常用细胞固定染色原理与方法

常用细胞固定染色原理与方法

一、固定与固定液

(一)固定：

将新鲜的活组织从生物体取下后，立即投入固定剂中，借助化学药品的作用，使细胞保持原有形态、结构的一种手段。

1.目的

(1)迅速防止细胞死亡后的变化,防止自溶、腐败，尽量保持生长状态结构。

(2)使细胞中的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持生前的形态。

(3)使组织内各种物质成分产生不同的折光率，便于观察和鉴定。

(4)使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色。

(5)防止细胞过度收缩或膨胀，失去原有的形态结构。

2.时期

(1)有丝分裂：有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点及幼叶等部位的分生组织，根尖取材容易，操作和鉴定方便。

(2)减数分裂：选取适当大小的花蕾是观察花粉母细胞减数分裂的关键性的第一步。此时的植株形态及花蕾大小依植物的类别及品种有所不同。

小麦：在植株开始挑旗，旗叶与下一叶的叶耳间距为3-4cm，花药长度大致在1-2mm左右，黄绿色时取材最好。如花药为绿色时则为时过早，花药为黄色，则已过时。一般上午8-10点为取材最佳时间。

玉米：一般夏玉米在7月份取材，以上午7-8点为好。在玉米雌穗未抽出前的7-10天手摸植株上部(喇叭口下部)有松软感觉，表明雄花序即将抽出。用刀在顶叶近喇叭口处纵向划一刀，切口长10-15cm，剥出雄花序，顶端花药长3-5mm，花药尚未变黄时取材。

蚕豆：从现蕾开始，上午10-11点可选取2-3mm大小的花蕾或一小段花序。蚕豆开花的次序是由下而上，由外而内。

3.固定时的注意事项

(1)固定液量：20倍于材料的体积，以免固定液被稀释。

(2)选择合适的固定液：渗透力强的固定液既可以迅速进入组织中，又不使组织过度收缩或膨胀。

(3)固定的时间要合适：

与材料的大小和温度有关：材料大则时间长，材料小则时间短；温度高则时间短，温度低则时间长。

经固定的材料如不及时使用，可以经过90%酒精换到70%酒精中各半小时，再换入一次70%酒精，在0-4℃冰箱内可保存半年。经过较长时间保存的材料进行观察前可以换新的固定液再处理一次，效果较好。

(二)固定液

固定液包括简单固定液和混合固定液两种。简单固定液就是用一种药品作为固定液，如乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞等。简单固定液只对细胞的某种成分

固定效果较好，而不能将所有的成分都保存下来。混合固定液是指两种或两种以上的化学物质的混合液，如卡诺氏固定液等。

1.固定液的条件

(1)迅速渗入组织,杀死原生质。在杀死的短时期中,细胞形态不致有所变化。

(2)必须具有渗透力，对组织各部分的渗透力相等，可使组织内外完全固定。

(3)尽可能避免使组织膨胀或收缩。

(4)使细胞内的成分凝固或沉淀。

(5)增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别。

(6)增加媒染作用和染色能力。

(7)使组织变硬，具有一定的硬度。

(8)固定以后能起到保存的作用。

(9)在凝固原生质以后，增加细胞对于各种穿透的抵抗力，不致于因以后的处理而使固定的原生质变形。

2.常用的几种固定液

(1)酒精：有固定、硬化和脱水的作用。

可以固定白蛋白、球蛋白、核蛋白，但对核蛋白固定效果较差(亲和力小且易自溶)。酒精固定的特点是杀死快，渗透力强，对组织收缩较大(可收缩20%左右)，可使材料变硬。酒精常用于混合固定液中，但由于它本身是一种还原剂，很容易氧化成乙醛，甚至氧化成醋酸，因此最好不与三氧化铬、重铬酸钾及锇酸等氧化剂配合使用。但与甲醛、醋酸或丙酸配合，用作固定效果很好。酒精能溶解脂肪及凝脂，故不宜用来固定脂类材料。

(2)甲醛水溶液：甲醛在水中的溶解度为37-40%，渗透力强，固定均匀，对组织收缩作用小，一般用于固定大材料。

市售溶液中含量下降，因形成三聚甲醛而失效。

(3)冰醋酸：纯醋酸在温度稍变低时即形成冰晶，所以又称为冰醋酸。

常用0.3-0.5%的浓度作为固定液。冰醋酸对材料有膨胀作用，对核蛋白固定好，可与水、酒精、氯仿混合。

(4)AF液：90ml乙醇+10ml甲醛用于固定大块组织。

(5)卡诺氏固定液：冰醋酸:氯仿:无水乙醇=1:3:6

改良卡诺氏固定液: 冰醋酸:无水乙醇=1:3

二、染色与染色原理

根据染料的来源不同可分为天然染料(苏木精、洋红等)和人工合成染料（煤焦油染料，如碱性品红等）。

1.苯与苯的取代物

苯醌(红色) 苯酚三硝基苯

2.染料的分子结构呈酸或碱性，溶于水，可电离，可与材料结合。

助色团：溶于水(-O-+H+) 色源(发色团)：不溶于水，不电离，三硝基苯酚(苦味酸)

呈酸性，含有酸性助色团，可以提供阴离子，与碱性物质生成盐。色源(红

色)，助色团(-NH

2+H++OH-→-NH

3

++OH-) ，三氨基三苯基氯化甲烷(碱性品红)，呈

碱性，含有碱性助色团，可以提供阳离子，与酸性物质生成盐。

3.酸性与碱性染料

(1)酸性染料：具有酸性助色团，可电离出阳离子，染色成盐时起阴离子作用。如-OH→-O-+H+ -COOH→COO-+H+ PH低时易染色。

(2)碱性染料：具有碱性助色团，可电离出阴离子，染色成盐时起阳离子作用。

如-NH

2→-NH

3

++OH- -NH

2

++HCl→-NH

3

++Cl- PH高时易染色。

4.染色原理

(1)化学作用碱性染料染细胞核；酸性染料染细胞质。

(2)物理作用染料通过毛细作用或渗透作用进入组织内部；组织吸附染料；染料进入细胞，由于吸收作用而留在细胞内部。

三、常用染料

1.染细胞核

(1)苏木精苏木用乙醚连续提取即可得到苏木精。苏木精为黄棕色结晶，溶于酒精、甘油，可氧化生成苏木红。常用于永久切片的制作，亲水力弱，不可单独使用。

(2)卡红(洋红、胭脂红）取自雌胭脂虫，方法是将晒干后的成虫磨碎提炼出胭脂虫红，然后用明矾去杂质。卡红是一种复杂的化合物，起作用的是卡红酸。卡红在中性溶液里溶解度很小，所以要用酸性或碱性溶液溶解。

醋酸洋红： 45%醋酸100ml与1-2g卡红混合，煮沸，充分溶解，凉后过滤。1-2个月后加媒染剂铁即可使用。主要染细胞核，若时间太长，细胞质也被染红。

(3)碱性品红染细胞核的特异染料。

2.染细胞质伊红Y、刚果红、苦味酸、酸性品红（品红+磺基）

四、洋葱根尖有丝分裂的观察

流程：固定好的根尖→水洗2-3次→1N HCl7-8min→水洗2-3次→取材(1/2分生区)→切碎→染色6-7min→加盖玻片→轻敲→压片→观察。

1.材料准备：将洋葱放在加满水的广口瓶上，使其根茎部接触水面，然后转移到25-28℃的条件下培养。待根尖长到2cm左右使，在上午9-10点剪取根尖备用。

2.预处理：为了有利于对有丝分裂过程中染色体的观察和计数，在固定前应对根尖进行预处理，这样可以改变细胞质的粘度，破坏和抑制纺锤体的形成，使染色体适度缩短和分散。预处理的方法有低温预处理和药物预处理。

