大肠杆菌O157_H7量子点免疫层析试纸条的研制_袁列江.pdf

第３１卷第４期 ，

Ｖｏｌ．３１Ｎｏ．４２ ０ １ ５年７月

Ｊｕｌ ．２ ０ １ ５

：

／

ＤＯＩ１０．１３６５２ｊ．ｉｓｓｎ．１００３－５７８８．２０１５．０４．０１０

大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７量子点免疫层析试纸条的研制

Ｓｔｕｄｙ ｏｎ ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ ｔｅｓｔ ｓｔｒｉｐ ｆｏｒ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：

Ｈ７ 袁列江１ 李萌立２ 王书源２

杨梦昕２ 李忠海２

ＹＵＡＮ Ｌｉｅ－ｊｉａｎｇ１ ＬＩ Ｍｅｎｇ－ｌｉ２ ＷＡＮＧ Ｓｈｕ－ｙｕａｎ２ ＹＡＮＧ Ｍｅｎｇ－ｘｉｎ２ ＬＩ Ｚｈｏｎｇ－ｈａｉ２

（１．湖南产商品质量监督检验检疫局，湖南 长沙 ４１０００７； ２．中南林业科技大学食品科学与工程学院，湖南 长沙 ４１０００４）

（

１．Ｉｎｓｔｉｔｕｔｅ ｏｆ Ｐｒｏｄｕｃｔ Ｑｕａｌｉｔｙ Ｓｕｐｅｒｖｉｓｉｏｎ ａｎｄ Ｉｎｓｐｅｃｔｉｏｎ ｏｆ Ｈｕｎａｎ Ｐｒｏｖｉｎｃｅ，Ｃｈａｎｇｓｈａ，Ｈｕｎａｎ４１０００７，Ｃｈｉｎａ

；

２．Ｓｃｈｏｏｌ ｏｆ Ｆｏｏｄ Ｓｃｉｅｎｃｅ ａｎｄ Ｅｎｇｉｎｅｅｒｉｎｇ，

Ｃｅｎｔｒａｌ Ｓｏｕｔｈ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ ｏｆ

Ｆｏｒｅｓｔｒｙ ａｎｄ Ｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，Ｃｈａｎｇｓｈａ，Ｈｕｎａｎ４１０００４，Ｃｈｉｎａ

）

摘要：研制一种大肠杆菌 Ｏ１５７：Ｈ７量子点免疫层析试纸。 利用自制水溶性量子点静电偶联大肠杆菌 Ｏ１５７：Ｈ７单克隆 抗体，将大肠杆菌 Ｏ１５７：Ｈ７单克隆抗体和羊抗兔二抗划线 于硝酸纤维素膜分别作为检测线和质控线，制备双抗体夹心 法检测大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７的量子点免疫层析试纸。该试纸 条能在５ｍｉｎ内完成检测，检测限制为１×１０４ ＣＦＵ／ｍＬ，对

常见的８种食源菌无交叉反应。基于量子点的大肠杆菌

Ｏ１５７：Ｈ７免疫层析试纸操作简便，灵敏度和特异性较好，可 用于食品快速检测。

关键词：大肠杆菌 Ｏ１５７：Ｈ７；量子点；免疫层析

Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ｔｏ ｄｅｖｅｌｏｐ ａｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔｓｂ（ＱＤｓ）

ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｒｏｍａｔｏ－ ｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｒｉｐ ｔｅｓｔ ｆｏｒ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ

ｏｆ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ

Ｏ１５７：Ｈ７．Ｗａｔｅｒ ｓｏｌｕｂｌｅ ＱＤｓ ｗａｓ ｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃ ｃｏｕｐｌｅｄ ｗｉｔｈ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：

Ｈ７ｍｏｎｏｃｌｏｎａｌ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｍｏｕｓｅ ａｎｔｉ－ Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：

Ｈ７ａｎｄ ｒａｂｂｉｔ ａｎｔｉ－ｍｏｕｓｅ ＩｇＧ ｗｅｒｅ ｍａｒｋｉｎｇ ｏｎ ｔｈｅ

ＮＣ ｍｅｍｂｒａｎｅ ａｓ ｔｅｓｔ ｌｉｎｅ ａｎｄ ｃｏｎｔｒｏｌ ｌｉｎｅ，

ｒｅｓｐｅｃｔｉｖｅｌｙ．Ｔｈｅ ｒａｐｉｄ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｒｉｐ ｔｅｓｔ ｐａｐｅｒ ｗａｓ ｂａｓｅｄ ｏｎ ｄｏｕｂｌｅ ａｎｔｉｂｏ

