肝细胞简易分离、培养和鉴定方法初探

造血干细胞分离培养方法

一造血干细胞分离 （一）小鼠骨髓采集与单个核细胞悬液的制备 1 HES(羟乙基淀粉)沉淀法 抽取髓液500 m L按4∶1比例加入HES，自然沉降红细胞后，分离上清。4℃400 g离心10 min得细胞沉淀物，以1 %白蛋白盐水液洗涤细胞2次。 2 percoll液密度梯度离心法 ①按体积比为(1.5～2)∶1在骨髓液中加入淋巴细胞分离液。4℃,1 5 00 r / min，离心20 min。取单个核细胞层，以1%白蛋白盐水液洗涤3次。 ②取鼠股骨和胫骨, 在两头关节处切开骨骼, 反复用培养基冲洗骨髓腔, 随后小心地逐滴将细胞悬液加在淋巴细胞分离液上, 2 000 r / min 离心20 min。吸取离心后相交液面处的白色细胞层即为单个核细胞。 3 Ficoll分离法 方法一在15ml分离管中加7.5ml比重为1.017的Ficoll液，缓慢移入等量骨髓细胞悬液，整体平衡后低温离心2000r/min×20min,吸取白细胞层，用RPMI1640液亲清洗后离心2000r/min×10min,取白细胞层加RPMI1640液到10ml制成造血干细胞悬液样本。 方法二取无菌离心管1支，预先添加3mlFicoll(与骨髓细胞悬液体积1:1)，用滴管取单细胞悬液3ml，沿离心管壁小心缓慢叠加于分离液面上，注意保持清楚的界面，室温下水平离心2000rpm×20分钟，（后续在冰上进行）用毛细吸管插到云雾层，小心吸取单个核细胞，置入另一短中管中，加入5倍以上体积的磷酸缓冲液PBS，1500rpm×10分钟，L-DMEM 洗涤细胞两次，每次以1000r/min离心10min，去上清液。（除第一步的室温离心外，其余为低温离心）。 取骨髓细胞悬液的方法是：取出大鼠腿骨将肌肉尽可能剔除，并用PBS缓冲液冲洗干净。在超净台中腿骨浸泡在PBS缓冲液中5min，之后在两头关节处切开骨骼, 反复用PBS 缓冲液冲洗骨髓腔，从而得到骨髓细胞悬液。 （二）Linc-- kit+造血干细胞的分离纯化。 去除Lin+细胞( 负筛选) : 带有生物素的混合抗体标记成熟细胞; 抗生物素的磁珠吸附抗体标记的成熟细胞, 包括T , B淋巴细胞、粒细胞、巨噬细胞以及它们的定向前体细胞; 细胞通过磁场不被柱子吸附的包括造血干细胞和骨髓间质干细胞。收集CD117+细胞( 正筛选)：带有CD117抗体的磁珠吸附CD117+细胞, 细胞通过磁场被柱子吸附的CD117+细胞(具体操作步骤参照M iltenyi公司MACS手册)。 （三）根据细胞表面CD34+抗原进行分离纯化 流式细胞仪检测骨髓CD34+细胞：取50μL细胞悬液, 加入2.5μL CD45- FITC和10μL CD34- PE充分混合, 避光孵育15 min。以PBS液洗涤并加多聚甲醛固定液450μL固定, 上机检测。

