酵母双杂交实验流程(精)

模块七蛋白质之间的相互作用

1. 实验目的

本实验以重组质粒和酵母细胞为材料, 学习检测蛋白质相互作用的基本原理和技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术; 让学生了解和掌握酵母

双杂交系统的应用; 掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。

2. 实验原理

1989年 Fields 和 Song 等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识(即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与 ,提出并建立了酵母双杂交系统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台,近几年得到了广泛的运用和发展。

相比于其它蛋白质筛选系统,酵母双杂交系统具有以下优点:(1检测在真核活细胞内进行,在一定程度上代表细胞内的真实情况。 (2作用信号是在融合基因表达后,在细胞内重建转录因子的作用而给出的,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。 (3检测结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。 (4酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。 (5 通过 mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型、 X-Gal 及

HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。

酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先, 经典的双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内, 因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性” 。在酵母双杂交系统建立的初期阶段,由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系,这种报告基因的表达往往不能十分严谨地被控制,因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用, 使 DNA 结合结构域融合蛋白在无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白

质的低亲和力区域, 能与其他蛋白形成稳定的复合物,从而引起报告基因的表达,产生“假阳性”结果。产生“假阴性”结果的原因可能有许多蛋白质间的相互作用依赖

于翻译后加工如糖基化、磷酸化和二硫键形成, 还有些蛋白的正确折叠和功能有赖于某些非酵母蛋白的辅助等。

现在的酵母双杂交系统大都采用多种报告基因,如 AH109酵母株含有三类报告基因— ADE2、 HIS3、 MEL1/lacZ,这三类报告基因受控于三种完全不同、异源性的 GAL4-反应元件和三类启动子元件 -GAL1、 GAL2以及 MEL1(如图 6-1-1 。通过这种方法就消除了两类最主要的假阳性,一类是融合蛋白可以直接与 GAL4结合位点结合或者是在结合位点附近结合所带来的假阳性; 另一类是融合蛋白和某种转录因子结合后再结合到特定的 TA TA 盒上所带来的假阳性。 ADE2一种报告基因就已经能够提供较强的营养选择压力,这时选择性地使用 HIS3报告基因,一来可以降低假阳性率;二来可以控制筛选的严格性(如果需要筛选与诱饵蛋白具有较强结合的蛋白,就可以同时使用 ADE2、 HIS3两种报告基因; 如果只需要筛选与诱饵蛋白具有中等强度或较弱结合的蛋白, 就可以使用 ADE2或 HIS3两者中的一种。

MEL1和 lacZ 分别编码α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶,可以作用于相应的底物

X-α-Gal 和 X-β-Gal 使酵母变蓝。其中, α-半乳糖苷酶是外分泌酶,在酵母表面就能直接检测到; β-半乳糖苷酶是内分泌酶, 需要将酵母破碎后才能检测到。用蓝斑显示酵母细胞内两个蛋白的相互作用的方法不仅具有较高的敏感性,而且蓝斑的深浅还可以反映两个蛋白相互作用的强弱。

随着酵母双杂交系统的广泛应用, 这一系统得到了不断的完善及改进, 除了经典的双杂交系统以外,同时也衍生出单杂交系统、三杂交系统、反向酵母双杂交系统、 hSos/Ras募集系统(hSos/Ras recruitment systems 、泛素分裂系统(Split-ubiquitin systems 、双诱饵系统(Dual-bait systems等一系列相关系统,根据这些系统的不同特点,可以分别应用于蛋白质与 DNA 、 RNA 的相互作用、蛋白质复合体之间的相互作用、膜蛋白质之间的相互作用、筛选阻断蛋白间相互作用的药物等一系列领域, 对经典的酵母双杂交系统起到了很好的补充,并有力地推动了酵母双杂交系统的发展与应用。

酵母双杂交系统的原理是利用转录激活因子在结构上是组件式的, 即这些因子往往由两个或两个以上相互独立的结构域构成,其中有 DNA 结合结构域(DNA binding domain, DB 和转录激活结构域(activation domain, AD ,它们是转录激活因子发挥功能所必需的。单独的 DB 虽然能和启动子结合,但是不能激活转录。而不同转录激活因子的 DB 和 AD 形成的杂合蛋白仍然具有正常的激活转录的功能。根据转录因子的这一特性,将 BD 与已知的诱饵蛋白质 X 融合,构建出 BD-X 质粒载体; 将 AD 基因与 cDNA 文库,基因片段或基因突变体(以 Y 表融合,构建 AD-Y 质粒载体。两个穿梭质粒载体共转化至酵母体内表达。蛋白质 X 和 Y 的相互作用导致了BD 与 AD 在空间上的接近, 从而激活 UAS 下游启动子调节的酵母菌株特定报告基因(如 LacZ , HIS 3, LEU 2等的表达(图 6-1-2 ,使转化体由于 HIS3或 LEU2表达,而可在特定的缺陷培养基上生长,同时因 LacZ 表达而在 X-α-Gal 存在下显蓝色。

酵母双杂交原理示意图

3. 实验仪器

微量取液器(2 μL; 20 μL; 200 μL; 1,000 μL 、低温离心机、台式离心机、琼脂糖凝胶电泳系统、蛋白凝胶电泳系统、凝胶成像系统、半干转移系统、恒温摇床、恒温孵箱、通风橱、制冰机、振荡器、恒温金属浴、无菌接种环、 10 cm培养皿、 15 cm培养皿。

4. 实验试剂

(1裂解缓冲液(Cracking buffer :

尿素 8 mol/L

SDS 5 %

Tris-HCl (pH 6.8 40 mmol/L

EDTA 0.1 mmol/L

溴酚蓝 0.4 mg/ml

(2 各种基础培养基和营养缺陷培养基:minimal SD base, minimal SD agar base, YPD medium, YPD agar medium, -Leu DO supplement, -Trp DO supplement, -Leu/-Trp DO supplement, -Leu/-Trp/-His DO supplement, -Leu/-Trp/-His/-Ade DO supplement, 腺苷酸 (adenine , PEG8000, Carring DNA, 二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide, DMSO , TE/LiAC buffur, PEG/LiAC, X-α-gal 或 X-β-gal 。

(3酵母质粒提取试剂盒, LB 培养基,羧苄青霉素和卡那霉素。

(4蛋白标准。

(5 Z-buffer (pH7.0 :

Na2HPO4?7H2O 16.1 g/L

NaH2PO4?H2O 5.5 g/L

KCI 0.75 g/L

MgSO4?7H2O 0.246 g/L

(6 Z-buffer/X-β-Gal 液体:

Z-buffer 100 ml

β-巯基乙醇 0.27 ml

X-β-Gal 储存液 1.67 ml

5. 实验方法

酵母的复苏与表型验证:

(1复苏前 1~2 天,配制 YPDA 琼脂并于高压消毒后倒板。

(2用无菌接菌环在酵母冻存管中挑取一小团酵母细胞,接种到 YPDA 琼脂板上。

(3 30 ℃倒置孵育 3~5天。

(4待酵母长到直径 2~3 mm后,将其接种到不同营养缺陷型培养基上进行表型验证。

质粒转化酵母细胞(常规转化 :

