实验动物设计
奥扎格雷注射液治疗急性心肌梗死班级：临床医学（眼科视光学方向）1201班
设计人员：刘宗霖033131201016
马路路033131201023
刘壮壮033131201033
赵斌033131201040
高月033131201045
谢濡徽033131201056
设计日期：2015年6月16日
一、研究背景
急性心肌梗死(AMI)是由冠状动脉供血不足所引起的心肌坏死的临床综合征，AMI发病突然、凶险、病死率高，抢救治疗必须争分夺秒。急性心肌梗死常导致冠心病患者心律失常及心脏骤停，严重可导致患者猝死。患者由于冠状动脉病变，动脉内粥样斑块破裂，使冠状动脉供血不足而导致心肌急性坏死。其治疗原则是尽快抢救恢复心肌的血液灌注和及时、充分开通闭塞的血管，以挽救存活及濒死心肌；防止梗死扩大或缩小心肌缺血范围，限制和缩小梗死面积可以最大限度地减少心脏泵功能衰竭或与其相关的致命性心律失常以及心脏破裂的发生，保护和维持心脏功能；及时处理并发症；是急性心肌梗死治疗的重要目标之一。而治疗时如何使急性闭塞的梗死相关血管尽早恢复前向血流，实现早期再灌注(早期血运重建)是达到上述目标的关键。近年来，对AMI的治疗进展较快，而且对改善AMI的预后起到了积极重要的作用，取得了很好的效果，AMI的治疗方法包括溶栓治疗、经皮冠状动脉介入(PCI)、冠状动脉搭桥术(CABG)、心肌干细胞移植等。
奥扎格雷为血栓烷（TX）合酶抑制剂，能阻碍前列腺素H2（PGH2）生成血栓烷A2 （TXA2），促使血小板所衍生的PGH2转向内皮细胞。内皮细胞用以合成PGI2，从而改善TXA2与前列腺素PGI2的平衡异常。理论上能抑制血小板的聚集和扩张血管作用。主要用于急性脑梗塞的治疗。冠状动脉粥样斑块的不稳定性决定了不稳定性心绞痛的发生机制，脂质斑块的破裂是由纤维帽变薄和脂质斑块增大，以及炎症的发生，炎性细胞的侵润，血管壁所受的剪切力增大，产生斑块破裂、冠状动脉就可能被纤维蛋白原、血小板聚集物和红细胞集合而堵塞，导致腔内不全性狭窄、阻塞，而形成临床不稳定型心绞痛。由血小板激活释放的TXA2可以诱发冠脉痉挛，加重冠脉狭窄。UAP的血栓大多数是以血小板为主要成分，纤维成分少的“白血栓”或“灰血栓”，因此，抗血小板凝集的治疗意义非常大。目前普遍认为体内血栓调节机制是由前列腺素G2(PGG2)和前列腺素H2(PGH2)在凝血恶烷A2(TXA2)合成酶的作用下形成TXA2，从而促使血小板聚集而形成血栓；另一方面PGG2和PGH2又在前列环素I2合成酶作用下可转化成前列环素I2(PGI2)，抑制血栓的形成，促使血栓溶解。奥扎格雷钠为凝血恶烷A2(TXA2)合成酶抑制剂，能选择性抑制TXA2合成酶，同时也能增强PGI2合成酶达到消除血栓。
二、研究假设：
目前临床上奥扎格雷注射液主要用于治疗急性脑梗塞，蛛网膜下腔出血脑血管痉挛等疾病。但在急性心肌梗死方面治疗应用经验不足。复制急性心肌梗死的动物模型。对急性心肌梗死动物给予奥扎格雷注射药，观察治疗疗效。
参考文献：
[1]项建立．急性心肌梗死的治疗进展[J]．医学理论与实践，2009，22 (8)：907—9l1．
[2]贾浩．急性心肌梗死不同时期溶栓的疗效观察和分析[J]．临床医学，2006，26(10)：66—67．
[3] 叶任高，陆再英．内科学．人民卫生出版社，2006：283-297．
[4] 中华医学会心血管病学分会．急性心肌梗死诊断和治疗指南．中华心血管病杂志，2001，29：713-714．
[5]李元玖，李正信,张颖，等. 降纤酶抗心绞痛作用与血浆纤维蛋白原及纤溶系统关系的研究［J］.临床内科杂志,2004,10：698.
[6]吕红星，刘鸿雁，张国莉，等.奥扎格雷钠治疗脑血栓形成［J］.中国新药与临床杂志，1999,18(1):57.
三、研究内容
复制急性心肌梗死的动物模型，观察奥扎格雷注射液的疗效，从而探讨奥扎格雷注射液是否对急性心肌梗死有较好的临床效果，为临床上提供血小板注射药治疗急性心肌梗死的新思路。
四、研究方案
（一）实验设计目标，拟解决的关键问题
设计目标：研究奥扎格雷注射药能否用于急性心肌梗死，观察其对急性心肌梗死时
堵塞血管有无再通作用及侧枝循环建立有无帮助。拟解决的关键问题：sD大鼠经戊巴比
妥钠麻醉后，经口人工呼吸，开胸结扎左冠状动脉前降支，制备动物试验性急性心肌梗死
模型。对试验性急性心肌梗死模型进行分组与实验结果分析。
（二）实验设计
(1) 随机抽样：选正常成年健康重量相近的SD大鼠100只，从造模成功的大鼠中选出80只大鼠按体重由小变大编号后，从随机数字表中查取随机数字，依次抄录于SD大鼠编号。
(2) 实验编号与分组：先将试验大鼠称重，然后先按体重每10g为一个重量级，
从小到大排列为若干个组，随后用龙胆紫和苦味酸将大鼠进行标记，龙胆紫表示个位，苦味酸表示十位，从大鼠的左爪开始标记，记为1，随后依次将左侧腹部，左后爪，右前爪，右侧腹部，右后爪，颈部，背部，尾部记为2，3，4，5，6，7，8，9。随后得到大鼠1至80的编号，再在随机数表中查询数字并分组。
(3) 实验手术：抓取手术大鼠，观察其是否健康，如果老鼠身体状况有异，应要更换老鼠。然后在电子称上称其重量，并做好记录，根据体重严格计算麻醉剂量，采用胸部注射麻药。大约三分钟左右，大鼠出现站立不稳，醉酒样步态。四肢固定与手术台上，松紧适中，手术过程中注意观察四肢是否出现瘀血，注意按摩。此时，可用大头针刺激大鼠尾巴，如果大鼠的反应不强烈，预示着可以开始手术。首先剪除大鼠前胸区域毛，而后均匀喷洒碘伏溶液于备皮区域。开通人工呼吸，BL一410生物机能实验系统行心电监测，从左胸纵切口分层开胸。
(4) 模型复制：于胸骨左缘第4肋间用血管弯钳稍用力穿透肋间肌进入胸腔，并迅速沿肋间隙方向撑开血管钳而钝性分离肋间肌;术者用另一血管弯钳垂直肋间隙撑开肋骨，暴露心脏。在肺动脉圆锥和左心耳之间，距左冠状动脉起始2mm处穿5—0号无创伤丝线，结扎该段冠状动脉。结扎后可见左室前壁失去原有光泽，变苍白，并出现搏动减弱，心电监测可见肢体导联R波振幅明显升高，随后出现I、aVL导联ST段明显抬高，证实制作AMI模型成功。术后注射青霉素预防感染。
(5) 处理措施：
1.奥扎格雷注射液：建模成功后即刻注射奥扎格雷注射液0.2mg/100g，以后每隔24h按上述剂量注射一次。
2.损伤组：建模成功后不给予任何治疗措施。