体外正常成人肝细胞分离培养的经验

?经验交流? 体外正常成人肝细胞分离培养的经验Ξ 马巧玉,郝　飞,王宇明,宋志强,刘国栋 (第三军医大学西南医院全军感染病中心,重庆400038) 摘　要:目的　为进一步研究病毒性肝炎免疫发病机制、临床治疗和疫苗研制提供最接近自然状态的理想细胞模型。方法　体外二步灌流法分离正常成人肝细胞并用1640培养液维持培养1个月以上。结果　分离较多量正常成人肝细胞可在体外存活1个月以上。结论　正常成人肝细胞可在体外被分离培养以供各种肝病基础和临床研究。 关键词:正常成人肝细胞;细胞模型 中图分类号:R44611文献标识码:B文章编号:167128348(2003)0921228202 各种肝脏疾病(特别是病毒性肝炎、原发性肝癌)在我国发病率高,无可靠治疗方法。因此,迫切需要在肝脏疾病的发病机制及治疗方面有所突破。近年来,国内外有许多关于用动物肝细胞、胎儿肝细胞及肿瘤细胞进行肝脏疾病研究的报道,但这些细胞与自然状态的成人肝细胞存在较大差别。我们在体外分离培养正常成人肝细胞,以期建立与自然状态最为接近、更适宜于进行肝脏疾病的发病机制和防治等研究的细胞模型。1　材料与方法 111　正常成人肝组织标本,共10例,其中取自意外死亡之3例成年男性(19、24、35岁),1例成年女性(27岁)肝脏;4例成年男性(42、47、55、62岁)胆囊结石或胆囊炎手术时肝脏活检标本;均无肝病史,临床生化和病理检查无异常发现;另有1例成年男性(36岁)肝脏血管瘤标本;2例成年男性(53、58岁)肝癌癌旁组织标本,各种肝炎病毒及AIDS标志物检测均阴性。112　小牛血清　由本校试剂中心提供,用前56℃×30min灭活补体。 113　主要试剂　(1)PRMI21640细胞培养基:购自美国GIB2 CO公司;(2)胶原酶、胰蛋白酶抑制剂:由美国SIGMA公司提供;(3)分散酶:购自德国宝灵曼公司。 114　实验方法 11411　正常成人肝细胞分离　采用体外灌流法分离正常成人肝细胞[1、2]。取上述成年人肝脏2～100g,将肝组织置于培养皿中,用37℃前灌流液自残存血管中反复灌注,至大部分肝脏呈现灰白色,用37℃,0105%的胶原酶(含011分散酶)反复注入残存血管,剪碎肝组织,37℃振荡,消化30min,三层无菌沙布过滤,450r/min×4min离心,弃上清,加入PRMI21640培养液混匀,450r/min×4min离心,弃上清,反复3次,最后用含10%小牛血清1640培养液(完全培养液)按细胞密度1×106ml 稀释后接种至25ml培养瓶和加爬片的24孔培养板,置于37℃,5%CO2培养箱孵育。 11412　正常成人肝细胞培养　24h后换液,弃去含漂浮细胞的培养液,按上述比例,加入PRMI21640培养液,此后每2～3d 更换完全培养液1次,维持培养1个月以上。于培养第10、20、30天分别计数肝细胞数,台盼蓝染色确定肝细胞存活率。2　结 果 211　细胞分离　由于肝组织为非全小叶标本,前灌液和胶原酶灌注仅可到达部分肝组织,分离效果较差,加入分散酶后可提高分离效率,分离后用台盼蓝染色显示肝细胞存活率约50%～90%。 212　细胞培养　4例胆囊手术后肝组织分离显示肝细胞少,台盼蓝染色显示肝细胞存活率60%,贴壁差(<50%),碎片多,分离培养1周内均放弃;肝血管瘤标本RBC多,肝细胞相对较少,贴壁差,分离后次日放弃;2例肝癌癌旁组织标本分离肝细胞较多,台盼蓝染色肝细胞存活率仅50%,生长差,贴壁少,细胞碎片迅速增多,于分离后3～4d放弃。4例意外死亡捐献的肝组织标本,分离细胞后用台盼蓝染色,肝细胞存活率约90%.24h后约70%～80%细胞贴壁,贴壁细胞前呈圆形,后呈多角形,单核,生长良好,加感染血清组与对照组细胞形态无明显差异。于培养第10、20、30天分别计数肝细胞数台盼蓝染色判断肝细胞存活率,结果见表1。 表1 正常成人肝细胞培养的计数、活力鉴定d肝细胞计数肝细胞存活率 10 6.79±0.21×105/ml>90% 20 5.56±0.24×105/ml>60% 30 4.47±0.32×105/ml>60% 3　讨 论 目前,在肝脏疾病特别是病毒性肝炎的研究中,用动物肝细胞、肿瘤细胞、人胎肝细胞等作为细胞模型最常见,但这些细胞模型与自然感染状态下的成人肝细胞是否有相似的感染方式、途径及生物学特性尚无定论。因此,我们建立了正常成人肝细胞分离培养的细胞模型,以期在最接近自然感染状况的情况下进一步研究肝疾病的发病机制、病理改变、临床治疗及疫苗效果。 目前分离肝细胞多采用二步灌流法。因为我们所取用肝组织为非全小叶标本,灌注时,灌注液不能到达部分肝组织,加之用胶原酶分离正常成人肝细胞效率较分离胎肝细胞、动物肝细胞低,手术中取活检肝组织标本小,分离肝细胞少,难以生长,肝血管瘤组织RBC太多,灌注时不易去除;肝癌癌旁组织均有慢性炎症,纤维化明显,分离培养有较大困难,但意外死亡捐献之肝细胞标本较大,献者年轻,肝脏纤维化程度低,均分离 Ξ基金项目:国家自然科学基金资助项目(39770682)