(1)低温预处理将材料浸在蒸馏水中，放在1-4℃冰箱内离体处理24h。此法效果很好，对染色体无破坏作用，染色体缩短均匀，简便易行，各种作物都适用。

(2)药物预处理

①0.05-0.2%秋水仙素溶液与室温下处理2-4h，对抑制纺锤体活动效果明显，易获得较多的中期分裂相，且染色体收缩较直，有利于染色体结构的研究。

②饱和对二氯苯溶液室温下处理3-5h，对阻止纺锤体活动和缩短染色体效果也较好，但对染色体小而多的植物来说个利于染色体的计数。

③0.002-0.00mol/L8-羟基喹啉18℃条件下处理5-6h，可以引起细胞粘度的改变，导致纺锤体活动受阻，使中期染色体在赤道面上保持相应的排列位置。缢痕区也较为清晰。一般认为对中等或长染色体的植物较合适。

④70ppm放线菌酮和250ppm8-羟基喹啉的混合液于25℃条件下，根尖不离体处理5h，可获得大量的分裂相，是最值得首选的预处理方法。

3.固定：预处理后的根尖用蒸馏水冲洗2-3次，然后移入Carnoy’s固定液中，室温下固定2-24h后，用70%酒精冲洗2次转入70%酒精中于4℃冰箱中保存，最好不要超过2个月。如经过较长时间保存的材料，在使用前可以用固定液在处理一次。

4.解离：解离有酸解和酶解两种方法，可以使分生区组织细胞间的果胶质分解，细胞壁软化或部分分解，使细胞和染色体容易压平。酸解一般用1N HCl在60℃水浴中处理7-8min即可。

5.压片和染色：取处理好的根尖置于载玻片上，用吸水纸吸去多余的液体，用刀片将根尖的分生组织切下并切碎，加1-2滴改良苯酚品红染液，6-7min后加盖玻片。用铅笔的橡皮头或小镊子的柄端轻敲盖玻片，使材料均匀分散，然后压片。压片时用力要适当，不要移动盖玻片。

6.镜检：低倍镜下找到分生区细胞，其特点为等直径细胞。细胞质浓厚，细胞核较大，占细胞体积的3/4。可以观察到有丝分裂过程中不同分裂时期的染色体。选取不同分裂时期的典型细胞，换高倍镜观察，注意细胞核染色体及纺锤体的变化动态。

注意事项：

(1)取材：取分生区，尽量要小；(2)解离要软，水洗要彻底，否则不易着色；

(3)压片前先敲，可使细胞分散开；(4)防止出气泡。

细胞染色方法总结

Hoechst染色:hoechst可以穿过活细胞膜与细胞核结合(主要为凋亡活细胞)在紫外光下将核染为蓝色. Hoechst染细胞核会影响共聚焦显微镜对该样本其他荧光的观察效果.hoechst 有hoechest33342和hoechst33258两种hoechsts33258，hoechst33342二者区别不大，但是hoechst33342对细胞的毒性作用更小一些，所以一般来说hoechsts33258用于细胞固定后再染色，而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色！ 染色步骤 PI (Propidium Iodide碘化丙啶)染色:是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测.碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料(红色），它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红.用PI单一染色观测培养细胞，只能表示细胞的坏死情况，而不是凋亡（当然晚期凋亡PI亦可着色）。但是如果您只是想知道细胞的死亡情况，而不是仔细区分坏死或凋亡，那么PI单一染色也可以。但是如果您一定要认定细胞的凋亡，那么PI单一染色显然不够！ annexin-v染色细胞凋亡早期,细胞膜标志发生改变.其中,磷脂酰丝氨酸(Annexin-V,PS)外翻,Annexin-V 在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合.这样,Annexin-v 染色阳性,表示细胞处于早期凋亡状态.Annexin-V结合不同的荧光抗体,就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。Annexin V用FITC标记发绿色荧光；如果用PE标记就发红色荧光。 JC-1染色JC-1是一种阳离子染料，可以在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体(monomer)存在，发射光以绿光(～525nm)为主；而在高浓度时则可以形成多聚体(aggregation)，发射光以红光(-590nm)为主。线粒体本身存在一定的极性(polarization)，其外膜为负极，内膜为正极。电位差由Ca2+、Na+和H+流调控。当线粒体状态良好时对JC-l摄取量少，因而在线粒体内主要以单体的形式存在绿光强度/红光强度的比值较高。在线粒体发生去极化(depolarization)时，线粒内JC-l的浓度较高，多以多聚体的形式存在，绿光强度/红光强度的比值降低。JC-1染色的绿光强度/红光强度仅取决于线粒体的膜电势(membrane potential)，而与线粒体的形态、体积和密度都无关，因而能更好地反映线粒体的功能状态。由于凋亡发生的早期存在线粒体的去极性，因此，JC-1染色被用于检测凋亡的早期发生。其实验方法如下。 JC-l染色非常简单。首先可将成品JC-1以DMSO配成储存液(1～5mg/ml)，储存于-20℃，用时以培养液稀释至10ug/ml终浓度。对贴壁细胞可以直接弃去培养液，漂洗细胞后直接加入染色液，10-30min后在荧光显微镜下或者激光共聚焦 下观察。线粒体状态好时细胞以绿色为主，当红光信号增强时，红绿相叠，以橙色为主。该染色运用于悬浮细胞时还可以通过流式细胞仪进行检测，收集红/绿信号强度，计算其强度比。

细胞染色方法大全

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Hoechst染色:hoechst可以穿过活细胞膜与细胞核结合 (主要为凋亡活细胞)在紫外光下将核染为蓝色. Hoechst染细胞核会影响共聚焦显微镜对该样本其他荧光的观察 效果.hoechst有hoechest33342和hoechst33258两种 hoechsts33258， hoechst33342二者区别不大，但是hoechst33342对细胞的毒性作用更小一些，所以一般来说hoechsts33258用于细胞固定后再染色，而hoechst33342则可以对活细胞直接进行染色！ 染色步骤 PI (Propidium Iodide碘化丙啶)染色:是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测.碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料(红色），它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红.用PI单一染色观测培养细胞，只能表示细胞的坏死情况，而不是凋亡（当然晚期凋亡PI亦可着色）。但是如果您只是想知道细胞的死亡情况，而不是仔细区分坏死或凋亡，那么PI单一染色也可以。但是如果您一定要认定细胞的凋亡，那么PI单一染色显然不够！ annexin-v染色细胞凋亡早期,细胞膜标志发生改变.其中,磷脂酰丝氨酸(Annexin-V,PS)外翻 ,Annexin-V 在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合.这样,Annexin-v 染色阳性,表示细胞处于早期凋亡状态.Annexin-V结合不同的荧光抗体,就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。Annexin V用FITC标记发绿色荧光；如果用PE标记就发红色荧光。 JC-1染色 JC-1是一种阳离子染料，可以在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体(monomer)存在，发射光以绿光(～525nm)为主；而在高浓度时则可以形成多聚