(1挑取一直径约 2~3 mm的酵母克隆接种到 0.5 ml YPDA培养基中。

(2剧烈震荡使细胞凝块均匀分散。

(3将细胞转移到含有新鲜 YPDA 培养基的锥形瓶中。

(4 30℃, 250 rpm,振荡孵育 16~18 hr,直到稳定期(OD 600>1.5 。

(5将过夜培养物转移到含有新鲜 YPDA 培养基的椎形瓶中,进一步扩增酵母细胞。

(6 30 ℃, 230~270 rpm,振荡孵育使 OD 600达到 0.5 ± 0.1(一般需要 3 hr

(7将细胞转移到数个 50 mL离心管中,转速 1 000 g,室温离心 5 min。

(8弃去上清,加入 25~50 mL消毒 H 2O ,振荡重悬、清洗并收集细胞。

(9转速 1 000 g,室温离心 5 min,弃上清

(10加入 1 mL新鲜配置的无菌的1Х TE / LiAC重悬细胞。

(11准备 1.5 mL无菌 EP 管,在每个管中加入需要转染的质粒以及担体(carrier DNA 。

(12加入经1Х TE/LiAC重悬的感受态细胞,轻柔混匀。

(13每个管中加入适量体积的 1?PEG/LiAC,高速震荡混匀。

(14 30 ℃, 200 rpm,振荡孵育 0.5 hr。

(15加入适量体积的 DMSO ,温和颠倒混匀,不要振荡。

(16 42 ℃水浴热休克 15 min,对于大量转化,应经常摇动以混匀。

(17置于冰上 5~10 min,室温 12,000 ? g离心细胞 5 sec。

(18移去上清,根据铺的板数加入适量体积的 1?TE 重悬细胞。

(19铺板,倒置平板于 30 ℃孵育直到克隆出现。

检测目的蛋白在酵母细胞中的表达:

(1挑取一直径约 2 mm、含有目的蛋白基因片段的 BD/X新鲜酵母克隆于 5 mL 相应营养缺陷液体

培养基中, 30 ℃、 230 rpm振荡孵育 16 hr。

(2 将过夜培养物在 50 mL YPDA培养基中扩大培养, 30 ℃, 220~250 rpm, 使 OD 600值达到 0.4~0.6。

(3 1,000 ? g离心 5 min,弃上清。

(4加入 30 mL H2O ,重悬细胞。 1,000 ? g,离心 5 min,弃上清,加入液氮速冻沉淀。

(5待液氮挥发完全以后,按照100 μL/7.5 OD600的比例加入 cracking buffer重悬细胞并移入到一个

小量转化大量转化质粒 DNA

0.1 μg 20~200 μg carrier

DNA 0.1 mg 2 mg 质粒

*7 每管中加入感受态细胞的体积根据酵母细胞的数量以及铺板的大小而定, 通常小量转化每管加入100 μL 的感受态细胞; 大量转化每管加入 1 mL 的感受态

细胞。如果长出

来以后克隆太密则可适量减少每管中加入的感受态细胞的体积; 反之则可适

当增加感受态细胞的体积。

转化酵母菌结果

1.5 mL的 EP 管。

(6按80 μL/7.5 OD600的比例向 EP 管中加入酸性玻璃微珠(glass beads 。 70 ℃加热 10 min。剧烈

震荡 1 min。

(7 12,000 ? g, 4 ℃离心 5 min。将上清转移到一个新的 1.5 mL EP管中,置于冰上。

(8 100 ℃水浴中 3~5 min,剧烈震荡 1 min。

(9 12,000 ? g, 4 ℃离心 5 min。将两次上清合到一个 EP 管中。

(10取20 μL 上清,加入上样缓冲液, 100 ℃变性 5 min。

(11 SDS-PAGE 电泳后,采用 Western blot技术检测目的蛋白在酵母细胞中的表达情况。小规模酵母杂合(mating :

(1在无菌的 1.5 mL EP管,加入 0.5 mL 2 ?YPDA 培养基。

(2挑取直径约 2~3 mm 、新鲜的含有表达质粒 pGBKT7-X 的 AH109酵母克隆和含有表达质粒

pGADT7-Y 的 Y187酵母克隆于上述 EP 管中。

(3剧烈震荡 1 min,使酵母细胞完全悬浮。

(4 30 ℃, 200 rpm振摇孵育 20~24 hr。

(5 将杂交混合液按 1:100稀释到 0.5?YPDA 培养基中, 取 100 mL铺到 SD/-Trp/-Leu/X-α-Gal 板上。

(6倒置平板于 30 ℃孵育直到克隆出现。

滤纸转移法检测β-半乳糖苷酶的分泌:

(1待酵母长到直径 1.5~3 mm大小时,取无菌、大小合适的 Whatman 滤纸贴在酵母板上。

(2待滤纸被琼脂板上的水分基本浸湿后,揭下滤纸,这时酵母克隆被转移到了滤纸上。

(3将附着有酵母克隆的滤纸在液氮中速冻 10 sec以上。

(4将新配制 Z-buffer/X-β-Gal 液体滴在另一无菌的 Whatman 滤纸上,并完全浸湿滤纸。酵母杂交操作步骤流程图

Y187 Mating SD/-His/-Leu/X-α-Gal

-Gal SD/-Ade/-Leu/-Trp/ X-α-Gal AH109

（5）将附着有酵母克隆的滤纸小心地贴放在浸有 Z-buffer/X--Gal 的滤纸上。（6）室温孵育 8~16 hr 等待蓝斑出现。滤纸转移法检测-半乳糖苷酶的表达量诱饵蛋白的文库筛选： Y187 BD-bait AH109 AD-library Pick out positive clone Mating Extracting plasmids TDO/x--Gal DDO/X--Gal QDO/X--Gal Thransform DH5α LB/Kan+ Extracting plasmids Retransform into AH109 SD/-Leu Mating with BD/Vector Mating with BD/bait Mating with BD/lam DDO plate DDO plate DDO plate QDO/X--Gal plate QDO/X--Gal plate QDO/X--Gal plate 酵母双杂交文库筛选操作流程图（1）挑取一新鲜、直径为 2~3 mm 的 BD-bait 酵母 AH109 于 50 ml SD/-Trp 液体培养基，℃， 30 250~270

rpm，16~18 hr，培养至 OD600 值>0.8。（2）离心 5 min，弃上清。用剩余的 5 mL 左右残液重悬细胞。（3）室温水浴融化冻存的文库（约 1

mL），轻柔震荡，留取文库用于文库滴度测定（文库滴度测定方法见后）。（4）快速将步骤 2 和步骤 3 的两种液体混合到 2 L 的烧瓶中并加入 45 mL

）（轻柔震荡；用冲洗装文库的离心管两次，并将冲洗液加入到烧瓶中。（5）30 ℃过夜孵育（20~24 hr）并轻柔震荡（30~50 rpm）。（6）将杂交混合液转移到一无菌离心瓶中，离心10 min，弃上清。再用 50 mL 2×YPD/Kan 冲洗杂交瓶两次，将两次冲洗液混合在一起重悬细胞。（7）离心 1 0 min，弃上清。用 10 mL 的

重悬细胞，并估算重悬后的总体积，铺板。（8）倒置平板于 30 ℃孵育 8~21 天直到克隆出现。（9）挑取阳性克隆于和消毒甘油的混合液中，冻存于-80 ℃。阳性克隆验证：（1）用接种环挑取单个阳性克隆接种到新的 SD/-Trp/-Leu/-His/ X-Gal 平板上，30 ℃倒置平板孵育。（2）待阳