间充质干细胞培养方法

间充质干细胞培养方法 1、间充质干细胞MSＣ基本形态 2、干细胞应用与干细胞调控。 3、间充质干细胞MSC生长过程 ４、间充质干细胞MSC培养得合适气体环境 5、细胞培养板得选择 7、如何维持培养液p Ｈ ６、如何选用细胞培养基? 8、血清与干细胞得培养?9、胎牛血清（F B S )就是否需要灭活?1０、细胞得细菌、真菌污染及排除?１1、细胞培养污染得预防 １2、使用胰蛋白酶时加入 E DTA得目得就是什么 13、胶原酶得种类与选型?1４、胶原酶V S胰酶?1５、干细胞得种类与表面标记 １6、间质干细胞培养原理概述? 17、间质干细胞成脂与成骨诱导分化?1８、干细胞老化得表现 20、冷冻保护剂作用与选择? 21、细胞冻存指导 19、细胞传代消化过程指导? 与处理? 22、干细胞冷冻与复苏 23、移植细胞得基因修饰?1。间充质干细胞MSＣ基本形态?体外培养细胞根据它们在培养器皿就是否能贴附于支持物上生长特征，可分为贴附型生长细胞，常表现为成纤维型细胞与上皮细胞。悬浮型细胞在培养中悬浮生长.?间充质干细胞MSC基本形态：形态与成纤维细胞类似,细胞在支持物表面呈梭形或不规则三角形生长,细胞中央有卵圆形核，胞质向外伸出2－3厘米个长短不同得突起。可瞧到细胞成螺旋状生长。 ?2．干细胞应用与干细胞调控 干细胞得调控就是指给出适当得因子条件，对干细胞得增殖与分化进行调控,使之向指定得方向发?２、１内源性调控 展.? 干细胞自身有许多调控因子可对外界信号起反应从而调节其增殖与分化，包括调节细胞不对称分裂得蛋白，控制基因表达得核因子等。另外,干细胞在终末分化之前所进行得分裂次数也受到细胞内调控因子得制约。 （1)胞内蛋白对干细胞分裂得调控?干细胞分裂可能产生新得干细胞或分化得功能细胞。这种分化得不对称就是由于细胞本身成分得不均等分配与周围环境得作用造成得.细胞得结构蛋白，特别就是细胞骨架成分对细胞得发育非常重要。如在果蝇卵巢中,调控干细胞不对称分裂得就是一种称为收缩体得细胞器，包含有许多调节蛋白，如膜收缩蛋白与细胞周期素A。收缩体与纺锤体得结合决定了干细胞分裂得部位，从而把维持干细胞性状所必需得成分保留在子代干细胞中。?（2）转录因子得调控在脊椎动物中，转录因子对干细胞分化得调节非常重要。比如在胚胎干细胞得发生中,转录因子Oct ４就是必需得.Ｏcｔ4 就是一种哺乳动物早期胚胎细胞表达得转录因子,它诱导表达得靶基因产物就是FＧＦ—４等生长因子，能够通过生长因子得旁分泌作用调节干细胞以及周围滋养层得进一步分化。Oct４缺失突变得胚胎只能发育到囊胚期,其内部细胞不能发育成内层细胞团。另外白血病抑制因子（LＩF)对培养得小鼠ES 细胞得自我更新有促进作用,而对人得成体干细胞无作用，说明不同种属间得转录调控就是不完全一致得。又如Tｃf/Lｅｆ转录因子家族对上皮干细胞得分化非常重要.T ｃｆ/Leｆ就是Wnt 信号通路得中间介质，当与β－Catｅnｉn 形成转录复合物后,促使角质细胞转化为多能状态并分化为毛囊.? 2、2外源性调控 除内源性调控外,干细胞得分化还可受到其周围组织及细胞外基质等外源性因素得影响。?(1）分泌因子?间质细胞能够分泌许多因子,维持干细胞得增殖，分化与存活。有两类因子在不同组织甚至不同种属中都发挥重要作用，它们就是TGFβ家族与Wnｔ信号通路.比如TGF 家族中至少有两个成员能够调节神经嵴干细胞得分化。最近研究发现,胶质细胞衍生得神经营养因子（GDNF）不仅能够促进多