培养细胞常用染色与固定方法

培养细胞常用染色与固定方法 培养细胞常用染色与固定方法 一、普通染色观察 苏木精-伊红(hematoxylin-eosin，HE)染色和Giemsa染色是观察培养细胞一般 形态的最常用方法，也是把细胞作为标本保存的主要方法。对于贴壁培养的细胞，以生长于盖玻片和塑料培养瓶壁者便于操作。固定前先用Hanks液、PBS、BSS 或生理盐水清洗培养物2次，去除妨碍染色的血清。固定后可将盖玻片用树胶贴 于载玻片上，以利操作。对于悬浮培养细胞，须先经离心沉淀(1000r／min， 10min)，弃上清液后(留少量液体)，将细胞悬液滴于玻片上做成涂片，冷风吹干。（一）HE染色法 1.染液配制 (1)苏木精染液：这里介绍鄂征(1995)改良的Mayer法。称取0.5g苏木精，5.0g 铵矾或钾矾，0.1g碘酸钠加温溶于70m1蒸馏水。再加入30ml甘油，2ml冰醋酸。混匀。过滤后即成母液。可长久保存。用蒸馏水以1:20稀释即成工作液，可用 很长时间。每次染色前宜过滤，去除氧化膜。 (2)伊红染液：伊红有醇溶性与水溶性之分。将0.5g伊红溶于100m170％乙醇或 蒸 馏水即成工作液。 2.染色程序 （1）用10％甲醛(福尔马林)固定培养物30min，或以丙酮固定15min。 （2）蒸馏水洗1次后，入苏木精染液5～10min染细胞核。 （3）入0.5％盐酸-70％乙醇溶液30～1min，脱去胞质的着色。此时核呈紫红色。（4）入碱性溶液碱化，使细胞核变成蓝色。如果时间允许，最好用自来水(呈弱

碱性)长时间浸泡。也可入1％NaHCO3溶液。此过程须不断用显微镜监视，以掌握碱化时间。 （5）蒸馏水洗1 min，去除残留的碱性溶液，否则影响伊红着色。 （6）入伊红染液30s～1 min。 （7）用梯度乙醇溶液脱水：70％、90％、95％乙醇各30s～1 min；100％(2次) 各2min。如伊红为乙醇溶液，略去70％乙醇。 （8）用二甲苯透明2次，各5min。 （9）树胶封固。 3.染色结果 细胞核呈紫蓝色或深蓝色，大部分细胞的胞质呈粉红色。如果胞质内含较多核糖体(例如淋巴细胞)则亦呈蓝色。 （二）吉姆萨染色法 此法可将细胞核与胞质同时染色，故便捷快速；但染液配制技术不易准确掌握，效果常不如HE染色稳定。 1.吉姆萨(Giemsa)染液的配制 （1）取1.5g吉姆萨粉末放入50ml甘油，置于60℃温箱，约3h后溶解。 （2）取出后倒入50ml中性甲醇，即为母液。于棕色瓶可长久保存。需要注意的是，有的甲醇内含醋酸，会使染液中的伊红沉淀出来，不利染色。 （3）将母液与0.1 mol／LPBS(Ph6.9～7.2)按1:9混合即成工作液。吉姆萨染 液对pH极敏感，偏酸时染色过红，偏碱时则过蓝。所以，工作液宜现用现配，保存时间不超过48h以免被CO2酸化。 2.染色程序

细胞染色方法

DAPI (4',6-diamidino-2-phenylindole)的配制 贮存液：70%酒精溶解，浓度100 μg/ml，配好后用锡纸包起来，避光，可在4摄氏度下长期保存。 使用浓度：贮存液用1xPBS稀释1000倍，最终浓度100 ng/ml。 10x PBS的配制 80 g NaCl 2 g KCl g 无水Na2HPO4 2 g 无水KH2PO4 加水到1000ml 贮存液可根据需要用蒸馏水稀释 荧光封片液 mol/L碳酸盐缓冲液与甘油等体积混合， 染色与观察： 制好的玻片上滴加几滴DAPI染液，染色10分钟，流水冲去染液，滤纸吸除多余水分，加一滴荧光封片液，置于荧光显微镜下观察，激发波长360-400nm.

注意事项： DAPI可能具有致癌性，全部操作过程中必须带塑料或乳胶手套。 上：正常绍鸭成纤维细胞核，下：凋亡核 Lyso-Tracker Red是一种溶酶体(lysosome)红色荧光探针，可以用于活细胞溶酶体特异性荧光染色。 Lyso-Tracker Red为采用Molecular Probes公司的DND 99进行了荧光标记的带有弱碱性的荧光探针，可以选择性地滞留在偏酸性的溶酶体中，从而实现对于溶酶体的特异性荧光标记。中性红(Neutral Red)和吖啶橙(Acridine Orange)也都可以对溶酶体进行荧光染色，但中性红和吖啶橙的染色缺乏特异性。 Lyso-Tracker Red呈红色荧光，检测时的最大激发波长为577nm，最大发射波长为590nm。 按照1:20000的比例稀释，可以配制1000ml Lyso-Tracker Red工作液。 可用于家蚕脂肪体细胞autophage监测。见李胜文章。

实验室做细胞常用染色word文档良心出品

实验室做细胞常用的细胞固定与染色方法、爬片前盖玻片处理方法 对于悬浮培养的细胞，在进行各种染色前常需先制备成涂片。为了保证细胞在长时间的染色过程中不从载玻片脱落，必须使其牢固贴附于载玻片上。在载玻片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一。能促进细胞黏附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法。 1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂（如Decon）浸泡5min,间或振荡。 2、用自来水冲洗5min。 3、以1 ％盐酸—70％乙醇溶液浸泡5min。 4、烤箱干燥（至此即可用于普通染色）。 5、多聚L赖氨酸（1:10溶于去离子水）浸泡5min，振荡。 6入60C烤箱1 h,或室温过夜干燥（用于细胞化学、免疫细胞化学及原 位杂交细胞化学）。 、细胞固定常用方法 固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞和组织内的各种酶失去活性，防止细胞和组织的各种分子变性、解离，使细胞的化学物质和酶能准确定位，并在以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏。同时，固定还可使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。 1.固定组织、细胞的基本原则：尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、 对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。

2. 培养物的准备和固定前处理：各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、 悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。对双盖片悬滴培 养物和悬液培养物来说，常通过离心收集细胞， PBS 漂洗2?3次后，备固定制 对盖片单层培养物来说，将盖片从培养器皿中取出后， PBS 液漂洗2?3 3. 常用固定液：常用的固定液分两类，一类是以单一化学物质配成的固定 称简单固定液。主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味 铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇 (锇酸 )。另一类是用两种或 两种以上化学物质配合成的固定液，称混合固定液。如 Mueller 固定液、 Flemming 固液、FAA 固定液、Carnoy 固定液、Rossman 固定液、Altmann 固定 液、Bouing 固定液等。不同的固定液对细胞的化学成分、酶类及细胞结构固定 效果不同。因此，选择合适的固定液是达到固定目的的基础。 (1) 4%甲醛-PBS:甲醛是一种气体，其饱和水溶液无色，约含 40%甲醛。在 很多情况下，甲醛常常产生多聚甲醛的白色沉淀。 4%甲醛-PBS 使组织变硬速 度比乙醇快，并能较好地保存组织的外部形式，固定效果不受制片影响，固定 材料可用苏木精和其他合成染料染色。甲醛的穿透力较强，对组织固定均匀， 能增强组织的弹性，大标本的固定和保存多用甲醛。甲醛是染色体、线粒体和 高尔基体的固定液，在冷冻切片中，甲醛作固定剂具有显著的优点。用 40%甲 醛水溶液：PBS=1:9配方制备甲醛固定液。 (2) 丙酮：丙酮为无色易挥发液体，用纯冷丙酮 (4 °C )固定细胞内酶效果较 佳。 (3) 乙醇：乙醇又称酒精，固定血纤维蛋白、色素、弹性纤维、细菌和白细 胞等效果优良。无水乙醇或乙醇和醋酸的混合液是固定肝糖原及肌糖原的良好 固定液。乙醇除有固定作用外，还具有硬化和脱水的作用。作为固定用乙醇的 适宜浓度为70%?100%。乙醇的缺点是渗透力差，并使组织收缩。 片； 次， 以洗去血清和附着于细胞表面的残渣，备固定用。 液， 酸、

