荧光技术在两亲性聚合物研究中的应用_丁敏
第22卷第2/3期2010年3月
化 学 进 展
PROGRESS I N CHE M I ST RY
Vol .22No .2/3
Mar .,2010
收稿:2009年3月,收修改稿:2009年6月
3国家自然科学基金项目(No .20734004,20804059)资助
33Corres ponding author e 2mail:ceszl@mail .sysu .edu .cn;ces wuq@mail .sysu .edu .cn
荧光技术在两亲性聚合物研究中的应用
3
丁 敏 郭丽华 张 玲
33
伍 青
33
(新型聚合物材料设计合成与应用广东省高校重点实验室聚合物复合材料与功能材料教育部重点实验室
中山大学化学与化学工程学院 广州510275)
摘 要 本文综述了应用荧光技术研究不同结构的两亲性聚合物性质的研究进展,涉及的不同结构两
亲性聚合物主要有两亲性嵌段共聚物、两亲性接枝共聚物、两亲性树状聚合物以及其他结构的两亲性聚合物;说明了荧光技术可以用于研究聚合物疏水(或亲水)基团的结构参数(如骨架、长度、取代度和分子量)的变化,对两亲性聚合物的微环境性质(如微极性、微黏度、局部黏结力)、聚集行为(如临界聚集浓度)以及其他性质(如临界胶束浓度)的影响规律,以便对功能性更强的两亲性聚合物的合成提供理论指导。
关键词 两亲性聚合物 荧光光谱 接枝共聚物 树状聚合物中图分类号:O63111 文献标识码:A 文章编号:10052281X (2010)02/320458207
Fluorescence Techn i que i n Stud i es of Am ph i ph ili c Poly m er
D ing M in Guo L ihua Zhang L ing
33
W u Q ing
33
(DS AP M Lab,PCF M Lab,School of Che m istry and Che m ical Engineering,
Sun Yat 2Sen University,Guangzhou 510275,China )
Abstract This article describes the study of fluorescence technique in variable structures of a mphi philic poly mers,including a mphi philic bl ock copoly mers,a mphi philic graft copoly mers,a mphi philic dendri m ers as well as other a mphi philic poly mers .It is shown that the effects of changes in structural para meters,such as backbone,length,degree of substituti on and molecular weight of poly mer ’s hydr ophobic (hydr ophilic )gr oup s,on the p r operty of poly mer m icr oenvir onment (such as m icr opolarity,m icr oviscosity,l ocal cohesi on ),aggregati on behavi or (such as the critical aggregati on concentrati on )and s ome other p r operties (such as critical m icelle concentrati on )have been studied by fluorescence technique .
These studies p r ovide theoretical instructi ons t o the synthesis of
a mphi philic poly mers with more powerful functi ons .
Key words a mphi philic poly mer;fluorescence s pectr oscopy;graft copoly mers;dendri m ers
Con ten ts
1 I ntr oducti on
2 Fluorescence technique in studies of a mphi philic
bl ock copoly mers
211 The m icr oenvir on mental p r operty of a mphi philic
bl ock copoly mers 212 The
aggregati on
behavi or
of
a mphi philic
bl ock copoly mers
213 Some other p r operties of a mphi philic bl ock co 2
poly mers
3 Fluorescence technique in studies of a mphi philic
graft copoly mers
311 The m icr oenvir on mental p r operty of a mphi philic
graft copoly mers
312 The aggregati on behavi or of a mphi philic graft co 2
第2/3期丁 敏等 荧光技术在两亲性聚合物研究中的应用?459
?
poly mers
313 Some other p r operties of a mphi philic graft copoly2 mers
4 Fluorescence technique in studies of a mphi2 philic dendri m ers
5 Fluorescence technique in studies of other a m2 phi philic poly mers
6 Conclusi on and f orecast
1 引言
两亲性聚合物是一类同时含有亲水基团和疏水基团的聚合物,因其独特的性质,如pH/温度响应[1—3],自组装特性[4]等,两亲性聚合物在药物载体[5—9]、相转移[10]、纳米材料[11—13]、催化剂[14,15]、环境净化等领域具有潜在的应用前景。
荧光技术(包括稳态荧光、时间分辨荧光、荧光动力学等)是研究微观非均相环境(如胶束等)局部性质的一种先进技术,它是利用探针分子周围环境的变化引起荧光光谱的改变这一现象来研究胶束内部空腔的微环境性质(如微极性、微黏度、局部黏结力)、胶束聚集行为(如临界聚集浓度)以及其他性质(如临界胶束浓度)等。由于具有灵敏度高、选择性好、操作简便、取样量少、样品可进行无损分析等特点,使得它在表征两亲性聚合物结构改变方面比红外光谱、核磁共振谱、质谱等手段更有优势。本文将综述荧光技术在两亲性嵌段共聚物、两亲性接枝共聚物、两亲性树状聚合物中的研究进展,其中大部分研究体系都是涉及水相,个别在有机溶剂中进行的测试表征均明显标出。
2 荧光技术在两亲性嵌段共聚物研究中的应用
211 利用荧光技术研究两亲性嵌段共聚物的微环境性质
Ki m课题组[16,17]通过开环聚合分别合成了以聚(22乙基222唑啉)为亲水嵌段,以聚(L2丙交酯) (P LA)、聚(ε2己内酯)(PCL)或聚(1,32三亚甲基碳酸)(PT MC)为不同疏水嵌段的三种两亲性二嵌段共聚物。以1,62二苯基21,3,52己三烯(DPH)为荧光探针,通过荧光偏振技术测定探针在嵌段共聚物中的稳态荧光各向异性值(r)来估算探针周围的微黏度,一般来说,r值越大,微黏度越大。研究表明,以PCL为疏水嵌段的共聚物的r值最小,以PT MC 为疏水嵌段的共聚物的r值最大,说明了疏水嵌段化学结构的不同对探针周围的微黏度影响很大;然