性克隆长出后，再用接种环挑取单个阳性克隆，接种到新的 SD /-Trp/-Leu/-His/X-Gal 平板或 SD/-Trp/-Leu/-Ade/ -His/X-Gal 平板上，倒置平板于 30 ℃孵育。（3）挑取单个阳性克隆于 5 mL YPDA/Kan 培养基中 30 ℃，250~270 rpm 振摇 12~16 hr。（4）使用酵母质粒微量抽提试剂盒提取质粒。（5）将提取到的质粒混合物（BD/bait、AD/cDNA）采用经典转化法转化大肠杆菌，铺 LB 抗生素平板。LB 平板中的抗生素与 AD/cDNA 载体所带的抗性一致，这样最终得到的克隆只含有 AD/cDNA。（6）挑取单个阳性克隆于 5 mL LB 培养基（含相应抗生素）中 37 ℃，250~270 rpm 振摇 12~16 hr。（7）提取质粒，做 PCR 鉴定。（8）将pGADT7-cDNA 表达质粒转入 AH109 酵母株中将 pGBKT7-bait 表达质粒转入 Y187 酵母中，待克隆长出对带有 AD-文库蛋白的 AH109 酵母克隆进行自激活验证，另外再将带有 AD-文库蛋白的 AH109 酵母克隆与带有 BD-bait 蛋白的 Y187 酵母克隆进行杂交，验证阳性克隆的真实性。—2 000bp —500bp —2 000bp —500bp —2 000bp —2 000bp —500bp —500bp 文库 cDNA 片段的 PCR 鉴定

文库滴度的测定：（1）将预留的文库与混合均匀。（2）取混合液到 1 mL LB 培养基中，混合均匀，制成稀释溶液 A（1:103）。（3）再从溶液 A 中取到 1 mL LB 培养基中，混合均匀，制成稀释溶液 B （1:106）。（4）从溶液 A 中取到 50 mL LB 培养基中，混合均匀，铺

板。（5）从溶液 B 中分别取和铺板。（6）将板倒置 30~31 ℃，孵育 36~48 hr。（7）克隆计数并计算文库滴度（cfu/mL），计算文库滴度的方法如下： A：克隆数：（克隆数/铺板体积）

注意事项（1）酵母双杂交对照的设定常规的酵母双杂交操作时一般会设定阳性对照、阴性对照以及显色系统对照三种对照，以MATCHMAKER GAL4 酵母双杂交筛选系统为例：阳性对照：pGADT7-T + pGBKT7-53，其中 T 蛋白和 53 蛋白是已经明确在酵母细胞内能够发生结合并启动报告基因表达的两种蛋白。阴性对照：pGADT7-T + pGBKT7-lam，其中已经明确T 蛋白和 lam 蛋白在酵母细胞内不能发生结合。系统显色对照，pGADT7-Pcl1，该表达质粒转入酵母细胞就能引起-半乳糖苷酶和-半乳糖苷酶的分泌，从而检测显色系统是否有问题。（2）假阳性现象多种原因可能造成假阳性结果，常见的有以下三种：筛到的文库蛋白自身具有转录活性，能够启动报告基因的表达——这种情况需要对筛到的候选蛋白进行自激活验证。酵母细胞内可能同时含有不止一种文库蛋白，其中的一种文库蛋白可以与诱饵蛋白相互及结合。这种情况需要对阳性克隆再次划板 2~3 次，以确保每一个酵母克隆中只含有一种文库蛋白和诱饵蛋白；另外划板的次数也不宜过多，否则会出现蛋白表达质粒丢失的情况。其他一些不明原因造成的假阳性—这种情况需要将筛到的候选文库质粒和表达诱饵蛋白的质粒重新共转入酵母细胞或者通过酵母杂交的方式重新验证，如有必要可以将 pGADT7-cDNA 质粒与 pGBKT7-bait 质粒的载体对调构建成 pGADT7-bait 与pGBKT7-cDNA 并重新在酵母细胞中验证，真正的阳性结合在对调以后也能在酵母细胞中做出阳性结果。（3）常见的问题及参考方案转化效率过低—尽量使用新鲜的培养基以及新鲜的、且直径大小在 2~3 mm 左右的酵母克隆，以

确保酵母的活力；可将用于转化的质粒在使用前进行乙醇沉淀，以提高质粒的纯度和浓度。杂交效率偏低—可能由于表达的融合蛋白对酵母细胞有毒性，在某些情况下在液体培养基中生长不好的酵母换到琼脂糖固体培养板上时，会生长得比较好，这种情况可以采用共转化的方法进行试验；或者将单转的酵母克隆分别铺到 5 块 10 mm 的培养板上，待克隆长出来以后，刮取所有克隆于 5 mL 0.5

×YPDA 中。重悬后再按照常规杂交操作步骤进行操作。背景过高—当使用 HIS3

作为报告基因时，由于 HIS3 基因具有一定程度的泄漏表达，可能会出现背景过高的情况，这时可以使用适量的 HIS3 蛋白竞争性抑制剂 3-AT（3-amino-1,2,4-triazole）以降低背景；或者再增加一种更加严格的报告基因的筛选如 Ade。诱饵蛋白具有自激活现象——可以采用克隆突变的方法将产生自激活一段氨基酸序列敲除或突变，但这种方法可能会破坏两蛋白之间的相互作用。

酵母双杂实验步骤

2.1.1酵母双杂交 2.1.1.1Gateway入门克隆 设计Gateway引物时，在上游引物的5'端加上B1序列：GGGG-ACA-AGT-TT G-TAC -AAA-AAA-GCA-GGC-TNN-，下游引物的5'端加上B2序列：GGGG-ACC-ACT-TT G-T AC-AAG-AAA-GCT-GGG-TN-。其中，5'-GGGG序列是保护碱基，防止引物的重要部分被降解，下划线加粗的部分是在整个的Gateway克隆中可以保存下来的序列，3'端的碱基N是为了保证经过入门载体构建目的载体时阅读框的正确性，一般建议为C。 通过PCR扩增获得带有att B位点的基因片段，扩增体系和条件见3.2.2.2，其中将退火温度改为65℃。获得扩增产物后对其进行回收纯化，测定纯化后DNA 的质量和浓度后进行下一步的BP反应，反应体系如下： att B-PCR产物（≥10 ng/μL）1-7μL pDONR221 (150 ng/μL)1μL TE buffer, pH 8.0 补足8μL 将上述混合物加入离心管中，加入2μL BP反应酶，加入之前需将其在涡旋仪上轻轻振荡两次，所有组分混匀离心后，25℃反应1h，加入1μL蛋白酶K后，混匀离心，37℃反应10min终止BP反应，将BP反应产物参照3.2.2.6进行转化，由于pDONR221载体为Kan抗性，所以选用含有50μg/mL Kan抗生素的LB平板进行阳性克隆筛选，参照3.2.2.7检测阳性克隆，然后根据3.2.2.8中的方法提取重组质粒，测定质量和浓度后送至测序公司进行测序。 进行BP反应时，需注意以下几项： (1)对于BP反应来说，最高效的是采用线性的att B-PCR产物和超螺旋的att P 入门载体； (2)为了提高BP反应的效率，可以将建议的25℃反应1h适当延长至4-6h，可 以将效率提高2-3倍，或者延长至过夜反应，可以将效率提高5-10倍，对 于长片段克隆来讲，适当的延长反应时间是非常必要的； (3)提高体系中PCR产物的量可以增加反应效率，但每10μL体系中PCR产物 最好不要超过250ng。 2.1.1.2诱饵载体构建 重组的入门载体测序正确后，通过LR反应来构建酵母双杂交的诱饵载体，LR反应体系如下： 入门载体(50-150 ng)1-7μL pDEST32 (150 ng/μL)1μL TE buffer, pH 8.0 补足8μL