细胞固定、染色原理与方法

细胞固定、染色原理与方法 一、固定与固定液 (一)固定：将新鲜的活组织从生物体取下后，立即投入固定剂中，借助化学药品的作用，使细胞保持原有形态、结构的一种手段。 1.目的 (1)迅速防止细胞死亡后的变化,防止自溶、腐败，尽量保持生长状态结构。 (2)使细胞中的蛋白质、脂肪、糖、酶等成分转变为不溶性物质，以保持生前的形态。 (3)使组织内各种物质成分产生不同的折光率，便于观察和鉴定。 (4)使不同组织成分对染料有不同的亲和力，便于染色。 (5)防止细胞过度收缩或膨胀，失去原有的形态结构。 2.时期 (1)有丝分裂：有丝分裂主要发生在根尖、茎生长点及幼叶等部位的分生组织，根尖取材容易，操作和鉴定方便。 (2)减数分裂：选取适当大小的花蕾是观察花粉母细胞减数分裂的关键性的第一步。此时的植株形态及花蕾大小依植物的类别及品种有所不同。 小麦：在植株开始挑旗，旗叶与下一叶的叶耳间距为3-4cm，花药长度大致在1-2mm左右，黄绿色时取材最好。如花药为绿色时则为时过早，花药为黄色，则已过时。一般上午8-10点为取材最佳时间。 玉米：一般夏玉米在7月份取材，以上午7-8点为好。在玉米雌穗未抽出前的7-10天手摸植株上部(喇叭口下部)有松软感觉，表明雄花序即将抽出。用刀在顶叶近喇叭口处纵向划一刀，切口长10-15cm，剥出雄花序，顶端花药长3-5mm，花药尚未变黄时取材。 蚕豆：从现蕾开始，上午10-11点可选取2-3mm大小的花蕾或一小段花序。蚕豆开花的次序是由下而上，由外而内。 3.固定时的注意事项 (1)固定液量：20倍于材料的体积，以免固定液被稀释。 (2)选择合适的固定液：渗透力强的固定液既可以迅速进入组织中，又不使组织过度收缩或膨胀。 (3)固定的时间要合适： 与材料的大小和温度有关：材料大则时间长，材料小则时间短；温度高则时间短，温度低则时间长。 经固定的材料如不及时使用，可以经过90%酒精换到70%酒精中各半小时，再换入一次70%酒精，在0-4℃冰箱内可保存半年。经过较长时间保存的材料进行观察前可以换新的固定液再处理一次，效果较好。 (二)固定液固定液包括简单固定液和混合固定液两种。简单固定液就是用一种药品作为固定液，如乙醇、甲醛、冰醋酸、升汞等。简单固定液只对细胞的某种成分固定效果较好，而不能将所有的成分都保存下来。混合固定液是指两种或两种以上的化学物质的混合液，如卡诺氏固定液等。 1.固定液的条件 (1)迅速渗入组织,杀死原生质。在杀死的短时期中,细胞形态不致有所变化。 (2)必须具有渗透力，对组织各部分的渗透力相等，可使组织内外完全固定。 (3)尽可能避免使组织膨胀或收缩。 (4)使细胞内的成分凝固或沉淀。 (5)增加细胞内含物的折光程度，易于鉴别。

细胞各种染色方法

细胞培养后，需要对其生长情况、形态甚至生物学性状进行连续地观察。由于细胞小而复杂，若不借助适当的手段，则难以观察其形态、结构，更难发现细胞内各种组分的分子组成及功能。目前，已有多种研究细胞的技术，从光镜到电子显微镜，从一般细胞化学法到免疫化学法，本章将重点介绍一些常用的观察和检测方法。 第一节培养细胞的常规检查和观察方法 细胞在体外培养过程中需要每天进行常规检查和显微镜观察，及时了解细胞生长状态、数量改变、细胞形态、细胞有无移动、有无污染、培养液pH是否变酸、变黄是否更换等。细胞常规检查观察的内容为： 一、肉眼观察 一般常规检查用肉眼即可观察，主要看培养液的颜色和透明度的变化。正常情况下，培养液pH介于7.2～7.4之间，呈桃红色清亮透明。加入细胞在培养瓶中置一般温箱培养时，随着细胞生长时间的延长，细胞代谢产生的酸性产物会使培养液pH值下降，引起颜色变浅变黄。在超越缓冲范围后培养液酸化变黄，如不及时调节pH，会影响细胞的生长，甚至造成细胞退变死亡。所以，一旦发现培养液变黄，应及时换液传代。一般更换培养液的时间，依营养物的消耗而定，正常情况生长稳定的细胞2～3天换液一次，生长缓慢的细胞3～4天换液一次。培养液中加Hepes或用5%CO2温箱培养可使pH维持稳定，利于细胞生长。用含磷酸盐缓冲系统培养时，可因瓶及塞子漏气，CO2溢出，也可能由于培养瓶塞洗刷不洁、残留碱性物，使培养液变碱发红，只致使细胞难以生长，甚至死亡。细胞换液传代后，若发现培养液很快变黄，要注意是否有细菌污染或培养器皿没有洗干净。贴壁细胞培养时若出现混浊，多为污染。悬浮培养的细胞，应将瓶竖起静置1小时，若培养基混浊示为污染，也可在显微镜下仔细观察有无污染现象出现。 二、显微镜观察 生长良好的细胞，在显微镜下可观察到细胞透明度大，折光性强，轮廓不清。相差显微镜观察时可见细胞部分细微结构。若细胞生长状态不良，可见细胞轮廓增强，细胞折光性变弱，细胞胞质中出现空泡、脂滴和其他颗粒状物质，细胞之间空隙增大，细胞形态不规则，甚至失去原有细胞的特点，产生圆缩脱落，有时细胞表面及周围出现丝絮状物。若细胞营养不良状况没有得到及时纠正，进一步发展可见到部分细胞死亡，崩解漂浮在培养液中。发现这种情况应及时处理，只有生长良好的细胞才能进行传代培养和实验研究。 三、细胞的生长状态 细胞培养时，经初代培养或传代培养，都有一长短不同的潜伏期，在培养过程中注意观察细胞增殖生长的状态极为重要。各种细胞增殖的时间不尽一致。传代细胞系，胚胎组织或幼体细胞潜伏期短，一般在接种培养第二天即可见细胞生长增殖，3～4天便可连接成片。成体组织的潜伏期长，老年组织和癌组织潜伏期更长，可达一周左右。原代细胞培养中最先可见从组织块中边缘“长出”细胞，这种细胞是从原代组织块中游走出来的，并不是细胞增殖产生。这种早期游出的细胞多以成纤维细胞为主，其易生长，适应性强，呈放射状或旋涡状分布，很快生长并互相连接成网状。传代细胞在传代后，一般经过悬浮、贴壁伸展很快进入潜伏期，对数生长期，细胞大量繁殖，逐渐相连成片而长满瓶底。一旦发现细胞长满瓶底80%就应及时传代，否则会影响细胞生长甚至脱落。悬浮细胞当发现生长显著、密度增大、分布稠密、培养液变黄时也应及时传代。 四、微生物污染 细胞接种、传代、换液加药后应经常观察，密切注意是否有微生物污染发生。一旦发现培养液混浊、液体内漂浮着菌丝或细菌，或生长明显变缓，胞质内颗粒增多，有中毒表现等