而当疏水嵌段化学结构相同时,r值不受疏水嵌段长度变化的影响,说明了疏水嵌段的长度对探针周围的微黏度影响不大。另外,他们通过氢化硅烷化(hydr osilylati on)和烷基化反应合成了以线型聚环氧乙烷(PE O)为亲水嵌段、以树状碳硅烷(carbosi2 lane)为疏水嵌段的两亲性二嵌段共聚物[18]。采用类似的方法来研究两亲性嵌段共聚物结构的改变对探针周围微黏度的影响,结果表明探针在第一、二代树状碳硅烷胶束核中的r值比较接近,但是比在两亲性线性聚合物胶束中的r值要小,说明了第一、二代树状碳硅烷胶束核环境的微黏度变化不大,但是比两亲性线性聚合物胶束核环境的微黏度要小,其原因是胶束核的结构不同(树状胶束核为支化结构,而两亲性线性聚合物的核为紧密堆积结构)。
Tenhu等[19]通过自由基聚合合成了聚(N2异丙基丙基酰胺)2b2聚环氧乙烷。以42(二氰基亚甲基)222甲基262对二甲基氨基苯乙烯基)2四氢吡喃(4HP)为荧光探针,利用探针的荧光发射光谱荧光最大发射强度随波长的变化研究了不同疏水嵌段长度对探针周围微黏度性质的影响。研究表明,随着疏水嵌段长度的增加,探针在共聚物中的荧光最大发射强度向短波移动,说明了探针周围的微黏度随之增大。
212 利用荧光技术研究两亲性嵌段共聚物的聚集行为
荧光除应用于两亲性嵌段共聚物的微环境性质研究外,还常用于研究其聚集行为。Verrall等[20]通过荧光探针分子芘的荧光发射光谱的I
1
/I3(第一、三振动带强度比)随温度的变化研究了不同疏水(或亲水)嵌段长度对聚氧乙烯2b2聚氧丙烯2b2聚氧乙烯(P OE2P OP2P OE)聚集行为的影响。研究表明,在相同的P OP/P OE摩尔质量比时,疏水和亲水嵌
段越长,I
1
/I3值越小,临界聚集温度(C MT)越低;在
相同的疏水嵌段长度时,亲水嵌段越短,I
1
/I3值越小,C MT越低。另外,他们采用了两种麻醉剂分子(三氟溴氯乙烷和异氟醚)来研究共聚物的聚集行为。结果表明,它们对共聚物聚集行为的影响类似于增加温度,在加与不加麻醉剂的情况下C MT都符合以上规律,但是加了麻醉剂的C MT比没有加麻醉剂的C MT要低,其原因是麻醉剂分子和共聚物的氢键作用以及对胶束核(P OP)的脱水作用。
W ang等[21]通过开环聚合合成了以PCL为疏水嵌段、侧基带功能化羟基的聚磷脂为亲水嵌段的两
?460
?化 学 进 展第22卷
亲性嵌段共聚物。利用芘的荧光激发光谱的I
338nm
/ I335nm(338n m和335n m时的荧光强度)随浓度的变化研究了嵌段共聚物的疏水嵌段含量对临界聚集浓度(CAC)的影响。研究表明,嵌段共聚物在水溶液中自组装而导致聚集,其CAC随着疏水嵌段含量的增加而降低。
Grinstaff等[22]通过酯化反应合成了树状大分子2b2线型PEG2b2树状大分子的两亲性三嵌段共聚物,其中树状大分子是通过琥珀酸和丙三醇间酯键连接而成。通过芘的荧光发射光谱的荧光强度随共聚物浓度的变化研究了在油相环境中树状大分子的代数和PEG的分子量对嵌段共聚物CAC的影响。结果表明,树状部分对CAC影响很大,CAC随着树状大分子代数的增加而降低;在相同代数的情况下, PEG的分子量对CAC影响不大。
213 利用荧光技术研究两亲性嵌段共聚物的其他性质
荧光技术还可以用来研究两亲性嵌段共聚物的临界胶束浓度(C MC),已有很多文献报道用荧光技术研究嵌段共聚物的C MC[16—18,23—30]。实验结果表明,随着疏水嵌段含量及长度的增加、疏水嵌段空间位阻的增大,嵌段共聚物的C MC降低;随着亲水嵌段长度的增加,嵌段共聚物的C MC增大。
Muller等[31]通过原子转移自由基聚合(ATRP)合成了聚丙烯酸正丁酯2b2聚丙烯酸,通过荧光相关光谱(FCS)的自相关函数公式估算了嵌段共聚物胶束的流体力学半径(hydr odyna m ic radius)。研究表明,胶束的流体力学半径随着亲水嵌段长度的增加而增大。
Zhao等[32]通过AT RP合成了聚环氧乙烷2b2聚甲基丙烯酸(22四氢吡喃)酯,利用荧光猝灭分析法研究了疏水嵌段长度对尼罗红释放速率的影响。结果表明,疏水嵌段越短,即疏水核越小,尼罗红的荧光猝灭速率越快,因此它在共聚物中的释放速率也就越快。
溶剂弛豫技术(s olvent relaxati on technique)是一种时间分辨荧光技术,可以用来研究嵌段共聚物胶束壳的结构、链段动力学等。Pr ocházka等[33]以聚苯乙烯2b2聚乙烯基吡啶2b2聚氧乙烯(PS2P VP2 P OE)三嵌段共聚物为研究对象,通过溶剂弛豫技术研究了pH响应的P OE壳的水合作用。采用了一种溶剂敏感的荧光探针62十六酰222(((22(三甲基氨基)乙基)甲基)氨基)氯化萘,它的疏水部分易包埋在胶束结构的非极性部分(PS或非质子化的P VP)中,带电荷的发荧光的头基定位在靠近核壳界面的P OE壳中,对溶剂弛豫行为进行跟踪。通过比较该三嵌段和二嵌段(PS2P VP)共聚物的St okes位移和弛豫时间,可以得知P OE壳在嵌段共聚物中的水合作用。利用时间分辨发射光谱的相关函数(correla2 ti on functi on)和半宽度(half2width)研究不仅可以测定溶剂在胶束体系中的弛豫速率,而且还可以判断溶剂弛豫的程度。
3 荧光技术在两亲性接枝共聚物研究中的应用
311 利用荧光技术研究两亲性接枝共聚物的微环境性质
Fischer等[34]通过对果胶进行疏水改性得到两亲性接枝共聚物,通过荧光发射光谱研究了取代度和烷基长度对疏水探针周围微环境性质的影响。共聚物在水中发生分子内缔合形成疏水微区,以芘和分子转子(molecular r ot or)1,12二氰基2(4′2N,N2二甲基氨基苯基)21,32丁二烯(DMAC)为荧光探针进行对比研究,通过测定芘的I
1
/I3、DMAC的荧光最大发射波长随共聚物浓度的变化来研究探针周围微极性的变化。研究表明,芘和DMAC都可以反映探针周围微极性的变化,而DMAC通过测定荧光量子产率还可以反映探针周围局部黏结力的变化,随着取代度和烷基长度的增加,探针周围的微环境极性降低,局部黏结力减少。I w asaki等[35]通过对22异丙基222氧代21,3,22二氧膦烷(I PP)、22(22氧代21,3, 22二氧膦酰乙氧基222溴代异丁酸)(OP BB)、22胆甾醇基222氧代21,3,22二氧膦烷(ChOP)进行开环聚合制得聚磷脂,然后通过ATRP在聚磷脂的OP BB位点上接枝亲水的MPC(22(甲基丙烯酰氧基)乙基磷酸胆碱),从而得到两亲性接枝共聚物。以胆甾醇基282苯胺212萘磺酸钠盐(ANS)为荧光探针,通过荧光发射光谱的荧光最大发射波长随浓度的变化研究了疏水ChOP的数目对接枝共聚物极性的影响,研究表明,Ch OP的数目越多,荧光最大发射波长越短,接枝共聚物的极性越小。N ichif or等[36]在聚糖的骨架上接枝N2烷基2N,N2二甲基2N2(22羟丙基)氯化铵侧基。以N2苯基萘胺(NP N)为荧光探针,利用荧光偏振技术测定探针在接枝共聚物中的稳态荧光各向异性值(r)来研究烷基链长度和阳离子侧基的取代度对探针周围微黏度的影响。结果表明,探针周围的微黏度随阳离子侧基取代度和烷基长度的增加而增大。
第2/3期丁 敏等 荧光技术在两亲性聚合物研究中的应用?461
?312 利用荧光技术研究两亲性接枝共聚物的聚集
行为
近年来,国内外已有很多报道用荧光研究两亲
性接枝共聚物的CAC[36—42],CAC主要受疏水部分
的结构(疏水基团含量、取代度和疏水链长)和接枝
共聚物分子量的影响,其规律为:CAC随着接枝共
聚物疏水基团含量、取代度和疏水链长的增加而降
低,随着接枝共聚物分子量的增大而增大。N ichif or
等[43]在葡聚糖骨架上接枝胆汁酸、去氧胆汁酸侧
基,制得胆汁酸葡聚糖和去氧胆汁酸葡聚糖的两亲
性接枝共聚物。以NP N为荧光探针,通过荧光发射
光谱的荧光发射强度随共聚物浓度的变化行为研究
了接枝共聚物的结构和取代度对其聚集行为的影
响。研究表明,当取代度相同时,胆汁酸葡聚糖的
CAC比去氧胆汁酸葡聚糖要低;对同一种接枝共聚
物而言,随着取代度的增加,接枝共聚物的CAC
降低。
313 利用荧光技术研究两亲性接枝共聚物的其他
性质
荧光技术还常用来研究两亲性接枝共聚物的
C MC,已有很多报道用荧光技术研究接枝共聚物的
C MC[44—47],研究结果均表明,C MC随着接枝密度和
接枝共聚物分子量的增大而增大,随着疏水基团的
取代度、含量和链长的增加而降低。