(6) 取材：将压力传感器与BL-410生物信号采集系统连接，测量并记录所需要的各项指标。经股静脉注入10%KCl 2 ml，使心脏停搏于舒张期，迅速取出心脏，用PBS液洗去血液，滤纸吸净水分后用电子天平(精确到0.1 mg)分别称取左、右心室实际重量(LV AW、RV AW)，计算其与体质量(BW)的比值，得到左、右心室相对重量(LVRW、RVRW)。将心脏从心尖到心底沿长轴横切4等分，用4%多聚甲醛固定24 h后分别石蜡包埋。各取一张5 μm的病理切片作HE染色。用HPIAS彩色病理图文分析系统测量每张切片的心内膜缘总长及心梗部位心内膜缘长度，计算梗死面积。
(7) 指标检测：
①心电图：于术后0h、24h、1w、2w、3w、4w，分别观察其心电图的变化。
②HE染色切片观察：在24h、1w、2w、3w、4w，时分别从5组中每组随机取出4只大鼠处死，并迅速取出心脏，PBS液洗去血液。用甲4%多聚甲醛固定24 h后分别石蜡包埋。各取一张5 μm的病理切片作HE染色并观察。
③血流动力学检查（SBP、DBP、LVSP、LVEDP、左室内压最大上升和下降速率)
在24h、1w、2w、3w、4w，时分别从5组中每组随机取出4只大鼠，用3%戊巴比妥钠(45 mg/kg)腹腔注射麻醉，气管切开插管，保持呼吸道通畅。分离右侧颈总动脉，插入2F聚乙烯导管，0.3%肝素生理盐水抗凝，将压力传感器与BL-410生物信号采集与处理系统连接，测量并记录颈总动脉收缩压(SBP)和舒张压(DBP)，向前推送导管至左心室测量左室收缩压(LVSP)、左室舒张末压(LVEDP)、左室内压最大上升和下降速率(±dp/dtmax)等参数。
测定SBP、DBP、LVSP、LVEDP、左室内压最大上升和下降速率的意义：这些指标能直接反应出心脏的恢复情况，从而了解到各种处理措施对大鼠恢复心脏功能的作用。
○4梗死面积大小、梗死区室壁厚度变化、心室肌质量／体重指标的测定：在24h、1w、2w、3w、4w，时分别从2组中每组随机取出4只大鼠，处死大鼠后用滤纸洗净，用电子天平分别称取左、右心室实际重量(LV AW、RV AW)，计算其与体质量(BW)的比值，得到左、右心室相对重量(LVRW、RVRW)。将心脏从心尖到心底沿长轴横切4等分，用尺子测量心室的厚度，并用4%多聚甲醛固定24 h后分别石蜡包埋。用HPIAS彩色病理图文分析系统测量每张切片的心内膜缘总长及心梗部位心内膜缘长度，计算梗死面积。
从梗死面积的变化情况可以知道该处理措施是否减小了梗死面积，从梗死区室壁的厚度变化我们可以知道各种药物处理是否对心室壁的重构有影响，从心室肌质量/体重可以知道心肌代偿肥大的程度。
五、可行性分析
1、SD大鼠易得到，容易饲养，在科研工作中被广泛利用。
2、手术器材、设备、仪器、药品均为实验室常用或易于得到。
3、实验药品较便宜，且选用大鼠使实验成本较低。
六、预期研究结果
1、奥扎格雷注射液治疗急性心肌梗死疗效更明显。
2、为临床上进一步应用奥扎格雷注射液治疗急性心肌梗死提供可靠依据。
3、奥扎格雷注射液可以考虑作为临床上治疗急性心肌梗死的一线用药。
第四军医大学实验动物中心 ; 实验部
!""#$%%&’(&)(细胞与分子免疫学杂志*+,-../0.!11230.45%%$6$&*74 859 ############################################################################################# 第四军医大学实验动物中心":;实验部 向国内外上等级课题开放公告 第四军医大学实验动物中心是一个集繁育、科研及成果转化为一体的综合机构。中心":;饲育部可提供包括裸鼠、",!<鼠、=>?=@A 、,8&、昆明小鼠、BCDEFG 和"<大鼠在内的&个品系不同等级的实验动物，特设恒河猴、小香猪、与比格犬培育基地，现已开始提供合格动物。对外开放寄养观察实验部，配有包括无菌动物实验室、水平层流实验室、:)级负压实验室在内的5H 个实验单元，可供$%%多个实验课题同步进行，并可出据本中心的实验报告和":;动物等级证与设施合格证。现已承接包括日本和香港 在内的合作课题几十项。最近正在进行广州、上海与北京等高等院校博士和博士后课题$%多项，本中心将以“三满意”、“五保证”为服务宗旨，竭诚欢迎全国各科研院所的科技人员使用本中心提供的动物及相关开放实验室。 联系电话：$)&%H$(%$%%李六金主任；*%5H 4))&9&(&姜春陵*生产部4；（%5H ）))&9&H5李杰*实验部46 I’1FC.J .FKF3C9L M112N -O2N A36MFPJ *%5H 458)5%98 地 址：*邮编&$%%)54西安市长乐西路第四军医大学实验动物中心 （图$,见8&)页）。 5N 5Doxycycline 对PC -3细胞侵袭转移的影响采用用 EGF3DQ-..小室法，检测不同浓度的<0PRARA.C3-作用后，:,S )细胞降解1FEGCT-.并穿过(!1孔径的无聚碳酸脂:U:多孔 滤膜的作用。结果表明对照组每5%%倍视野穿过的细胞数平 均为（(5N %9V 9N 75），而8、$%和5%1T @?的<0PRARA.C3-作用后，每5%%倍视野穿过的细胞数分别平均为（57N $V )N 87）、（&N $&V 5N 5$）和（)N 58V %N &9），分别与对照组相比差异显著（W X %N %$），表明随着<0PRARA.C3-浓度的增加，其抑制:,S )细胞侵袭转移的能力越强。 )讨论 前列腺癌是雄激素依赖性型和非依赖型两种癌细胞组成的异质体。常用的治疗方法有性腺切除或用内分泌治疗等。这些方法只能诱导雄激素依赖型细胞凋亡，但不可避免的使其转变为雄激素非依赖型前列腺癌，而对于该种前列腺癌的治疗目前尚无有效的方法，因此，研究其侵袭转移的抑制更显得重要。肿瘤侵袭与转移是多步骤的过程，//:在其中起着重要的作 用。如//:S $的表达水平与结肠、直肠癌及食管癌的不良预后有关Y 9Z 8[。//:S $可作为判定胃癌预后的指标，并可将其用于作为对腹膜复发可能性大的患者进行辅助治疗的依据。/FG\等Y 7[研究了=:]和前列腺癌中//:S 5的表达后， 指出//:S 5在良性前列腺增生组织中的表达很少或几乎不表达，而在前列腺癌中则表达很强，且随着^.-FD03积分的增加而增强，表明金属蛋白酶在肿瘤的转移中起着很重要的作用。