细胞染色方法大全

染色步骤 PI (Propidium Iodide碘化丙啶)染色:是一种可对DNA染色的细胞核染色试剂，常用于细胞凋亡检测. 碘化丙啶（Propidium Iodide, PI）是一种核酸染料(红色），它不能透过完整的细胞膜，但凋亡中晚期的细胞和坏死细胞由于细胞膜通透性的增加，PI 能够透过细胞膜而使细胞核染红.用PI单一染色观测培养细胞，只能表示细胞的坏死情况，而不是凋亡（当然晚期凋亡PI亦可着色）。但是如果您只是想知道细胞的死亡情况，而不是仔细区分坏死或凋亡，那么PI 单一染色也可以。但是如果您一定要认定细胞的凋亡，那么PI单一染色显然不够！ annexin-v染色细胞凋亡早期,细胞膜标志发生改变.其中,磷脂酰丝氨酸(Annexin-V,PS)外翻 ,Annexin-V 在Ca+存在的条件下与其高亲和力特异性结合.这样,Annexin-v 染色阳性,表示细胞处于早期凋亡状态.Annexin-V结合不 同的荧光抗体,就可以利用流式细胞仪、荧光显微镜以及共聚焦激光扫描显微镜检测细胞凋亡的发生。Annexin V用FITC标记发绿色荧光；如果用PE标记就发红色荧光。 JC-1染色 JC-1是一种阳离子染料，可以在线粒体内聚集，低浓度时主要以单体(monomer)存在，发射光以绿光(～525nm)为主；而在高浓度时则可以形成多聚体(aggregation)，发射光以红光(-590nm)为主。线粒体本身存在一定的极性(polarization)，其外膜为负极，内膜为正极。电位差由Ca2+、Na+和H+流调控。当线粒体状态良好时对JC-l摄取量少，因而在线粒体内主要以单体的形式存在绿光强度/红光强度的比值较高。在线粒体发生去极化(depolarization)时，线粒内JC-l的浓度较高，多以多聚体的形式存在，绿光强度/红光强度的比值降低。JC-1染色的绿光强度/红光强度仅取决于线粒体的膜电势(membrane

Hoechst染色方法

Hoechst染色方法 实验步骤 1．贴壁细胞 1) 取普通洁净盖玻片于70%乙醇中浸泡5分钟或更长时间，无菌超净台内吹干或用细胞培养PBS或0.9%NaCl等溶液洗涤三遍，再用细胞培养液洗涤一遍。将盖玻片至于六孔板内，种入细胞培养过夜，使约为50%——80%满。 2)刺激细胞发生凋亡后，吸尽培养液，加入0.5ml固定液，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。 3) 去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟，吸尽液体。洗涤时宜用摇床，或手动晃动数次。 4) 加入0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。也宜用摇床，或手动晃动数次。 5) 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。 6) 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上贴有细胞的盖玻片，尽量避免气泡，使细胞接触封片液，切勿弄反。 7) 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。 2. 悬浮细胞 1) 离心收集细胞样品于1.5ml离心管内，加入0.5ml固定液，缓缓悬起细胞，固定10分钟或更长时间（可4℃过夜）。 2) 离心去固定液，用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。洗涤期间手动晃动。 3) 最后一次离心后吸去大部分液体保留约50ml液体，再缓缓悬起细胞，滴加至载玻片上，尽量使细胞分布均匀。 4) 稍晾干，使细胞贴在载玻片上不易随液体流动。 5) 均匀滴上0.5ml Hoechst 33258染色液，染色5分钟。用吸水纸从边缘吸去液体，微晾干。 6) 用PBS或0.9%NaCl洗两遍，每次3分钟。 7) 滴一滴抗荧光淬灭封片液于载玻片上，盖上一洁净的盖玻片，尽量避免气泡。 8) H. 荧光显微镜可检测到呈蓝色的细胞核。

实验室做细胞常用染色

实验室做细胞常用的细胞固定与染色方法 一、爬片前盖玻片处理方法 对于悬浮培养的细胞，在进行各种染色前常需先制备成涂片。为了保证细胞在长时间的染色过程中不从载玻片脱落，必须使其牢固贴附于载玻片上。在载玻片上涂布一层有助于细胞黏附的物质是经常采用的方法之一。能促进细胞黏附的物质主要有多聚赖氨酸、铬矾明胶等，这里介绍多聚赖氨酸的涂布方法。 1、将载玻片用玻璃专用洗涤剂(如Decon)浸泡5min，间或振荡。 2、用自来水冲洗5min。 3、以1％盐酸—70％乙醇溶液浸泡5min。 4、烤箱干燥(至此即可用于普通染色)。 5、多聚L-赖氨酸(1:10溶于去离子水)浸泡5min，振荡。 6、入60℃烤箱1 h，或室温过夜干燥(用于细胞化学、免疫细胞化学及原位杂交细胞化学)。 二、细胞固定常用方法 固定细胞的目的在于把组织和细胞的原有结构尽可能完整地保存下来，避免组织和细胞发生降解、自溶、腐败和变形等，使细胞和组织的各种酶失去活性，防止细胞和组织的各种分子变性、解离，使细胞的化学物质和酶能准确定位，并在以后的处理和制片过程中亦不发生改变和破坏。同时，固定还可使细胞的各部分易于着色，适于观察、长期保存和分析。 ..

1.固定组织、细胞的基本原则：尽可能选用新鲜培养物；根据检测工具、对象、目的和要求选择固定剂和固定方法。 2.培养物的准备和固定前处理：各种细胞培养物，如双盖片悬滴培养物、悬液培养物、单层培养物和盖片单层培养物都可作固定材料。对双盖片悬滴培养物和悬液培养物来说，常通过离心收集细胞，PBS漂洗2～3次后，备固定制片；对盖片单层培养物来说，将盖片从培养器皿中取出后，PBS液漂洗2～3次，以洗去血清和附着于细胞表面的残渣，备固定用。 3.常用固定液：常用的固定液分两类，一类是以单一化学物质配成的固定液，称简单固定液。主要有甲醇、乙醇、甲醛、醋酸、丙酮、戊二醛、苦味酸、铬酸、重铬酸钾、氯化汞、氯化镉、四氧化锇(锇酸)。另一类是用两种或两种以上化学物质配合成的固定液，称混合固定液。如Mueller固定液、Flemming固液、FAA固定液、 Carnoy固定液、Rossman固定液、Altmann固定液、Bouing固定液等。不同的固定液对细胞的化学成分、酶类及细胞结构固定效果不同。因此，选择合适的固定液是达到固定目的的基础。 (1)4％甲醛-PBS:甲醛是一种气体，其饱和水溶液无色，约含40％甲醛。在很多情况下，甲醛常常产生多聚甲醛的白色沉淀。4％甲醛-PBS使组织变硬速度比乙醇快，并能较好地保存组织的外部形式，固定效果不受制片影响，固定材料可用木精和其他合成染料染色。甲醛的穿透力较强，对组织固定均匀，能增强组织的弹性，大标本的固定和保存多用甲醛。甲醛是染色体、线粒体和高尔基体的固定液，在冷冻切片中，甲醛作固定剂具有显著的优点。用40％甲醛水溶液:PBS=1:9配方制备甲醛固定液。 ..