Tenhu等[48]通过自由基聚合合成了荧光标记
(芘或萘)的聚(N2乙烯基己内酰胺)均聚物和接枝
共聚物(在聚(N2乙烯基己内酰胺)上接枝十一烷基
PEO)。荧光猝灭实验表明,接枝共聚物的PEO侧
链在芘单元的周围能够创造一个亲水的环境,即使
温度高于临界溶液温度也有类似规律。通过混合
(芘或萘)标记的聚合物的非辐射能量转移(NRET)
研究表明,(芘或萘)标记的接枝共聚物之间没有
NRET发生,而(芘或萘)标记的均聚物之间有
NRET发生,说明了(芘或萘)标记的接枝共聚物不
能相容,而(芘或萘)标记的均聚物能够相容,其原
因是接枝共聚物主要形成分子内胶束,而均聚物发
生的是不同链间的疏水缔合作用。
4 荧光技术在两亲性树状聚合物研究中的
应用
两亲性树状聚合物是近年来高分子科学界的研
究热点之一。Cao等[49]通过活性开环聚合合成了
聚(L2赖氨酸)2b2聚(L2丙交酯)2b2聚(L2赖氨酸)
(D
22LLA152D2)的两亲性树状聚合物,通过荧光滴定
分析(fluorescence titrati on assay)对比研究了D
22
LLA152D2和聚(L2赖氨酸)2b2M2b2聚(L2赖氨酸)(M
为六亚甲基二胺或聚乙二醇)的两种亲水树状聚合
物对DNA的亲和力。3种聚合物和质体DNA以不
同的负/正电荷值混合,研究表明,在相同的负/正电
荷值时,D
22LLA15
2D2比后两者使相对荧光强度降低
得更多,说明了D
22LLA15
2D2比后两者对DNA的亲
和力要大,其原因是D
22LLA15
2D2的疏水嵌段的缔
合作用加强了对DNA的亲和力,因此D
22LLA15
2D2
可以用来作为一种新的聚阳离子的质体DNA载体
(polycati onic p las m id DNA carrier)。
A llcock等[50]在树状聚丙烯亚胺表面引入聚磷
腈(臂)制得了不同臂数的两亲性树状聚合物。通
过芘的荧光发射光谱的I
1
/I3和F/F0(F0和F为滴
加聚合物前后芘的荧光强度)随浓度的变化研究了
臂数对客体分子(芘)在树状聚合物中包裹性质的
影响。研究表明,臂越多,I
1
/I3和F/F0随聚合物浓
度的增大降低得更多,说明了聚合物的树状部分包
裹的客体分子就越多。
Shi等[51]通过Bolt om H40(末端具有羟基的聚
酯)和十八烷酰氯发生缩聚反应制得两亲性核2壳结
构的树状聚合物,通过荧光激发光谱的相对荧光强
度随浓度的变化研究了聚合物烷基链封端的羟基数
目(即烷基密度)对树状聚合物包裹能力的影响。
研究表明,树状聚合物在氯仿中形成单分子胶束,刚
果红作为客体分子被包裹在胶束中,单分子胶束的
包裹能力主要由烷基密度决定,当烷基密度为
4314%时,树状聚合物包裹客体分子的能力最强,更
高或更低的烷基密度都会导致树状聚合物的包裹能
力降低。同时,他们采用类似的方法,通过芘标记的
超支化砜胺同棕榈酰氯发生缩聚反应合成了两亲性
超支化聚合物[52],通过荧光发射光谱研究了疏水烷
基含量对超支化聚合物疏水缔合作用的影响。结果
表明,随着疏水烷基含量的增加,荧光强度增强,疏
水缔合作用增强。
值得一提的是,近年来配位聚合领域出现的树
状聚乙烯,它有别于通过缩聚反应得到的树状聚合
物,树状聚乙烯的形成主要是基于α2二亚胺后过渡
金属镍、钯催化剂的“链行走(chain2walking)”机
理[53]。在此基础上,Guan研究小组[54]通过“链行
走”催化剂一步合成了具有疏水树状PE核和亲水
PEG壳的树状聚乙烯两亲性聚合物。光散射法、紫
外可见光谱法和荧光探针技术的研究结果表明这些
树状聚乙烯两亲性聚合物在水溶液中以单分子球形
?462
?化 学 进 展第22卷
纳米胶束存在,并且单分子胶束在水介质中对疏水客体分子的包裹量取决于两亲性树状聚合物所形成的疏水树状PE核的分子量大小。Guan等[55]采用“链行走”聚合和ATRP联用,通过改变共聚单体的浓度,可以得到具有不同分子量和不同引发点数的树状大分子引发剂,在此基础上,通过改变ATRP聚合时间,可以制备亲水壳厚度可控的两亲性聚乙烯树枝状聚合物。关于树状聚烯烃及其两亲性聚合物的合成及其性能研究国内伍青课题组[56,57]正在开展相关研究工作。从配体类型、位阻效应和电子效应以及中心金属选择出发,设计合成出多种系列新型的“链行走”催化剂,以制备不同拓扑结构的聚烯烃;在此基础上通过自由基可控聚合(AT RP或可逆加成断裂链转移聚合)、点击化学(click che m is2 try)[58,59]等方法联用,制备树状聚烯烃两亲性聚合物。
5 荧光技术在其他结构两亲性聚合物研究中的应用
近年来,两亲性蝎形和星形大分子也备受关注。Uhrich等[60]由黏酸和不同烷基长的酰氯发生烷基化反应制得烷基化黏酸,然后再和PEG反应得到两亲性蝎形大分子(烷基化黏酸是疏水部分,PEG是亲水骨架)。通过芘的荧光激发光谱的I
33415nm
/I332nm 随蝎形大分子浓度的变化研究了亲水(或疏水)链长对蝎形大分子C MC的影响。研究表明,当PEG 长度固定时,烷基链越长,C MC越小;当烷基链长度固定时,PEG链越长,C MC越大。同时,他们又通过稳态荧光发射光谱和荧光各向异性研究比较了该两亲性蝎形大分子和两种两亲性星形大分子(由烷基化黏酸和PEG组成,烷基为十二烷基和己基)疏水核的微极性和微黏度[61]。蝎形大分子通过疏水缔合形成胶束聚集体,而星形大分子通过共价键合形成更高级的聚集体。以香豆素153为荧光探针,稳态荧光发射光谱研究表明,探针在星形大分子中的荧光最大发射波长比蝎形大分子的要短,说明了星形大分子聚集体比蝎形大分子胶束聚集体更疏水,所以星形大分子的疏水核环境极性更小。探针在大分子疏水核的荧光各向异性研究表明,蝎形大分子胶束核的再定位时间常数(reorientati on ti m e con2 stant)为两个,而星形大分子胶束核的再定位时间常数为3个,说明了探针和星型大分子的核缔合得非常紧密,而蝎形大分子的胶束核相对自由;蝎形大分子的荧光各向异性值比星形大分子的低,说明了探针在蝎形大分子胶束核中的微黏度比星形大分子的低。
Tenhu等[62]通过ATRP合成了以八功能化的引
发剂为核、以聚甲基丙烯酸甲酯2b2聚丙烯酸为臂的两亲性八臂星形共聚物。以4HP为荧光探针,稳态荧光发射光谱的荧光最大发射波长随共聚物浓度的变化研究了星形共聚物的臂结构对CAC的影响,研究表明,臂的亲水/疏水嵌段的聚合度之比越大, CAC越大。
W ang等[63]通过开环聚合分别合成了以树状聚酰胺2胺为核、以PCL2b2PEG或P LA2b2PEG为臂的两种两亲性星形共聚物。通过芘的稳态荧光发射光谱研究了星形共聚物的臂结构对胶束形成过程的影响。研究表明,以PCL2b2PEG为臂的共聚物呈现单分子胶束行为,所以没有C MC;以P LA2b2PEG为臂的共聚物呈现缔合行为,所以有明显的C MC。由于PCL的疏水性比P LA强,因此以PCL2b2PEG为臂的共聚物胶束包裹疏水分子的能力更大,载药能力更强。
Lee等[64]通过开环聚合合成了以聚(γ2谷氨酸)为亲水骨架、以去氧氟尿苷2聚(ε2己内酯)为疏水侧链的两亲性梳形接枝共聚物,通过芘的荧光发射光谱的I
338nm
/I335nm随浓度的变化研究了亲水骨架长度对共聚物C MC的影响。研究表明,亲水骨架越长,梳形共聚物的C MC越大。
Dey等[65]通过自由基聚合合成了以N2丙烯酰2 L2缬氨酸钠为亲水结构、以N2十二烷基丙烯酰胺为疏水结构的两亲性无规共聚物。通过NP N的稳态荧光发射光谱研究了疏水微区的形成。研究表明,共聚物间的疏水缔合形成疏水微区时的浓度为CAC,疏水基团含量越高,CAC越低;通过芘的稳态
荧光发射光谱的I
1
/I3随共聚物浓度的变化研究了疏水微区的微极性。研究表明,疏水基团含量越高, I1/I3值越低,说明了芘周围的微极性随着疏水基团含量的增大而降低;通过荧光偏振技术测定DPH的稳态荧光各向异性值(r)来估算探针周围的微黏度,研究表明,r值随着疏水基团含量的增大而增大,说明了探针周围的微黏度随着疏水基团含量的增大而增大。
6 结语与展望
本文综述了应用荧光技术研究不同结构的两亲性聚合物性质的研究进展,主要涉及微环境、聚集行为和临界胶束浓度等性质。两亲性聚合物的性能与
第2/3期丁 敏等 荧光技术在两亲性聚合物研究中的应用?463
?