肝细胞原代培养实验方案

原代培养肝细胞就是肝细胞移植、生物人工肝得最佳生物材料。长期以来, 国内外众多学者对肝细胞分离方法、培养条件进行了大量得研究 , 但要获得高活率、功能好得肝细胞,至今仍非易事。早期主要用非酶法分离肝细胞,包括机械法( 如匀浆法) 及螯合法、机械法对肝细胞损伤大, 细胞活率低; 螯合法就是用可结合 Ca2＋、M g２＋得螯合剂(如枸橼酸盐或ＥDＴＡ) 分离肝细胞,但螯合剂单独使用效果不好 ,常需与酶法结合使用。后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞 ,包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法。后者对酶浓度及作用时间要求十分严格, 且由于胰蛋白酶就是一种强蛋白质消化酶, 对肝细胞膜破坏严重 , 因而易造成肝细胞死亡 , 导致分离失败。胶原酶消化法对肝细胞损伤较小, 虽然肝细胞膜在消化过程中也会受到损害, 但经培养后可完全修复。胶原酶在消化肝得同时解除了细胞间接触抑制或活化了潜在得蛋白激酶、生长因子或受体, 使肝细胞能逐渐适应消化分离过程中所发生得细胞内、外环境及细胞间得各种改变。这些改变对离体肝细胞修复、生长及其功能有重要得促进作用,有利于肝细胞得培养。这种适应性改变恰恰就是机械分离法所没有得。因此 ,要获取理想得肝细胞,酶消化这一重要环节不可缺少。 Seglｅｎ二步灌注法为经典得胶原酶消化法,但所需设备较复杂,胶原酶消耗量大。本研究在其基础上略加改进、作者认为 ,采用胶原酶消化法 ,胶原酶得用量、作用时间及作用条件就是分离成功与否得关键。胶原酶得浓度过高 ,作用时间难以控制; 浓度过低 ,

则作用时间过长、细胞活率降低、事先用无Ｃa2 +、M g2+得灌注液进行预灌注, 去除 Cａ2+依赖性粘附因子,使桥粒断裂; 然后用含 Ca2+得胶原酶消化 ,胶原酶得作用需要 Ca2＋得活化 , 在 5 mmoｌ/ＬCa２+浓度下 ,用浓度为 5０0 mg/ L 得胶原酶 37 ℃条件下消化１5 mｉn 最佳。在进行肝细胞洗涤、离心、重悬等纯化操作时 ,温度需保持在０～ 4 ℃。肝细胞分离时, ｐH 值宜维持在 7 。 4 左右, 不低于７。 2 ,最高不超过７。 6 , 否则将对肝细胞造成很大损伤、在肝灌注液中加入适量得小牛血清或者牛血清白蛋白,可以维持细胞代谢与液体渗透压, 提高肝细胞成活率、此外,门静脉插管应迅速置入,灌注速度必须保持一致。 培养板预处理及培养液选择采用铺过胶原得新培养板与没有铺过胶原得新培养板 ,铺过胶原得老培养板培养肝细胞比较 , 发现肝细胞在铺过胶原得新培养板中长势更好、新得培养板使用 Sigm a公司提供得胶原铺胶 ,置于 37℃恒温箱中过夜后使用。过去选择含 8％胎牛血清得Ｗ E作培养基 ,效果不错 , 但WＥ价格昂贵 ,我们试着采用含 10%胎牛血清得RPM 1６４0培养基 , 并在其中加入胰岛素 , 地塞米松等生长因子 , 肝细胞生长好。肝细胞得接种密度对其以后得生长状况有很大得影响 : 密度太小 ,细胞不易生长; 密度太大 , 肝细胞增殖受到抑制 , 培养板中缺少足够得空间供细胞伸展、当细胞密度为 5×1０５ / m ｌ左右时 ,试剂及仪器主要试剂 : 胰岛素、高血糖素、转铁蛋白、表皮生长因子、地塞米松、Ⅳ型胶原酶、锥虫蓝等购自美国 Sig ma 公司。鼠尾胶为

干细胞培养

造血干细胞的特性与应用 姓名： 学号： xx大学生命科学学院，2010生物科学 摘要： 关键词： 造血干细胞；生物学特性；应用 1造血干细胞的来源 胚胎造血与出生后的较单一、固定的骨髓造血不同，它伴随着生长发育而不断变换造血部位。一般认为，随着胚胎发育过程中造血中心的转移，其造血过程相继分为三个阶段，即胚胎外造血期——卵黄囊造血期（人胚第13~16天）、胎肝造血期（人胚第6周至第5个月）和骨髓造血期（胚胎第四4个月开始至终生）。但有学者认为成体造血干细胞来源于胚胎的背主动脉区，因为能够重建成体各系造血的造血干细胞最早出现在鼠胚第10天的主动脉-性腺-中肾（AGM）区。 而卵黄囊只是一种一过性的造血组织，不是胚胎发育过程中的第一个造血中心。至于骨髓造血干细胞，有人认为其来源于胎肝造血干细胞的迁移，也有人认为其来源于上述的AGM区，目前尚无定论。 2造血干细胞的特性与鉴定 2.1造血干细胞的生物学特性 2.1.1造血干细胞的活化 1986年Lemischka等通过对移植小鼠血液细胞DNA分析所做的克隆研究发现，在小鼠接受移植后的造血恢复期，植入的造血干细胞不是被平均使用，一部分克隆逐渐消退;以移植小鼠的骨髓做二次移植后，二次移植的小鼠造血由在

