基因克隆(包括DNA提取技术步骤)
基因克隆
DNA克隆是指在体外将目的基因或DNA片段同能够自我复制的载体DNA 连接，然后将其转入宿主细胞或受体生物进行表达或进一步研究的分子操作的过程，又称为重组DNA技术。DNA克隆涉及一系列的分子生物学技术，如目的DNA片段的获得、载体的选择、各种工具酶的选用、体外重组、导入宿主细胞技术和重组子筛选技术等。
一 DNA的提取
二目的DNA片段的获得（酶切）
三体外重组
1 LB培养基的配制
2大肠杆菌感受态细胞的制备
3载体的选择
四导入受体细胞
五重组子的筛选
1插入失活法
实验一DNA提取
取0.5克以下的鱼类组织或20ul血液：
1 准备1.5ml离心管，加入500ul裂解液，取组织放入离心管，破碎。（常温操作）
2 恒温箱裂解，55℃。30min。
3 加等体积Tris饱和酚(酚：氯仿：异戊醇25：24：1)，先颠倒混匀后静置抽提10分钟，离心4度12000g 10分钟。（注意酚在油层下面）
4 取上清（把枪头去掉部分，注意液面。蛋白质凝胶停留在水相及氯仿相中间，而DNA位于上层水相中），加入等体积CI(氯仿：异戊醇24：1)，先颠倒混匀后静置抽提10分钟，离心4度12000g 10分钟。
5 汇集上清，加2倍无水乙醇(-30度保存)，颠倒混匀可观察到絮状DNA。在-30度冰箱沉淀30min。离心4度12000g 10分钟。
6 弃去上清，75%乙醇洗涤，7500g离心5分钟。
7 重复一次上述操作。
7 在无菌台干燥半小时，乙醇挥发。
8 溶解于200ulddwater。
9 定量DNA。
裂解液的配制
1ml体系200ul 0.5M EDTA（PH=8.0高压灭菌。作用抑制酶的活性。）
螯合DNA酶发挥作用需要的金属离子。
50ul 10%SDS（蛋白质变性剂）
10ul 1MTris-cl（PH=8.0高压灭菌）缓冲溶液
5ul PK（消化）
735ul 灭菌超纯水
EDTA（0.5 M，pH8.0）
将186.1 g 二水乙二胺四乙酸二钠（EDTA-Na.2H2O）加入800ml水中，在磁力搅拌器上剧烈搅拌。用NaOH调节pH值至8.0（约需20g NaOH颗粒），定容至1L。分装后高压蒸汽灭菌。EDTA二钠盐加入NaOH将溶液的pH值调至接近8.0时，才会溶解。
实验二目的DNA片段的获得（酶切）
获得了包含目的基因在内的DNA，这些DNA或来自于目的生物基因组DNA 或来自目的细胞mRNA逆转录合成的双链cDNA。由于基因组DNA较大，不利于克隆，必须将其处理成适合克隆的DNA小片段，常用的方法是核酸限制性内切酶消化。
仪器：
台式离心机、恒温水浴、取液器、电泳仪、电泳槽、紫外观测仪
试剂
EcoRⅠ,Hind Ⅲ酶,DNA样品（浓度>0.3μg/μl）1X TAE缓冲液。
操作
(一)EcoR Ⅰ单酶切。
1, 取1支干净、灭菌新Eppendof管，分别按下表加入（ul）
灭菌水13
EcoR Ⅰ缓冲液 2
DNA 4 3ug
EcoR Ⅰ１10U
20ul体系。
２，37℃保温１－4小时，也可过夜。
3，保温结束后65-70℃10min灭活酶(如为热稳定性酶,则用氯仿抽提)。
4，取10μl左右的反应液加入1μl电泳加样缓冲液，电泳。目的片段回收。
注意：１，样品加入次序为水、缓冲液、DNA最后为酶，不应颠倒。
２，加酶步骤要在冰浴中进行，在加酶前应先将水、缓冲液及待切DNA混匀。
３，反应体系的体积要尽量少，要保证所加酶的体积不高于总体积的1/10。
4，为了控制反应体积和促进反应进行，要求模板DNA的浓度应很高，因此如底物DNA浓度过低则应进行真空浓缩。
实验三LB培养基的配制
LB培养基是一种应用最广泛和最普通的细菌基础培养基。含有酵母提取物、蛋白胨和NaCl。其中酵母提取物为微生物提供碳源、能源和磷酸盐，蛋白胨主要提供氮源，NaCl提供无机盐。在配制固体培养基时还要加入一定量琼脂作凝固剂。琼脂在常用浓度下96℃时溶化。琼脂在40℃时凝固（高压灭菌融化琼脂糖），通常不被微生物分解利用。固体培养基中琼脂的含量根据琼脂的质量和气温不同而有所不同。
LB培养基用来培养细菌，将其pH调至中性或微碱性，利于细菌生长繁殖。
器材和试剂
酵母提取物，蛋白胨， NaCl，琼脂，氨苄青霉素(Amp)；1mol/L NaOH；
锥形瓶，烧杯，量筒，玻璃棒，细菌培养皿，培养基分装器，天平，牛角匙，高压蒸汽灭菌锅，pH试纸，记号笔，纱布，封口胶。
1000ml体系LB液体培养基：参考《分子克隆实验指南》
在950 ml去离子水中加入:
胰化蛋白胨(bacto-typtone)10g ，
酵母提取物(bacto-yeast extract)5g ，
NaCl 10g
摇动容器直至溶质溶解.
用1mol/LNaOH（大约1ml）调pH至7.4. (适合E.coli的生长)
用去离子水定容至1L.