ｄｙ ｓａｎｄｗｉｃｈ．Ｗｉｔｈ ｔｈｅ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｒｉｐ ｔｅｓｔ，

ｏｎｌｙ ５ｍｉｎ ｗａｓ ｎｅｅｄｅｄ ｆｏｒ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ．Ｔｈｅ ｌｉｍｉｔ ｏｆ ｄｅｔｅｃ－ ｔｉｏｎ ｗａｓ １×１０４ ＣＦＵ

／

ｍＬ．Ｎｏ ｃｒ

ｏｓｓ－ｒｅａｃｔｉｖｉｔｙ ｗａｓ ｆｏｕｎｄ ｗｉｔｈ ８ ｋｉｎｄｓ ｏｆ ｃｏｍｍｏｎ ｆｏｏｄ ｂｏｒｎｅ ｐａｔｈｏｇｅｎｓ．Ｔｈｅ ＱＤｓ ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｒｏｍａｔｏ－ ｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｒｉｐ ｔｅｓｔ ｏｆｆｅｒｓ ａ ｒａｐｉｄ ａｎｄ ｓｅｎｓｉｔｉｖｅ ｔｏｏｌ ｆｏｒ ｔｈｅ ｄｅｔｅｃｔｉｏｎ ｏｆ

Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：

Ｈ７

基金项目：国 家 科 技 支 撑 计 划 课 题 （编 号：２０１２ＢＡＤ２９Ｂ０５， ２０１２ＢＡＣ０１

Ｂ０７）；质 检 公 益 性 行 业 科 研 专 项 （编 号：

２０１３１００１２８，２０１２１００３５

）

作者简介：袁列江（１９７３－），男，湖南产商品质量监督检验检疫局研

究员，博士。Ｅｍａｉｌ：

ｕａｎｌｉｅｉａｎ １６３．ｃｏｍ － ｙ ｊ ｇ＠

通讯作者：李忠海 收稿日期：

２０１５－０６－１２ Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７；ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔｓ；

ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｒｏ－

ｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ

在中国的食品中毒事件中，约一半由微生物引起，其中 又以大肠杆

菌引起 的 最 多［１－４］

。大 肠 杆 菌 Ｏ１５７：Ｈ７ 型

（

Ｅｓｃｈｅｒｉｃｈｉａ ｃｏｌｉ Ｏ１５７：Ｈ７）是一种肠道出血性大肠杆菌，

是

主要食源致病菌之一［５］。大肠杆菌 Ｏ１５７：Ｈ７的致病性极 强，有文献［６］报道仅

需１００～２００个细菌即可对人体产生中

毒反应。大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７在全球频繁发生，传播范围广， 致病性强，往往一爆发就会造成严重危害，因此引起了各国 政府的普遍关注。２０１１年肠出血性大肠杆菌菌株（ＥＨＥＣ）