骨组织和肺组织是前列腺癌最常见的两个转移部位，"FGA_-‘S "Q-FE1F3Y &[通过体外实验证实，前列腺癌细胞可直接降解骨相关的基质，而在这一过程中//:起了很重要的作用。"EC..等Y ([ 采用原位杂交和a#>印迹法， 检测良性前列腺增生和前列腺癌组织后，发现//:S 5及其组织型抑制剂 （b!/:S 5） 定位于低分化和高分化的肿瘤腺体周边恶性上皮细胞内和囊外侵袭的恶性上皮内，且恶性度越高表达越强Z //:S 5@ b!/:的比值越大。以上都表明，//:在肿瘤的侵袭转移中起了很重要的作用，而肿瘤治疗失败的最主要的原因，就是在于不能控制肿瘤细胞的侵袭和转移。//:在肿瘤的侵袭转移中 发挥着重要作用，对其抑制剂的研究将具有广阔的应用前景。 目前，大部分合成的//:抑制剂（如==S H9），都是一种假肽类衍生物，但这类药物口服效果及局部耐受性均差，从而阻碍了它的发展。<0PRARA.C3-可代表一类化学修饰的四环素类金属 蛋白酶抑制剂，在体内外研究中表明均有抑制金属蛋白酶表达的作用，但国内尚未见关于其抑制前列腺癌侵袭转移的报道。我们的研究表明，<0PRARA.C3-在81T @?就能明显抑制:,S )细胞表达//:S 5，抑制:,S )细胞的侵袭转移，改善其恶性表型，而且其抑制作用具有剂量依赖性。这一发现，为应用<0PR’ARA.C3-治疗高表达//:S 5的前列腺癌提供了实验依据。参考文献： Y $[;CM-a"，".-OT-^B +G ，a0E_=+Z -E F.N IMM-AED 0M O0PRARA.C3-03 _21F3WG0DE3E-AF3A-G A-..D C3cCEG0Y +[N ,F3A-G .-EE Z $HH(Z $5&J )&S 9$N Y 5[,F\CG dZ ]F_3e>N
动物实验方法总结：组织研磨管的使用方法 临床样本或动物取材注意事项 动物模型
组织研磨管的使用方法 1.作用：只适用于蛋白提取、RNA提取、基因组DNA提取时的组 织裂解，不做他用； 2.组织研磨管：容量为1.5ml, 里面已经提前放置了研磨珠（有时也 不放置），研磨液（Trizol或RIPA裂解液，有时也不放置）一般在取回后才加入，如果已经加入了研磨液，请离心后才拧开管盖，以免研磨液溢出，对皮肤造成伤害，所以操作时，要小心注意！ 3.组织：把收取的组织分切，用生理盐水或PBS缓冲液把分切的组 织上的血液漂洗干净，然后用医用纱布或滤纸把组织表面的水分吸干，然后放入研磨管（组织体积大小为1颗绿豆至2颗黄豆，根据实际情况决定）中，然后把放入的组织尽量剪碎； 4.存放：上述过程应尽量在最短的时间内操作完毕，立即用液氮冻 结，然后置于液氮或-80℃保存； 5.操作事项：操作时间尽可能短，做好一个，立马放置一个；
实验方法总结（3）：动物模型部分 1、研究肿瘤细胞增殖 (2) 2、研究肿瘤细胞转移 (3) 2.1. 体外(浸润模型) (3) 2.2. 体内(转移模型) (3) 3、研究肿瘤细胞耐药 (5) 3.1. 耐药细胞株的建立 (5) 3.2. 裸鼠移植瘤耐药模型的建立 (6) 从肿瘤起源分，肿瘤动物模型的分类如下： 从研究目的来分，可以从增殖、转移、耐药三个角度来分析： 1、研究肿瘤细胞增殖 细胞准备：GeneA敲减慢病毒感染细胞扩增至需要的细胞量。分为：空白对照组、阴性对照组、实验组。 取Balb/c裸鼠，雄性，6周龄，每组10只，适应一周后进行肿瘤细胞注射。
XXX细胞消化离心后制成单细胞悬液，计数后取适量的细胞用PBS悬浮，在Balb/c裸鼠侧腹部皮下接种。每只接种2×106个细胞，注射体积为100 μL。此后，每隔5天测量注射部位肿瘤的体积。30天后裸鼠小鼠腹腔注射80 mg/kg 戊巴比妥钠，小鼠麻醉后置蓝色背景布上拍照（侧卧位，接种部位朝上），小鼠颈椎脱臼处死，取出肿瘤称重，将肿瘤置蓝色背景布上拍照，肿瘤一分为二，一份4%多聚甲醛固定，待后续病理分析，一份-80℃冻存。 2、研究肿瘤细胞转移 肿瘤转移的模型包括两大类：体外(浸润模型)和体内(转移模型)。体外(浸润模型)：了解肿瘤细胞对周围相连组织的侵润性。体内模型主要研究肿瘤细胞的转移性即肿瘤细胞在远端组织形成病灶的能力。 2.1. 体外(浸润模型) 例：浸润型脑胶质瘤动物模型的建立 方法：取若干只Balb/c免疫缺陷裸鼠，将分离和鉴定并转染携带绿色荧光蛋白的脑胶质瘤干细胞立体定向法行小鼠颅内接种，每组10只。小鼠麻醉后头部正中切口，剥离骨膜后钻孔(坐标是冠状缝后0.5 cm，矢状缝右侧2.5 cm) 。取2 μL胶质瘤干细胞以1×104 cells /只小鼠的剂量，经微量注射器缓慢注射入鼠脑纹状体内(深度是2.5 ～3 mm) 。在确定的时间点处死一部分动物进行荧光( 立体荧光显微镜下) 病理证实和比较，同时检查脑胶质瘤干细胞的体内生长特征以及干细胞标志物等。 2.2. 体内(转移模型)
实验动物的等级划分及实验动物房的设计规范
实验动物的等级划分及实验动物房的设计规范公司标准化编码 [QQX96QT-XQQB89Q8-NQQJ6Q8-MQM9N]
【特殊实验室】实验动物的等级划分及实验动物房的设计规范 一、实验动物的分类 实验室根据实验动物微生物控制标准，可将实验动物分为四级，分别是普通动物、清洁动物、无特殊病原体动物、无菌或栖生动物。 一级普通动物（CV），系指微生物不受特殊控制的一般动物。要求排除人兽共患病的病原体和极少数的实验动物烈性传染病的病原体。为防止传染病，在实验动物饲养和繁殖时，要采取一定的措施，应保证其用于测试的结果具有反应的重现性（即无论不同的操作人员，在不同的时间，用同一品系的动物按规定的实验规程所做的实验，都能获得几乎相同的结果）。 二级清洁动物（CL），要求排除人兽共患病及动物主要传染病的病原体。 三级无特殊病原体动物（SPF），要求到二级外，还要排除一些规定的病原体。其除菌与灭菌的方法，可使用高效空气过滤器除菌法、紫外线灭菌法、三甘醇蒸气喷雾法及氯化锂水溶液喷雾法。 四级无菌动物（GF）或栖生动物（GN），无菌动物要求不带有任何用现有方法可检出的微生物。栖生动物要求在无菌动物体上植入一种或数种已知的微生物。 二、四类实验动物的病理检查标准 在病理学检查上，四类实验动物也有不同的病理检查标准。 一级外观健康，主要器官不应有病灶。 二级除一级指标外，显微镜检查无二级微生物病原的病变。 三级无特殊病原体动物。无二、三级微生物病原的病变。 四级不含二、三级微生物病原的病变，脾、淋巴结是无菌动物组织学结构。三、动物房设计管理上的要求 对不同级别的实验动物在动物房设计上和管理上则有不同的要求。 无菌、已知菌以及无特殊病原体动物都需要在无菌或尽可能无菌的环境里饲养，这种环境，目前国际上通用称为屏障环境，即用一道屏障把动物与周围污染的环境隔开，就如胎鼠在母鼠子宫内一样。这种环境从控制微生物的角度分为隔离系统、屏障系统、半屏障系统、开放系统和层流架系统等五大类。 A隔离系统 是在带有操作手套的容器中饲养动物的系统，用于饲养无菌动物和栖生动物。内部保持按微生物要求的100级的洁净度，但其设置的房间及操作人员不必按无菌室考虑。 B屏障系统