在15psi高压下蒸汽灭菌20min.（全过程需要2小时）锡箔。常温保存。
氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成50mg/mL溶液，置-20℃冰箱保存。
LB固体培养基1L和液体一样，加15g琼脂粉。
1．称量按培养基配方比例依次准确地称取酵母提取物5g、蛋白胨10g、NaCl 10g.放入烧杯中。蛋白胨很易吸潮，在称取时动作要迅速。
2 在烧杯中加入950 ml去离子水，摇动容器直至溶质溶解.用1mol/LNaOH （800ul）调pH至7.4，再用去离子水定容至1L。转移到试剂瓶中再加入加15g琼脂粉。高压灭菌。
2.抗生素的加入：高压灭菌后，待培养基温度降到55℃时（手可触摸）在超净台加入1/500体积50mg/ml抗生素，以免温度过高导致抗生素失效，并充分摇匀。一定要在温度降下之前加好抗生素，并且倒好板。（类似琼脂糖制胶）
3.倒板：一般10ml倒1个板子。培养基倒入培养皿后，打开盖子，在紫外下照10-15分钟。
4.保存：用封口胶封边，并倒置放于4℃保存，一个月内使用。
1kg=1000g 1g=1000mg 1mg=1000ug 1ug=1000ng
试验四大肠杆菌感受态细胞的制备（超净台）
细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化（Transformation）是指质粒DNA或以它为载体的重组子导入细菌的过程。其原理是细菌处于0℃，CaCl
2低渗溶液中，菌细胞膨胀成球形。转化混合物中的DNA形成抗DNA酶的羟基-钙磷酸复合物粘附于细胞表面，经42℃短时间热击处理，促进细胞吸收DNA复合物。将细菌放置在非选择性液体培养基中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新表型得到表达，然后将此细菌培养物涂在含氨苄青霉素的选择性固体培养基上。【仪器、材料与试剂】
(一)仪器
1．超净UV工作台 2．低温4℃离心机3．恒温摇床37℃180rpm/min
4．-80℃冰箱 5．恒温水浴器
(二)材料
) 2.LB培养基（液体） 3大肠杆菌DH5a（kit）4．50mL离心管1．氯化钙(CaCl
2
5．吸嘴、小指管 6．试管、培养皿、锥形瓶等
(三)试剂
1．0.05 mol/L CaCl
溶液（分子量110.98）灭菌后4℃保存。
2
2. 氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成50mg/mL溶液，置-20℃冰箱保存。
3. LB液体培养基。
大肠杆菌感受态细胞的制备
1. 从大肠杆菌平板上挑取一个单菌落接于含有5 mL LB液体培养基的试管中，37℃。180rpm/min振荡培养过夜。
2. 取5 mL菌液转接到一个含有100 mL LB液体培养基1000ml锥形瓶中，37℃180rpm/min振荡培养90min。
3．将菌液转移到冰预冷的50 mL离心管中，冰上放置10 min。
4．4℃，离心10 min(4 000 r/min)，回收细胞。
5. 倒出培养液，将管倒置1 min以便培养液流尽。
20mL悬浮沉淀，立即放在冰上保温10 min。
6. 用冰冷的0.05 mol/L CaCl
2
7. 4℃ 4 000 r/min，离心10 min，回收细胞。
悬浮细胞(务必放冰上)。加入甘油至终浓度8．用冰冷的2 mL 0.05mol/L CaCl
2
为15%；
9. 使用1.5ml离心管分装细胞，每200 ul一份。此细胞为感受态细胞。-80℃保存备用。
本实验使用生物公司感受态大肠杆菌DH5a。
本实验使用克隆载体质粒是PGEM(R)-3ZF(+) VECTOR
载体的选择
基因工程的载体应具有一些基本的性质：
1）在宿主细胞中有独立的复制和表达的能力，这样才能使外源重组的DNA片段得以扩增。
2）分子量尽可能小，以利于在宿主细胞中有较多的拷贝，便于结合更大的外源DNA片段。同时在实验操作中也不易被机械剪切而破坏。
3）载体分子中最好具有两个以上的容易检测的遗传标记（如抗药性标记基因Amp），以赋予宿主细胞的不同表型特征（如对抗生素的抗性）。
4）载体本身最好具有尽可能多的限制酶单一切点，为避开外源DNA片段中限制酶位点的干扰提供更大的选择范围。若载体上的单一酶切位点是位于检测表型的标记基因之内可造成插入失活效应，则更有利于重组子的筛选。（蓝白斑法）
DNA克隆常用的载体有：质粒载体（plasmid），噬菌体载体（phage），柯斯质粒载体（cosimid），单链DNA噬菌体载体（ssDNA phage ），噬粒载体（phagemid）及酵母人工染色体（YAC）等。从总体上讲，根据载体的使用目的，载体可以分为克隆载体，表达载体，测序载体，穿梭载体等。
PGEM(R)-3ZF(+) VECTOR酶切位点及复制起始点。
本实验使用克隆载体质粒是PGEM(R)-3ZF(+) VECTOR
实验五体外重组
体外重组即体外将目的片断和载体分子连接的过程。大多数核酸限制性内切酶能够切割DNA分子形成有粘性末端，用同一种酶切割载体的多克隆位点便可获得相同的粘性末端，粘性末端彼此退火，通过T4 DNA连接酶的作用便可形成重组体，此为粘末端连接。当目的DNA片断为平端，可以直接与带有平端载体相连，此为平末端连接，但连接效率比粘端相连差些。
外源DNA与载体分子的连接就是DNA重组，重新组合的DNA叫重组子。重组的DNA分子是在DNA连接酶的作用下，有Mg2+、ATP存在的连接缓冲系统中，将分别经
酶切的载体分子与外源DNA分子进行连接。DNA连接酶有两种：T4噬菌体DNA连接酶和大肠杆菌DNA连接酶。两种DNA连接酶都有将两个带有相同粘性末端的DNA分子连在一起的功能，而且T4噬菌体DNA连接酶还有一种大肠杆菌连接酶没有的特性，使两个平末端的双链DNA分子连接起来。
T4噬菌体DNA连接酶催化DNA连接反应分为3步：首先，T4 DNA连接酶与辅助因子ATP形成酶-AMP复合物；然后，酶-AMP复合物再结合到具有5′-磷酸基和3′-羟基切口的DNA上．使DNA腺苷化；最后产生一个新的磷酸二酯键，把切口封起来。连接反应的温度在37°时有利于连接酶的活性。但在这个温度下，粘性末端的氢键结合是不稳定的。实验温度选择在12-16℃，连接12-16 h(过夜)，既可最大限度地发挥连接酶的活性，又兼顾到短暂配对结构的稳定。
重组质粒转化宿主细胞后，还需对转化菌落进行筛选鉴定。利用α互补现象进行筛选是最常用的一种鉴定方法。载体具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其编码肽链的DNA序列，此结构称为lacZ′基因。lacZ′基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段(146个氨基酸)。宿主和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的β半乳糖苷酶分子。lacZ'基因编码的α肽链与失去了正常氨基端的β半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为α互补。由α互补而形成的有功能活性的β半乳糖苷酶，可以用X-gal(5-溴-4-氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)显色测定出来，它能将无色的化合物X-gal切割成半乳糖和深蓝色的底物5-溴-4-靛蓝。因此，任何携带着lacZ'基因的质粒载体转化了染色体基因组存在着此种β半乳糖苷酶突变的大肠杆菌细胞后，便会产生出有功能活性的β半乳糖苷酶，在IPIG(异丙基硫代β-D-半乳糖苷)诱导后，在含有X-gal的培养基平板上形成蓝色菌落。而当有外源DNA片段插入到位于lacZ'中的多克隆位点后，就会破坏α肽链的ORF，从而不能合成与受体菌内突变的β半乳糖苷酶相互补的活性α肽，而导致不能形成有功能活性的β
半乳糖苷酶，含有重组质粒载体的克隆是白色菌落。
（一）设备
1．恒温摇床 2．恒温水浴器 3．恒温培养箱 4．台式离心机 5．低温离心机(二)材料