CLONTECH酵母双杂中文版

目录 （一）介绍 4 （二）试剂盒物品清单 7 （三）额外附加物品列表9 （四）酵母菌株11 （五）酵母载体14 （六）方法简述：单杂交文库的构建和筛选16 方法简述：双杂交文库的构建和筛选17 （七）构建用于酵母单杂交的报告质粒载体18 （八）构建用于酵母双杂交的DNA-BD融合载体19 （九）构建生成cDNA文库21 （十）构建和筛选酵母单杂交和双杂交文库（简述）27 （十一）酵母单杂交文库的构建和筛选28 （十二）酵母双杂交文库的构建和筛选30 方法A:通过酵母配对（Yeast Mating）来筛选目的蛋白30 方法B:通过共转化的方法筛选目的蛋白35 （十三）分析阳性相互作用结果38 （十四）问题解决指南44 （十五）参考文献47 （十六）相关产品50 附录A: 双链 cDNA合成的典型结果51 附录B: 酵母感受态的制备—LiAc 法52 附录C：单杂交对照载体信息53 附录D：双杂对照载体信息54 表格列表 Table I． BD Matchmaker酵母菌株的基因型11 Table II． BD Matchmaker酵母菌株的表型11 Table III．单杂交系统的载体14 Table IV．双杂交系统的载体15 Table V．各BD-Matchmaker DNA-BD 载体的比较19 Table VI． RNA起始浓度和PCR扩增循环数之间的关系24 Table VII．单杂交共转化的对照实验的设置29 Table VIII．单杂共转化对照实验：期望的结果29 Table IX．双杂交转化的对照实验的设置33 Table X．双杂交配对筛选的对照实验的设置 Table XI．双杂交共转化的对照实验的设置 Table XII．双杂交共转化的对照实验：期望的结果 Table XIII．用于PCR筛选菌落的Assembling Master Mixs

!!酵母双杂交操作步骤(中文翻译)

各种SD培养基： 1)SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？ “四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的） ; 葡萄糖20g (即2%) 2)SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3)SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4)SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 5)SD/-trp (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.74g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g (即2%) 注意：YNB有两种，一种含有硫酸胺，另外一种不含硫酸胺。我们这用的是含硫酸铵的。（买来就加进去了的）。如果不含硫酸铵，那么要在终浓度0.17%的YNB中再加入0.5%的硫酸铵，即最终在1000 ml溶液中加入总量为6.7g的YNB与硫酸铵。 实际配制的方法是： 1.配制40%的葡萄糖贮存液（贮存在4℃），过滤除菌，待高压灭菌的溶液温度降至55℃ 以下时，再将50ml葡萄糖贮存液加入。（李博士经验这一步不高压，过滤即可使用）2.酵母氮源6.7g，加DO supplement 在920ml水中溶解，调PH至5.8（李博士的经验大 约加10M NaOH 200ul即可），之后补水至950 ml。 3.高压完后待温度降至55℃以下，加入50 ml40%葡萄糖。

酵母双杂交操作步骤(中文翻译)

（酵母菌储存在-70℃中，引物和质粒DNA储存在-20℃中） 概念： 1. 次序转化:指的是先将一种质粒转化进酵母中（常是DNA-BD/bait plasmid），在选择培养基中选择出阳性克隆，之后再将另外一个质粒（AD fusion library）转化进去。优点：就是比共转化使用更少的质粒DNA，也就是节约质粒DNA。 2. 共同转化：将两种质粒一起转化进酵母中。优点：比次序转化更容易操作。 pGBKT7----的选择物是：kanamycin（卡那霉素）？ pGADT7----的选择物是：ampicillin (氨苄西林) ？ 各种SD培养基： 1) SD/-ade（腺嘌呤）/-leu（亮氨酸）/-trp（色氨酸）/-his （组氨酸）(1000 ml)（？“四缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.60g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 2) SD/-leu/-trp/-his (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu/-trp/-his DO supplement 0.62g ; （购买来就配好的） 葡萄糖 20g. (即2%) 3) SD/-leu/-trp (1000 ml) （？“二缺”） 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -ade/-leu/-trp/-his DO supplement 0.64g （购买来就配好的）; 葡萄糖 20g (即2%) 4) SD/-leu (1000 ml) 酵母氮源（YNB）：6.7g ; -leu DO supplement 0.69g ; （购买来就配好的）

酵母双杂交技术

酵母双杂交系统 1．原理 酵母双杂交系统的建立得力于对真核细胞调控转录起始过程的认识。研究发现，许多真核生物的转录激活因子都是由两个可以分开的、功能上相互独立的 结构域(domain)组成的。例如，酵母的转录激活因子GAL4，在N端有一个由147个氨基酸组成的DNA结合域(DNA binding domain,BD)，C端有一个由113 个氨基酸组成的转录激活域(transcription activation domain,AD)。GAL4分子的DNA结合域可以和上游激活序列(upstream activating sequence，UAS)结合，而 转录激活域则能激活UAS下游的基因进行转录。但是，单独的DNA结合域不 能激活基因转录，单独的转录激活域也不能激活UAS的下游基因，它们之间只 有通过某种方式结合在一起才具有完整的转录激活因子的功能。 2．试验流程 酵母双杂交系统正是利用了GAL4的功能特点，通过两个杂交蛋白在酵母细 胞中的相互结合及对报告基因的转录激活来捕获新的蛋白质，其大致步骤为: 2．1、视已知蛋白的cDNA序列为诱饵(bait)，将其与DNA结合域融合，构建 成诱饵质粒。 2．2、将待筛选蛋白的cDNA序列与转录激活域融合，构建成文库质粒。2．3、将这两个质粒共转化于酵母细胞中。 2．4、酵母细胞中，已分离的DNA结合域和转录激活域不会相互作用，但诱 饵蛋白若能与待筛选的未知蛋白特异性地相互作用，则可激活报告基因的转录；反之，则不能。利用4种报告基因的表达，便可捕捉到新的蛋白质。 3．特点 优点 蛋白--蛋白相互作用是细胞进行一切代谢活动的基础。酵母双杂交系统的建立 为研究这一问题提供了有利的手段和方法。 缺点 尽管该系统己被证实为一种非常有效的方法，但它也有自身的缺点和问题。1、它并非对所有蛋白质都适用，这是由其原理所决定的。双杂交系统要求两种杂 交体蛋白都是融合蛋白，都必须能进入细胞核内。因为融合蛋白相互作用激活 报告基因转录是在细胞核内发生的。2、假阳性的发生较为频繁。所谓假阳性，即指未能与诱饵蛋白发生作用而被误认为是阳性反应的蛋白。而且部分假阳性 原因不清，可能与酵母中其他蛋白质的作用有关。3、在酵母菌株中大量表达外源蛋白将产生毒性作用，从而影响菌株生长和报告基因的表达。 使用酵母双杂交技术应注意的问题 真正明了酵母双杂交技术的主要原理及筛选方法是进行酵母双杂交实验的前提，构建成功的诱饵质粒及大量的材料准备是进行酵母双杂交实验的保证。只 有明了双杂交的原理，才有可能设计实验进程、才能有目的的进行材料准备， 并能对实验结果作出预测与分析，尤其要对具体实验中各种选择性压力培养基 的使用目的要十分清楚。大量的材料准备、较长的实验流程是酵母双杂交有别