实验动物房的设计
实验动物房的设计 根据实验动物微生物控制标准，可将实验动物分为四级： 一级普通动物（CV），系指微生物不受特殊控制的一般动物。要求排除人兽共患病的病原体和极少数的实验动物烈性传染病的病原体。为防止传染病，在实验动物饲养和繁殖时，要采取一定的措施，应保证其用于测试的结果具有反应的重现性（即无论不同的操作人员，在不同的时间，用同一品系的动物按规定的实验规程所做的实验，都能获得几乎相同的结果）。 二级清洁动物（CL），要求排除人兽共患病及动物主要传染病的病原体。 三级无特殊病原体动物（SPF），要求到二级外，还要排除一些规定的病原体。其除菌与灭菌的方法，可使用高效空气过滤器除菌法、紫外线灭菌法、三甘醇蒸气喷雾法及氯化锂水溶液喷雾法。 四级无菌动物（GF）或栖生动物（GN），无菌动物要求不带有任何用现有方法可检出的微生物。栖生动物要求在无菌动物体上植入一种或数种已知的微生物。 在病理学检查上，四类实验动物也有不同的病理检查标准。 一级外观健康，主要器官不应有病灶。 二级除一级指标外，显微镜检查无二级微生物病原的病变。 三级无特殊病原体动物。无二、三级微生物病原的病变。 四级不含二、三级微生物病原的病变，脾、淋巴结是无菌动物组织学结构。 综合上述，对不同级别的实验动物在动物房设计上和管理上则有不同的要求。 无菌、已知菌以及无特殊病原体动物都需要在无菌或尽可能无菌的环境里饲养，这种环境，目前国际上通用称为屏障环境，即用一道屏障把动物与周围污染的环境隔开，就如胎鼠在母鼠子宫内一样。这种环境从控制微生物的角度分为隔离系统、屏障系统、半屏障系统、开放系统和层流架系统等五大类。 A 隔离系统是在带有操作手套的容器中饲养动物的系统，用于饲养无菌动物和栖生动物。内部保持按微生物要求的100级的洁净度，但其设置的房间及操作人员不必按无菌室考虑。 B 屏障系统把10000～100000级左右的无菌洁净室作为饲养室，主要用于无特殊病原体动物的长期饲养和繁殖。入室施行严格管理，如淋浴、换贴身衣服等。 C 半屏障系统放宽对屏障系统中人及物出入房间时的管理，平面组成大致与屏障系统相同。 D 层流架系统笼具放在洁净的水平层流空气中。常用于小规模饲养，但在一般房间进行饲
实验方法总结：动物模型部分
实验方法总结：动物模型部分 1、研究肿瘤细胞增殖 (1) 2、研究肿瘤细胞转移 (2) 2.1. 体外(浸润模型) (2) 2.2. 体内(转移模型) (2) 3、研究肿瘤细胞耐药 (4) 3.1. 耐药细胞株的建立 (4) 3.2. 裸鼠移植瘤耐药模型的建立 (5) 从肿瘤起源分，肿瘤动物模型的分类如下： 从研究目的来分，可以从增殖、转移、耐药三个角度来分析： 1、研究肿瘤细胞增殖 细胞准备：GeneA敲减慢病毒感染细胞扩增至需要的细胞量。分为：空白对照组、阴性对照组、实验组。 取Balb/c裸鼠，雄性，6周龄，每组10只，适应一周后进行肿瘤细胞注射。
XXX细胞消化离心后制成单细胞悬液，计数后取适量的细胞用PBS悬浮，在Balb/c裸鼠侧腹部皮下接种。每只接种2×106个细胞，注射体积为100 μL。此后，每隔5天测量注射部位肿瘤的体积。30天后裸鼠小鼠腹腔注射80 mg/kg 戊巴比妥钠，小鼠麻醉后置蓝色背景布上拍照（侧卧位，接种部位朝上），小鼠颈椎脱臼处死，取出肿瘤称重，将肿瘤置蓝色背景布上拍照，肿瘤一分为二，一份4%多聚甲醛固定，待后续病理分析，一份-80℃冻存。 2、研究肿瘤细胞转移 肿瘤转移的模型包括两大类：体外(浸润模型)和体内(转移模型)。体外(浸润模型)：了解肿瘤细胞对周围相连组织的侵润性。体内模型主要研究肿瘤细胞的转移性即肿瘤细胞在远端组织形成病灶的能力。 2.1. 体外(浸润模型) 例：浸润型脑胶质瘤动物模型的建立 方法：取若干只Balb/c免疫缺陷裸鼠，将分离和鉴定并转染携带绿色荧光蛋白的脑胶质瘤干细胞立体定向法行小鼠颅内接种，每组10只。小鼠麻醉后头部正中切口，剥离骨膜后钻孔(坐标是冠状缝后0.5 cm，矢状缝右侧2.5 cm) 。取2 μL胶质瘤干细胞以1×104 cells /只小鼠的剂量，经微量注射器缓慢注射入鼠脑纹状体内(深度是2.5 ～3 mm) 。在确定的时间点处死一部分动物进行荧光( 立体荧光显微镜下) 病理证实和比较，同时检查脑胶质瘤干细胞的体内生长特征以及干细胞标志物等。 2.2. 体内(转移模型)
实验动物的等级划分及实验动物房的设计规范
——您身边的实验室工程专家【特殊实验室】实验动物的等级划分及实验动物房的设计规范 一、实验动物的分类 实验室根据实验动物微生物控制标准，可将实验动物分为四级，分别是普通动物、清洁动物、无特殊病原体动物、无菌或栖生动物。 一级普通动物（CV），系指微生物不受特殊控制的一般动物。要求排除人兽共患病的病原体和极少数的实验动物烈性传染病的病原体。为防止传染病，在实验动物饲养和繁殖时，要采取一定的措施，应保证其用于测试的结果具有反应的重现性（即无论不同的操作人员，在不同的时间，用同一品系的动物按规定的实验规程所做的实验，都能获得几乎相同的结果）。二级清洁动物（CL），要求排除人兽共患病及动物主要传染病的病原体。 三级无特殊病原体动物（SPF），要求到二级外，还要排除一些规定的病原体。其除菌与灭菌的方法，可使用高效空气过滤器除菌法、紫外线灭菌法、三甘醇蒸气喷雾法及氯化锂水溶液喷雾法。 四级无菌动物（GF）或栖生动物（GN），无菌动物要求不带有任何用现有方法可检出的微生物。栖生动物要求在无菌动物体上植入一种或数种已知的微生物。 二、四类实验动物的病理检查标准 在病理学检查上，四类实验动物也有不同的病理检查标准。 一级外观健康，主要器官不应有病灶。 