) 1．胰蛋白胨 2．酵母提取物 3．氯化钠(NaCl) 4．氨苄青霉素5．氯化钙(CaCl
2 6．二甲基甲酰胺 7．限制性内切酶 8．T4 DNA连接酶 9．大肠杆菌11．PGEM(R)-3ZF(+) VECTOR 12．培养皿 13．接种针
14．玻璃涂棒 15．试管 16．酒精灯 17．镊子、牙签等
(三)试剂
1．3 mol/L KAc(pH 5.2) （分子量98.14）高压灭菌，常温保存。
2．X-gal：将X-gal溶于二甲基甲酰胺，配成20 mg/mL，不需过滤灭菌，分装小包装，避光贮存于-20℃。
3．IPTG：取2 g IPTG溶于8 mL双蒸水中，再用双蒸水补至10 mL，用0.22μ滤膜过滤除菌，每份1 mL，贮存于-20℃。
(一)质粒DNA的制备：PGEM(R)-3ZF(+) VECTOR。
(二)制备重组DNA
1．在灭菌的Eppendorf管中，质粒酶切。
2. 在另一无菌Eppendorf管中，全基因组酶切。
3. 反应完毕后各取2μ酶解液做电泳分析。基因组做胶回收。-20℃保存。
4.余下的质粒酶解液加入1/10体积的3 mol/L KAc(pH
5.2)溶液，再加2倍体积的无水乙醇（-20℃保存）, -20℃冰箱, 2h (沉淀DNA)。12 000 r/min 4℃离心15 min，弃上清, 加常温70%乙醇洗沉淀物, 再离心，去上清，真空干燥后，加50μL 灭菌水。
连接试验 20ul体系
超净水 7
酶切质粒 5
酶切DNA 5
10XBuffer 2
T4 DNA连接酶 1
PCR仪上14℃过夜。
在琼脂糖上观察连接产物，对照组是质粒酶切产物和基因组酶切产物。
实验六转化实验
载体DNA分子上具有能被原核宿主细胞识别的复制起始位点，因此可以在原核细胞（如大肠杆菌）中复制，重组载体中的目的基因随同载体一起被扩增，最终获得大量的重组DNA分子。
将外源重组DNA分子导入原核宿主细胞的方法有转化（transformation），转染（transfection），转导（transduction）。重组质粒通过转化导入到宿主细胞中，同样重组噬菌体DNA可以通过转染技术导入。
2. 在200ul新制备的感受态细胞中，加入5ul连接产物，混匀，冰上放置30 min。同时做一个对照管。受体菌对照：200μ受态细胞+5ul无菌双蒸水。
3．将管放到42℃水浴，1-2 min。
4．冰上放置1-2 min。
5．每管加800μL LB液体培养基(轻轻混匀)，37℃温育45 min。慢摇。
6. 在预制的LB琼脂平板上，加40μL 20 mg/mL X-gal和4μL 200 mg/mL IPTG 溶液，并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面。
7. 200ul己转化的感受态细胞均匀涂在上面的培养皿上。将平皿放置37℃温箱30 min，至液体被吸收。
8. 倒置平皿37℃培养12-16 h，出现菌落。
实验七重组子的筛选
从不同的重组DNA获得的转化子中鉴定出含有目的基因的转化子即阳性克隆的过程就是筛选。
插入失活法外源DNA片段插入到位于筛选标记基因（抗生素基因或β-半乳糖苷酶基因）的多克隆位点后，会造成标记基因失活，表现出转化子相应的抗生素抗性消失或转化子颜色改变，通过这些可以初步鉴定出转化子是重组子或非重组子。本实验使用β-半乳糖苷酶显色法即蓝白筛选法。白色菌斑为目的菌斑。
上述方法获得的阳性克隆最后要进行测序分析，以最终确认目的基因。
dna基因克隆及序列分析英语翻译
热和酸应力条件下脂环酸芽孢杆菌Dnak基因克隆和序列分析DNA基因克隆及序列分析。通过兼并PCR基因组扩增获得了大约1300bp的基因片段，然后子克隆到PMD-18T载体上测序。BLAST基因组数据库搜索表明，此PCR产物的序列共享原核热休克蛋白70 DNAK基因，与来自脂环酸芽孢杆菌LAA1伴侣蛋白的DNAK基因的同源性是最高的（92%）。通过基因组步移技术测定DNAK 基因（基因组数据库登录号HQ893543），包含1854bp完整的开放阅读对话框（ORF），编码617个氨基酸。推知的氨基酸序列与来自A. acidocaldarius LAA1 (86%)的DNAK基因表达的伴侣蛋白的相似性最高，与来自Bacillus tusciae,Paenibacillus sp.Y412MC10,Thermosinus carboxydivorans, Brevibacillus brevis 的 A. acidocaldarius 的相似性分别为83%, 77%, 76%,75%。没有检测到信号肽。预测分子量是(Mw)是66.2KDa，等电点（pI）是4.82. 氨基酸序列比对和主题搜索结果显示，在这个基因中有3个域：N末端核苷酸结合域(NBD, aa 1–360)类似于肌动蛋白ATP酶结构域，它包括三个保存位点(-I-D-L-G-T-T-N-S-, -V-F-D-L-G-G-G-T-F-D-V-S-I-L-,和V-I-L-V-G-G-S-T-R-I-P-A-V-Q-E) ，它可能与ATP绑定和激活有关；aa 360–517组成C-末端底物结合域(SBD);aa- 484–617组成的C-末端子域，它可能和底物的结合和释放有关。 脂环酸芽孢杆菌在不同的培养温度下DNAK基因的表达。脂环酸芽孢杆菌生长的温度范围从20°C - 60°C，最适生长温度为45-50°C。在这项研究中，脂环酸芽孢杆菌DSM 3922T在45°C中活跃培养16小时，分别在20°C, 25°C, 30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C, 55°C和60°C繁殖生长。根据观察脂环酸芽孢杆菌在温度为30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C和55°C正常生长。在55°C和30°C生长时，分别繁殖8小时和10小时时达到对数生长期。然而，在培养温度为20°C，25°C或者60°C时，芽孢生长及其缓慢，与其他处理组像比较很难进入指数生长期。值的注意的是，在繁殖温度为20°C，25°C和60°C 时没法收集到足够的细菌ＲＮＡ用于分离和表达分析。 如图２所示，ＤｎａＫ在培养温度为30°C, 35°C, 40°C, 45°C, 50°C 和55°C的基本表达情况。在脂环酸芽孢杆菌最适生长温度(40–55°C),其表达水平相对稳定。在较低的温度下，30°C和35°C,Ｄｎａｋ的表达大幅升高。这表明Ｄｎａｋ可能参与脂环酸芽孢杆菌对不良环境的适应。 在热应力条件下脂环酸芽孢杆菌DNAK的表达。在实验中，热应力加在45°C 繁殖生长到指数生长期摇瓶菌悬液内的细菌上，然后置于温度分别为70°C, 80°C, 90°C的恒温浴内。在80°C和 90°C时，开始10分钟内，细菌正常生长，15分钟后细胞开始破裂。随着热应力的继续，有明显的细胞裂解和细胞凋亡的进一步加剧。在80°C,和90°C时仅仅热应力持续5分钟和10分钟，提取的RNA适合做进一步分析，热冲击15分钟或更长时间，提取的RNA严重退化，不能用于ＲＴ－ＰＣＲ分析。当孵育温度70°C热冲击，所有的时间范围内细菌维持正常生长，全部的RNA被分离用于ＲＴ－ＰＣＲ检测。 正如图３所示，以70°C的热冲击温度，与对照在不孵育的脂环酸芽孢杆菌相比，ＤＮＡＫ的表达水平在孵育５分钟增加了４０％，长时间的热冲击，表达水平下降，与对照的相比２５分钟孵育的细菌ＤＮＡＫ表达水平提高了３０％，当热休克在80°C和90°C时，与对照相比，在5分钟内细菌的DNAK表达水平高速增加70%和15%。有人指出，随着热冲击温度的上升，DNAK表达水平
基因克隆、假病毒操作步骤