血细胞化学染色检验

血细胞化学染色检验 发表时间：2011-05-13T17:08:37.940Z 来源：《中外健康文摘》2011年第5期作者：张辉[导读] 中性、嗜酸性较细胞及单核细胞胞质能将试剂中的联苯胺氧化为联苯胺蓝，生成蓝色颗粒。 张辉 (黑龙江省林甸县中医院 166300) 【中图分类号】R446.1 【文献标识码】A 【文章编号】1672-5085 (2011)5-0146-02 【关键词】血细胞检验染色 (一)过氧化物酶(POX)染色中性、嗜酸性较细胞及单核细胞胞质内含过氧化物酶(POX)，能将试剂中的联苯胺氧化为联苯胺蓝，生成蓝色颗粒。 1.酶活性增高可见于再生障碍性贫血、急性粒细胞性白血病、急性淋巴细胞性白血病、放射病，嗜碱性粒细胞在慢性粒细胞白血病时可出现阳性。 2.酶活性减低可见于肿瘤、MDS、链球菌感染、风湿热等。 (二)中性粒细胞碱性磷酸酶染色 中性粒细胞中的碱性磷酸酶(NAP)能使试剂中的成分产生一系列化学反应，形成棕黑色颗粒定位于胞质中。胞质中出现灰色到棕黑色颗粒为阳性反应，视反应强度可分为阴性反应，+～4+。由此可计算出NAP阳性细胞的百分率和阳性积分值。 1.NAP积分增高可见于①细菌性感染时，NAP活性明显增高，病毒性或寄生虫性感染时常无明显变化或减低，这有助于感染性质的鉴别；②真性红细胞增多症以及再生障碍性贫血；③类白血病，由化脓性球菌引起的白血病反应；④急性淋巴细胞性白血病；⑤多发性骨髓瘤时，NAP活性显著升高；⑥烧伤、中毒、手术、外伤等。 2.NAP积分降低可见于①慢性粒细胞性白血病时NAP活性明显降低，经治疗病情缓解时活性恢复正常，急变时活性增强，有助于对病情判断；②粒细胞缺乏症、脾功能亢进等疾病；③感染革兰阴性杆菌、结核、病毒感染以及立克次体病等。 (三)酸性磷酸酶染色 血细胞中的酸性磷酸F(ACP)在酸性条件下水解试剂中的成分，产生的化学反应形成黑色颗粒定位于胞质中。 1.单核细胞、网状细胞、巨噬细胞、组织细胞中此酶呈阳性反应，有助于急性单核细胞性白血病、组织细胞性淋巴瘤及恶性组织细胞病的诊断。 2.毛细胞白血病时呈阳性反应，且不为左旋酒石酸所抑制，有助于毛细胞白血病的诊断。 3.高雪细胞呈阳性反应尼曼-匹克细胞细胞呈阴性反应，有助于两者鉴别。 (四)特异性酯酶染色 特异性酯酶(SE)为粒细胞所特有，能将试剂成分形成不溶性红色沉淀定位于胞质中。 急性粒细胞性白血病时，原粒及早幼粒细胞的SE活性显著增强；急性单核细胞性白血病时一般呈阴性反应；急性淋巴细胞性及单核细胞性白血病时均呈阴性反应。 (五)非特异性酯酶染色 血细胞中的非特异性酚酶(NSE)能将试剂中的成分形成不溶性的有色沉淀定于胞质中。 NSE主要存在干单核细胞系，从原单核细胞到成熟单核细胞其活性逐渐增强，粒系细胞一般为阴性或弱阳性反应，淋巴细胞系一般呈阴性反应。在急性单核细胞性白血病时呈强阳性反应，但其活性能被氟化钠抑制。急性粒细胞性白血病时，有部分病理可呈弱阳性反应，但其活性不被氟化钠抑制，有助于急性单核细胞性白血病与急性粒细胞性白血病的鉴别。 (六)糖原染色 糖原染色又称过碘酸-雪夫(FAS)反应。过碘酸能将血细胞内的糖原氧化后与雪夫试剂反应形成紫红色化合物定位于细胞质中。胞质中出现红色颗粒或块状物质为阳性反应因细胞不同，其反应程度各异粒系细胞中原始粒细胞多呈阴性反应；早幼粒细胞以下各阶段随细胞成熟，阳性反应增强；红系细胞呈阴性反应；单核细胞呈弱阳性淋巴细胞多呈阴性；巨核细胞及血小板均呈阳性反应按阳性强度计算积分值。 1.鉴别良性与恶性淋巴细胞增生性疾病在良性淋巴细胞增生如传染性单核细胞增多症时，其淋巴细胞PAS阳性反应产物呈细小颗粒状，积分值正常；在恶性增生时如恶性淋巴瘤、急或慢性淋巴细胞性白血病时，其淋巴细胞中常呈粗颗粒或块状红细胞沉淀的阳性反应，积分值增高。 2.鉴别幼红细胞增生的性质在巨幼红细胞性贫血、溶血性贫血时，幼红细胞PAS反应积分值正常；在红血病、红白血病时则呈强阳性反应，积分值增高。 3.鉴别急性白血病的类型原始及幼稚粒细胞PAS反应呈阴性；原始淋巴细胞及幼稚淋巴细胞反应呈颗粒状或块状阳性；原始单核细胞及幼稚单核细胞反应呈弥漫性强阳性。 4.鉴别某些细胞类型如巨核细胞呈强阳性反应，尼曼-匹克细胞呈弱阳性或阴性，李-斯细胞一般为阴性或弱阳性反应。 (七)铁染色 骨髓组织中的含铁血黄素(细胞外铁)和幼红细胞中的铁粒(细胞内铁)在酸性溶液中与亚铁氰化钾反应，生成蓝色沉淀定位于含铁部位及胞质中。 1.细胞内外铁消失或减低，见于铁原料摄入降低，铁吸收功能障碍或铁的丢失和消耗过度，使幼红细胞血红蛋白合成量减少或障碍，如临床常见的缺铁性贫血及能引起机体缺铁的相关疾病，如钩虫病、ITP等均能使机体细胞内外铁减少，产生贫血症状。 2.细胞内外铁增多，见于机体造血功能障碍，铁利用和转换能力下降或迟缓，临床常见的疾病有再生障碍性贫血、铁粒幼细胞贫血、骨髓增生异常综合征、溶血性贫血、白血病等。 3.铁染色与血清铁、总铁结合力联合检测，有助于了解机体内铁的动态变化以及铁剂治疗的效果，可评价骨髓代偿造血能力。参考文献