二级除一级指标外，显微镜检查无二级微生物病原的病变。 三级无特殊病原体动物。无二、三级微生物病原的病变。 四级不含二、三级微生物病原的病变，脾、淋巴结是无菌动物组织学结构。 三、动物房设计管理上的要求 对不同级别的实验动物在动物房设计上和管理上则有不同的要求。 无菌、已知菌以及无特殊病原体动物都需要在无菌或尽可能无菌的环境里饲养，这种环境，目前国际上通用称为屏障环境，即用一道屏障把动物与周围污染的环境隔开，就如胎鼠在母鼠子宫内一样。这种环境从控制微生物的角度分为隔离系统、屏障系统、半屏障系统、开放系统和层流架系统等五大类。 A隔离系统 是在带有操作手套的容器中饲养动物的系统，用于饲养无菌动物和栖生动物。内部保持按微生物要求的100级的洁净度，但其设置的房间及操作人员不必按无菌室考虑。 B屏障系统 把10000～100000级左右的无菌洁净室作为饲养室，主要用于无特殊病原体动物的长期饲养和繁殖。入室施行严格管理，如淋浴、换贴身衣服等。
如何设计动物实验
如何设计动物实验 一般来说，动物实验的研究工作应该明确描述，研究的目的和/或者需要验证的假说。1、选择特定动物模型的原因。2、动物种、品系、来源和类型。3、每个独立实验步骤的详细描述，包括研究设计和使用动物数量。4、数据分析所用的统计学方法。动物实验设计有重要的意义的意义1、正确的动物实验设计对提高科学研究质量、发表高水平的学术论文非常重要2、目前许多动物实验质量不高。3、一个好的实验设计，对统计学分析来说帮助很大，可以使问题变得更加容易解决4、一个不正确的实验设计，导致结果信息无用。实验设计的主要目的一是保证所测变量的任何差异是由处理造成的，而不是其他非对照变量引起；另一个目的是通过控制确定的变量在尽可能小的范围内，减少所测反应的变异性，这样对处理效应的评介更准确。我将它分为以下几个步骤 一、实验设计的最初步骤 1、查阅文献 A: 明确研究焦点B：明确方法 C：明确模型D：评估实验 2、科研方法 A：观察和描述科研中的现象B：系统的陈述问题和解释问题的假说C：利用假说预测新的观察结果D：验证假说 3、问题的陈述、研究的目标和提出假说 ?问题提出：实验将说明的问题是什么，意义 ?研究目标：总目标，特殊问题 ?假说：对每一个至少给出两个预计结果 ４、动物模型的确定 ?使用系统发育水平最低的动物，符合３Ｒ原则 ?使用的动物具有研究要求种属或品系专一特点，特定研究目的必须特点?实验期间动物模型维持条件 ?动物模型来源渠道 ?最终确定动物模型前征询实验动物兽医意见 ５、实验合作者的确定 ?在研究的过程中，明确应用的试验技术操作，并确认具有相应操作专长的人员来完成。 ?让合作者了解实验：设计、计算、样品收集．．．． ?实验动物中心可以提供动物实验有关技术操作培训及昂贵设备服务 二、动物实验设计 １、研究方案 根据问题、目标、假说，提出实验操作安排的计划并文字化 考虑的方面： A：动物模型持续时间B: 模型中预期疾病的进程（决定测定的最适时间点） Ｃ：人员参加的时间，实验花费Ｄ：给药方法 Ｅ：风险评估Ｆ：统计学方法选定 ２、实验单元 可以是一个动物，也可以是一组动物群体
动物实验室设计规范
动物实验室的设计布局是规范工作流程和人员、动物、物品等相互关系和移动，并确保实验室安全，此外，对形成屏障结构具有重要意义。本文将从三个防护区（外围防护区、建筑防护区、饲养防护区）和四条控制路线（人员控制路线、动物控制路线、物料控制路线、废物控制路线）等方面详细介绍。 动物实验室 1.外围防护区 外围防护区主要指建筑外围的区域。鉴于实验动物饲养的特殊性，外围可能需要设监控设备、人员进出的控制、卫生防护带等。如果设施内从事涉及高致病性病原微生物的动物实验活动，须考虑设施的安保要求，以及一旦发生意外事故后对周围控制区域、疏散和救援的需求。外围的防护主要通过设置栅栏、围墙等方式实现。鉴于景观的需求，使用栅栏更显人性化。栅栏不应低于2米，栏杆的间距不大于10厘米，栏杆要坚固、易于清洁。 此外，需要设置照明系统、报警系统和视频监控系统，更高级别的防护包括地下的电磁场报警、红外线报警和运动物体报警、低压电击等措施。防护区内一般不布置绿化，以免影响监控，同时也可减少昆虫、老鼠等。为保证正常的外来服务，如邮件、送货、访客等，通过风险评估决定是否需要建设安检、特殊通道、中转站等措施。对控制区域应设置警示牌，避免无意闯入。对防护要求高的设施，
应保证外来车辆不能靠近设施，距离保持至少30米。在外围防护区，宜设专用的外部人员和车辆入口。 2.建筑防护区 建筑防护区主要指动物实验室所在的建筑。建筑内有动物设施和其它设施之分，其它设施可以与动物设施有关，也可以无关;动物设施可以就是建筑的主体，也可以是其部分。需要考虑的主要问题是动物设施环境与建筑物内其它区域环境的相互隔离与相互关系，人员、动物、物料和废物的进出路线。使用时，动物设施及其相关的设施宜集中布置，从事感染动物活动的设施需要单独布置。建筑除主入口外，要考虑设置动物、大型设备和废物的出口和入口。 出于安全考虑，必须评估和明确对门窗的性能要求。在合理控制数量的前提下，对门窗的大小、形状、耐冲击能力、耐火性、保温性、光学特性等均要有要求。可能的风险来自于异常的气候、自然灾害、人为破坏、设备异常等，如，通风系统的异常可造成室内压力急剧变化，造成门窗损坏。 3.饲养防护区 饲养防护区设施基本的形态是由入口、走廊(或通道)、功能间和出口组成。走廊是连接各功能区的纽带，各种通道发挥快捷、隔离、消毒等作用。实验动物设施的特点是不相容的因素多，需要利用走廊和通道对不相容的因素作合理的安排。走廊的形式包括双走廊、单走廊、U型走廊、环廊等。设施内部的安排应根据工作流程和利于控制风险的原则确定，此外，还要考虑工程可行性和日常维护的方便性，可以组成相对独立的单元。 1.人员控制路线 进出动物实验室的人员主要包括动物管理人员、动物实验人员和清洁人员。此外，还有送货人员、维护人员、来访人员、检查人员、安保人员等。为保证各类人员的进出有序，需要合理设计路线和设置不同级别的物理限制。人员的移动具有主动性，可以到达任何区域，要通过SOP和物理控制措施管理人员的移动。
二十种常见实验动物模型