实验名称：基因克隆 实验器材:荧光定量PCR仪、摇床、离心机、生工PCR产物纯化试剂盒、恒温加热器、 NEB连接体系、灭菌纯水、JM109感受态、冰、LB培养基、酒精灯、涂棒、氨苄、氨苄抗性平板、甘油等； 操作步骤： 1、可通过PCR进行拼接获得目的基因的，过柱纯化（生工试剂盒根据说明书进行纯化， 在最后一步的洗脱可以用预热的灭菌纯水洗脱，在加灭菌纯水洗脱的时候一定要加在纯化柱子的膜中间）； 2、选择合适的载体（EZ-T）用连接酶进行连接，NEB体系，16℃过夜连接 T4lages 1.0 10×T4buffer 2.0 EZ-T 1.0 目的基因8.0 DdH2O 8.0 ＿＿＿＿＿＿＿＿＿ 20ul 3、取100μl摇匀后的JM109感受态细胞悬浮液（如是冷冻保存液，则需化冻后马上进行下 面的操作），加入10μl连接产物，轻轻摇匀，冰上放置30min后，于42度水浴中保温90s，然后迅速在冰上冷却2min； 4、加入500μl LB液体培养基，混匀于37℃振荡培养45min使受体菌恢复正常生长状态并 使转化体产生抗药性； 5、将恢复培养的菌体5000rpm离心3min，移去上层LB培养基，用余下的200μl重悬菌体， 并用灭菌玻璃推子(酒精灯上烧后冷却)，均匀涂布于琼脂凝胶表面（氨苄抗性），37℃倒置培养12~16小时； 6、挑取多个单克隆菌落分别接种到1ml含有抗生素（氨苄）的LB液体培养基中，37℃振 荡培养3h； 7、培养1-2小时即可以利用PCR（定量或定性）进行鉴定； 8、选取初步鉴定阳性的菌液送测序，测序正确后甘油保存（甘油的浓度为30%-50%），充 分混匀，-80℃保存；
植物基因的克隆｜植物基因克隆的基本步骤
植物基因的克隆 08医用二班姚桂鹏0807508245 简介 克隆（clone）是指一个细胞或一个生物个体无性繁殖所产生的后代群体。通常所说的基因克隆是指基于大肠埃希菌的DNA片段（或基因）的扩增，主要过程包括目标DNA的获取、重组载体的构建、受体细胞的转化以及重组细胞的筛选和繁殖等。本文主要介绍植物基因的特点、基因克隆的载体、基因克隆的工具酶、基因克隆的策略以及植物目的基因的分离克隆方法等内容。 关键词 植物基因基因克隆载体工具酶克隆策略分离克隆方法 Plant gene cloning Introduction Cloning (clone) refers to a cell or an individual organisms asexual reproduction produced offspring. Usually said cloning genes means
based on escherichia coli segment of DNA (or genes), including the main course target DNA, restructuring of the carrier, transformation of receptor cells and reorganization of screening and reproductive cells. This paper mainly introduces the characteristics of plant gene and gene cloning and carrier, gene clone tool enzyme, gene cloning and plant gene strategy of separation cloning method, etc. Keywords Plant gene cloning tool enzyme gene cloning vector method of separation of cloning strategy 一、植物基因的结构和功能 基因（gene）是核酸分子中包含了遗传信息的遗传单位。一般来说，植物基因都可分为转录区和非转录的调控区两部分。 （一）植物基因的启动子 启动子（promoter）是指在位于结构基因上游决定基因转录起始的区域，植物积阴德启动子包括三个较重要的区域，一时转录起始位点，而是转录起始位点上游25~40bp的区域，三是转录起始位点上游-75bp处或更远些的区域。 （二）植物基因的增强子序列
整个基因克隆实验流程(完整)
一、组织总RNA的提取 相关试剂：T rizol；氯仿；苯酚；异丙醇；75%乙醇；RNase-free水 相关仪器：制冰机；液氮&研钵/生物样品研磨仪；高速离心机；移液器（1ml、200μl、100μl/50μl）；涡旋振荡仪；恒温金属浴。 相关耗材：解剖工具，冰盒，离心管，离心管架，吸头（1ml，200μl/300μl），一次性手套，实验手套。 实验步骤 1.取暂养草鱼，冰上放置一段时间，然后解剖，剪取肠道50~100mg，放入研钵中，加入 液氮迅速研磨，然后加入1ml 预冷TRIzol试剂，充分研磨至无颗粒物存在。 2.转移到离心管中，室温放置5min，使细胞充分裂解； 3.按1ml Trizol加入200μl氯仿，盖上盖子，迅速充分摇匀15s，然后室温放置3min； 4.4℃，,12000g 离心15min； 此时混合物分为三层，下层红色的苯酚氯仿层，中间层和上层无色水相；RNA存在于无色水相中； 5.小心吸取上清液，千万不要吸取中间界面，否则有DNA污染；转移至一个新的离心管， 加入等体积的异丙醇，轻轻混匀； 6.室温放置10min；4℃，,12000g 离心10min； 7.弃上清，加入1ml 75%乙醇洗涤；涡旋，悬浮沉淀；4℃，,12000g 离心5min； 8.弃上清；可以再次用75%乙醇洗涤沉淀； 9.弃上清；用移液器轻轻吸取管壁或管底的残余乙醇，注意不要吸取沉淀；室温放置5min 晾干沉淀；（RNA样品不要过于干燥，否则极难溶解） 10.沉淀中加入30μl RNase-free水，轻弹管壁，使RNA溶解。 RNA质量检测 相关试剂：溴酚蓝，TEB/TAE电泳缓冲液，溴乙锭（EB） 相关仪器：（超微量分光光度计，移液器（2.5μl 或2μl 规格，10μl规格），电子天平，电泳仪，电泳槽，凝胶成像仪，微波炉，制冰机） 相关耗材：（无菌无绒纸，吸头，离心管架，PCR管，PCR管架，锥形瓶，烧杯，一次性手套，实验手套，冰盒） （1）RNA纯度的检测：测定其OD260和OD280的值，根据其OD260/ OD280的比值，当其比值在1.9~2.1之间，说明提取的总RNA纯度比较高，没有蛋白质和基因组的污染。 （2）RNA完整性的检测：取2μlRNA，与2μl溴酚蓝混匀，用1%的琼脂糖进行凝胶电泳，20min后，在凝胶成像系统中观察效果。当28S与18S条带清晰，且亮度比大约是2:1时，5S条带若隐若现，而且没有其它条带时，说明完整性不错，可以用于下游逆转录实验。
DNA分子克隆技术(也称基因克隆技术)
DNA分子克隆技术（也称基因克隆技术）：在体外将DNA分子片段与载体DNA片段连接，转入细胞获得大量拷贝的过程中DNA分子克隆(或基因克隆)。其基本步骤包括：制备目的基因→将目的基因与载体用限制性内切酶切割和连接，制成DNA重组→导入宿主细胞→筛选、鉴定→扩增和表达。载体（vecors）在细胞内自我复制，并带动重组的分子片段共同增殖，从而产生大量的DNA分子片段。主要目的是获得某一基因或NDA片段的大量拷贝，有了这些与亲本分子完全相同的分子克隆，就可以深入分析基因的结构与功能，随着引入的DNA片段不同，有两种DNA库，一种是基因组文库（genomic library）,另一种是cDNA库。 载体所谓载体是指携带靶DNA片段进入宿主细胞进行扩增和表达的工具。 细菌质粒是一种细菌染色体外小型双链环状结构的DNA，分子大小为1-20kb，对细菌的某些代谢活动和抗药性表型具有一定的作用。质粒载体是在天然质粒的基础上人工改造拼接而成。最常用的质粒是 pBR322。 基因库的建造 含有某种生物体全部基历的随机片段的重组DNA克隆群体，其含有感光趣的基因片段的重组子，可以通过标记探针与基因库中的重组子杂交等方法而筛选出来，所得到的克隆经过纯化和扩增，可用于进一步的研。其主步骤包括：（1）构建基因库迅速的载体；(2)DNA片段的制备；（3）DNA片段与载体DNA 的连接；（4）包装和接种。 cDNA库的建造 是指克隆的DNA片段，是由逆转录酶自mRNA制备的cDNA。cDNA库包括某特定细胞的全部cDNA克隆的文库，不含内含子。 特异基因的筛选 常用的方法有：（1）克隆筛选即探针筛选法；（2）抗体检测法，检测其分泌蛋白质来筛选目的基因；（3）放射免疫筛选法，查出分泌特异抗原的基因；（4）免疫沉淀法，进行特异基因的筛选。 核酸序列测定 DNA的碱基序列决定着基因的特性，DNA序列分析（测序，sequencing）是分子生物学重要的基本技术。无论从基因库中筛选的癌基因或经PCR法扩增的基因，最终均需进行核酸序列分析，可藉以了解基因的精细结构，获得其限制性内切酶图谱，分析基因的突变及对功能的影响，帮助人工俣成基因、设计引物，以及研究肿瘤的分子发病机制等。测序是在高分辨率变性聚丙烯酰胺凝胶电泳技术的基础上建立起来的。目前最常用的方法有Maxam-Gilbert的化学降解少和Sanger的双脱氧法等，近年来已有DNA序列自动测定仪问世。化学降解法是在DNA的片段的5`端标记核素，然后用专一性化学试剂将DNA特异地降解，在电泳和自显影后，可得到从标记端延伸的片段供测读序列和进行比较。一般能读出200-250个核苷酸序列。双脱氧法是采用核苷酸链终止剂，如：2`，3`-双脱氧核苷三磷酸ddNTP(如ddTTP、ddTTP、ddGTP和ddCTP中的一种)掺入到DNA链中以终止链的延长，与掺入4种正常的dNTP的混合物分成四组进行反应，这样可得到一组结尾长衙不一、不同专一性核苷酸链终止剂结尾的DNA片段，经凝胶电泳分离和放射自显影，可读出合成的DNA核苷酸序列，根据碱基互补原则，可推算出模板DNA分子的序列。