常见细胞染色试剂简介

常见细胞染色试剂简介 1、酸性品红（Acid fuchsin）酸性品红是酸性染料，呈红色粉末状，能容于水，略溶于酒精（0.3%）。是良好的细胞制染色剂，在动物制片上应用很广，在植物制片上用来染皮层、髓部等薄壁细胞和纤维素壁。它跟甲基绿同染，能显示线粒体。组织切片在染色前先浸在带酸性的水中，可增强它的染色力。酸性品红容易跟碱起作用，所以染色过度，易在自来水中褪色。 2、刚果红（Congo red）刚果红是酸性染料，呈枣红色粉末状，能溶于水喝酒精，遇酸呈蓝色。它能作染料，也用作指示剂。它在植物制片中常作为苏木精或其他细胞染料的衬垫剂。用来染细胞质时，能把胶制或纤维素染成红色。在动物组织制片中用来染神经轴、弹性纤维、胚胎材料等。刚果红可以跟苏木静作二重染色，也可用作类淀粉染色，由于它能溶于水和酒精，所以洗涤和脱水处理要迅速 3、甲基蓝（Methyl blue）甲基蓝是弱酸性染料，能溶于水和酒精。甲基蓝在动植物的制片技术方面应用极广。它跟伊红合用能染神经细胞，也是细菌制片中不可缺少的染料。它的水溶液是原生动物的活体染色剂。甲基蓝极易氧化，因此用它染色后不能长久保存。 4、固绿（Fast green）固绿是酸性染料，能溶于水（溶解度为4%）和酒精（溶解度为9%）。固绿是一种染含有浆质的纤维素细胞组织的染色剂，在染细胞和植物组织上应用极广。它和苏木精、番红并列为植物组织学上三中最常用的染料。 它和苏木精、番红并列为植物组织学上三中最常用的染料。 5．苯胺蓝（Aniline blue）是一种混合酸性染料，平常所用很难有一定的标准。此染料一般很难溶于水，也不易溶于酒精（1.5％）。植物制片中可与番红合用，作为组织染色；也可作藻类植物染色。因为这种染料的成分很不一致，染色效果不易掌握。 6、苏丹Ⅲ（Sudan Ⅲ）苏丹Ⅲ是弱酸性染料，不溶解于水，呈红色粉末状，易溶于脂肪和酒精（溶解度为0.15%）。常用70％酒精中的饱和溶液。苏丹Ⅲ是脂肪染色剂。 7、苏丹Ⅳ（Sudan Ⅳ）苏丹Ⅳ是弱酸性染料，也是很好的染脂肪染料，现在多用以代替苏丹Ⅲ，可染树脂、乳汁管、蜡质以及角质等结构，也可使叶绿体染成暗红色。 s8、伊红（Eosin）这类染料种类很多。常用的伊红Y，是酸性染料，呈红色带蓝的小结晶或棕色粉末状，溶于水（15摄氏度是溶解度达44%）和酒精（溶于无水酒精的溶解度为2%）。伊红在动物制片中广泛应用，是很好的细胞质染料，常用作苏木精的衬染剂。 9、碱性品（复）红（Basic fuchsin）碱性品红是碱性染料，呈暗红色粉末或结晶状，能溶于水（溶解度1%）和酒精（溶解度8%）。碱性品红在生物学制片中用途很广，可用来染色胶原纤维、弹性纤维、嗜复红性颗粒和中枢神经组织的核质。在生物学制片中用来染维管束植物的木质化壁，又作为原球藻、轮藻的整体染色。在细菌学制片中，长用来鉴别结核杆菌。在尔根氏响应中用作组织化学试剂，已核查脱氧核糖核酸。 10、结晶紫（Crystal violet）结晶紫是碱性染料，能溶于水（溶解度9%）和酒精（溶解度

细胞染色方法

一、形态学观察方法 1、HE染色、光镜观察：凋亡细胞呈圆形，胞核深染，胞质浓缩，染色质成团块状，细胞表面有“出芽” 现象。 2、丫啶橙（AO)染色，荧光显微镜观察：活细胞核呈黄绿色荧光，胞质呈红色荧光。凋亡细胞核染色 质呈黄绿色浓聚在核膜内侧，可见细胞膜呈泡状膨出及凋亡小体。 3、台盼蓝染色：如果细胞膜不完整、破裂，台盼蓝染料进入细胞，细胞变蓝，即为坏死。如果细胞膜 完整，细胞不为台盼蓝染色，则为正常细胞或凋亡细胞。此方法对反映细胞膜的完整性，区别坏死细胞有一定的帮助。 4、透射电镜观察：可见凋亡细胞表面微绒毛消失，核染色质固缩、边集，常呈新月形，核膜皱褶，胞 质紧实，细胞器集中，胞膜起泡或出“芽”及凋亡小体和凋亡小体被临近巨噬细胞吞噬现象。 二、DNA凝胶电泳 （一）、检测原理 细胞发生凋亡或坏死，其细胞DNA均发生断裂，细胞内小分子量DNA片断增加，高分子DNA减少，胞质内出现DNA片断。但凋亡细胞DNA断裂点均有规律的发生在核小体之间，出现180－200bpDNA 片断，而坏死细胞的DNA断裂点为无特征的杂乱片断，利用此特征可以确定群体细胞的死亡，并可与坏死细胞区别。 （二）结果判断 正常活细胞DNA 电泳出现阶梯状（LADDER)条带；坏死细胞DNA电泳类似血抹片时的连续性条带。 三、酶联免疫吸附法（ELISA)核小体测定 凋亡细胞的DNA断裂使细胞质内出现核小体。核小体由组蛋白及其伴随的DNA片断组成，可由ELISA 法检测。 （一）检测步骤 1、将凋亡细胞裂解后高速离心，其上清液中含有核小体； 2、在微定量板上吸附组蛋白体? 3、加上清夜使抗组蛋白抗体与核小体上的组蛋白结合… 4、加辣过氧化物酶标记的抗DNA抗体使之与核小体上的DNA结合? 4、加酶的底物，测光吸收制。 （二）用途 该法敏感性高，可检测5*100/ml个凋亡细胞。可用于人、大鼠、小鼠的凋亡检测。该法不需要特殊仪器，适合基层工作，但是不能精确测定凋亡细胞发生的绝多对量。 四、流式细胞仪定量分析 （一）检测原理 细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性也增加，但是其程度介于正常细胞与坏死细胞之间。利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪测量细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞核凋亡细胞。 （二）应用价值 流式细胞仪检测具有以下特点： 1)、检测的细胞数量大，因此其反映群体细胞的凋亡状态比较准确 2)、可以做许多相关性分析 3)、结合被检测细胞的DNA含量的分析，可确定凋亡的细胞所处的细胞周期 ■检测形态学及细胞膜完整性的Hoechs-PI双染色法 细胞发生凋亡时，其细胞膜的通透性液增加，但其程度介于正常细胞和坏死细胞之间，利用这一特点，被检测细胞悬液用荧光素染色，利用流式细胞仪检测细胞悬液中细胞荧光强度来区分正常细胞、坏死细胞和凋亡细胞。