其对客体分子的包裹和释放作用有关,其包裹能力的大小又取决于两亲性聚合物类型、结构及内部空腔大小等性质。荧光技术作为一种研究手段,可以定量地研究两亲性聚合物胶束的微观参数,这是其他常规手段所不能给出的。因此,研究和理解胶束的性质及其关键的结构影响因素,对建立两亲性聚合物胶束的结构与性能的关系至关重要,为进一步从分子水平和分子设计层面研究树状两亲性聚合物结构性能关系提供了可能和基础。
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三维荧光光谱分析法
三维荧光光谱分析法 荧光强度与激发波长Kex、发射波长Kem、衰变时间( t)、荧光寿命(S)、吸光系数(E)、偏振度(P ) 及待测组分浓度(c) 等因素有关。若主要研究荧光强度与Kex 和Kem 的关系, 就构成了Kex2K em2F 三维荧光光谱(EEM ) , EEM 光谱技术简化了复杂组分繁琐的分离过程, 提高了荧光分析的灵敏度、选择性和实用性, 还可进行指纹分析和技术鉴定。许金钩小组应用EEM 技术和方法,获得了生物大分子、有机小分子荧光探针、以及荧光探针分子与生物大分子相互作用的大量信息, 并运用Mon te2Carlo 数学模型对EEM 进行总体积分,建立了EEM 总体积分方法, 用于样品中有机物质和药物分子的定量分析, 获得满意的结果。除了使用EEM 技术和方法外, 还可以根据实际需要, 选择荧光衰变时间( t)、偏振度(P )、荧光寿命(S) 等参数,构成Kex2K em2x (待定参数) 三维荧光光谱, 从不同的角度出发来提高荧光分析的灵敏度、选择性。这种分析技术不仅被用来进行物质的定性和定量分析,而且被用于测定生物大分子的形状、大小、构象, 以及固态物质、生物大分子与有机分子和金属离子相互作用等的研究, 在临床医学、环境检测、法医鉴定、生命科学以及有序介质中生物大分子荧光探针光谱特性的研究等方面, 发挥着极为重要的作用。但由于多维荧光光谱技术中需要处理大量的实验数据,因此在研制仪器的同时, 还要开发许多有实用价值的数学处理方法和多维光谱软件120 世纪70 年代发展起来的同步导数荧光技术在混合物的连续测定中发挥着重要作用, 这一方法的特点是同时扫描激发波长和发射波长, 并对得出的图谱进行微分处理, 使容易重叠的波峰彼此完全分开, 便于得出可靠的测量结果。有人对人血尿中temopo rt in2po lyethylene glyno l 共轭物分别用HPLC、C I 和荧光光谱分析法进行测定, 发现荧光光谱分析法是其中最简便、迅速、灵敏的分析方法, 新一代荧光指示剂如酪氨
荧光分析法检测原理及应用举例
1 荧光定义 某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。 2 荧光分类 由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。 3 光致荧光机理 某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。 分子受激发过程 在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。 在电子激发态中，存在多重态。多重态表示为2S+1。S为0或1，它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。S=0表示所有电子自旋的角动量代数和为0，即所有电子都是自旋配对的，那么2S+1=1，电子所处的激发态为单重态， 用S i 表示，由此可推出，S 即为基态的单重态，S 1 为第一跃迁能级激发态的单重 态，S 2 为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+1=3，电子 在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用T i 来表示，T 1 即为第一激发态中 的三重态，T 2 即为第二激发态中的三重态，以此类推。
免疫荧光操作步骤及注意事项
免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术（比如流式细胞仪）测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透（或称为透化）、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备（通俗的说法是细胞爬片）是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片（Slides or Coverslips）的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法（如ELISA或Western Blot）中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4℃或-20℃避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。 由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤：
免疫荧光操作步骤及注意事项
免疫荧光操作步骤及注意事项 免疫荧光技术是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体(或抗原)作为探针检查细胞或组织内的相应抗原(或抗体)。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位，以及利用定量技术(比如流式细胞仪)测定含量。 紫外光激发荧光物质放射荧光示意图 免疫荧光实验的主要步骤包括细胞片制备、固定及通透(或称为透化)、封闭、抗体孵育及荧光检测等。细胞片制备(通俗的说法是细胞爬片)是免疫荧光实验的第一步，细胞片的质量对实验的成败至关重要，原因很简单，如果发生细胞掉片，一切都无从谈起。这一步关键的是玻片(Slides or Coverslips)的处理以及细胞的活力，有人根据成功经验总结出许多有益的细节或小窍门，非常值得借鉴。固定和通透步骤最重要的是根据所研究抗原的性质选择适当的固定方法，合适的固定剂和固定程序对于获得好的实验结果是非常重要的。免疫荧光中的封闭和抗体孵育与其它方法(如ELISA或Western Blot)中的相同步骤是类似的，最重要的区别在于免疫荧光实验中要用到荧光抗体，因此必须谨记避光操作，此外抗体浓度的选择可能更加关键。最后需要注意的是，标记好荧光的细胞片应尽早观察，或者用封片剂封片后在4?或-20?避光保存，以免因标记蛋白解离或荧光减弱而影响实验结果。
由于操作步骤比较多，同时在分析结果时无法像WB那样可以根据分子量的大小区分非特异性识别，所以要得到一个完美的免疫荧光实验结果，除了需要高质量的抗体，以及对实验条件进行反复优化外，还必须设立严谨的实验对照。总之，免疫荧光实验从细胞样品处理、固定、封闭、抗体孵育到最后的封片及观察拍照，每步都非常关键，需要严格控制实验流程中每个步骤的质量，才能最终达到你的实验目的。 基本实验步骤: (1) 细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次;对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤(1000rpm,5min)2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 (2) 固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4?保存3个月。PBS洗涤3×5 min. (3) 通透。使用交联剂(如多聚甲醛)固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5 min. (4) 封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. (5) 一抗结合。室温孵育1h或者4?过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. (6) 二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 (7) 封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 (一)细胞准备 用于免疫荧光实验的细胞可以是直接生长在盖玻片上的贴壁细胞，也可以是经过离心后涂片的悬浮细胞或者是将取自体内的组织细胞悬液离心后涂片。贴壁良好
第八章荧光免疫技术
第八章荧光免疫技术 FluoreSCenCe ImmunoaSsay 第一部分目的要求和教学内容 一、目的要求 掌握：荧光免疫技术原理、类型及临床应用，常用的荧光物质；熟悉：荧光免疫技术 的技术要点；了解：荧光标记物的制备与保存，镧系稀土元素标记物的制备，荧光免疫技术主要类型的技术要点。 二、教学内容 1．荧光标记物的制备：荧光和荧光物质，荧光标记物的制备。 2．荧光免疫显微技术：基本原理，技术类型，技术要点，方法评价，临床应用。 3．荧光免疫测定技术：时间分辨荧光免疫测定(基本原理，技术类型，技术要点，方法评价和临床应用)；荧光偏振免疫测定(基本原理，技术类型，技术要点，方法评价和临床应用)。 第二部分测试题 一、选择题 (一)单项选择题(A型题) 1.如下有关荧光免疫技术正确的提法 A．直观性检测抗原和抗体 B．直观性检测抗原 C．直观性检测抗体 D．间接检测抗原或抗体 E．间接检测抗原和抗体 2．荧光素易受温度影响，操作时通常选择较佳的温度 A．10～15℃ B．15～20℃ C．20～25℃ D．25～30℃ E．30～35℃ 3．荧光抗体保存3～4年，应选择 A．小量分装、4℃ B．瓶分装、4℃ C．瓶分装、-10℃ D．瓶分装,-20℃ E．小量分装、-20℃ 4．下列组成荧光显微镜的结构中，与普通光学显微镜相同的是 A．光源 B．聚光器 C．目镜 D．物镜 E．滤光片
5．下列哪项方法不属于荧光免疫显微技术类型 A．直接法 B．夹心法 C．间接法 D．补体法 E．双标记法 6．荧光抗体染色标本的观察时间 A．当天 B.第二天 C．第三天 D．1周内 E．5天 7．荧光抗体闭接法应标记 A．抗原 B．抗体 C．补体 D．抗抗体 E．抗体及补体 8．荧光显微技术常用于检验血清中各种自身抗体和多种病原体抗体的方法是 A．直接法 B．间接法 C．双抗体夹心法 D．补体法 E．双标记法 9．荧光抗体间接法可检测 A．抗原 B．抗体 C.补体 D．蛋白质 E．抗原和抗体 lO．在荧光显微镜检查中直接影响检测结果的是 A．抗原荧光染色 B．抗体荧光染色 C．补体荧光染色 D．特异性荧光染色 E．非特异性荧光染色 11．主要用于测定各种激素、蛋白质、酶、药物及病毒抗原的技术 A．荧光偏振免疫测定 B．荧光免疫显微技术 C．时间分辨荧光免疫测定 D．底物标记荧光免疫测定 E．流式荧光免疫技术 12．临床药物浓度检测的首选方法
水溶性荧光共轭聚合物MPS_PPV的聚合新方法及其荧光波长调控研究
2009年第67卷化学学报V ol. 67, 2009第24期, 2827～2832 ACTA CHIMICA SINICA No. 24, 2827～2832 zhkhe@https://www.wendangku.net/doc/e88905296.html, * E-mail: Received April 27, 2009; revised July 29, 2009; accepted August 21, 2009. 国家自然科学基金(Nos. 90717111, 20621502)资助项目.