基因克隆及转基因方法
基因克隆及转基因 一、基因克隆及转基因过程 1、设计引物 软件是，用到里面的PrimerSelect和EditSeq。 一般原则：1、长度：18-25； 2、GC含量：40-60％，正反向引物相差不要大于5%； 3、Tm值：55以上（到65），实在不行50以上也可以，正反向引物相差不要大 于5； 4、3’端结尾最好是GC，其次是T，不要A； 5、正反向引物连续配对数小于4； 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何； （如果克隆的话不能满足条件也没办法。） 不是必须条件，但可以考虑：多个基因设计引物时，可尽量使Tm值相似，方便PCR。 步骤： 一、打开PrimerSelect和EditSeq。 二、在EditSeq中输入你的序列。 引物有一对F和R 1、对于F是从5’到3’，在序列的前部分选择长度为18-25bp的碱基，如果你是要验证就随便选，如果你是要克隆就在最开始选，不符合原则就只能在你选的后边增或减碱基。 2、将选择的F引物输入到PrimerSelect中，在File中选择Enter New Primer，复制，OK，然后可以看到引物的情况，看看长度、Tm、GC含量是不是符合标准，不符合就继续选。 3、对于R是从3’到5’，选中序列，在EditSeq的Goodies中选择第一个“反向互补”，此时序列已反向互补，按照前面F的方法搜索R的引物。、 4、注意你想要的目的带的大小，比如序列是1000bp，你想PCR出来800大小的目的带，那
就要看看F和R之间的长度在你想要的范围内。可以将R反向互补，在正向的序列中搜索R 在的位置，就是在EditSeq中选择Search，点击第一个Find，开始搜寻。 5、搜索完引物在PrimerSelec中的Report中选择前两个查看二聚体情况。 6、在NCBI上的Primer Blast上看引物特异性如何。 7、因为是克隆，所以引物要有酶切位点，酶切位点的加入主要考虑所用到的表达载体，在NEBcutter网站中输入总序列查看可用的酶切位点。在引物上游加入酶切位点，注意加入时载体的表达的方向，前面的酶切位点在引物F上，后面的酶切位点在引物R上。一般在引物上游还要加上两个保护碱基。 2、提取醋栗DNA 3、PCR扩增与目的基因回收 PCR先找合适的退火温度，找到后回收时就可以多PCR几管，一般我们用20ul的体系，PCR5管就可以回收，就是琼脂糖凝胶回收，将目的基因用刀片切下来，用试剂盒回收。回收完可以再跑电泳检测一遍。 PCR： 20ul体系：灭菌水，若模板为质粒灭菌水； ； 10乘Taq ； 引物F、R各； 模板1ul；若为质粒就够； 最后加入Taq酶，Taq酶现用现拿。 过程：我们用的是预变性94℃3min； 然后进入循环（要进行克隆的话循环数最好不要超过30个），循环过程：变性94℃30s，退火退火温度下30s，延伸72℃时间根据目的基因长度和酶而定，一般Taq酶30s可以延伸1kb； 循环完成后，此时尚有正处于合成过程中的dna链,为了保证充分的得率,所以再增加7分钟的72℃延伸； 最后4℃保存待用。
PCR技术克隆目的基因全过程
实验：目的基因克隆（PCR技术） 【课前预习】 PCR (polymerase chain reaction) 反应的基本原理。 【目的要求】 1．学习和掌握PCR 反应的基本原理与实验技术方法。 2．认真完成每一步实验操作，详细记录实验现象和结果并加以分析和总结。 【基本原理】 类似于DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA 经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR 扩增形成的双链DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA 与引物的退火(复性)：模板DNA 经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA 单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4 分钟，2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。到达平台期(Plateau)所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。【实验用品】 1．材料：重组质粒DNA作为模板 2．器材和仪器：移液器及吸头，硅烷化的PCR 小管，DNA扩增仪(PE 公司)，琼脂糖凝胶电泳所需设备(电泳槽及电泳仪)，台式高速离心机 3．试剂： ①10×PCR 反应缓冲液：500mmol/L KCl, 100mmol/L Tris·Cl, 在25℃下, pH9.0, 1.0％Triton X-100。 ②MgCl2 ：25mmol/L。 ③ 4 种dNTP 混合物:每种 2.5mmol/L。 ④Taq DNA聚合酶5U/μl。 ⑤T4 DNA连接酶及连接缓冲液：
基因克隆的几种常见方法
基因克隆得几种常见方法 基因（gｅｎe)就是遗传物质得最基本单位,也就是所有生命活动得基础。不论要揭示某个基因得功能,还就是要改变某个基因得功能,都必须首先将所要研究得基因克隆出来。特定基因得克隆就是整个基因工程或分子生物学得起点。本文就基因克隆得几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因 对已知序列得基因克隆就是基因克隆方法中最为简便得一种。获取基因序列多从文献中查取，即将别人报道得基因序列直接作为自己克隆得依据。现在国际上公开发行得杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及得基因序列在基因库中注册，拟发表得文章中仅提供该基因在基因库中得注册号(acｃｅssion numｂer）,以便别人参考与查询。目前，世界上主要得基因库有１）EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室得基因库，其网上地址为; （2)Genbank，为设在美国国家卫生研究院(ＮIＨ）得基因库，其网上地址为;（3)Swｉssport与TＲEMBＬ,Swissport就是一蛋白质序列库,其所含序列得准确度比较高,而TREMBＬ只含有从EＭBＬ库中翻译过来得序列。目前,以Geｎbａnk得应用最频繁。这些基因库就是相互联系得,在Genbank注册得基因序列,也可能在Swisspoｒt注册。要克隆某个基因可首先通过Inｔeｒnet查询一下该基因或相关基因就是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都就是免费得,因而极易将所感兴趣得基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异得引物，通过PＣＲ从基因组中克隆该基因,也可以通过RＴ-PCＲ克隆cＤNA。值得注意得就是,由于物种与分离株之间得差异,为了保证PＣR扩增得准确性,有必要采用两步扩增法,即neｓted PCR。 