PI染色检测细胞周期实验步骤

protocol：PI染色检测细胞周期 1、收集细胞：胰酶（含EDTA）消化收集对数生长期细胞（加热处理后损失多的组宜多收集细胞保证细胞有0.5-2×10*6个），吸取旧培养基到一个新离心管里；少量常温PBS（根据培养皿大小决定量，PBS洗可以保证消化效率）洗2次，清洗的PBS也要收集到上述离心管内【检测凋亡才需收集旧培养基及清洗的PBS】；然后胰酶消化（注意一定要消化完全，显微镜下观察细胞呈单个，而不是成片脱落）后利用旧培养基中和胰酶；离心(1000r/300g5min)收集细胞沉淀。 2、用预冷的PBS清洗细胞两次。 3、固定细胞：用0.5ml预冷的PBS重悬细胞沉淀，使细胞充分悬浮成单细胞，再将重悬细胞加入1.2ml预冷的99.7%无水乙醇(乙醇终浓度70%)，吹打混匀以免细胞团聚，4℃固定2H至过夜。 4、细胞染色：离心（1000r/300g5min）收集固定的细胞，以1.8 mL的PBS洗细胞一次，离心(第一次实验时用7000rpm才把细胞离心下来，但最后流式结果显示细胞没有碎)再次获取细胞沉淀后加入1 00μlRNaseA于37℃水浴30min，最后加入400μlPI避光染色30 min（常温或4℃均可） 【有的试剂盒说明是：每个样本加入500uL染色剂（据样本数，用P BS临时配好总量，其中PI 50ug/ml、RNase A 100ug/mL、Triton X-100 0.2%）4℃避光染色30分钟】 5、流式分析

以标准程序用流式细胞仪检测，一般计数2-3万个细胞，结果用细胞周期拟和软件ModFit分析。分析时，使用FL2-w和FL2-A显示，去除联体细胞。

常用血细胞化学染色原理及应用

常用血细胞化学染色原 理及应用 Document number：NOCG-YUNOO-BUYTT-UU986-1986UT

常用血细胞化学染色原理及应用 （1）过氧化物酶染色的原理和临床意义（POX） [原理]粒细胞和单核细胞胞浆中含有的过氧化物酶能将底物过氧化氢分解，产生新生态氧，它将四甲基联苯胺氧化为蓝色联苯胺。后者进一步变成黑色化合物，沉积于胞质内。 正常血细胞的染色反应： 1.粒细胞系---原粒大多数呈阴性反应，有点渴出现少量蓝黑色颗粒。自早幼粒致成熟中性郡城阳性反应，细胞月成熟，阳性越强。中性分叶核强阳性，嗜酸性粒细胞阳性反应最强，其阳性颗粒比中性粗大，有折光性。定位于胞质内。嗜碱性粒细胞呈阴性反应。 2.单核细胞系-原始单核呈阴性反应，幼稚单核及单核呈弱阳性,阳性颗粒少而细小，均匀分布，有时也可呈阴性反应。 3.红细胞系、淋巴细胞系、巨核细胞系、浆细胞系---均呈阴性。有的巨噬细胞可呈阳性。 （2）过碘酸-雪夫染色的原理和临床意义（PAS） [原理]过碘酸-雪夫又称糖原染色。胞浆内存在的糖原或多糖类物质（如黏多糖、黏蛋白、糖蛋白、糖酯等）中的乙二醇基经过碘酸氧化，转变为二醛基，与雪夫试剂中的无色品红结合，形成紫红色化合物而沉积于胞浆中糖原类物质所存在的部位。该反应称为过碘酸-雪夫（PAS）阳性反应。 正常血细胞的染色反应： 1.粒细胞系-----原粒细胞多呈阴性,至早幼粒至中性分叶核粒细胞呈阳性反应，并随细胞熟，阳性反应的强度逐渐增强。嗜酸粒细胞本身不着色，而颗粒之间的胞浆呈红色，嗜碱粒细胞为阳性反应，阳性物质为大小不一的紫红色颗粒。 2.单核细胞系---原单位阴性，幼单为（+）阳性反应，单核细胞为（+）~（++）阳性反应。 3.淋巴细胞系---大多数淋巴细胞为阴性反应，少数淋巴细胞可为（+）阳性反应。 4.红细胞系----红细胞系的各个阶段皆呈阴性反应。

第九章 细胞核与染色体

名词： 核孔复合体染色质/染色体/染色单体/巨染色体基因组核小体 常染色质/异染色质着丝粒/着丝点 主缢痕/次缢痕核仁组织区 随体端粒/端粒酶 核型染色体分带 核仁周期核骨架 核定位信号核输出信号 输入蛋白importin 输出蛋白exportin 组成性异染色质兼性异染色质 思考题： 1.概述细胞核的基本结构；核被膜的形成对细胞生命活动具有什么 意义? 2.简述核孔复合体的结构。 3.核蛋白是如何进行运输的，简述核蛋白的运输模型。 4.染色质的类型及其特征。 5.组蛋白的主要成分有哪些？在结构和功能上有什么异同？ 6.试述从DNA到染色体的包装过程。 7.核仁的结构及其功能。 核骨架的主要生物学功能。

名词： 1、核孔复合体：核被膜上沟通核质和细胞质的复杂隧道结构，由多种核孔蛋白构成。隧道的内、外口和中央有由核糖核蛋白组成的颗粒，对进出核的物质有控制作用。 2、染色质:是细胞间期细胞核内能被碱性染料染色的物质。染色体：细胞在有丝分裂和减速分裂过程中有染色质聚缩而成的棒状结构 3、染色单体：复制时产生的染色体拷贝 4、巨染色体;某些生物的细胞中，特别是在发育的某些阶段，可以观察到一些特殊的染色体，它们的特点是体积巨大，细胞核和整个细胞体积也大，所以称为巨大染色体，包括多线染色体和灯刷染色体。 5、基因组：一般的定义是单倍体细胞中的全套染色体为一个基因组，或是单倍体细胞中的全部基因为一个基因组。 6、核小体：核小体是染色体的基本结构单位，由DNA和组蛋白(histone）构成，是染色质（染色体）的基本结构单位。由4种组蛋白H2A、H2B、H3和H4，每一种组蛋白各二个分子，形成一个组蛋白八聚体，约200 bp的DNA分子盘绕在组蛋白八聚体构成的核心结构外面，形成了一个核小体。 7、常染色质：常染色质是指间期核内染色质纤维折叠压缩程度低，处于伸展状态，用碱性染料染色时着色浅的那些染色质。 8、异染色质：在细胞周期中，间期、早期或中、晚期，某些染色体或染色体的某些部分的固缩常较其他的染色质早些或晚些，其染色较深或较浅，具有这种固缩特性的染色体称为异染色质 9、着丝粒：染色体中连接连个染色单体、并将染色单体分为短臂和长臂的结构。 10、着丝点：有着丝点结合蛋白在有丝分裂期间特别装配起来的、附着于主缢痕外侧的圆盘状结构，内层与着丝粒结合，外层与动粒微管结合。 11、主缢痕：中期染色体上一个染色较浅而缢缩的部位，主缢痕处有着丝粒，所以亦称着丝粒区，由于这一区域染色线的螺旋化程序低，DNA含量少，所以染色很浅或不着色。 12、次缢痕：是染色体上的一个缢缩部位, 由于此处部分的DNA松懈, 形成核仁组织区, 故此变细。它的数量、位置和大小是某些染色体的重要形态特征。每种生物染色体组中至少有一条或一对染色体上有次缢痕。次缢痕中的染色质含有rDNA，它与rDNA的形成有关 13、核仁组织区：细胞核特定染色体的次缢痕处,含有rRNA基因的一段染色体