2828化学学报V ol. 67, 2009 Scheme 1 但是这种方法所需步骤长[图式2(a)], 合成总产率低, 聚合过程操作复杂、所需时间长[见图式2(c)]. Bazan课题组[17]采用1,4-丁基磺酰内酯为原料, 大大缩短了反应步骤并提高了合成产率[图式2(b)]. 但是迄今为止, 在聚合方式上仍然没有大的改进. 过去几年, 我们一直在从事水溶性荧光共轭聚合物传感器研究[3,7,15,18,19], 发现聚合物的聚合方法及其性能对传感器的影响尤为重要, 因此如何实现单体简单快速的聚合具有很重要的意义. 作者以4-甲氧基苯酚和1,3-丙基磺酰内酯为反应原料, 提出了一种新的单体聚合方法[图式2(d)], 使聚合步骤得到了简化, 缩短了反应时间; 同时, 我们发现改变聚合反应溶液中NaOH的浓度, MPS-PPV的链长有所改变, 导致其紫外吸收和荧光发射峰发生变化. 利用元素分析, IR, 1H NMR和动态光散射对0.5 mol/L NaOH乙醇溶液中生成的聚合物进行表征, 所得结果与文献[13]的结果基本相符, 证实目标产物为MPS-PPV. 研究了聚合物与过氧化氢之间的作用, 结果发现, 过氧化氢可使聚合物原有发射峰(508 nm)蓝移, 并在472 nm处出现新的荧光峰, 进一步验证了聚合物的链长与其荧光发射波长的关系. 同时结合聚合物峰形和强度的变化可以实现过氧化氢选择性的检测, 优于单纯基于聚合物荧光猝灭的传感模式, 此研究无疑为基于荧光聚合物的新型生物化学传感器研制提供了新的思路. 1 实验部分 1.1 仪器和试剂 荧光激发和发射光谱使用Perkin Elmer LS55荧光仪测试; 核磁共振于Variant Mercury UX-300核磁共振仪测定; 红外光谱在Nicolet Magna-IR spectrometer 550红外光谱仪上测定; 紫外光谱使用TU-1901紫外光谱仪测试; 元素分析数据在Perkin-Elmer2400元素分析仪上获得; 分子量在ALV/DLS/SLS-5000动态光散射仪上测定; pH用PHS-3C精密pH计调节. 4-甲氧基苯酚、1,3-丙基磺酰内酯、四氢噻吩、三羟甲基氨基甲烷(Tris)均购于Aldrich公司; 二氧杂环己烷购于百灵威化学技术公司; 无水乙醇、乙醚、氯仿、丙酮、DMF (N,N-二甲基甲酰胺)、二氯亚砜、多聚甲醛、苯、无水甲醇、浓盐酸、浓硫酸、无水硫酸镁、过氧化氢均为国药分析纯试剂, 所用MPS-PPV配成1× 10－4 mol/L(以重复单元的浓度表示, 以下相同); Tris缓冲溶液浓度为20 mmol/L, 用浓盐酸调节至所需pH; 过氧化氢现配; 实验用水为超纯水. 1.2 荧光共轭聚合物MPS-PPV的合成 根据文献以4-甲氧基苯酚和1,3-丙基磺酰内酯为起始原料, 通过四步反应和一步聚合得到MPS-PPV, 具体 图式2 MPS-PPV的合成路线图Scheme 2Synthetic route of the MPS-PPV
免疫荧光技术的实验方法及其分类
免疫荧光技术的实验方法及其分类 一、免疫标记法及其分类 1.荧光免疫法 原理是应用一对单克隆抗体的夹心法。底物用磷酸-4-甲基伞形酮，检测产物发出的荧光，荧光强度与Mb浓度呈正比，可在8min 内得出结果。结果以Mb每小时释放的速率表示(△Mb)表示。该法重复性好，线性范围宽，具有快速、敏感、准确的特点。 以双抗夹心法为例，首先将特异性抗体与固相载体连接，形成固相抗体。除去未结合抗体，然后加受检标本，使其中的蛋白抗原与固相抗体形成抗原抗体复合物。洗涤除去未结合物，接着加入荧光标记的抗体，使之与抗原特异性结合，形成抗体—抗原—抗体复合物。最后根据荧光强度，即可对蛋白抗原进行定量。 传统的荧光免疫法受本底荧光的干扰较大，时间分辨荧光免疫测定法是以具有特长寿命的稀土金属如铕，作为标记物，加入正常液后激发测定，能有效去除短寿命本底荧光的干扰。
2.放射免疫法 放射免疫法是以过量的未标记抗原与放射性物质标记的抗原，竞争性地与抗体结合，形成有放射性的抗原—抗体复合物与无放射性的抗原—抗体复合物，并有过剩的标记抗原与未标记的抗原。然后通过离心沉淀等方法，将抗原—抗体复合物与游离抗原分离，分别测定其放射性强度与标准曲线比较，即可对未标记的待测抗原进行定量。 RIA法测定血清蛋白灵敏度高、特异性强，可准确定量到ng/ml 水平。但早期的方法操作麻烦，耗时长，且有放射性污染。近年来，随着单克隆抗体的应用，RIA的灵敏度又有了较大提高，且操作大为简化，并已有商品试剂盒供应，使用方便。 3.酶联免疫法(ELISA) ELISA法有竞争法和夹心法两种。竞争法是基于标准或血清Mb 和微孑L板上包被的Mb竞争性地与单克隆抗体相结合的原理而建立，该法的最低检测限为10μg/L，线性范围达1 000ug/L。夹心ELISA 法与EIA具有良好的相关性(r=0.92)。ELISA法具有灵敏度高，特异性强，精密度好，操作简单，适用于多份标本的检测，不需特殊仪器设备等优点，易于推广普及。但不适合急诊的快速检测。
荧光分析技术新进展
第27卷第5期 唐山师范学院学报 2005年9月 Vol. 27 No.5 Journal of Tangshan Teachers College Sep. 2005 ────────── 收稿日期：2005-04-02 作者简介：孙继红（1969-），男，河北丰南人，唐山第九中学中教一级教师。 - 19 - 荧光分析技术新进展 孙继红1，钱丹青2 （1.唐山第九中学，河北 唐山 063000；2.唐山学院 机电系，河北 唐山 063000） 摘 要：荧光分析法因具有灵敏度高,线性范围宽等优点。综述了近年来荧光分析技术的发展情况，并对各种荧光分析新技术的特点和应用进行了归纳。 关键词：荧光分析；HPLC ；离子色谱 中图分类号：O657.3 文献标识码：B 文章编号：1009-9115（2005）05-0019-02 近年来荧光分析研究发展迅速，年文献量不断增加。主要应用领域有中西药、临床、生物大分子、食品营养和添加剂等试样。激光诱导荧光法诊断恶性肿瘤，显微荧光法研究药物与细胞的相互，DNA 编序及含量的荧光法测定均是目前受到关注的热点问题。 1 荧光分析新技术 近些年更多的研究者转向充分利用或开发仪器软件技术，以期提高发光分析的选择性和灵敏度，这方面年均论文数量增长了约两倍。刘绍璞先生等率先研究了分子二级散射光谱、共振荧光光谱、共振瑞利散射光谱的分析应用并取得了丰硕成果。郑飞跃等利用解卷积法、黄俊利用相调制技术研究了荧光寿命的测量。潘利华等[1-3]研究了激光诱导荧光寿命测量以及在稀土元素测定中的应用。其它关于金属配合物及镁、铝测定[4][5]及塑封料中铀的测定也有报道[6]。 导数光谱、多维光谱、偏振光谱、磁效应、时间分辨技术、恒能量、固定波长或可变角荧光法等，单独或几种方法的结合并借以化学计量学手段，在提高分析选择性方面具有很大的优越性，而且论文日趋增多，在医药临床、环境检测、石油勘探等领域得到广泛应用。吡哌酸的固体表面延迟荧光测定具有较好的灵敏度[7]。高灵敏检测器以及荧光成像技术对提高分析灵敏度、从有限样品中获取更丰富的化学信息显 示出大的威力。电感偶合检测器件（CCD ）[8-10]、增强型CCD （ICCD ）[11][12]结合毛细管电泳及激光诱导荧光技术，使得分析检出限显著降低。荧光成像技术[13]可望获得单细胞的化学信息。国外单细胞或单分子检测的研究非常活跃，而上述技术的联合应用对此是必不可少的。 荧光免疫及生化分析持续好的势头。赵启仁等[14]研究了铕标记抗癌胚抗原单克隆抗体C17的应用。周四元等[15]提出对氟苯酚2过氧化氢2辣根过氧化物酶体系酶联荧光免疫法，并用于人血清中乙肝表面抗原和表面抗体测定。姚凤姬等[16]用非标记铕络合物荧光免疫法测定了血清中金属硫蛋白。王敏灿等[17]合成了荧光免疫分析中增强22萘甲酰三氟 丙酮。李建中等用新合成的荧光标记试剂KLUK 标记靶细胞K562，采用时间分辨技术，测量了NK 细胞毒性，具有很好的应用前景。 2 荧光检测技术与其它仪器联用 荧光分析法因具有灵敏度高，线性范围宽等优点，愈来愈引起人们的重视，尤其是近年来激光、计算机、电子学等新技术的飞速发展，加速了荧光分光光度计与其它技术的结合而形成多种多样的新型荧光分析。 