在欧洲的传播非常迅猛，有１３个国家的２ ４００多人被感染， 其中２

３人死亡［７］

。中国也爆发过多次，１９９９年发生的大肠 杆菌Ｏ１５７：

Ｈ７中毒事件，对中国的经济造成了巨大损失［８］

。 传统的大肠杆

菌检测方法为平板培养法，试验条件要求

简单，但操作繁琐，检测周期较长。分子生物学方法灵敏度 高，但在实际应用中受试验仪器的制约［９－１３］。免疫层析技 术［１４］是近年

发展的一种快速检测方法，其检测简单迅速，每

个样品检测时间在５ｍｉｎ，方便快捷、特异灵敏、稳定性强、不 需要

设备支撑，是一种优良的快速检测技术。解泉源等

［１５］

以荧光微球为标记物建立了大肠杆菌 Ｏ１５７：Ｈ７荧光微球免

，

疫层析试纸条 不借助检测仪器条件下检测限可达１．２×

４

王静等

［１６］

／ 。

，

１０ＣＦＵｍＬ 以胶体金做标记物 建立了大 肠杆

，

菌Ｏ１５７胶体金免疫层析快速筛查方法 检测能在１５ｍｉｎ内

完成

５

，

／ 。

检测限为１×１０ＣＦＵｍＬ

量子点（

， ）是一种由 族元素或

ｑｕａｎｔｕｍｄｏｔｓＱＤｓⅡ～Ⅵ

Ⅲ～Ｖ族元素组成，直径在１～１０ｎｍ 的半导体荧光纳米粒 子

［１

７，１８］

。量子点中电子的能量状态与原子相似，由于电子和 空穴被

量子限域，连续的能带结构变成具有分子特性的分立 能级结构，所以量子点受激后可以发射荧光。量子点显示出

３８

安全与检测

２０１５年第４期

了优良的荧光特性，量子点荧光强度和稳定性好，分别是传 统荧光染料的１ ０００倍和１００倍，几乎不受环境的影响，抗光 漂白性强，可以反复激发，有利于长时间的试验观察。蔡朝 霞等［１９］利用化学偶联剂使得量子点表面基团与菌体之间的 成功结合，建立了一种快速简便的大肠杆菌定量检测分析方 法，但此法几乎没有特异性。王玉娇等［２０］利用量子点甘露 糖与大肠杆菌表面含有的ＦｉｍＨ 凝集素的特有识别性质，通

过配体交换合成甘露糖修饰的量子点，作为检测大肠杆菌的 荧光探针，但此法针对大肠杆菌的特异性识别程度不如大肠 杆菌抗原抗体反应。Ｗｕ等［２１］利用兔抗山羊抗体交联水溶 性ＺｎＳ／ＣｄＳｅ量子点，合成了量子点荧光免疫探针，其方便性 和特异性佳，应用广泛。在免疫层析技术中，相比于其他标 记物，以量子点为标记物，由于其基于荧光显色，抗干扰性和 检测灵敏度理论上都更强。结合量子点的优良荧光性质和 抗原抗体反应的特异性，本研究拟应用双抗体夹心量子点免 疫层析法检测大肠杆菌 Ｏ１５７：Ｈ７，并评价该方法的灵敏度、 特异性、和适用性。

１ 材料与方法

１．１ 仪器与材料

分析天平：ＦＡ１００４Ｂ型，上海佑科仪器仪表有限公司； 磁力搅拌加热器：ＣＪＪ７９－１型，金坛大地自动化仪器厂； 超纯水机：ＺＷＬ－ＬＳ１－１０型，湖南中沃水务环保科技有限