酵母单杂交-实验步骤总结

1 pBait-AbAi载体的构建（酵母报道子的构建） 注：酵母报道子（pBait-AbAi）包含目的顺式作用元件的一个或多个拷贝，且插入到pAbAi载体AbAi r报告基因的上游。大量研究表明最有效的构建应包含目的DNA三个以上的首尾连接的拷贝。首尾连接的拷贝产生方式很多，但对于长度小于20 bp的调控元件，人工合成寡核苷酸是最方便可靠的途径。 （1）设计并合成包含目的序列的两条反向平行的寡核苷酸序列，且两端加上与pAbAi载体酶切产物一致的粘性末端（建议合成一个目的序列的突变序列作为对照，以排除可能的假阳性）。 （2）用TE buffer溶解寡核苷酸至终浓度100 μmol/L。 （3）将正向链和反向链按照1:1的比例混合（退火后的双链寡核苷酸最大浓度为50 μmol/L）。 （4）95 ?C保温30 s，去除二级结构。 （5）72 ?C保温2 min，37 ?C保温2 min，25 ?C保温2min。 注：缓慢退火，有助于双链寡核苷酸的形成。 （6）冰上放置。退火后的产物可贮存在-20 ?C冰箱备用。 （7）酶切1 μL pAbAi载体，用凝胶回收纯化或柱纯化的方式纯化酶切产物。 注：回收前，可用琼脂糖凝胶检测是否酶切完全。 （8）将退火后的寡核苷酸稀释100倍至终浓度为0.5 μmol/L。 （9）在连接反应管中加入如下成分： pAbAi载体（50 ng/μL） 1.0 μL annealed oligonucleotide （0.5 μmol/L） 1.0 μL 10×T4 DNA ligase buffer 1.5 μL BSA（10 mg/mL）0.5 μL Nuclease-free H2O 10.5 μL T4 DNA ligase （400 U/μL）0.5 μL 总体积15 μL 注：如果有必要，可用1 μL nuclease-free H2O代替寡核苷酸作为阴性对照。 （10）将反应体系室温放置连接3 h，转化E coli，采用常规方法检测阳性克隆。

酵母双杂交试验流程

4月4日划线配培养基TE/LIAC PEG/LIAC 配置培养基（YPD YPDA）取酵母细胞划线30°生长3天。 需要用品：三角瓶灭菌封口膜酵母提取物蛋白胨 注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。 4月6号星期三 （1）选择2-3mm的单克隆（枪头吸取）放入3-5ml的YPDA液体培养基，30°摇菌200rpm，8h 7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。 需要用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。 4月7号星期四 （2）吸取2.5-10ul酵母培养液，加入25mlYPDA液体培养基，摇菌16-20h直到OD值0.15-0.3。 下午4点开始8号8点结束 Tips：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取2.5、5、10 ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基（转化5个以下质粒的话，25ml菌量就够后续使用）。 4月8号星期五 （3）将菌液转移至灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。 （4）弃掉上清，加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒掉上清液时要小心操作）。 （5）30°震荡培养，直到OD值达到0.4-0.5 （3-5h）。8号8点开始下午一点结束进行以下操作之前，配置好TE/LiAc溶液，并准备好冰浴。 （6）将上述菌液转移至一个灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。（7）弃掉上清，用30ml无菌水重悬菌体（小心操作）。 （8）再次用天平配平后，室温下700g离心5分钟，弃去上清，加入1.5ml 1.1xTE/LIAC重悬菌体。（9）将上述溶液转移到灭菌的1.5mlEP管中，高速离心15s。 （10）弃去上清，加入600ul 1.1x TE/LIAC，感受态细胞制备完成，置于冰上待用。 需要物品：50ml灭菌离心管、50ml 三角瓶、1.5ml EP管、5ml灭菌枪头、1ml灭菌枪头、灭菌ddH2O、YPDA液体培养基、1.1x TE/LIAC。 1.1x TE/LIAC10ML 10xTE 1.1ml 10xliac 1.1ml Dh2O8.8ml

蛋白的酵母双杂交操作手册大全

蛋白的酵母双杂交实验 ——以钓饵蛋白筛选cDNA 文库研究蛋白相互作用 第一部分 系统简介 1. 实验原理 蛋白的酵母双杂交实验是以酵母的遗传分析为基础，研究反式作用因子之间的相互作用 对真核基因转录调控影响的实验。很早就已知道，转录活化蛋白可以和DNA 上特异的序列结合而启动相应基因的转录反应。这种DNA 结合与转录激活的功能是由转录活化蛋白上两个相互独立的结构域即DNA 结合结构域(Binding Domain, BD)和转录活化结构域(Activation Domain, AD)分别来完成的，并且这两个结构域对于基因的转录活化都是必须的。目前酵母双杂交实验采用的系统有LexA 系统和Gal4系统两种。在LexA 系统中，DNA 结合结构域由一个完整的原核蛋白LexA 构成，转录活化结构域则由一个88个氨基酸的酸性的大肠杆菌多肽B42构成，它在酵母中可以活化基因的转录; 在 Gal4系统中，BD 和AD 分别由Gal4蛋白上不同的两个结构域(1-147aa 与768-881aa)构成。在利用GAL4系统筛选cDNA 文库或研究蛋白间的相互作用时，DNA 结合结构域与靶蛋白即“诱饵”相结合，转录活化结构域与文库蛋白或要验证的蛋白相结合。一般情况下，单独的BD 可以与GAL4上游活化序列（GAL UAS ）结合但不能引起转录，单独的AD 则不能与GAL UAS 结合，只有当BD 与AD 分别表达的融合蛋白由于相互作用而导致两者在空间上相互靠近时，BD 与AD 才能与GAL UAS 结合并且引起报道基因的转录。在BD 与AD 要导入的酵母菌AH109中，通过基因工程的方法在GAL4 UASs 和启动子的下游构建了3个报道基因——ADE2，HIS3，MEL1（或LacZ ），因此可以通过营养缺陷筛选和酵母菌表型的改变来筛选或验证两个蛋白之间是否存在相互作用。GAL4系统的原理如图所示： 图一：酵母双杂交系统工作原理 Kan r Amp r pGBKT7-bait pACT2-cDNA

酵母双杂交实验流程(精).doc

模块七蛋白质之间的相互作用 1.实验目的 本实验以重组质粒和酵母细胞为材料, 学习检测蛋白质相互作用的基本原理和 技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术 ; 让学生了解和掌握酵母双 杂交系统的应用 ; 掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2.实验原理 1989 年Fields 和Song 等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认 识(即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与,提出并建立了酵母双杂交系 统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平 台 ,近几年得到了广泛的运用和发展。 相比于其它蛋白质筛选系统,酵母双杂交系统具有以下优点:(1 检测在真核活细 胞内进行 ,在一定程度上代表细胞内的真实情况。(2 作用信号是在融合基因表达后, 在细胞内重建转录因子的作用而给出的 ,省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。(3 检测结果是基因表达产物的积累效应,因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互 作用。(4 酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA 文库 ,能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。(5 通过mRNA 产生多种稳定的酶使信号放大。同时,酵母表型、X-Gal 及 HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先 , 经典的双杂交系统分析蛋白间的 相互作用定位于细胞核内,因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白 的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的 初期阶段 ,由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系,这种报告基因的表 达往往不能十分严谨地被控制,因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活 转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用, 使DNA 结合结构域融合蛋白在 无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白