荧光分光光度计的联用技术与紫外可见分光光度计的联用技术有许多相似之处。首先它可以作为一种仪器的检测器，其次可以作为一个独立的主体与其它附件相连接，形成一种新的测试系统，最后它还可以与其它分析技术相结合构成一种新型的分析仪器。 2.1 荧光检测与HPLC 联用 液相色谱检测器种类很多，灵敏度较高、选择性较好的荧光检测器在进行微量分析中经常使用。如许多芳香族化合物如蒽、菲、芴等在特定条件下发出特征荧光，利用HPLC 的荧光检测器可以同时测定上述物质。Tanabe 等[18]设计一种供HPLC 用的多波长荧光检测系统，有4个干涉滤光片和光电倍增管通道;Gluckman 等[19]研制的荧光检测器，流通池为150μL ，可用于毛细管HPLC 和超临界色谱，其最小检测量为0.2pg 。 2.2 荧光检测与离子色谱联用 Mho 等人[20]研制一套供离子色谱用的双光束激光激发间接荧光检测器，它用具有荧光的淋洗离子维持恒定背景信号，当待测离子淋出时，信息观测信号减少。这种荧光检测器可以检测纳克级阴离子，方法灵敏度非常高。 2.3 激光光源引入荧光分光光度计 激光光源引入荧光计在我国开发较早，也是目前应用比较成熟的仪器之一，如测铀仪就是其中的代表[21]。时间分辨激光荧光分光光度计的研制成功，大大改善了荧光仪器的性能，这类仪器已广泛应用于环境监测、稀土分析、冶金、化
水溶性共轭聚合物发光材料(精)
水溶性共轭聚合物发光材料 本论文的研究内容主要涉及共轭高分子发光材料领域。上世纪九十年代以来,共轭高分子发光材料的研究开始成为当今高分子科学热点研究领域之一。共轭高分子发光材料在高分子发光二极管方面的应用研究方兴未艾,水溶性共轭高分子发光材料特别是共轭聚电解质的研究又愈来愈引起人们的关注。本课题组长期从事共轭高分子发光材料的研究,在共轭聚电解质的研究方面也已经有一定的工作积累。除了采用传统的经典化学合成即利用共价键连接的合成方法得到水溶性共轭高分子之外,最近我们开始尝试采用共轭高分子非共价键自组装的方法来制备水溶性共轭高分子发光材料。这类材料主要是利用共轭聚合物和水溶性小分子或者高分子之间的非共价键相互作用而得到的,此类材料目前研究较少,但是当材料科学发展到今天,单一材料的性质已具有某种程度的可预测性时,通过分子层次的剪裁或者组装来实现材料应用上的需求将逐渐上升为研究主流。共轭高分子的分子或者聚集态结构及其性能特别是发光性能的关系始终是贯穿我们课题组学术研究的主线之一,结合本课题组与此相关的工作基础,本论文对水溶性共轭聚合物发光材料进行了系列研究,论文工作主要分为四个部分,分别简述如下:第一部分,合成了系列新型阳离子聚对苯乙烯撑类共轭聚电解质,并进行了系列表征;我们合成了系列胺功能化的苯取代PPV类共聚物P1\'— P4\',通过Wittig反应在主链上分别引入了噻吩、芴、烷氧化的苯以及苯取代的苯等组分,经过季胺化以后得到相应的阳离子发光聚合物。从FT-IR以及~1H NMR谱图分析得知,这些聚合物具有不同含量的顺式构型,其含量与PPV主链上 所引入的芳香基类型有关。它们的发光颜色可以通过在PPV共轭主链上引入具有不同光电性能的单元很方便的进行调控。P3和P3\'主链上含有芴以及大体积苯取代的苯单元,在中性聚合物以及季胺化聚合物中分别表现出最高的荧光量子效率。进一步的荧光猝灭行为研究表明,顺式构型含量较少的P4\'荧光表现出 完全猝灭,而顺式构型含量较多的P1\'-P3\'表现出不完全荧光猝灭。第二部分,在第一部分工作基础之上,我们系统研究了系列聚对苯乙烯撑类共轭聚电解质的荧光猝灭行为,发现包括顺反异构在内的分子结构因素是荧光猝灭行为最主要的影响因素。我们研究了具有不同含量顺反构型的系列阳离子型PPV类衍生物与Fe(CN)_6~(4-)之间的荧光猝灭行为。我们发现,采用Wittig反应所合成的顺式构型含量较多的PPV呈现线性下偏型Stern-Volmer曲线,即不完全荧光猝灭;而采用Gilch反应所得到的全反式构型的PPV的Stern-Volmer曲线则为线性上偏型,即完全荧光猝灭。通过对其荧光猝灭行为比较研究,我们发现荧光猝灭主要是通过电子转移而非能量转移而完成的。考虑到被包埋发色团的存在以及“作用范围”的影响,参考前人工作,我们引入了一个经过修正的Stern-Volmer方程,能很好的拟合顺式构型含量较多的PPV所呈现的线性下偏型Stern-Volmer曲线。此外,对比研究发现,分子链中大体积的苯取代基对荧光猝灭行为很可能存在直接的位阻效应,阻止了发色团与猝灭剂之间的静电相互作用,一定程度上影响了荧光猝灭;而在不存在大体积的苯取代基时,顺式构型的存在应该是产生这种不可接触发色团的主要因素。而链间聚集以及季胺化不完全等其它因素对荧光猝灭行为的影响则较小。由于在Wittig反应中分子侧链中的取代基对于最终的顺式构型含量具有较大影响,我们可以把这些聚合物特殊的荧光猝灭性质本质上归因于其分子链上取代基性质的不同(即分子结构的不同)。第三部分,基于上述结论,我们采用Gilch反应合成了一种侧链无大体积取代基的新型阳离子聚对
荧光光谱分析技术概述
荧光光谱分析技术概述....................................................................................................................... 1荧光光谱分析原理.1 ................................................................................................................................... 4荧光分析法.2 ........................................................................................................................ 4定性分析法.2.1 4 ......................................................................................................................... 2.2定量分析法 荧光光谱分析原理1光谱法是辐射能与物质组成和结构的相光学分析法 分为光谱法和非光谱法，不涉及能级跃非光谱法不包含物质内能的变化，互作用，以光谱的出来为基础，迁，而是辐射方向和物理性质的改变。 光学分析方法分类 1表分析法特征具体方法 射线荧光光谱、分子荧X光谱法原子发射光谱、原子荧光光谱、光的发射光光谱、分子磷光光谱、化学发光、电子能谱、俄歇电子能谱射线原子吸收光谱、紫外-可见分光光度法、红外光谱、X光的吸收吸收光谱、核磁共振光谱、电子自旋共振光谱、光声光谱拉曼光谱光的散射 比浊法、散射浊度法光的散射非光谱法 折射法、干涉法光的折射 X射线衍射、电子衍射光的衍射 旋光色散法、偏振法、圆二向色法光的转动 , 光波愈短荧光发光机理可按量子理论通俗解释: 光具有波动、粒子二重性, 当某些物质受到紫外线或较短波长其光子能量愈强; 反之波长愈长其能量则弱。当, , 吸收了全部或部分光能量, 使其分子的能级升高而处于亚稳定状态光照射其中一部分化为热量, , 这些分子就会立即释放多余的能量恢复到稳定的基态时因为有部分能, 向基态跃迁时是以“光”形式释放而消失。但对某些物质而言, 光波愈, 量被消耗所以重新发出的光能量总比吸收的能量要小。由于能量愈小, , 所以物质所激发的荧光总比照射它的光波要长。磷光的能量较荧光还要小长, 这就是两者的区别。寿命可达数小时之久所以它的波长比荧光要长, , 如果物质的分子吸收了紫外和可见区电磁辐射后，它的电子能跃迁至激发本身又回复到基态如果吸收辐然后以热能的形式将这一部分能量释放出来，态，再发射的波射能后处于电子激发态的分子以发射辐射的方式释放这一部分能量， 长可以同分子所吸收的波长相同，也可以不同，这一现象称为光致发光。最常见的两种光致发光现象是荧光和磷光。这两种光致发光的机理不同，荧光发光过程 -3s-10s的时间间隔。而磷光则往往能延续10因在激发光停止后10s内停止发光，此，可通过测定发光寿命的长短来区分荧光和磷光。 一些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射(即发光)称之为荧光。可产生荧光的分子