公司；

荧光分光光度计：Ｆ９６ｐｒｏ型，上海棱光仪器有限公司；

结 合 垫 Ｇｌ０１９４、层 析 膜 Ｉｍｍｕｎｏｐｏｒｅ ＲＰ、

ＰＶＣ 底 板

ＤＢ－４、吸水纸 Ｈ５０７６：上海杰一生物科技有限公司； Ｔｅ粉、

巯基乙酸、硼氢化钠、氯化镉：分析纯，国药集团 化学试剂有限公

司；

大肠杆菌 ＡＴＣＣ８７３９、

鼠 抗 Ｅ．ｃｏｌｉ０１５７ 单 克 隆 抗 体 （ＬＭ－Ｍａｂ－０１）、兔抗鼠ＩｇＧ抗体：上海慧耘生物科技公司；

沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、副溶血性弧菌、霍乱弧菌、肉

毒杆菌、金黄色葡萄球菌：均为本实验室保藏。

１．２ 细菌培养

各种细菌采用ＬＢ固体培养基上划线培养２４ｈ，挑选特 征菌落接种与液体ＬＢ培养基培养２４ｈ。以生理盐水梯度稀 释进行菌落计数。

１．３ 免疫层析试纸条的制备

１．３．１ 量子点制备 采用巯基乙酸作为修饰剂制备水溶性 量子点。

称取３１．９ｍｇ Ｔｅ粉和２８．４ｍｇ ＮａＢＨ４至预先通氮 除氧的圆

底烧瓶中，加５ｍＬ除氧水，磁力搅拌至Ｔｅ粉完全溶 解，

生成ＮａＨＴ

ｅ溶液；称取１１４．２ｍｇ的ＣｄＣｌ２·２．５Ｈ２Ｏ，

加入

２５０ｍＬ去氧水溶解；用移液枪量取混合修饰剂９３μＬ，加入 氯化铬溶液中，滴加ＮａＯＨ 调节ｐＨ 至９，使白色絮状沉淀完 全溶解；将 溶 液 转 移 至

三 口 烧 瓶 中，通 氮 气 除 氧，加 入

ＮａＨＴｅ溶液，１００℃下加热回流２ｈ，得量子点溶液。透析纯 化后４℃冷藏。

１．３．２ 大肠杆菌Ｏ１５７：

Ｈ７与量子点偶联最佳ｐＨ 的确定 采用静电结合的方法偶联抗体蛋白和量子点（图１）。移 液枪取２０μＬ纯化

过的量子点，０．１ｍｏｌ／Ｌ磷酸缓冲液分别 调节ｐＨ 至６．２，６．７，７．２，

７．７，８．２。

分别向其中加入２０μＬ

图１ 抗体与量子点偶联原理图

Ｆｉｇｕｒｅ １ Ｏｕｔｌｉｎｅ ｏｆ ａｎｔｉｂｏｄｙ ａｎｄ ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ ｃｏｕｐｌｉｎｇ

兔大肠杆菌抗体ＥＣ－ＭＡＢ－０１，在３７ ℃条件下，１５０ｒ

／

ｍｉｎ震

动反应２ｈ，后置于冰箱中４ ℃过夜。为纯化反应量子点大 肠杆菌抗体混合物，将混合物用４０ ０００ｒ／ｍｉｎ超速离心，去 上清液，将沉淀用ＢＳＡ 溶液重悬，相同条件下离心两次，重

悬得到大肠杆菌量子点荧光偶联物。采用免疫层析法确定 偶联效果［２２］。

１．３．３ 免疫层析试纸条组装 免疫层析试纸由样品垫、结

合垫、层析膜、吸水纸和底板构成。样品垫和结合垫采用

ＢＳＡ溶液浸泡后洗涤干燥，以减少实际检测时的蛋白吸附。 将免疫化量子点加入结合垫中，干燥。层析膜检测带和质控 带为鼠抗Ｅ．ｃｏｌｉ０１５７单克隆抗体（ＬＭ－Ｍａｂ－０１）划线。

将样 品垫、结合垫、硝

酸纤维素膜和吸水纸依次粘贴于底板上，切 成３ｍｍ 的试纸条，－２０℃低温保藏待用。

１．３．４ 试纸条特异性的评价 将浓度在１×１０７ ＣＦＵ／ｍＬ

的大肠杆菌、沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、蜡样芽胞杆菌、副溶 血性弧菌、霍乱弧菌、肉毒杆菌、黄色葡萄球菌各取０．５ｍＬ，

以制备好的量子点荧光免疫层析试纸条检测。 １．３．５ 试纸条灵敏性评价 将大肠杆菌 Ｏ１５７：Ｈ７菌悬液 按１０倍

梯度稀释制备的１×１０１ ～１×１０８ ＣＦＵ／ｍＬ大肠杆 菌菌液分别滴加到试纸条加样孔，待免疫反应达到平衡后， 在紫外灯下观察质

控线和检测线。

１．３．６ 试纸条在食品样品中检测适用性评价 选取火腿肠 为肉制品模拟物作检验对象。称取１ｇ火腿肠加４ｍＬ超纯 水捣碎，滤去火腿肠渣，将１００μＬ大肠杆菌污染至０．９ｍＬ 火腿肠滤液中，得到肉制品待测液。选取纯牛奶为乳制品模

