)、豆浆粉、豆奶粉和鸡蛋等500个样品中蛋白质的定量测定，并与凯氏定氮法进行比较，同时测定了3种奶粉中蛋白质标准物质，部分结果见表5所示。从检测数据可知，与凯氏定氮法测定结果(依据国家标准方法[1’7]分别测定样品中的总氮和非蛋白氮，二者差减后计算出样品中真实的蛋白质含量)与标准物质相比，其相对误差均小于5％。从实验结果可知，蛋白质试剂可快速定量与样品中蛋白质发生反应(1 min)，且能稳定2 h，单一产品全程检测周期仅需5～10 rain；因蛋白质试剂仅与蛋白质氮特异性反应，避免了三聚氰胺、尿素、甘氨酸和硝酸铵等非蛋白氮的干扰；同时该仪器和方法操作简单，避免了传统检测方法消解、蒸馏和滴定等复杂步骤，适用于实际样品中的蛋白质定量检测。 参考文献：蛋白质快速检测仪测定乳及乳制品中蛋白质冯旭东安卫东丁毅于爱民刘静等