二十种常见实验动物模型 一、缺铁性贫血动物模型 缺铁性贫血（iron deficiency anemia，IDA）是体内用来合成血红蛋白（HGB）的贮存铁缺乏，HGB合成减少而导致的小细胞低色素性贫血，主要发生于以下情况：（1）铁需求增加而摄入不足，见于饮食中缺铁的婴幼儿、青少年、孕妇和哺乳期妇女。（2）铁吸收不良，见于胃酸缺乏、小肠粘膜病变、肠道功能紊乱、胃空肠吻合术后以及服用抗酸和H2受体及抗剂等药物等情况。（3）铁丢失过多，见于反复多次小量失血，如钩虫病、月经量过多等。 IDA是一种多发性疾病，据报道，在多数发展中国家，约2/3的儿童和育龄妇女缺铁，其中1/3患IDA，因此，研究IDA的预防和治疗具有重要的意义。在这些研究中，缺铁性贫血的动物模型（Animal model of IDA），又是实施研究的基础工具。常见的IDA动物模型的构建技术如下： 实验动物：一般选用SD大鼠，4周龄，雌雄不拘，体重65g左右，HGB≥130g/L。 建模方法：低铁饲料加多次少量放血法。低铁饲料一般参照AOAC 配方配制，采用EDTA浸泡处理以去除饲料中的铁，饲料中的含铁量是诱导SD大鼠形成缺铁性贫血模型的关键，现有研究表明，饲喂含铁量<15.63mg/Kg的饲料35天，SD大鼠出现典型IDA表现，而饲喂
含铁40.30mg/Kg的饲料SD大鼠出现缺铁，但并不表现贫血症状。建模时一般采用去离子水作为动物饮水，以排除饮水中铁离子的影响。少量多次放血主要用于模拟反复多次小量失血导致的铁丢失，还可以加速贫血的形成。放血一般在低铁饲料饲喂2周后进行，常用尾静脉放血法，1～1.5ml/次，2次/周。 模型指标：（1）HGB≤100g/L；（2）血象：红细胞体积较正常红细胞偏小，大小不一，中心淡染区扩大，MCV减小、MCHC降低；（3）血清铁（SI）降低，常小于10μmol/L，血清总铁结合力（TIBC）增高，常大于60μmol/L。 需要指出的是，以上模型不能用于铁吸收不良相关IDA的防治研究。根据具体的研究需要，也可以适当调整建模方法。 二、白血病动物模型 用免疫耐受性强的人类胎儿骨片植入重症联合免疫缺陷病(SCID)小鼠皮下，出于人类造血细胞与造血微环境均植入小鼠，建立具有人类造血功能的SCID小鼠模型称为SCID－hu小鼠。再将髓系白血病患者的骨髓细胞植入SCID－hu小鼠皮下的人类胎儿骨片内，植入的髓系白血病细胞选择性生长在SCID－hu小鼠体内的人类造血微环境中，即为人类髓系白血病的小鼠模型。SCID小鼠是由于其scid所致。T、B淋巴细胞功能联合缺陷，这种小鼠能接受人类器官移植物。 造模方法：
动物实验方案申请书
动物实验方案申请书 中国科学院上海生命科学院生物化学与细胞生物学研究所（实验动物管理委员会批准不超过两年期的《动物实验方案申请书》）动物实验方案名称: 动物实验方案编号(由实验动物管理委员会填写) : 动物实验方案研究期限: 动物实验方案首次提交日期: 动物实验方案更新日期（方案到期前个工作日内）: 以下内容由实验动物管理委员会填写 实验动物管理委员会审查意见： 实验动物管理委员会决定: 实验动物管理委员 兽医（签章）：日期: 实验动物管理委员会（签章）: 日期:
★如实验动物管理委员会在审批过程中发现，该实验中有涉及生物安全及伦理审查方面的内容，则由实验动物管理委员会各成员在充分讨论后填写本页内容送生物安全与伦理委员会进行审批： 实验方案中涉及到生物安全及伦理审查方面的内容是： 该内容可能带来的潜在的生物安全风险及伦理考虑点主要是: 如该问题未能得到有效的管理监督及控制,可能的严重后果是: 基于以上原因,可采取的应对方式包括有: *** 动物实验方案参与人员*** 研究组长 姓名: 单位： 办公电话: 移动电话： 电子邮件：传真：
学位：职位： 请在下列方框内填写是或否 [] 是否有参加过实验动物及动物实验的相关培训？ [] 是否有从事动物实验或动物模型的工作经历、经验？ [] 是否有参加过实验动物导致的意外伤害及生物安全培训？ 请简要描述本人与该实验方案中所用的实验动物及动物模型有关的工作经验或培训经历： 紧急联系人 姓名: 单位： 办公电话: 移动电话： 电子邮件：传真： 学位：职位： 请在下列方框内填写是或否 [] 是否有参加过实验动物及动物实验的相关培训？ [] 是否有从事动物实验或动物模型的工作经历、经验？ [] 是否有参加过实验动物导致的意外伤害及生物安全培训？ 请简要描述本人与该实验方案中所用的实验动物及动物模型有关的工作经验或培训经历： 其他人员(如涉及多于一人参与本实验方案，请按需要拷贝并增加本页，至完成所有实验人员信息的填写) 姓名: 单位： 办公电话: 移动电话： 电子邮件：传真： 学位：职位： 请在下列方框内填写是或否 [] 是否有参加过实验动物及动物实验的相关培训？ [] 是否有从事动物实验或动物模型的工作经历、经验？ [] 是否有参加过实验动物导致的意外伤害及生物安全培训？
实验动物房总体建筑设计原则SICOLAB
医学实验动物房设计（详细）SICOLAB 实验动物房总体建筑设计原则 根据国家科委《实验动物管理条例》、国家卫生部《医学实验动物管理实施细则》的具体要求，结合广西的具体情况，目前广西尚未有能够提供合格的ＳＰＦ级实验动物的单位，而我所是药品检验单位，国家科委要求2000年底前药品检定应使用清洁级实验动物。因此，我所新建的实验动物中心设计的原则是以建立动物饲养繁殖和实验饲养相结合的综合基地，该工程的环境与设施要求达到ＳＰＦ级标准。该中心的设计具有小规模、起点高、设计完善、布局设置合理，可使用面积大，利用率高，具有节能、节资等特点 平面布局设计加层新建的十层楼长48ｍ，宽103ｍ，楼层高为38ｍ;其中十楼西侧长24ｍ暂作普通级设施使用，十楼东侧长24ｍ为ＳＰＦ级设施即ＳＰＦ级实验动物中心，十一楼为饲料加工房和空调、风机机房。SPF级实验动物中心内设置有货物电梯、淋浴室1间，2套更衣1、更衣2和风淋室，洁净物品储藏室1间，洗刷消毒室1间，清洁走廊和亚清洁走廊，隔离观察室(检疫室)1间，饲育室6间及实验室2间，平面布局采用三走廊方式，中间走廊为清洁走廊，二边走廊为亚清洁走廊，清洁真走廊与亚清洁走廊之间为饲育室和实验室。饲育室区和实验室区各走廊均有密封门严格隔开，饲育室区和实验室区分别设置有独立的更衣1、更衣2和风淋室，以便各区域的人员运行各行其道，防止交叉感染。 