免疫荧光技术
免疫荧光技术（Immunofluorescence technique）又称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的一种。它是在免疫学、生物化学和显微镜技术的基础上建立起来的一项技术。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利用荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从而确定抗原或抗体的性质和定位。 一、基本原理： 免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。 二、应用范围： 其应用范围极其广泛，可以测定内分泌激素、蛋白质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因子、细胞表面抗原、肿瘤标志物、血药浓度等各种生物活性物质。根据诊断类别，又可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、血型鉴定等。 三、基本实验步骤：
1、细胞准备。对单层生长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻片的培养皿中，待细胞接近长成单层后取出盖玻片，PBS洗两次；对悬浮生长细胞，取对数生长细胞，用PBS离心洗涤（1000rpm,5min）2次，用细胞离心甩片机制备细胞片或直接制备细胞涂片。 2、固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个月。PBS洗涤3×5min. 3、通透。使用交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，一般需要在加入抗体孵育前，对细胞进行通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋白的性质。通透的时间一般在5-15min.通透后用PBS洗涤3×5min. 4、封闭。使用封闭液对细胞进行封闭，时间一般为30min. 5、一抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min. 6、二抗结合。间接免疫荧光需要使用二抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再用蒸馏水漂洗一次。 7、封片及检测。滴加封片剂一滴，封片，荧光显微镜检查。 四、注意事项： 1、染完之后没有封片前直接照一些，因为有的时候可能封片会出现问题，再想照反而没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。 2、荧光的片子一定要避光保存，保存的好的话，过一段时间仍然能照出很好的片子。
浅谈荧光分析法的特点及在环境分析中的应用
荧光分析法的特点及在环境分析中的应用 摘要：论文综述了荧光分析法的特点及在环境分析中的应用。重点分析了荧光分析法的原理、特点，以及常用的荧光分析法的讨论。分析了荧光分析法在环境监测中的应用，测定范围和发展情况。 关键词：荧光分析；环境分析；应用 1.引言 环境中分析、监测的对象往往是微量、超微量的物质，有很多还具有时间性和空间性，因此对分析技术要求越来越高。荧光分析法和分光光度法以其灵敏度高、检测限低、准确性好等优点在近年来得到了迅速发展。荧光分子探针的设计合成以及荧光分析法在环境分析化学中的应用是方兴未艾的研究方向[1]。 分子荧光分析具有检测限低，灵敏度高，选择性好，取样量少，方法简捷快速等特点，是一种重要的光谱化学分析手段，其中荧光分子探针检测技术在环境分析化学中占有重要的地位[2]。因此，在对环境的分析中，荧光分析法应用非常广泛，从天然水、饮用水到废水、污水；从土壤、大气到动植物；从人的头发、骨骼、血液到内脏等各个器官，涉及到的样品和应用范围几乎无所不有[3]。 2.荧光分析法的原理和特点 2.1.荧光分析法 2.1.1荧光及荧光分析 荧光是荧光化合物在受到紫外光、电和化学等能量激发后，电子从基态跃迁到激发态，然后通过辐射衰变释放出光子而回复到基态，即产生荧光。这些物质会在极短的时间内(8-10秒)发射出各种颜色和不同强度的可见光，而当紫外光停止照射时，所发射的光线也随之很快地消失。 荧光分析是指利用某些物质在紫外光照射下产生荧光的特性及其强度进行物质的定性和定量的分析的方法。1852年G.G.斯托克斯(G.G.Strokes)发现荧光，真正的荧光光谱测量则始于本世纪60年代。 2.1.2荧光激发光谱和发射光谱 荧光是一种光致发光现象，由于分子对光的选择性吸收，不同波长的入射光便具有不同的激发效率。如果固定荧光的发射波长不断改变激发光的波长，并记
荧光分析法检测原理及应用举例
1荧光定义 某些化学物质从外界吸收并储存能量而进入激发态，当其从激发态回到基态时，过剩的能量以电磁辐射的形式放射出去即发光，称之为荧光。可产生荧光的分子或原子在接受能量后引起发光，供能一旦停止，荧光现象随之消失。 2荧光分类 由化学反应引起的荧光称为化学荧光，由光激发引起的荧光称为光致荧光，课题主要研究光致荧光。按产生荧光的基本微粒不同，荧光可分为原子荧光、X 射线荧光和分子荧光，课题主要研究分子荧光。 3光致荧光机理 某一波长的光照射在分子上，分子对此光有吸收作用，光能量被分子所吸收，分子具有的能量使分子的能级由最低的基态能级上升至较高的各个激发态的不同振动能级，称为跃迁。分子在各个激发态处于不稳定的状态，并随时在激发态的不同振动能级下降至基态，在下降过程中，分子产生发光现象，此过程为释放能量的过程，即为光致荧光的机理。光致荧光的过程按照时间顺序可分为以下几部分。 3.1 分子受激发过程 在波长为10~400nm的紫外区或390~780nm的可见光区，光具有较高的能量，当某一特征波长的光照射分子时，是的分子会吸收此特征波长的光能量，能量由光传递到分子上，此过程为分子受激发过程。分子中的电子会出现跃迁过程，在稳定的基态向不稳定的激发态跃迁。跃迁所需要的能量为跃迁前后两个能级的能量差，即为吸收光的能量。分子跃迁至不稳定的激发态中即为电子激发态分子。 在电子激发态中，存在多重态。多重态表示为2S+1 o S为0或1,它表示电子在自转过程中，具有的角动量的代数和。S=0 表示所有电子自旋的角动量代数和为0,即所有电子都是自旋配对的，那么2S+仁1,电子所处的激发态为单重态，用S i 表示，由此可推出，S0 即为基态的单重态，S1 为第一跃迁能级激发态的单重态，S2为第二跃迁能级激发态的单重态。S=1表示电子的自旋方向不能配对，说明电子在跃迁过程中自旋方向有变化，存在不配对的电子为2个，2S+仁3,电子在激发态中位于第三振动能级，称为三重态，用T i 来表示，T1 即为第一激发 态中的三重态，T2即为第二激发态中的三重态，以此类推。 分子跃迁至各个激发态中，状态不稳定，随时会释放出能量，释放能量的类型有两种：一种是辐射跃迁，另一种是非辐射跃迁，释放能量会回到稳定的基态。
免疫荧光技术操作步骤