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质得基因扩增出来。在基因文库中注册得蛋白质序列都可以找到相应得ＤNA或cDNＡ序列。如蛋白质序列就是自己测定得，那么需要设计至少１对简并引物(dｅgｅneｒated ｐrimeｒ),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆得基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物得特异性。 另外,在基因克隆之后，如还要进一步做表达研究，所使用得PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶，而采用其她有自我检测（reading proｏf)功能得酶,如pfｕ。这样可以避免由于扩增过程中出现得点突变或终止密码子而导致整个研究结论得错误。 ２根据已知探针克隆基因 这也就是基因克隆得一种较直接得方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理得基因组DNＡ杂交,最后将所识别得片段从胶中切下来，克隆到特定得载体（质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中得拷贝数。
基因克隆步骤完整版
1总RNA提取 (1) 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将1mlTrizol加到离心管中待用 (2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min；打开离心机预冷 (3) 加200 μL氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层； (4) 4o C，12,000g，离心15 min； (5) 取上清，加500 μL异丙醇，混匀，室温放置10 min； (6) 4o C，12,000g，离心10 min； (7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗 (8) 4o C，7,500g，离心5 min； (9) 弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC 水，－80o C保存。 此操作中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。提取的总RNA 需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。OD260值为核酸的吸收值，OD280值为蛋白的吸收值，OD260/280值在1.8-2.0间一般说明该核酸蛋白含量在允许的范围内，可正常使用；此外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD260/230值能达到2.2左右。RNA浓度计算公式：总RNA 浓度（μg/mL）=A260×稀释倍数×40。
2反转录/cDNA第一链的合成 纯化RNA以去除基因组DNA，操作按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。其体系为： Total RNA 1μg 5×gDNA Eraser Buffer 2μL gDNA Eraser 1μL RNase Free dH2O 补齐至10μL 条件为：42o C，2min； RNA纯化后，即可进行反转录。其体系为： 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time）4μL PrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μL RT Primer Mix 1μL 上一步的反应液10μL RNase Free dH2O 补齐至20μL 操作条件为： (1) 37o C放置15 min；(2) 85o C，5 sec；(3) 4o C保存。 3 PCR 按TaKaRa公司的Premix Taq Version 2.0操作，，PCR反应体系如下： Premix Taq25μL 模板5μL 引物1 (10 μM) 1μL 引物2 (10 μM) 1μL ddH2O 18μL PCR反应条件为：94°C预变性5min；94°C变性30s，53°C退火30s，72°C 延伸30s，循环36次；72°C延伸10min。 PCR反应完毕，取5μL反应产物进行1%琼脂糖凝胶电泳（若割胶回收则用10μL反应产物）。
基因克隆的几种常见方法
基因克隆的几种常见方法 基因(gene)是遗传物质的最基本单位,也是所有生命活动的基础。不论要揭示某个基因的功能,还是要改变某个基因的功能,都必须首先将所要研究的基因克隆出来。特定基因的克隆是整个基因工程或分子生物学的起点。本文就基因克隆的几种常用方法介绍如下。 1 根据已知序列克隆基因 对已知序列的基因克隆是基因克隆方法中最为简便的一种。获取基因序列多从文献中查取,即将别人报道的基因序列直接作为自己克隆的依据。现在国际上公开发行的杂志一般都不登载整个基因序列,而要求作者在投稿之前将文章中所涉及的基因序列在基因库中注册,拟发表的文章中仅提供该基因在基因库中的注册号(accession number),以便别人参考和查询。目前,世界上主要的基因库有1)EMBL,为设在欧洲分子生物学实验室的基因库,其网上地址为 https://www.wendangku.net/doc/e7163531.html,/ebi-home.html;(2)Genbank,为设在美国国家卫生研究院(NIH)的基因库,其网上地址为 https://www.wendangku.net/doc/e7163531.html,/web/search/index.html;(3)Swissport和TREMBL,Swissport是一蛋白质序列库,其所含序列的准确度比较高,而TREMBL只含有从EMBL库中翻译过来的序列。目前,以Genbank的应用最频繁。这些基因库是相互联系的,在Genbank注册的基因序列,也可能在Swissport注册。要克隆某个基因可首先通过Internet查询一下该基因或相关基因是否已经在基因库中注存。查询所有基因文库都是免费的,因而极易将所感兴趣的基因从库中拿出来,根据整个基因序列设计特异的引物,通过PCR从基因组中克隆该基因，也可以通过RT-PCR克隆cDNA。值得注意的是,由于物种和分离株之间的差异,为了保证PCR 扩增的准确性,有必要采用两步扩增法,即nested PCR。 根据蛋白质序列也可以将编码该蛋白质的基因扩增出来。在基因文库中注册的蛋白质序列都可以找到相应的DNA或cDNA序列。如蛋白质序列是自己测定的,那么需要设计至少1对简并引物(degenerated primer),从cDNA文库中克隆该基因。以这种方法克隆的基因必须做序列测定才能鉴别所扩增产物的特异性。 另外,在基因克隆之后,如还要进一步做表达研究,所使用的PCR酶最好不用Taq DNA聚合酶,而采用其他有自我检测(reading proof)功能的酶,如pfu。这样可以避免由于扩增过程中出现的点突变或终止密码子而导致整个研究结论的错误。 2 根据已知探针克隆基因 这也是基因克隆的一种较直接的方法。首先将探针作放射性或非放射性标记,再将其与用不同内切酶处理的基因组DNA杂交,最后将所识别的片段从胶中切下来，克隆到特定的载体(质粒、噬菌体或病毒)中作序列测定或功能分析。这种方法不但可以将基因克隆出来,还能同时观察该基因在基因组中的拷贝数。但在探
基因克隆详细步骤说明书