拟物作检测对象，将１００μＬ大肠杆菌污染至０．９ｍＬ 牛奶 中，得到乳制品

待测液。选取小白菜为蔬菜品模拟物作检测

对象，剪下表面积约５ｃｍ２的叶子加水４ｍＬ捣碎，滤去叶渣， 将１００

μＬ大肠杆菌污染至０．９ｍＬ小白菜滤液中，得蔬菜待 测液。３个样品

分别１０倍梯度稀释成菌浓度约１×１０５，１× １０４，１×１０３ ＣＦＵ／ｍＬ待测。各个待测样取１００μＬ的待测液 体用量子点荧光免疫层析试纸样品进行检测。

２ 结果与分析

２．１ 量子点的透射电镜及Ｘ衍射分析

将等体积比的异丙醇倒入ＣｄＴｅ量子点水溶液中，充分 搅拌，

沉淀，离心后，将得到的固体产品置于真空干燥箱中干 燥得到ＣｄＴ

ｅ量子点固体粉末。

如图２所示，利用本试验方法制备的 ＣｄＴｅ量子点在水 溶液中具

有很好的分散性与稳定性，ＣｄＴｅ量子点呈近似球 形，尺寸大约在５

ｎｍ 左右，分散均匀。Ｘ 衍射如图３所示，

ＣｄＴｅ量子点结晶性良好，其晶型结构为闪锌矿立方晶相。

３９

第卷第期袁列江等：大肠杆菌：量子点免疫层析试纸条的研制３１Ｏ１５７Ｈ７

图２ＣｄＴｅ量子点的ＴＥＭ图像

Ｆｉｇｕｒｅ２ＴＥＭｐｈｏｔｏｇｒａｐｈｙｏｆＣｄＴｅＱＤｓ

图３ＣｄＴｅ量子点的Ｘ衍射图谱

Ｆｉｇｕｒｅ３ＸＲＤｐａｔｔｅｒｎｏｆＣｄＴｅＱＤｓ

２．２量子点与大肠杆菌抗体的偶联效果

量子点的荧光发射光谱显示，５５０～７００ｎｍ为荧光发射峰

波段，发射峰为６２０ｎｍ，半峰宽为７５ｎｍ，荧光发射峰对称性好。

ＣｄＴｅ量子点在与大肠杆菌抗体偶联之后，最大荧光值及发射峰的

半峰宽都没有变化（见图４），表明ＣｄＴｅ量子点与大肠杆菌Ｏ１５

７：Ｈ７抗体偶联之后，分散性保持良好，没有聚团，其荧光性质保

持稳定［２３］。荧光发射峰位置红移了

２ｎｍ，引起发射峰位置移动的原因可能是，ＣｄＴｅ量子点在与蛋白

质通过电荷相互作用的过程中，由于蛋白质大分子偶联多个量子

点，从而引起其偶极相互作用增加，斯托克斯位移增大，发射光谱

红移［２４］。

如图５所示，在层析法验证量子点与大肠杆菌抗体偶联

效果中，Ｈ６．７，７．２，７．７时出现了两条明显的荧光带，其中ｐ

图４量子点与大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７抗体静电偶联前后

荧光图谱对比

Ｆｉｇｕｒｅ４Ｃｏｍｐａｒｉｓｏｎｏｆｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅｓｐｅｃｔｒｕｍｂｅｆｏｒｅ

ａｎｄａｆｔｅｒｅｌｅｃｔｒｏｓｔａｔｉｃｃｏｕｐｌｉｎｇ

７．２尤其清晰。说明静电偶联的办法是可行的，偶联之后能保持抗

体的特异性，并且最佳偶联ｐＨ值为７．２。大肠杆菌单克隆抗体是

一种免疫球蛋白，其等电点为ｐＩ８．０，在ｐＨ为８时，其不适用结

合其他物质。在ｐＨ＜８时，免疫球蛋白带正电荷。以巯基乙酸为稳

定剂合成的量子点表面为巯基和羧基，且在碱性条件下合成，其表

面带负电。由于带电性相反，两者在溶液中容易发生静电吸引从而

产生偶联。理论上来说，量子点与抗体之间的带电差异越大偶联越

好，所以应在偏碱环境偶联，具体在ｐＨ７～８进行，这在试验结果

中得到验证。综上，量子点与大肠杆菌抗体静电偶联技能保持量

子点的荧光性质也能保持抗体的特异性，是一种成功的偶联方式。

图５不同ｐＨ值下量子点与大肠杆菌的偶联效果

Ｆｉｇｕｒｅ５Ｃｏｕｐｌｉｎｇｅｆｆｅｃｔｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎｏｆｑｕａｎｔｕｍｄｏｔｓｉｎ