酵母双杂交试验流程

4月4日划线配培养基 TE/LIAC PEG/LIAC 配置培养基（YPD YPDA）取酵母细胞划线 30°生长3天。 需要用品：三角瓶灭菌封口膜酵母提取物蛋白胨 注：以下所有涉及菌的操作均需在超净台中完成。 4月6号星期三 （1）选择2-3mm的单克隆（枪头吸取）放入3-5ml的YPDA液体培养基，30°摇菌200rpm，8h 7号下午开始，过夜培养，次日若菌液浓度达到标准，可先置于4度冰箱保存。 需要用品：200ul灭菌枪头、50ml三角瓶、YPDA液体培养基、摇床。 4月7号星期四 （2）吸取2.5-10ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基，摇菌16-20h直到OD值0.15-0.3。 下午4点开始 8号 8点结束 Tips：由于第一次活化的菌夜浓度不一，此处建议设置梯度，分别取2.5、5、10 ul酵母培养液，加入25ml YPDA液体培养基（转化5个以下质粒的话，25ml菌量就够后续使用）。 4月8号星期五 （3）将菌液转移至灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。 （4）弃掉上清，加入50ml新鲜的YPDA液体重悬菌体（由于离心转速较低，沉淀易悬起来，故倒掉上清液时要小心操作）。 （5）30°震荡培养，直到OD值达到0.4-0.5 （3-5h）。8号 8点开始下午一点结束进行以下操作之前，配置好TE/LiAc溶液，并准备好冰浴。 （6）将上述菌液转移至一个灭菌的50ml离心管中，用天平配平后，室温下700g离心5分钟。（7）弃掉上清，用30ml无菌水重悬菌体（小心操作）。 （8）再次用天平配平后，室温下700g离心5分钟，弃去上清，加入1.5ml 1.1xTE/LIAC重悬菌体。（9）将上述溶液转移到灭菌的1.5ml EP管中，高速离心15s。 （10）弃去上清，加入600ul 1.1x TE/LIAC，感受态细胞制备完成，置于冰上待用。 需要物品：50ml 灭菌离心管、50ml 三角瓶、1.5ml EP管、5ml灭菌枪头、1ml灭菌枪头、灭菌ddH2O、YPDA液体培养基、1.1x TE/LIAC。 1.1x TE/LIAC 10ML 10xTE 1.1ml 10xliac 1.1ml Dh2O 8.8ml

文库构建及酵母双杂交技术

第四章基因文库构建及酵母双杂交技术 1 基因组文库的构建 基因组文库（genomic library）将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。 理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。 1. 1构建基因文库的载体选用 载体能够容载的DNA片断大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。

第四章基因文库构建及酵母双杂交技术1.1.1对载体的要求：载体容量越大，所要求的DNA片断数目越少，所需的重组子越少。 1.1.2目前常用的载体： 载体系列（容量为24 kp ）、cosmid载体（容量为50 kb ）、YAC（容量为1 Mb ）、BAC （容量为300 kb） 1.2 基因文库构建的一般步骤 1.2.1染色体DNA大片段的制备：断点完全随机，片断长度合适于载体连接。不能用一般的限制性内切酶消化法，使用物理切割法或不完全酶切法。 1.2.2载体与基因组DNA大片段的连接：直接连接、人工接头或同聚物加尾。

噬菌体载体构建基因组文库

第四章基因文库构建及酵母双杂交技术2 cDNA文库的构建 cDNA克隆的基本过程是通过一系列，酶酶催作用，使poly(A) mRNA转变成双链cDNA群体并插入到适当的载体分子上，转化大肠杆菌寄主细胞，构建包含所有基因编码序列的cDNA基因文库。 2.1高质量mRNA的制备 应用Promega PolyAT tract mRNA Isolation System 分离Poly(A)RNA。将Biotinylated Oligo(dT)引物与细胞总RNA共温育，加入与微磁球相连的Streptavidin，用磁场吸附与PMP相连的SA-Biotinylated Oligo(dT)-mRNA。

酵母双杂交实验流程

模块七蛋白质之间的相互作用 1. 实验目的 本实验以重组质粒和酵母细胞为材料，学习检测蛋白质相互作用的基本原理和技术方法。主要介绍酵母双杂交的基本原理与操作技术；让学生了解和掌握酵母双杂交系统的应用；掌握酵母感受态的制备的基本原理和主要的操作步骤。 2. 实验原理 1989年Fields和Song等人根据当时人们对真核生物转录起始过程调控的认识（即细胞内基因转录的起始需要转录激活因子的参与），提出并建立了酵母双杂交系统。该系统作为发现和研究活细胞体内的蛋白质与蛋白质之间的相互作用的技术平台，近几年得到了广泛的运用和发展。 相比于其它蛋白质筛选系统，酵母双杂交系统具有以下优点：（1）检测在真核活细胞内进行，在一定程度上代表细胞内的真实情况。（2）作用信号是在融合基因表达后，在细胞内重建转录因子的作用而给出的，省去了纯化蛋白质的繁琐步骤。（3）检测结果是基因表达产物的积累效应，因而可检测存在于蛋白质之间的微弱或暂时的相互作用。（4）酵母双杂交系统可采用不同组织、器官、细胞类型和分化时期材料构建cDNA文库，能分析细胞质、细胞核及膜结合蛋白等多种不同亚细胞部位及功能蛋白。（5）通过mRNA产生多种稳定的酶使信号放大。同时，酵母表型、X-Gal 及HIS3 蛋白表达等检测方法均很敏感。 酵母双杂交系统也具有一定的局限性。首先，经典的双杂交系统分析蛋白间的相互作用定位于细胞核内，因而限制了该系统对某些细胞外蛋白和细胞膜受体蛋白的研究。酵母双杂交系统的另一个局限性是“假阳性”。在酵母双杂交系统建立的初期阶段，由于仅仅采用β-半乳糖苷酶这一单一的报告基因体系，这种报告基因的表达往往不能十分严谨地被控制，因此容易产生假阳性。由于某些蛋白本身具有激活转录的功能或在酵母中表达时发挥转录激活作用，使DNA结合结构域融合蛋白在无特异激活结构域的情况下也可被激活转录。另外某些蛋白表面含有对多种蛋白质的低亲和力区域，能与其他蛋白形成稳定的复合物，从而引起报告基因的表达，产生“假阳性”结果。产生“假阴性”结果的原因可能有许多蛋白质间的相互作用依赖于翻译后加工如糖基化、磷酸化和二硫键形成，还有些蛋白的正确折叠和功能有赖于某些非酵母蛋白的辅助等。 现在的酵母双杂交系统大都采用多种报告基因，如AH109酵母株含有三类报告基因—ADE2、HIS3、MEL1/lacZ，这三类报告基因受控于三种完全不同、异源性的GAL4-反应元件和三类启动子元件-GAL1、GAL2以及MEL1（如图6-1-1）。通过这种方法就消除了两类最主要的假阳性，一类是融合蛋白可以直接与GAL4结合位点结合或者是在结合位点附近结合所带来的假阳性；另一类是融合蛋白和某种转录因子结合后再结合到特定的TA TA盒上所带来的假阳性。ADE2一种报告基因就已经能够提供较强的营养选择压力，这时选择性地使用HIS3报告基因，一来可以降低假阳性率；二来可以控制筛选的严格性（如果需要筛选与诱饵蛋白具有较强结合的蛋白，就可以同时使用ADE2、HIS3两种报告基因；如果只需要筛选与诱饵蛋白具有中等强度或较弱结合的蛋白，就可以使用ADE2或HIS3两者中的一种）。MEL1和lacZ分别编码α-半乳糖苷酶和β-半乳糖苷酶，可以作用于相应的底物