实验一 大肠杆菌感受态细胞的制备及转化 [实验原理]（供参考，试剂盒的Solution SS成分未知） 细菌处于容易吸收外源DNA的状态叫感受态。转化是指质粒DNA或以它为载体构建的重组子导入细菌的过程。其原理是：在0℃下的CaCl2低渗溶液中，细菌细胞膨胀成球形。转化缓冲液中的DNA形成不易被DNA酶所降解的羟基—钙磷酸复合物，此复合物粘附于细菌细胞表面。42℃短时间热处理（热休克），可以促进细胞吸收DNA复合物。将处理后的细菌放置在非选择性培养液中保温一段时间，促使在转化过程中获得的新的表型(如Amp抗性) 得到表达。然后再涂布于含有氨苄青霉素的选择性平板上，37℃培养过夜，这样即可得到转化菌落。 [仪器、材料与试剂] (一)仪器1．小型高速离心机2．恒温摇床3．恒温箱4．‐20℃冰箱5．恒温水浴器 (二)材料1．氨苄青霉素2．大肠杆菌DH5a3．pUC194．1.5mL 离心管5．枪头、枪6．试管、培养皿 (三)试剂1．快速感受态细菌制备试剂盒（申能博彩公司产品）2．LB培养液在950mL去离子水中加入：胰蛋白胨 (tryptone) 10g酵母提取物 (yeast extract) 5g NaCl 10g 摇动容器直至溶质完全溶解，用Na0H调节pH至7.0，加入去离子水至总体积为1L，121℃湿热灭菌20min。 3．氨苄青霉素(Amp)，用无菌水配制成100mg／mL 溶液，置‐20℃冰箱保存。 [实验步骤] 1．从大肠杆菌DH5a平板上挑取一个单菌落接于2mL LB培养液的试管中，37℃振荡培养过夜。 2．取50mL菌液转接到一个含有5mL LB培养液锥形瓶中，37℃振荡培养2小时。 以下步骤按修改后的试剂盒说明书进行。 3．用灭菌的枪头取0.5mL的大肠杆菌培养物于1.5mL灭菌离心管中，冰上放置3分钟后，加入0.5mL预冷的Solution SS。在冰上小心地用1mL 枪头将细胞悬浮起来。注意：1mL的取液器设定在500mL。悬浮细胞要轻，防止细胞进入枪内。 4．将上述细胞分装于1.5mL离心管 (离心管要在放在冰上预冷) 中，每管0.1mL。细胞可以立即使用或储存。 5．将感受态细胞迅速转移到‐20℃或更低的低温冰中。注意：在转移过程中要防止温度升高，解决的办法之一是在塑料袋里装上低温冰块，将细胞迅速转移到塑料里，将整个塑料袋放到低温冰箱内。 转化：1．新鲜制备的或‐20℃下保存的100mL感受态细胞，置于冰上，完全解冰后轻轻地将细胞均匀悬浮。 2．加入5mL pUC19质粒，DNA浓度为10pg/mL，轻轻混匀。 3．冰上放置30分钟。 4．42℃水浴热激60秒。 5．冰上放置2分钟。 6．加400mL LB培养液，37℃ 250转／分振荡培养30分钟。 7．室温下4000rpm离心5分钟，用枪头吸掉400mL上清液，用剩余的培养液将细胞悬浮。 8．将细菌涂布在 Amp/LB琼脂平板上。 9．平皿在37℃下正向放置1小时，待接种的液体吸收进琼脂后，将平皿倒置，培养过夜。 [实验结果]经37℃培养过夜的、在氨苄青霉素/LB琼脂平板上出现的菌落即为pUC19质粒转化的大肠杆菌。计数菌落总数，计算制备的感受态菌的转化效率，以每mg 质粒DNA 转化的菌落数表示。
基因克隆步骤完整版
基因克隆步骤完整版 Company Document number：WTUT-WT88Y-W8BBGB-BWYTT-19998
1总RNA提取 (1) 液氮研磨或冰上匀浆实验材料；先将1ml Trizol加到离心管中待用 (2) 将研磨好的样品加到离心管中混匀，室温放置5 min；打开离心机预冷 (3) 加200 μL氯仿，振荡15 sec，室温放置3 min，分层； (4) 4o C，12,000g，离心15 min； (5) 取上清，加500 μL异丙醇，混匀，室温放置10 min； (6) 4o C，12,000g，离心10 min； (7) 弃上清，加1 mL75%乙醇，漂浮洗涤沉淀，振荡充分；再用100%乙醇清洗 (8) 4o C，7,500g，离心5 min； (9) 弃上清，离心，用枪吸取多余液体，放在超净台里干燥后，加50 μL DEPC水，－80o C保存。 此操作中所用到的器皿均需经过DEPC灭活RNA酶处理。提取的总RNA 需经RNA电泳检测质量，并用紫外分光光度计测定浓度。OD260值为核酸的吸收值，OD280值为蛋白的吸收值，OD260/280值在间一般说明该核酸蛋白含量在允许的范围内，可正常使用；此外还有OD230值为多糖和酚类的吸收值，比较干净的核酸OD260/230值能达到左右。RNA浓度计算公式：总RNA 浓度 （μg/mL）=A260×稀释倍数×40。 2反转录/cDNA第一链的合成 纯化RNA以去除基因组DNA，操作按TaKaRa公司的PrimeScript RT reagent with gDNA Eraser(Perfect Real Time)说明书进行。其体系为： Total RNA 1μg 5× gDNA Eraser Buffer 2μL gDNA Eraser 1μL RNase Free dH2O 补齐至10μL 条件为：42o C，2min； RNA纯化后，即可进行反转录。其体系为： 5×PrimeScript Buffer 2（for Real Time） 4μL PrimeScript RT enzyme mix Ⅰ1μL RT Primer Mix 1μL 上一步的反应液10μL RNase Free dH2O 补齐至20μL 操作条件为： (1) 37o C放置15 min； (2) 85o C，5 sec； (3) 4o C保存。
基因克隆基本实验方法
重组质粒的连接、转化及筛选 第一节概述 质粒具有稳定可靠和操作简便的优点。如果要克隆较小的DNA片段(＜10kb)且结构简单,质粒要比其它任何载体都要好。在质粒载体上进行克隆,从原理上说是很简单的，先用限制性内切酶切割质粒DNA和目的DNA片段, 然后体外使两者相连接, 再用所得到重组质粒转化细菌,即可完成。但在实际工作中, 如何区分插入有外源DNA的重组质粒和无插入而自身环化的载体分子是较为困难的。通过调整连接反应中外源DNA片段和载体DNA的浓度比例,可以将载体的自身环化限制在一定程度之下,也可以进一步采取一些特殊的克隆策略,如载体去磷酸化等来最大限度的降低载体的自身环化,还可以利用遗传学手段如α互补现象等来鉴别重组子和非重组子。 外源DNA片段和质粒载体的连接反应策略有以下几种： 1、带有非互补突出端的片段用两种不同的限制性内切酶进行消化可以产生带有非互补的粘性末端,这也是最容易克隆的DNA片段，一般情况下,常用质粒载体均带有多个不同限制酶的识别序列组成的多克隆位点，因而几乎总能找到与外源DNA片段末端匹配的限制酶切位点的载体，从而将外源片段定向地克隆到载体上。也可在PCR扩增时，在DNA片段两端人为加上不同酶切位点以便与载体相连。 2、带有相同的粘性末端用相同的酶或同尾酶处理可得到这样的末端。由于质粒载体也必须用同一种酶消化，亦得到同样的两个相同粘性末端，因此在连接反应中外源片段和质粒载体DNA均可能发生自身环化或几个分子串连形成寡聚物, 而且正反两种连接方向都可能有。所以，必须仔细调整连接反应中两种DNA的浓度, 以便使正确的连接产物的数量达到最高水平。还可将载体DNA的5'磷酸基团用碱性磷酸酯酶去掉, 最大限度地抑制质粒DNA的自身环化。带5'端磷酸的外源DNA片段可以有效地与去磷酸化的载体相连, 产生一个带有两个缺口的开环分子,在转入E. coli受体菌后的扩增过程中缺口可自动修复。 3、带有平末端是由产生平末端的限制酶或核酸外切酶消化产生，或由DNA聚合酶补平所致。由于平端的连接效率比粘性末端要低得多，故在其连接反应中，T4 DNA连接酶的浓度和外源DNA及载体DNA 浓度均要高得多。通常还需加入低浓度的聚乙二醇(PEG 8000)以促进DNA分子凝聚成聚集体的物质以提高转化效率。 特殊情况下，外源DNA分子的末端与所用的载体末端无法相互匹配,则可以在线状质粒载体末端或外源DNA片段末端接上合适的接头(linker)或衔接头(adapter)使其匹配, 也可以有控制的使用E. coli DNA聚合酶Ⅰ的klenow大片段部分填平3'凹端,使不相匹配的末端转变为互补末端或转为平末端后再进行连接。 本实验所使用的载体质粒DNA为pBS,转化受体菌为E. coli DH5α菌株。由于pBS上带有Ampr 和lacZ 基因,故重组子的筛选采用Amp抗性筛选与α-互补现象筛选相结合的方法。 因pBS带有Ampr 基因而外源片段上不带该基因,故转化受体菌后只有带有pBS DNA的转化子才能在含有Amp的LB平板上存活下来;而只带有自身环化的外源片段的转化子则不能存活。