ＥｓｃｈｅｒｉｃｈｉａｃｏｌｉｕｎｄｅｒＵＶｌａｍｐ

２．３量子点免疫层析试纸条组装

如图６所示，量子免疫层析试中羊抗兔二抗为质控线，大肠杆菌

抗体为检测线，分别用划膜仪固定在硝酸纤维膜上，结合垫采用量

子点大肠杆菌抗体偶联物浸润，在３７℃条

件下经干燥后制得。将样品垫、结合垫、硝酸纤维素膜和吸水纸，

按顺序粘贴到ＰＶＣ底板上，各部分重叠以保证样品液体的流动。

其检测原理为双抗体夹心法，在检测过程中，样

品中的大肠杆菌在毛细作用下往吸水纸方向移动，结合垫中的量

子点抗体偶联物会标记到大肠杆菌上，在继续往吸水纸方向移动

的过程中，检测线上的大肠杆菌抗体会将标记量子点的大肠杆菌

捕获，形成检测带，未标记大肠杆菌的量子点抗体偶联物继续移动

至质控线被羊抗兔二抗捕获形成质控线。

２．４量子点免疫层析试纸特异性评价

用纯净水分别稀释各种细菌至１×１０７ＣＦＵ／ｍＬ，各取

０．５ｍＬ滴加至量子点荧光免疫层析试纸上进行检测，结果

（图７）表明，大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７样品呈阳性反应，其余样品

图６量子点免疫层析试纸结构图

Ｆｉｇｕｒｅ６ＳｔｒｕｃｔｕｒｅｏｆＱＤｓｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃｓｔｒｉｐ４０

安全与检测

２０１５年第４期

均为阴性反应，包括沙门氏菌、蜡样芽孢杆菌、副溶血性弧 菌、霍乱弧菌、肉毒杆菌、金黄色葡萄球菌。试验显示，大肠 杆菌Ｏ１５７：Ｈ７量子点荧光免疫层析试纸条与其它细菌之间 不发生反应，其特异性良好。

１．大肠杆菌Ｏ１５７：

Ｈ７ ２．枯草芽孢杆菌 ３．沙门

氏菌 ４．蜡样芽胞杆菌 ５．副溶血性弧菌 ６．霍

乱弧菌 ７．肉毒杆菌 ８．金黄色葡萄球菌

图７ 量子点免疫层析试纸特异性测试

Ｆｉｇｕｒｅ ７ Ｓｐｅｃｉｆｉｃ ｔｅｓｔ ｏｆ ＱＤｓ ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｒｉｐｓ

２．５ 量子点免疫层析试纸灵敏度评价

大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７最初源于出血性结肠炎病的人畜及 感染此菌的人畜排泄物。在处理不到位的地区，这些排泄物 通过一些方式，

会释放到水体，对水体造成污染。将大肠杆 菌Ｏ１５７：Ｈ７样品用自来水按照１０倍梯度稀释，通过倾注平 板法测得其浓度分别约为１×１０８，１×１０７，１×１０６，１×１０５，

１×１０４，１×１０３，１×１０２，１×１０１ ＣＦＵ／ｍＬ。分别取１００μＬ不

同浓度的菌悬液用量子点荧光免疫层析试纸条检测，结果最 低的检出浓度为１×１０４

ＣＦＵ／ｍＬ，同市售的大肠杆菌Ｏ１５７： Ｈ７胶体金免疫层析试纸检测相比，其最低检测浓度要低一 个数量级，灵敏度更高（见图８）。

污染也非常常见，同肉制品一样，乳制品来源于动物，且主要 为牛奶，其生产、加工、运输、储藏过程中也容易受大肠杆菌 的污染［２

８］

。蔬菜中的大肠杆菌污染主要来自农家肥的使 用，清洗不净会导

致致病菌的残留。此外，肉制品和乳制品 能为大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７的生长提供极佳的环境，因此容易 造成其大规模富集。

实际的检测结果（表１）表明，量子点荧光免疫层析试纸 在实际

样品中适用性良好，在肉制品、乳制品和蔬菜样品中 灵敏性与在自来水中检测相当。与胶体金试纸条相比，其灵 敏度仍要高一个数量级。

表１ 量子点荧光免疫层析试纸适用性测试

Ｔａｂｌｅ １ Ａｐｐｌｉｃａｂｉｌｉｔｙ ｔｅｓｔ ｏｆ ｑｕａｎｔｕｍ ｄｏｔ ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｔ

ｉｍｍｕｎｅ ｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｙ

样品

浓度

量子点试纸

胶体金试纸

肉１ １×１０３ 阴性 阴性 肉２ １×１０４ 阳性 阴性 肉３ １×１０５ 阳性 阳性 乳１ １×１０３ 阴性 阴性 乳２ １×１０４ 阳性 阴性 乳３ １×１０５ 阳性 阳性 蔬１ １×１０３ 阴性 阴性 蔬２ １×１０４ 阳性 阴性 蔬３ １×１０５