酵母双杂交实验步骤

LexA酵母双杂交系统简介 一、LexA酵母双杂交系统的设计原理 报告质粒p8op-LacZ的GAL4 UAS编码序列被完全去除，因此在缺乏LexA融合激活剂的情况下，报告基因LacZ的转录活性为零，该基因的筛选标志为URA3，可以作为有自主复制能力的质粒存在于酵母EGY48菌株中，也可以被整合到EGY48基因组DNA上。 质粒pLexA的筛选标志为HIS3，在双杂交系统中用于表达DNA-BD(202个氨基酸残基组成的LexA蛋白)与目标蛋白(钓饵，Bait)的融合蛋白，该融合体的表达受酵母强启动子ADH1的调控，选择与报告基因的操纵子LexA×8结合。 质粒pB42AD的筛选标志为TRP1，在其供外源基因插入的多克隆位点(EcoR I与Xho I)上游，含有SV40核定位(SV40 nuclear localization)、HA(血凝素)及AD(来自于E.coli的88个氨基酸残基组成的B42蛋白)等几种编码序列，共同组成可以启动报告基因转录表达的激活成份。在酵母EGY48的基因组中还整合有另一个报告基因Leu，它与LacZ报告基因具有相同的操纵子-LexA，但两者启动子不同。 根据双杂交系统的原理，如果某一复合物同时具有DNA-BD和AD的活性，即可激活报告基因的转录和表达。分别将待测蛋白X、Y的编码序列插入pLexA质粒载体和pB42AD质粒载体的多克隆位点中，然后共同转入含有报告基因的酵母菌株，如果蛋白X与Y能相互作用，则启动报告基因的转录和表达，通过检测报告基因的表达情况，就可以间接反映蛋白X、Y是否具有相互作用以及作用的强弱。 如果将蛋白Y换为取自组织或血液的cDNA文库，则可用X从该文库中筛选出能与其相互作用的蛋白，并且可以获得编码这些蛋白的cDNA。 二、商品化酵母双杂交系统的组成 1. 载体质粒：pLexA、pB42AD、p8op-LacZ、pB42AD-DNA文库 2. 酵母菌株：EGY48、EGY48（p8op-LacZ）、YM4271（EGY48的伴侣菌株） 3. 大肠杆菌菌株：E.coli KC8株 4. 对照质粒： 质粒用途 pLexA-53，pB42AD-T 阳性对照 pLexA-Pos(LexA/GAL4 AD融合蛋白〕阳性对照 pLexA-Lam(LaminC蛋白少与其它蛋白相互作用) 假阳性检测质粒 5. 引物： pLexA测序引物及pB42AD测序引物。 三、酵母双杂交实验的基本流程 1. 将报告基因p8op-LacZ转化酵母EGY48菌株，用培养基SD/-Ura筛选。 2. 同时构建或扩增DNA文库，并纯化足够的质粒以转化酵母细胞。 3. 构建DNA-BD/靶蛋白质粒pLexA-X，作为钓饵(bait)。 4. 将上述钓饵质粒pLexA-X转化EGY48(p8op-LacZ)细胞株，用SD/-His/-Ura筛选；并用固体诱导培养基SD/Gal/Raf/-His/-Ura检测此DNA-BD/靶蛋白是否具有直接激活报告基因的活性，以及对酵母细胞是否具有杀伤毒性。 转化质粒选择培养基克隆生长情况说明

酵母单杂交实验方法.

酵母单杂分析 酵母单杂交技术是体外分析DNA与细胞内蛋白质相互作用的一种方法，通过对酵母细胞内报告基因表达状况的分析来鉴别DNA结合位点并发现潜在的结合蛋白基因，或对结合位点进行分析。运用此技术能筛选到与DNA结合的蛋白质，并可直接从基因文库中得到编码该蛋白质的核苷酸序列而无需复杂的蛋白质分离纯化操作，故在蛋白质研究中具有一定的优势；而且酵母属真核细胞，通过酵母系统得到的结果比其它体外技术获得的结果更能体现真核细胞内基因表达调控的情况。 【实验目的】 了解酵母单杂交的基本原理和应用，掌握酵母单杂交的主要步骤及注意事项，学会酵母感受态的制作与转化，基因文库的构建及筛选。 【实验原理】 酵母单杂交方法是根据DNA结合蛋白（即转录因子）与DNA顺式作用元件结合调控报告基因表达的原理来克隆编码目的转录因子的基因（cDNA）。该方法也是细胞内分析鉴定转录因子与顺式作用元件结合的有效方法。如图所示，将已知的特定顺式作用元件构建到最基本启动子（minimal promoter，Pmin）上游，Pmin启动子下游连接报告基因。进行cDNA融合表达文库时，编码目的转录因子的cDNA融合表达载体被转化进入酵母细胞后，其编码产物（转录因子）与顺式作用元件结合，就可以激活Pmin启动子，并促使报告基因表达。根据报告基因的表达，筛选出与已知顺式元件结合的转录因子。

“Matchmaker Gold Yeast One-Hybrid Library Screening System”提供了一个简单高效的构建cDNA文库并进行酵母单杂交筛选的方法，它使用aureobasidin A 抗性基因作为报告基因，筛选效率高，背景低。单杂交筛选是从酵母双杂交筛选发展而来，利用单杂交筛选可以对cDNA文库进行筛选直接获得与目的顺式作用元件相结合的蛋白质。 图2 用Matchmaker Gold One-Hybrid System筛选protein-DNA相互作用的原理 The Matchmaker Gold One-Hybrid Library Screening process主要包括以下步骤： 1 将已知序列（bait）克隆到pAbAi载体。 2 pBait-AbAi质粒转化Y1HGold酵母菌株，使其与酵母基因组发生重组，生成bait/reporter酵母菌株。 3 检测Y1HGold bait菌株AbAi r基因的本底表达水平。 4 合成cDNA并通过cDNA和pGADT7-Rec载体共转化酵母进行细胞内同源重组筛选cDNA文库。 5 筛选结果的验证和分析。 【实验准备】 1 仪器设备 微量取液器（2.5 μL；20 μL；50 μL；100 μL；200 μL；1000 μL）、PCR仪、低温离心机、台式离心机、CHROMA SPIN TM+TE-400纯化柱、琼脂糖凝胶电泳系统、凝胶成像系统、恒温摇床、恒温孵箱、通风橱、制冰机、振荡器、恒温金属浴、酒精浴、无菌接种环、10 cm培养皿、15 cm培养皿等。

630490 酵母双杂交文库构建实验流程(clontech)

第一链cDNA合成 1.准备: 高质量的Poly A 或总RNA 2. 在微量离心管中混匀以下试剂： 1–2 μl RNA 样本(0.025–1.0 μg poly A+或0.10–2.0 μg 总RNA) 1.0 μl CDS III 或CDSIII/6 引物 1–2 μl 去离子水(补齐体系到4.0 μl) 4.0 μl 总体积 注意: 对照实验时，请使用1μl *1μg+ 的对照RNA。CDSIII = Oligo-dT； 引物CDSIII/6 =随机引物 3. 72°C ，孵育2 min。 4. 冰上冷却2 min，然后14000rpm，10sec，瞬时离心。 5. 混合以下试剂，将混合液加入Step4中的经过变性且结合有引物的 RNA样本中，轻拍混匀。 2.0 μl 5X First-Strand 缓冲液 1.0 μl DTT (100 mM) 1.0 μl dNTP 混合物(10 mM ) 1.0 μl SMART MMLV 反转录酶 6. 只有使用随机引物(CDSIII/6)实验才进行此步骤[如果采用Oligo-dT (CDSIII)请忽略此步骤，直接进行Step7]，25°C，室温孵育10 min。 7. 42°，孵育10 min。 注意: 孵育在热盖的PCR仪中进行。若用非热盖的PCR仪或水浴，请 在反应管中加入一滴矿物油来避免水分蒸发。 8. 加入1 μl SMART III-modified oligo，混匀，42°C，孵育1 hr。 9. 75°C ，10 min终止第一链合成反应。 10. 室温冷却，加入1 μl RNA酶H (2U)。 11. 37°，孵育20 min。 12. 继续进行LD-PCR 扩增(Section VII.B)。 注意: –20°C下可保存3个月。 第一链反应最终体积为15μl ? 10 μl SMART III Oligo (10 μM; 5’-AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG CCATTATGGCCGGG-3’) ? 10 μl CDS III 引物 (10 μM; 5’-AT TCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA TG-d(T)30VN-3’)*23个碱基 ? 10 μl CDS III/6 引物 (10 μM; 5’-AT TCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA TG-NNNNNN-3’) 注意: N = A, G, C, or T; V = A, G, or C ? 50 μl 5’ PCR 引物 (10 μM; 5’-TTCCACCC AAGCAGTGGTATCAACGCAGAGTGG-3’)25个碱基 ?50 μl 3’ PCR 引物 (10 μM; 5’-GTATCGATGCCCACCC TCTAGAGGCCGAGGCGGCCGACA-3’)