3 空调通风系统 31 空调系统 311 空调设计及ＳＰＦ级环境设施设计的主要参数：温度：夏季24℃±2℃，冬季22℃±2℃;湿度：ＲＨ(50±10)%;光照度：不小于300～350ＬＸ，明暗比12∶12ｈ，日光灯照明，且设紫外灭菌灯;通风：采用全新风，顶棚送风，四角回风;净化度：1万级(每立升空气中粒径大于05μｍ的尘埃粒子数小于或等于350个);噪音：低于50ｄＢ;氨浓度：低于20ｐｐｍ;正压控制：清洁走廊、饲育室(或实验室)、亚清洁走廊、外环境的压力梯度20Ｐａ。 312 空调系统的设计和选用空调系统是实验动物屏障设施中重要设备，主要起调温调湿作用。由于ＳＰＦ级实验动物中心采用全新风，屏障系统内部与外环境之间换气量大，空调系统在运转时消耗能源相当大，因此，在设计ＳＰＦ级实验动物设施时必须考虑设备的一次性投资和运转的维持费用两方面问题。我所经过大量调查，采用清华同方股份有限公司生产的ＦＳＬＲ60型风冷模块式冷热水机组空调2台，每台机组制冷量为66ｋＷ，输入功率为231ｋＷ。2台机组可依据使用情况自动控制十楼普通级环境(约24ｍ2)和ＳＰＦ级实验动物中心环境(约250ｍ2)的温度和湿度。该机组具有以下优点： ①无需专用机房和水塔，使用方便 ②节省能源，降低维持费用。 ③管理方便。空调机组的工作状态及送风状态都在远程控制上显示及控制，利于使用和管理。 ④维修方便。该机组为模块式组合，可以在工作状态不断电情况下进行维修，更换元件简易，方便;且主要元件均为美国进口元件，不易损坏。 32 通风系统送风系统采用清华同方股份有限公司生产的变频风机，通过该机设置的集成模块可以调节风速和风量，节省运转费用。全新空气经空调净化箱初效、中效过滤、恒温后，由变频风机加压，通过送风管道从各室顶部中央600ｍｍ×600ｍｍ或400ｍｍ×400ｍｍ高效过滤器送入各室内、清洁走廊和亚清洁走廊等。排风系统由2台排风机(其中一台为备用机)组成，在各室四角壁及清洁走廊、亚清洁走廊与各室隔墙处均设置回风口，废气从回风口经排风管道在机房排风箱内集中外排。4 建筑室内净化装饰工程及电气设备工程 41 建筑室内净化装饰工程室内四壁墙体和吊顶顶壁均采用50ｍｍ厚保温泡沫夹心彩钢板，其外形美观，隔音、保温、阻燃、密闭性能较好。室内竖角和横角选中100铝合金圆弧。进气、排气管道位于技术杂层，室内装饰高23ｍ，技术夹层高15ｍ;内门均采用彩钢夹心板密封推开门，门上设置观察窗，各室内隔墙之
动物实验室设计方案
动物实验室设计布局要求与规范 动物实验室包括普通的动物实验室规划设计和洁净动物实验室规划设计，一般由前区、饲养区、动物实验室、辅助区组成。 1.动物实验室布局的设计:计符合实验室标准和使用要求的产品布局规划;确定实验室内产品的类别规格数量。 2.水电预留位置的设计:在确定了平面布局后，提供全面水电位置图，方便客户工程精准施工。 3.通排风系统的设计:在实验室新建或改造项目中，在规划阶段就参与其中，派专业的工程师到现场与相关的人员联系，根据实验室内通风载体的数量(如通风柜、集气罩、排气罩)设计出完整的通风方案;方案内容包括：建筑内预留排风管井的位置及尺寸，管道的分布及规格。确保通风的载体使用时的风速、排风量、噪声等指标符合国家标准，并与建筑内的空调、消防、照明等线路互不干绕。 4.气路管道系统的设计:根据实验对气体供应的需要，结合现场布局，提供供气系统设计方案，在保证气体纯度的同时，精密调控气体的压力和流量。 5.环保的设计:提供完善的废气净化处理解决方案，使实验中产生的废气得到有效的解决，符合环保的排放指标。 6.产品个性设计:根据实验流程及人员的特殊要求，调整产品结构和功能，设计出个性的产品以满足不同用户的需要。 7.安全设施的设计:按照国际标准，在实验室合理配置安全柜、毒品柜及紧急事故淋洗器，急救洗眼器等安全设施。 动物实验室的级别： 一级普通动物(CV)，系指微生物不受特殊控制的一般动物。要求排除人兽共患病的病原体和积少数的实验动物烈性传染病的病原体。为防止传染病，在实验动物饲养和繁殖时，要采取一定的措施，应保证其用于测试的结果具有反应的重现性(即无论不同的操作人员，在不同的时间，用同一品系的动物按规定的实验规程所做的实验，都能获得几乎相同的结果)。 二级清洁动物(CL)，要求排除人兽共患病及动物主要传染病的病原体。 三级无特殊病原体动物(SPF)，要求到二级外，还要排除一些规定的病原体。其除菌与灭菌的方法，可使用高效空气过滤器除菌法、紫外线灭菌法、三甘醇蒸气喷雾法及氯化锂水溶液喷雾法。 四级无菌动物(GF)或悉生动物(GN)。无菌动物要求不带有任何用现有方法可检出的微生物。悉生动物要求在无菌动物体上植入一种或数种已知的微生物。 在病理学检查上，四类实验动物也有不同的病理检查标准。 一级外观健康，主要器官不应有病灶。 二级除一级指标外，显微镜检查无二级微生物病原的病变。 三级无特殊病原体动物。无二、三级微生物病原的病变。
动物试验模版
一. 背景： 本次动物实验相关疾病介绍、国内外相关治疗及研究的现状及结果（含临床、基础）、相关引文摘要等。 二、实验所用器械简介： 三、实验目的 1、使用猪或其他适宜动物为实验模型, 按照临床要求对产品进行模拟 使用，对* *器械的* *性能、* *效应进行测试。 2、通过动物实验取得数据和经验, 以便为产品的临床使用撰写详尽的使 用指南。 3、确定* * 器械置入猪后的最长可回收天数, 以便为临床使用的最长 可回收时间提供参考。 4、研究* *器械置入* *天后的可回收性, 以回答以往实验中未能解决 的* * 器械在置入* * 天后是否可取出的问题。 四、实验模型和材料 1、实验模型 （1）.动物模型：猪，体重：25?35KG （2）.体外模型：拟采用透明塑料软管作成的20mm 25mm两 种直径的下腔静脉模型。 2、材料： （1）* *器械采用XX公司研发生产的器械。 （2）其他手术配套器械采用临床通用器械。 3.过程要求：
本实验开始前必须取得动物道德委员会的许可（注：国外 有此要求，国内仅少数几家大医院有动物伦理委员会） 五.实验设计 动物数量及分组方法：实验动物共22头，在置入器械后分为A和B两组.A组动物采用介入方法取出滤器，B组动物采用外科方法经腹切开方法取出滤器.下腔静 脉滤器置入后饲养观察时间为7、10、12、14、16、20、30、60和90天，具体分组方法见下表。 分组（头） 时间（天）- A B 7 1 1 10 1 1 12 3 1 14 3 1 16 1 1 20 3 1 30 0 2 60 0 1 90 0 1 六、实验方法： 1、随机选取实验动物以1:1的比例进行* *实验，并记录* * 总结出的操作要求。7?20天实验用以观察器械置入后的可回收期，30、60、90天实验用以观察器械置入后的长期通畅情况。 2、所有动物器械取出前应造影复查，并与器械置入时的资料进行对比，判断器