免疫荧光技术操作步骤 直接免疫荧光法测抗原 基本原理 将荧光素标记在相应的抗体上，直接与相应抗原反应。其优点是方法简便、特异性高，非特异性荧光染色少，相对使用标记抗体用量偏大。 试剂与仪器 磷酸盐缓冲盐水（PBS）：0.01mol/L，pH7.4 荧光标记的抗体溶液：以0.01mol/L，pH7.4 的PBS 进行稀释 缓冲甘油：分析纯无荧光的甘油9 份+ pH9.2 0.2M 碳酸盐缓冲液 1 份配制 搪瓷桶三只（内有0.01mol/L，pH7.4 的PBS 1500ml） 有盖搪瓷盒一只（内铺一层浸湿的纱布垫） 荧光显微镜 玻片架 滤纸 37℃温箱等。 实验步骤 1. 滴加0.01mol/L，pH7.4 的PBS于待检标本片上，10min后弃去，使标本保持一定湿度。 2. 滴加适当稀释的荧光标记（饱和浓度可以用滴度发或公式法算出）的抗体溶液，使其完全覆盖标本，置于有盖搪瓷盒内，保温30min 定时间（参考：30min）。 3. 取出玻片，置玻片架上，先用0.01mol/L，pH7.4 的PBS 冲洗后，再按顺序过0.01mol/L， pH7.4 的PBS 三缸浸泡，每缸3-5 min，不时振荡。 4. 取出玻片，用滤纸吸去多余水分，但不使标本干燥，加一滴缓冲甘油，以盖玻片覆盖。 5. 立即用荧光显微镜观察。观察标本的特异性荧光强度，一般可用“+”表示： （-）无荧光；（±）极弱的可疑荧光；（+）荧光较弱，但清楚可见；（++）荧光明亮；（+++ --++++）荧光闪亮。待检标本特异性荧光染色强度达“++”以上，而各种对照显示为（±） 或（-），即可判定为阳性。 注意事项 1. 对荧光标记的抗体的稀释，要保证抗体的蛋白有一定的浓度，一般稀释在1：20-100 之 间，要自行摸索最佳梯度，建立最好的稀释比例，抗体浓度过低，会导致产生的荧光过弱， 影响结果的观察。 2. 染色的温度和时间需要根据各种不同的标本及抗原而变化，染色时间可以从10 min 到数 小时，一般30 min 已足够。染色温度多采用室温（25℃左右），高于37℃可加强染色效果， 但对不耐热的抗原（如流行性乙型脑炎病毒）可采用0-2℃的低温，延长染色时间。低温染 色过夜较37℃30 min 效果好的多。 3. 为了保证荧光染色的正确性，首次试验时需设置下述对照，以排除某些非特异性荧光染 色的干扰。 （1）标本自发荧光对照：标本加1-2 滴0.01mol/L，pH7.4 的PBS。 （2）特异性对照（抑制试验）：标本加未标记的特异性抗体，再加荧光标记的特异性抗 体。 如果标本自发荧光对照和特异性对照呈无荧光或弱荧光，待检标本呈强荧光，则为特异性阳性染色。4. 一般标本在高压灯下照射超过3min，就有荧光减弱现象，经荧光染色的标本最好在当天观察，随着时间的延长，荧光强度会逐渐下降。
免疫荧光技术常见问题汇总
免疫荧光技术常见问题汇总 1、问：用免疫荧光方法做组织切片和培养细胞内的蛋白，两者操作过程有哪些不同？ 参考见解：只是固定方法不同。细胞固定用甲醇，切片固定用多聚甲醛，而染色方法是一样的。 2、问：近期要做免疫荧光双标，不知哪位有免疫荧光双标技术的详细步骤及其注意事项？ 参考见解：经验是： （1）选取一抗时要来源于两种不同的动物，用来源于rabbit和rat的抗体，二抗则是不同荧光信号标记的，比如donkey anti-rabbit-FITC（绿）和donkey anti-rat-Tex-Red（红）。 （2）两种一抗同时孵育，然后两种二抗同时孵育。抗体浓度、孵育时间要仔细摸索，感觉一抗4度孵育过夜比较好，背景比较清晰。 （3）阳性对照用的是阳性组织切片，阴性对照则分别是家兔和大鼠的IgG，荧光标记物对照是PBS+荧光标记物。 （4）封闭血清与二抗来源动物一致，用的是10%的正常donkey血清。 （5）其余步骤同一般免疫荧光单标操作。 3、问：本人拟做Brdu标记神经干细胞免疫荧光，二抗为FITC标记，想请教各位大侠： （1）抗体分装和荧光显微镜观察时是否一定要在暗室中进行？ （2）封片时是否用甘油缓冲液即可，还是用甘油和0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液等量混合封片？ （3）免疫酶染色中的3%过氧化氢及2N盐酸是否还需要用？ 参考见解： （1）你的二抗是用FITC标记的，为避免荧光分解，分装及荧光显微镜观察时均要避光； （2）封片最好用甘油加0.5mmol/L pH9.0-9.5的碳酸氢盐缓冲液，后者能使玻片透明； （3）关于免疫酶染色，如果是用过氧化物酶做标记，就必须用3%H2O2以去除内源性过氧化物酶；2N盐酸需要使用，目的是使DNA变性，让Brdu抗体能够充分地与已经掺入的Brdu结合。
时间分辨荧光分析技术
1.1 时间分辨荧光分析技术 时间分辨荧光生化分析技术是基于稀土荧光配合物特殊的荧光性质而建立起来的，自1978年提出以来[1]，已广泛的应用于免疫分析、核酸测定、荧光显微镜成像、细胞识别、单细胞原位测定、生物芯片等生化领域，并发展出了相应的时间分辨荧光免疫测定法、时间分辨荧光DNA 杂交测定法、时间分辨荧光显微镜成像测定法、时间分辨荧光细胞活性测定法及时间分辨荧光生物芯片测定法等分支。 本节主要对稀土荧光配合物的发光机理、荧光性质，时间分辨荧光测定的原理，时间分辨荧光免疫分析技术，时间分辨荧光显微镜成像技术的研究进展等加以介绍。 1.1.1 稀土荧光配合物的发光机理及荧光性质 稀土元素指的是元素周期表中IIIB 族的镧系元素以及钪和钇，共17种元素。其中镧系元素的外层电子结构为4f 0-145d 0-106s 1-2，由于5s 和5p 电子对4f 电子的屏蔽作用，导致这些金属及其离子的性质十分相似。图1.1给出了四种三价稀土离子的基态及激发态电子能级图[2]。 1020 152530355 E N E R G Y ,103c m -1 6 H 5/2 G 5/2 6 H 15/2 7 F 0 F 2D 0 5D 1 7F 6 F 5 4 5D 3 13/2 4 9/2 Sm 3+ Eu 3+ Tb 3+ Dy 3+ H 9/2 图1.1 部分三价稀土离子的电子能级图 Fig. 1.1 Electronic energy levels of certain lanthanide(III) ions 大部分稀土离子本身是不具有荧光性质的，只有Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+的水溶液在紫外光或可见光的激发下能够发出微弱的荧光。当Sm 3+、Eu 3+、Tb 3+和Dy 3+与某些有机配位体形成配合物时其荧光强度会显著增强，这种发光是基于配合物内由配位体到中心稀土离子的能量转移所产生的[3-8]。以铕(III)配合物为
免疫荧光技术
免疫荧光技术 荧光免疫技术是标记免疫技术中发展最早的一种。很早以来就有一些学者试图将抗体分子与一些示踪物质结合，利用抗原抗体反应进行组织或细胞内抗原物质的定位。Coons等于1941年首次采用荧光素进行标记而获得成功。这种以荧光物质标记抗体而进行抗原定位的技术称为荧光抗体技术（fluorescentantibodytechnique）。 荧光免疫法按反应体系及定量方法不同，还可进一步分做若干种。与放射免疫法相比，荧光免疫法无放射性污染，并且大多操作简便，便于推广。国外生产的TDM用试剂盒，有相当一部分即属于此类，并且还有专供TDM荧光偏振免疫分析用的自动分析仪生产。 由于一般荧光测定中的本底较高等问题，荧光免疫技术用于定量测定有一定困难。近年来发展了几种特殊的荧光免疫测定，与酶免疫测定和放射免疫分析一样，在临床检验中应用。 有关荧光的基本知识 一、荧光现象 （一）荧光的产生 一此化学物质能从外界吸收并储存能量（如光能、化学能等）而进入激发态，当其从激发态再回复到基态时，过剩的能量可以电磁辐射的形式放射（即发光）。 荧光发射的特点是：可产生荧光的分子或原子在接受能量后即刻引起发光；而一旦停止供能，发光（荧光）现象也随之在瞬间内消失。 可以引起发荧光的能量种类很多，由光激发所引起的荧光称为致荧光。由化学应所引起的称为化学荧光，由X线或阴极射线引起的分别称为X线荧光或阴极射线荧光。荧光免疫技术一般应用致荧光物质进行标记。 （二）荧光效率 荧光分子不会将全部吸收的光能都转变成荧光，总或多或少地以其他形式释放。荧光效率是指荧光分子将吸收的光能转变成荧光的百分率，与发射荧光光量子的数值成正比。 荧光效率＝发射荧光的光量分子数（荧光强度）／吸收光的光量子数（激发光强度）发射荧光的光量子数亦即荧光强度，除受激发光强度影响外，也与激发光的波长有关。各个荧光分子有其特定的吸收光谱和发射光谱（荧光光谱），即在某一特定波长处有最大吸收峰和最大发射峰。选择激发光波长量接近于荧光分子的最大吸收峰波长，且测定光波量接近于最大发射光波峰时，得到的荧光强度也最大。 （三）荧光的猝灭