一次移植中与造血无关的另一部分克隆来维持。结果提示，造血干细胞并非全部处于增殖分化周期中。一般情况下，大部分造血干细胞处于静止期，在必要时才进入细胞周期进行细胞分裂。造血干细胞分裂后，其子代细胞一个通过自我复制维持造血干细胞的特性，另一个则通过分化成为多能性造血祖细胞。造血干细胞的活化机制尚不明确，但至少其中一个机制是通过各种细胞因子来调节。人们推测，造血干细胞的活化，需要多种刺激因子的协同作用。在细胞刺激因子之外，细胞抑制因子也能调节造血干细胞的活化。 2.1.2造血干细胞的自我更新 造血干细胞最为基本的生物学特征是其具有高度的自我更新能力(Self-re-newal)，即它能通过自我复制方式使子代细胞与亲代细胞具有完全相同的特征。造血干细胞的这种高度的自我更新能力，在维持机体一生的造血过程中具有重要意义。因为，造血干细胞如果不能通过自我复制进行自我更新，随细胞的增殖分化成熟，干细胞池即会被耗尽而导致难以维持造血。大量研究证实，造血干细胞经分裂后其子代细胞基本上能够保持与亲代细胞完全相同的特性。但也有学者认为，即使是造血干细胞，只要行分裂，从严格的意义上来讲，就不存在完全的自我复制，而已进入了分化阶段。造血干细胞是否确实能够进行完全的自我复制，尚存争议。但具有长期体内外造血重建能力这一特征是造血干细胞所必备的。 2.1.3造血干细胞的多向分化 通过放射线照射，诱导细胞产生染色体异常，然后将具有这种染色体异常的造血干细胞移植给小鼠，在小鼠体内可以看到含淋巴细胞在内的所有血液细胞均具有相同的染色体异常，说明造血干细胞可以形成含淋巴细胞在内的各种血液细胞。现已明确，造血干细胞向成熟细胞分化过程中受到多种正负造血因子的作用，形成一种较为复杂的调控网络。在综合因素作用下，造血干细胞可以分化形成红系、髓系、巨核系成熟血液细胞，也是淋巴系干细胞的来源。除造血系细胞外，近年还发现造血干细胞可以分化形成一些非造血细胞，如破骨细胞、表皮生发层细胞等。新近在一例作异性间骨髓移植后的病人，发现受者肝细胞具有供者的染色体核型，提示其来源于供者的造血干细胞。 而近

痢疾杆菌分离与鉴定培训

痢疾杆菌的分离与鉴定 濮阳市疾病预防控制中心 许银怀 第一节概述 志贺菌属（Shigellae）细菌又称痢疾杆菌，引起人类及灵长类动物细菌性痢疾。 1899年由日本人志贺首先发现。 全球每年感染人次约为1.65亿，死亡110万，发病率、死亡率居感染性腹泻之首位。 发展中国家发病率较高，如阿根廷990.6／10万、印度972.3／10万；发达国家相对较低，如美国6～12／10万、德国2.7／10万、法国0.3／10万；我国上世纪50～80年代发病率在46.37～1018.93／10万之间。 近20年痢疾发病率在法定传染病中由第一位降至第三位，但在卫生状况不良的地区，发病率仍居高不下。 人群对细菌性痢疾普遍易感，各年龄组均可受到感染，5岁以下儿童发病率最高。 据估计，在临床就诊的腹泻病人中的5%～15%是志贺菌引起的，而因腹泻死亡病例中有75%是志贺菌感染造成的。 发展中国家福氏志贺菌最常见，发达国家以宋内志贺菌为主。美国