阳性

阳性

量子点荧光免疫层析试纸保藏于－２０ ℃的低温冰箱 中。分别

在保藏１，３，５，１０，２０，３０，４０，５０，６０ｄ时用试纸对大 肠杆菌进行检测。结果表明，６０ｄ内在－２０ ℃条件下，量子 点荧光免疫层析试纸中的抗体保持良好的活性，量子点荧光 性质稳定，整个试

纸的性质保持良好。

图８ 两种免疫层析试纸灵敏度测试对比

Ｆｉｇｕｒｅ ８ Ｃｏｎｔｒａｓｔ ｏｆ ｓｅｎｓｉｔｉｖｉｔｙ ｔｅｓｔｉｎｇ ｏｆ ｔｗｏ ｋｉｎｄｓ

ｉｍｍｕｎｏｃｈｒｏｍａｔｏｇｒａｐｈｉｃ ｓｔｒｉｐ

２．６ 量子点免疫层析试纸适用性评价

受大肠杆菌的生物学性质影响，肉制品的生产加工过程 中极易

产生大肠杆菌污染事件［２５，２６］。牛、羊、猪等动物是大 肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７的宿主，会由于肉制品本身携带、操作工人 携带、不按规范操作导致产品污染

［２７］

。乳制品中大肠杆菌

３ 讨论

大肠杆菌Ｏ１５７：Ｈ７是一个全球范围的公共卫生问题， 各国都

将其列为必检项目［２９］。其各种检测技术中，以免疫 层析技术的检测最为方便快捷，现最流行的为胶体金免疫层 析技术。在检测某些目标物质浓度较低的样品时，胶体金本 身的颜色太浅，无法使用肉眼进行判断。量子点具有极佳的 荧光性质，激发光谱宽，荧光强度高而且稳定，十分有利于降 低免疫层析技术的检测限。本试验将大肠杆菌抗体与羊抗 兔二抗划线固定于层析膜，量子点大肠杆菌单克隆抗体偶联 物浸润与结合垫干燥，通过构建免疫层析系统，完成了量子 点大肠杆菌荧光免疫层析试纸。该法不仅结合了免疫反应 与层析技术准确快速的优点，并且相比于胶体金试纸，由于 量子点基于荧光显色，因而其抗干扰性更强，检测限更低。

４１

第

卷第 期

袁列江等：大肠杆菌

：

量子点免疫层析试纸条的研制

３１Ｏ１５７Ｈ７

本研究构建的量子点试纸的特异性良好，最低检测限为

１０４ ＣＦＵ／ｍＬ，检测时间小于５ｍｉｎ，能适用于多种实际样品 的现场快速检测。

参考文献

１ 中国国家卫生部．卫生部关于２０１１年全国食物中毒事件报告情 况的通 报

［Ｚ／ＯＬ］．卫 办 应 急 发 ［２０１２］１８ 号 （２０１２—０２—２４）

［

２０１３

—

０７—２０］．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｈ．ｇｏｖ．ｃｎ／ｍｏｈｗｓｂｗｓｔｊｘｘｚｘ

／ ｓ７９６７／２０１２０２／

５４２００．ｓｈｔｍｌ．

２ 中国国家卫生部．卫生部关于２０１２年全国食物中毒事件报告情 况的通 报

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２０１３

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０７—２０］．ｈｔｔｐ：／／ｗｗｗ．ｍｏｈ．ｇｏｖ．ｃｎ／ｍｏｈｗｓｂｗｓｔｊｘｘｚｘ

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３ 中国国家卫生部．卫生部关于２０１３年全国食物中毒事件报告情 况的通 报

［Ｚ／ＯＬ］．卫 办 应 急 发 ［２０１４］１５ 号 （２０１３—０２—２０）

［

２０１４

—

０９—２１］．ｈｔｔｐ

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４ 中国国家卫生部．卫生部关于２０１４年全国食物中毒事件报告情 况的通 报

［Ｚ／ＯＬ］．卫 办 应 急 发 ［２０１５］９ 号 （２０１５—０２—１５）

［

２０１５

—

０３—１２］．ｈｔｔｐ

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