TAKARA酵母双杂交实验步骤

酵母双杂交实验方法 一）酵母感受态细胞的制备 1. 于YPDA平板上划线培养酵母Y2H Gold菌株，30℃培养约3d； 2. 挑取单菌落（2-3mm）接种于YPDA液体培养基中，30℃、250rpm摇培8-12h； 3. 接种0.5μL至5mL YPDA液体培养基中（1:1W的接种比例），30℃、250rpm 摇培至OD600 = 0.15~0.3（16-20h）； 4. 700g离心5min，弃上清后用10mL YPDA（2倍体积）重悬； 5. 30℃、230rpm摇培至OD600 = 0.4~0.5（3-5h）； 6. 将10mL菌液分装成2管5mL，700g离心5min，用3mL ddH2O重悬（0.6倍体积）； 7. 700g离心5min，用150μL 1.1×TE/LiAc重悬（0.05倍体积）； 8. 转移至1.5mL离心管后，高速离心15s； 9. 用60μL 1.1×TE/LiAc重悬（0.02倍体积）。 二）酵母感受态转化方法 1. 感受态细胞转化体系： 感受态细胞50μL Yeastmaker Carrier DNA（10ng/μL）5μL 质粒DNA 100ng* *共转化时，prey的质粒DNA量两倍于bait 于50μL酵母感受态细胞中依次加入5μL Carrier DNA、100ng 质粒DNA，共转化时，猎物蛋白（未知蛋白）质粒DNA量为诱饵蛋白的2倍。 2. 混匀后加入500μL PEG/LiAc，30℃孵育30min，每10min轻微混匀； 3. 加入20μL DMSO，42℃水浴15min，每5min轻微混匀； 4. 10000rpm离心15s，用1mL YPD Plus重悬； 5. 10000rpm离心15s，用1mL 0.9% NaCl重悬； 6. 涂布于二缺培养基，30℃培养。

酵母双杂实验操作手册和注意事项

酵母双杂（Yeast two-hybrid）实验操作手册和注意事项一. 酵母双杂的原理 1989年，Song和Field建立了第一个基于酵母的细胞内检测蛋白间相互作用的遗传系统。很多真核生物的位点特异转录激活因子通常具有两个可分割开的结构域，即DNA特异结合域（DNA-binding domain，BD）与转录激活域（Transcriptional activation domain ，AD）。这两个结构域各具功能，互不影响。但一个完整的激活特定基因表达的激活因子必须同时含有这两个结构域,否则无法完成激活功能。不同来源激活因子的BD区与AD结合后则特异地激活被BD结合的基因表达。基于这个原理，可将两个待测蛋白分别与这两个结构域建成融合蛋白，并共表达于同一个酵母细胞内。如果两个待测蛋白间能发生相互作用，就会通过待测蛋白的桥梁作用使AD与BD形成一个完整的转录激活因子并激活相应的报告基因表达。通过对报告基因表型的测定可以很容易地知道待测蛋白分子间是否发生了相互作用。 酵母双杂交系统由三个部分组成： (1)与BD融合的蛋白表达载体，被表达的蛋白称诱饵蛋白(bait)。 (2)与AD融合的蛋白表达载体，被其表达的蛋白称靶蛋白(prey)。 (3)带有一个或多个报告基因的宿主菌株。常用的报告基因有HIS3，URA3，LacZ和ADE2等。而菌株则具有相应的缺陷型。双杂交质粒上分别带有不同的抗性基因和营养标记基因。这些有利于实验后期杂交质粒的鉴定与分离。根据目前通用的系统中BD来源的不同主要分为GAL4系统和LexA系统。后者因其BD来源于原核生物，在真核生物内缺少同源性，因此可以减少假阳性的出现。 二.所用的载体及相关信息 1. pGBKT7载体的图谱和相关信息 The pGBKT7 vector expresses proteins fused to amino acids 1–147 of the GAL4 DNA binding domain (DNA-BD). In yeast, fusion proteins are expressed at high levels from the constitutive ADH1promoter (PADH1); transcription is terminated by the T7 and ADH1 transcription termination signals(TT7 & ADH1). pGBKT7 also contains the T7 promoter, a c-Myc epitope tag, and a MCS. pGBKT7replicates autonomously in both E. coli and S. cerevisiae from the pUC and 2 m ori, respectively. Thevector carries the Kan r for selection in E. coli and the TRP1 nutritional marker for selection in yeast.Yeast strains containing pGBKT7 exhibit a higher transformation efficiency than strains carrying other DNA-BD domain vectors (1). b. pGADT7载体的图谱和相关信息

酵母双杂交实验

酵母双杂交相关实验方法 一、酵母总DNA的提取方法（蜗牛酶法） 1、酵母质粒提取试剂 Buffer I 0.9 mol/L Sorbitol 0.1mol/L EDTA Buffer II 50mM/L Tris 20mM/L EDTA Buffer III 10mM/L Tris 1Mm/L EDTA 2、操作步骤： (1)收集新鲜菌体重加入150μl buffer I，25μl 蜗牛酶（30mg/ml）。. (2)37℃水浴1h。 (3)10000rpm离心10min，去上清，沉淀中加入250μl buffer II。 (4)加入25μl 10% SDS，65℃水浴30min，每间隔5min中震荡一次。 (5)加入25μl 5mol/L 醋酸钾，冰浴60min。 (6)4℃12000rpm离心15min，取上清。 (7)在上清中加入2-3倍体积的无水乙醇，混匀静置于-20℃，1小时以上。 (8)取出，4℃12000rpm离心15min ，弃上清。 (9)加入150μl buffer III 溶解沉淀，用等体积苯酚/氯仿/异戊醇抽提。 (10)12000rpm离心15min。 (11)将上清转入新的离心管中，加入6μl(10U/μl)RNA酶37℃放置30min。 (12)取上清，加入等体积的异丙醇。 (13)4℃静置10min，1小时以上或过夜。 (14)4℃10000rpm 离心5min。 (15)弃上清，并把沉淀溶于10μl buffer III 中。

二、小规模酵母转化 1、酵母转化试剂： 转化用试剂除PEG采用过滤灭菌外，其它试剂均需高温高压灭菌，条件同普通培养基灭菌。 (1)M 醋酸锂（Lithium Acetate） (2)聚乙二醇（Polyethylene glycol，PEG）分子量3350，浓度50%（w/v） (3)PEG/LiAc 溶液的配制（现用现配） 800μl 50%PEG 100μl 10×TE 100μl 10×LiAc 1ml 总体积 (4) 1.1×TE/LiAc溶液（现用现配）11ml 10×TE (5)11ml 10×LiAc (6)78ml ddH20 2、操作步骤： (1)第一天下午3点将酵母接种于5ml YPDA中，30℃摇菌。 (2)第二天上午10点测OD600，转2.5×108个于50ml YPAD中。 (3)下午3:00收集菌体。 (4)室温离心，700g，5min。 (5)弃上清，用60ml 灭菌ddH20重悬细胞。 (6)室温离心，700g，5min。 (7)弃上清，用3ml 1.1×TE/LiAc 重悬细胞。 (8) 1.5ml/管分装细胞。 (9)12000rpm离心15-30s。 (10)弃上清，每管加入600μl 1.1×TE/LiAc重悬细胞，100μl分装到1.5ml管中。 (11)冰上准备转化混合物(与收集菌体同步进行)： PEG3350 (50%) 240μl LiAc (1.0M) 36μl Carrier DNA (10mg/ml) 10μl