宋内志贺菌>75%，但在男-男性行为人群仍以福氏志贺菌常见。 鲍氏志贺菌最先在印度发现，除印度次大陆地区较为常见外，其它地区较为少见。 细菌性痢疾发病有明显的季节性，发病高峰为夏秋季，通常在7～9月份。 细菌性痢疾防治仍需探索、研究内容： 细菌性痢疾在不同地区、不同人群的发病强度、分布特征、病原学特点缺乏全面、准确的数据； 缺乏快速、简便的病原学诊断方法，细菌性痢疾漏诊和误诊现象普遍； 志贺菌耐药性谱的不断扩大，细菌性痢疾抗菌治疗难度加大； 洗手、母乳喂养、安全饮水、粪便无害化处理等行之有效的干预措施的落实需要强化； 目前所用痢疾菌苗免疫保护效果仍需进一步评价。 第二节病原学 一、抗原分类 志贺菌属细菌有菌体（O）抗原，某些新分离菌株有表面（K）抗原。 (一) 菌体（O）抗原 1.型特异性抗原：多糖，光滑型菌株主要抗原；分A、B、C、D 4个群及35个抗原型。 2.群特异性抗原：光滑型菌株次要抗原，主要存在于B群，籍此将菌型分

原代肝细胞分离方法

原代肝细胞分离方法 体外培养肝细胞的关键是如何分离得到形态完整、体外代谢活性高的肝细胞. 自1953年Anderson[2]首创剪切法从肝脏分离肝细胞以来, 各实验室对肝细胞的分离方法进行了不断改进. 在众多方法中, 主要分为非灌流的方法和灌流的方法. 1.1 采用非灌流的方法 早期的研究一般通过非灌流这种简单的步骤分离肝细胞. 1.1.1 机械分离法: 机械分离法是利用机械剪切及强力吹打等物理手段来分离肝细胞的方法[3]. 张 顶et al[4]在分离树鼩肝细胞的过程中, 首先将树鼩的肝脏剪成小块, 然后通过挤压、剪碎和 震荡等机械手段, 使肝细胞从肝组织上脱落, 从而获得互相分离的肝细胞. 1.1.2 胰酶消化法: 胰酶消化法是利用胰酶来破坏肝细胞之间的桥连, 使肝细胞分离的一种方法. Dulbecco et al[5]首次采用胰酶来分离猴肾细胞、大鼠肝细胞, 并运用到体外细胞的研究和培 养中. 刘友平et al[6]利用该方法分离肝细胞时, 首先取出小鼠的肝组织用眼科剪剪碎至糊状, 然后用缓冲液充分清洗并加入胰酶进行消化. 待消化完全后用D-Hank's液清洗, 最后加入含有血清的培养液终止胰酶的作用, 得到消化彻底的细胞悬液. 1.1.3 胶原酶消化法: 胶原酶消化法是利用胶原酶来破坏细胞间的纤维成分, 使肝细胞分离的一种方法. 王琳et al[7]在利用该方法分离新生小鼠肝细胞时, 首先将新生小鼠的肝脏剪成1 mm3组 织块, 用无钙无镁的D-Hank's液反复冲洗后加入胶原酶进行消化. 最后用DMEM液终止胶原酶的作用, 得到肝细胞悬液. 1.2 采用灌流的方法 虽然非灌流的方法以其简单易行的特点得到了一定的应用, 但由于存在消化不 完全、分离得到的肝细胞中多细胞团块存在的问题, 不能满足许多基础研究或临床应用的要求. 1969年, Berry和Friend[8]引入了肝脏灌流法, 灌流可以使消化液与肝组织更加充分地接触, 不仅提高了分离效率, 还使分离所得肝细胞的活力和数量大大提高. 1.2.1 离体胶原酶灌流法: 离体胶原酶灌流法是将离体灌注与胶原酶消化相结合的方法. 在使用该方法分离肝细胞时, 首先将动物肝脏取出, 于门静脉内置管或直接在获得的肝组织块的血管或切口内置管, 用预热的无钙无镁的D-Hank's液灌流. 然后换用胶原酶作持续灌流, 使肝细胞与间质分离. 最后用培养液终止胶原酶的消化作用, 过滤、离心、弃上清后得到肝细胞悬液. 1.2.2 Seglen两步灌流法（原位胶原酶灌注法）: 自从引入灌流法分离肝细胞以来, 许多学者根据不同的应用条件对灌流法进行了改良. 其中Seglen[10]经过一系列细致的研究, 创立了改良的Seglen两步灌流法, 这一方法已成为应用至今的标准的原代肝细胞分离方法. 两步灌流法主要是通过门静脉先后用含EDTA或EGTA缓冲液和胶原酶缓冲液进行灌注来分离肝细胞的方法. 许多学者在具体操作中, 不断改进 两步灌流法的灌注条件, 目的在于进一步减少分离过程中肝细胞的损伤, 提高肝细胞的活率. 1.2.3 半原位胶原酶灌流法:

肝细胞原代培养实验方案

原代培养肝细胞是肝细胞移植、生物人工肝的最佳生物材料。长期以来, 国内外众多学者对肝细胞分离方法、培养条件进行了大量的研究 , 但要获得高活率、功能好的肝细胞,至今仍非易事。早期主要用非酶法分离肝细胞 ,包括机械法( 如匀浆法) 及螯合法。机械法对肝细胞损伤大, 细胞活率低; 螯合法是用可结合 Ca2+ 、M g2 +的螯合剂(如枸橼酸盐或 EDTA) 分离肝细胞,但螯合剂单独使用效果不好 ,常需与酶法结合使用。后期逐渐改为酶消化法分离肝细胞 ,包括胶原酶消化法、胰蛋白酶消化法。后者对酶浓度及作用时间要求十分严格, 且由于胰蛋白酶是一种强蛋白质消化酶, 对肝细胞膜破坏严重 , 因而易造成肝细胞死亡 , 导致分离失败。胶原酶消化法对肝细胞损伤较小 , 虽然肝细胞膜在消化过程中也会受到损害, 但经培养后可完全修复。胶原酶在消化肝的同时解除了细胞间接触抑制或活化了潜在的蛋白激酶、生长因子或受体, 使肝细胞能逐渐适应消化分离过程中所发生的细胞内、外环境及细胞间的各种改变。这些改变对离体肝细胞修复、生长及其功能有重要的促进作用 ,有利于肝细胞的培养。这种适应性改变恰恰是机械分离法所没有的。因此 ,要获取理想的肝细胞,酶消化这一重要环节不可缺少。 Seglen 二步灌注法为经典的胶原酶消化法,但所需设备较复杂 ,胶原酶消耗量大。本研究在其基础上略加改进。作者认为 ,采用胶原酶消化法 ,胶原酶的用量、作用时间及作用条件是分离成功与否的关键。胶原酶的浓度过高 ,作用时间难以控制 ; 浓度过低 ,则作用时间过长、细胞活率降低。事先用无Ca2 +、M g2+的灌注液进行预灌

注, 去除 Ca2+依赖性粘附因子 ,使桥粒断裂; 然后用含 Ca2+的胶原酶消化 ,胶原酶的作用需要 Ca2+的活化 , 在 5 mmol/LCa2 +浓度下 ,用浓度为 500 mg/ L 的胶原酶 37 ℃条件下消化 15 min 最佳。在进行肝细胞洗涤、离心、重悬等纯化操作时 ,温度需保持在 0 ～4 ℃。肝细胞分离时, pH 值宜维持在 7 . 4 左右, 不低于 7 . 2 ,最高不超过 7 . 6 , 否则将对肝细胞造成很大损伤。在肝灌注液中加入适量的小牛血清或者牛血清白蛋白,可以维持细胞代谢和液体渗透压, 提高肝细胞成活率。此外,门静脉插管应迅速置入,灌注速度必须保持一致。 培养板预处理及培养液选择采用铺过胶原的新培养板与没有铺过胶原的新培养板 ,铺过胶原的老培养板培养肝细胞比较 , 发现肝细胞在铺过胶原的新培养板中长势更好。新的培养板使用 Sigm a公司提供的胶原铺胶 ,置于 37℃恒温箱中过夜后使用。过去选择含 8%胎牛血清的 W E作培养基 ,效果不错 , 但 WE价格昂贵 ,我们试着采用含 10%胎牛血清的 RPM 1640培养基 , 并在其中加入胰岛素 , 地塞米松等生长因子 , 肝细胞生长好。肝细胞的接种密度对其以后的生长状况有很大的影响 : 密度太小 ,细胞不易生长 ; 密度太大 , 肝细胞增殖受到抑制 , 培养板中缺少足够的空间供细胞伸展。当细胞密度为 5×105 / m l左右时 ,试剂及仪器主要试剂 : 胰岛素、高血糖素、转铁蛋白、表皮生长因子、地塞米松、Ⅳ型胶原酶、锥虫蓝等购自美国 Sig ma 公司。鼠尾胶为自行配制。Williams E 培养液、胎牛血清购自美国 Gibco 公司。BT01-100 蠕动泵( 保定格