此为初步的抗性筛选。 pBS上带有β-半乳糖苷酶基因(lacZ)的调控序列和β-半乳糖苷酶N端146个氨基酸的编码序列。这个编码区中插入了一个多克隆位点,但并没有破坏lacZ的阅读框架,不影响其正常功能。E. coli DH5α菌株带有β-半乳糖苷酶C端部分序列的编码信息。在各自独立的情况下,pBS和DH5α编码的β-半乳糖苷酶的片段都没有酶活性。但在pBS和DH5α融为一体时可形成具有酶活性的蛋白质。这种lacZ基因上缺失近操纵基因区段的突变体与带有完整的近操纵基因区段的β-半乳糖苷酸阴性突变体之间实现互补的现象叫α-互补。由α-互补产生的Lac+ 细菌较易识别，它在生色底物X-gal(5-溴-4氯-3-吲哚-β-D-半乳糖苷)下存在下被IPTG(异丙基硫代-β-D-半乳糖苷)诱导形成蓝色菌落。当外源片段插入到pBS质粒的多克隆位点上后会导致读码框架改变, 表达蛋白失活, 产生的氨基酸片段失去α-互补能力, 因此在同样条件下含重组质粒的转化子在生色诱导培养基上只能形成白色菌落。在麦康凯培养基上，α-互补产生的Lac+细菌由于含β-半乳糖苷酶，能分解麦康凯培养基中的乳糖，产生乳酸，使pH下降，因而产生红色菌落，而当外源片段插入后，失去α-互补能力，因而不产生β-半乳糖苷酶，无法分解培养基中的乳糖，菌落呈白色。由此可将重组质粒与自身环化的载体DNA分开。此为α-互补现象筛选。 第二节材料、设备及试剂 一、材料 外源DNA片段: 自行制备的带限制性末端的DNA溶液,浓度已知; 载体DNA: pBS质粒(Ampr ,lacZ),自行提取纯化,浓度已知; 宿主菌: E. coli DH5α,或JM系列等具有α-互补能力的菌株。 二、设备 恒温摇床，台式高速离心机，恒温水浴锅，琼脂糖凝胶电泳装置，电热恒温培养箱，电泳仪无菌，工作台，微量移液枪，eppendorf管。 三、试剂 1、连接反应缓冲液(10×)：0.5mol/L Tris·Cl (pH7.6)，100mol/L MgCl2，100mol/L 二硫苏糖醇(DTT)(过滤灭菌），500μg/ml 牛血清清蛋白(组分V.Sigma 产品）（可用可不用），10mol/L A TP（过滤灭菌）。 2、T4 DNA连接酶(T4 DNA ligase)；购买成品。 3、X-gal储液(20mg/ml): 用二甲基甲酰胺溶解X-gal配制成20mg/ml的储液, 包以铝箔或黑纸以防止受光照被破坏, 储存于-20℃。 4、IPTG储液(200mg/ml): 在800μl蒸馏水中溶解200mg IPTG后,用蒸馏水定容至1ml,用0.22μm滤膜过滤除菌，分装于eppendorf管并储于-20℃。
基因克隆方法步骤
克隆步骤 一、目的片段的回收纯化 1．柱平衡步骤：向吸附柱CB2中（吸附柱放入收集管中）加入500ul 平衡液BL,12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 重新放回收集管中。（请使用当天处理过的柱子）。 2．将单一的目的DNA条带从琼脂糖凝胶中切下（尽量切除多余部分）放入干净的离心管中，称取重量。 3．向胶块中加入加入溶液PC(0.1g加入100ul，注意没过胶块)，50℃水浴放置10min左右，期间不断温和地上下翻转离心管，已确保胶块 充分溶解。 4．将上一步所得溶液加入一个吸附柱（吸附柱放入收集管中），12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱重新放回收 集管中。 5．向吸附柱CB2中加入600ul漂洗液（使用前请先检查是否已加入无水乙醇），12000rpm离心1min，倒掉收集管中的废液，将吸附柱 重新放回收集管中。 6．重复步骤5. 7．将吸附柱CB2放入收集管中，12000rpm离心2min，尽量除去漂洗液，将吸附柱置于室温放置数分钟，彻底晾干。 8．将吸附柱CB2放入一个干净的1.5ml离心管中，向吸附膜中间位置悬空滴加40ul的无菌水。室温放置2min，12000rpm离心2min， 收集DNA溶液。(可以将离心后的溶液重新加到柱子中再回收一次) 9．取2ulDNA加入loading buffer点样，电泳检测是否回收出来样品。 二、目的片段与载体的连接 1. 将回收的目的片段与T 载体连接，反应体系如下： 目的片段 4 .5μL pMD19-T simple Vector 0.5μL SolutionⅠ 5 μL Total 10 μL
(整理)DNA克隆.
人类基因组计划的主要内容：1、阐明人类基因组序列，发现所有人类基因并搞清其在染色体上的位置。2、破译人类全部遗传信息，使人类第一次在分子水平上全面地认识自我。3、解码生命、了解生命的起源和生命体生长发育规律。4、认识种属之间和个体之间存在差异的起因、认识疾病产生的机制以及长寿与衰老等生命现象，为疾病的诊治提供科学依据。 引物设计的原则：1、引物的长度以15-30bp为宜。2、（G+C）的含量45-55%，引物的Tm值可用共识计算：﹛Tm=4（G+C）+2（A+T）﹜。3、避免两引物间的互补，以免形成引物二聚体。4、引物一定要与模版DNA配对。5、引物必须经GenBank查询后，证实没有与其他非目的DNA有高度互补，才能使用。 蛋白质一、二、三、四级结构及其相应功能：1、一级结构：多肽链中氨基酸的排列顺序，包括二硫键的位置称为蛋白质的一级结构(primary structure)。这是蛋白质最基本的结构，它内寓着决定蛋白质高级结构和生物功能的信息。2、二级结构：指肽链主链不同区段通过自身的相互作用，形成氢键，沿某一主轴盘旋折叠而形成的局部空间结构，是蛋白质结构的构象单元。主要有以下类型：（1）α－螺旋（2）β－折叠（3）β－转角（4）无规则卷曲。3、三级结构：多肽键在二级结构的基础上，通过侧链基团的相互作用进一步卷曲折叠，借助次级键维系使α－螺旋、β－折叠片、β－转角等二级结构相互配置而形成特定的构象。三级结构的形成使肽链中所有的原子都达到空间上的重新排布。4、四级结构：指由相同或不同的称作亚基（subunit）的亚单位按照一定排布方式聚合而成的蛋白质结构，维持四级结构稳定的作用力是疏水键、离子键、氢键、范得华力。亚基本身都具有球状三级结构，一般只包含一条多肽链，也有的由二条或二条以上由二硫键连接的肽链组成。 琼脂糖凝胶电泳的原理：在一定PH条件下，每一种分子都具有特定的电荷（种类和数量）、大小和形状，在一定时间内他们在相同电场中泳动速度不同，各自集中到特定的位置上而形成紧密的泳动带。在当低浓度的荧光嵌入染料溴化乙锭(EB)染色，在紫外光下至少可以检出1-10mg的DNA条带，从而可以确定DNA 片段在凝胶中的位置。（特点：电泳支持介质：琼脂糖；琼脂糖凝胶电泳分离DNA 片度大小范围较广，不同浓度琼脂糖凝胶可分离长度从200bp至近50kb的DNA 片段，其分辨率比聚丙烯酰胺凝胶低，但制备容易，分离范围广，尤其适当分离大片段DNA。） 转录的机制：1、起始，RNA聚合酶是负责转录的酶，它结合到被称为启动子的特定DNA序列上以起始RNA的合成。这些序列位于蛋白质编码区的上游(5'端)，含有一些短而保守的DNA序列，在不同启动子中这些序列是相同的。RNA聚合酶结合到双链DNA的启动子序列上，引起DNA局部解旋。合成第一个RNA碱基的位置称为起始位点，其位置称为+1。2、延伸.RNA聚合酶沿着DNA链移动，顺次合成RNA链。DNA在移动的聚合酶抵达之前解旋，在其经过之后又恢复成双螺旋。 3、终止，RNA聚合酶识别终止子，导致不再有新的核苷酸插入，该序列通常是发夹结构。 蛋白质翻译机制：1、起始①30S亚基与mRNA的结合:在一定Mg2+的生理条件下,核糖体亚基很容易缔合,所以70S核糖体在IF3作用下解离,然后再形成30S-IF3复合物,接着与mRNA结合.②30S-IF3-mRNA与起始tRNA结合:在IF1和IF2的作用下和GTP的参与下,30S-IF3-mRNA与起始fMet-tRNAf结合,形成30S起始复合物30S-mRNA-fMet-tRNAf-GTP-IF1-IF2,并释放出IF3.③70S起始复合物的形成:50S的加入和GTP的水解,形成70S起始复合物70S-mRNA-fMet-tRNAf,释放出