动物实验设计
口服避孕药预防化疗对大鼠卵巢损伤的研究 研究背景 卵巢早衰(premature ovarian failure POF)系指妇女在40岁以前绝经，常表现为雌激素水平降低引起的月经紊乱、不孕、围绝经期综合征等一系列症状。POF病因复杂，目前仍不清楚，化疗远期毒副作用是其中之一。随着化学毒性药物在肿瘤及自身免疫疾病的广泛应用，其导致的性腺功能损害成为研究新热点，其中以环磷酰胺(cyclophosphamide，crx)为代表的烷化剂引起的卵巢功能损害研究较多，但其作用机制仍不清楚。一些研究显示，CTX可直接损伤卵巢颗粒细胞，并主要作用于有丝分裂活跃的卵泡，而静止的生殖细胞呈低度敏感。另有学者提出，化疗期间应用口服避孕药抑制卵泡发育，能够减少化疗对卵巢的损害，依据是化疗药物损伤卵巢的机制和口服避孕药的作用机理，即通过雌孕激素负反馈抑制下丘脑．垂体一卵巢轴，从而抑制卵泡发育，储存原始卵泡，保护卵巢储备功能，减少卵巢损伤。相关研究也证实口服避孕药能够降低及预防化疗对卵巢的损伤，促进化疗后卵巢功能甚至是生殖功能的恢复。但也有学者持不同观点，结论尚有争议。本研究旨在探讨化疗期间应用口服避孕药能否保护卵巢功能，以确定口服避孕药的有效性。 目的 本文采用阴道涂片法监测大鼠动情周期，放射免疫法和组织切片法，检测大鼠血清雌二醇(E2)水平、卵泡刺激素(FSH)水平、卵巢重量及卵泡数量，并通过统计学分析，比较实验前后各组实验指标变化，探讨口服避孕药在化疗期间有否起到保护卵巢的作用及其相关机制。 材料与方法 1．SPF级近交系雌性Wistar大白鼠，3月龄，体重1 809～2009。喂食SPF级鼠饲料及净化水，室温20℃~25℃，相对湿度450／0-．55％，每日光照12h，饲养1周熟悉环境后，每日清晨9：00行阴道细胞涂片，显微镜下观察动情周期，选用有正常动情周期的大鼠进入实验。口服避孕药(OC>．—-．达英一35(35pg炔雌醇／2mg醋酸环丙孕酮)。环磷酰胺(CTX)，规格0．29x10支。 2．动物实验：75只Wistar雌性大鼠随机分为5组： ①空白对照组：不予任何药物处理； ②CTx组：负荷剂量50 mg／kg腹腔注射，之后8 mg／(kg·d)腹腔注射，连续14d； ③oc组：8．7599炔雌醇／0．5mg醋酸环丙孕酮(溶于lml生理盐水)，灌胃，连续25d； ④联合治疗I组：同时给予CTX和OC，连续15d，给药方法同②、③组； ⑤联合治疗II组：先连续10d给予OC灌胃，用药剂量同③组；第11d起加用CTX，给药方法、时间及剂量同④组。3．采用阴道涂片法监测大鼠动情周期，放射免疫法测定E2、FSH浓度。所有卵巢标本均经石蜡包埋，连续切片，苏木素．伊红(HE)染色。 从实验开始到结束，各组大鼠每天行阴道涂片，并于给药结束前，每隔5天(相当于大鼠1个正常动情周期)，于动情间期测定各组E2、FSH浓度；停药后第15、30天(相当于3及6个正常动情周期)，测定各组E2、FSH浓度。另外，停药当天、第15、30天，分别处死各组1／3大鼠，比较卵巢重量、卵泡数量变化。 4．统计学处理采用SPSSl0．0软件包检验分析，数据以均数士标准差表示，采用的具体统计学方法有单向方差分析、重复测量、析因分析，两两比较采用SNK及LSD法，所有结果均P<0．05具有统计学意义。 数据记录与结果分析 1．各组大鼠E2、FSH浓度及动情周期变化 (1)大鼠E2、FSH行重复测量分析，分别比较各组、各时间点E2、FSH，分析差异是否有统计学意义，实验分组和时间是否有交互作用。 (2)空白对照组：于动情间期测定E2和FSH。观察阴道涂片是否呈正常大鼠的动情周期改变。 (3)CTX组：观察从给药第5天至实验结束，E2和FSH的变化情况，与同期其余4组E2、FSH分别比较，并分析计算差异是否有统计学意义。记录阴道涂片该组大鼠在给药的第几天出现持续不排卵现象，停药多少天后恢复正常动情周期。 (4)OC组：观察并比较从给药第5天至停药第15天，以及停药第30天，该组E2、FSH浓度与同期空白对照组的高低，计算差异是否有统计学意义。记录阴道涂片该组大鼠在给药的第几天出现持续不排卵现象，停药多少天后恢复正
THU-LARC清华大学实验动物中心
Laboratory Animal Research Center of Tsinghua University Requisition Form for Cas9/sgRNA embryo injection Services Date Received (LARC Use Only)______________ 以下请同学们填写： Principle Investigator______________ Contact Person____ _ _______ Contact Phone ______________ Contact E-mail Type of knockout/knockin mice (please check “√”) __ KO ___ CKO ___Knockin Gene to be KO/KI_______________ GeneBank ID gRNA construct _______________ mRNA Concentration_______ _ Cas9 construct________________ mRNA Concentration_____ __ ___ _ Purification method_____ ____ ____ Resuspension buffer used (MUST be RNAase free)_ ____ Please attach a labeled photograph of the gel demonstrating the quality of the mRNA： 假如gel photo表明了有可能有降解，请重新转录、纯化： 说明： 1.中心没有存放和处理RNA 设备，每次注射当天提前通知送注射样品，请当天上午送样之前一定要 经过跑胶验证RNA质量，是否降解，同时发邮件给我们验证胶图。下面胶图对照请参照（左KI 右KO）