人肝细胞的分离_培养和冻存

metastases:acom parisonofinterstitiallaser photocoagulation (ILP )and percutaneousalcoholin jection (PAI ).ClinRadiol,1993;48(3):166-171. (收稿日期:2004-09-18) ?综述? 人肝细胞的分离、培养和冻存 李　涛　彭志海 摘要　人肝细胞是生物人工肝的最理想细胞来源,决定其治疗效果。本文就人 肝细胞分离、培养及冻存进行综述。 关键词　生物人工肝　人肝细胞　分离　培养　冻存作者单位:200080上海,上海市第一人民医院普外科 进展期肝功能衰竭(advancedacuteliverfailure )唯一证明有效的治疗措施是急诊肝移植(livertrans 2plantation,LT )[1]。然而,许多患者却由于供肝的严重缺乏而在等待中死去。这促使了研究者对肝功能支持研究的兴趣。理想的肝功能支持可以使患者成功的桥接(bridge )肝移植或者使患肝得以再生恢复[2]。作为一种替代疗法,一个桥接设备可以像肾透析一样为衰竭的肝脏提供长期的支持[3]。在生物人工肝中(bioartificialliver,BAL ),患者的血浆循环通过体外的生物反应器,该反应器装载有具有生物合成、解毒和生物转化功能的肝细胞,从而发挥肝功能支持作用。人原代肝细胞可以提供大部分肝功能,因此是生物人工肝中最理想的肝细胞来源。本文主要对人肝细胞的分离技术、培养方法及冻存研究进展作一综述。1.人肝细胞的分离 人肝细胞主要来源于外科切除标本及由于严重脂肪变性或者肝硬化而遗弃的供肝[4～8,22,24]。与脂肪肝相比,肝硬化肝分离的肝细胞产量及活性均低,但肝细胞的安定代谢功能却没有差别[8]。 目前广泛应用的人肝细胞分离技术是Seglen [9] 创立的胶原酶两步法灌注分离技术。简述如下:对于整肝灌注,通过门静脉插管并固定;而对于肝段,则通过切面主要血管开口插管,其他血管结扎以防漏液。首先用含离子鳌合剂如EDTA [7,8,24]或者 EGTA [23,25]的无Ca 2+缓冲液(保持37℃ )灌注,目的是去除Ca 2+离子,打破细胞间桥粒紧密连接。接 着用含Ca 2+离子的胶原酶缓冲液灌注消化组织。收集消化后的肝细胞并悬浮于冰冷的培养基中。然后,通过不锈钢筛网过滤及低速离心纯化肝细胞。分离纯化后的肝细胞通常立即采用台盼兰抗拒染色法评估细胞活性[7,8,23～25]。许多研究小组通过对该技术略加改良分离获得肝细胞[4～7,24]。最近,一个意大利研究小组设计了一种改良四步法来分离人肝细胞,目的是减小缺血再灌注损伤及提高细胞分离后能量状态,从而提高分离后肝细胞的活性[6]。与传统两步法相比,其在EDTA 灌注前及胶原酶灌注后采用含甘氨酸、丙氨酸及果糖等基质的灌注液灌注,以促进肝细胞分离后的能量恢复[6]。 分离肝细胞的数量及活性主要取决于组织质量、供肝冷缺血时间、灌注液成分、胶原酶类型和浓度。大多数研究中所用的酶为胶原酶Ⅳ或胶原酶P [7,8,24,25]。Liberase 是一种用来分离胰岛细胞的酶,它具有更低细菌污染的优点,最近有报道用来分离肝细胞。Donini 等[10]曾比较LiberaseHI 与胶原酶P 分离猪肝细胞的效果,结果发现LiberaseHI 可有效的分离获得更高活性的猪肝细胞。因此,许多小组应根据自己实验室条件建立自己的分离技术,这主要考虑下述因素:理想的灌注装置、胶原酶类型及浓度、灌注液离子浓度、灌注时间及温度、灌注液流速等。 2.人肝细胞原代培养 成熟肝细胞通常不能存活超过2周,并且在标准体外培养条件下不能增值。长期培养肝细胞,首 ? 29?国外医学外科学分册2005年第32卷第2期SurgeryForei gnMedicalSciences, 2005,vol.32.No.2

小鼠肝细胞的分离培养

第26卷第4期1998年12月 衡阳医学院学报 Jou rnal of H engyang M edical Co llege V o l.26N o.4 1998小鼠肝细胞的分离培养① 陈敏时　陈　新　刘传爱② (衡阳医学院流行病学教研室,衡阳市,421001) 摘　要　采用0.1%的胰蛋白酶消化乳小鼠肝组织块,用DM E M培养基进行肝细胞的培养,1周后可见细胞生长,30d左右细胞铺满培养瓶,培养的肝细胞能分泌白蛋白,培养第20天白蛋白分泌量达高峰。 关键词　胰蛋白酶;　肝细胞;　分离培养 哺乳动物肝细胞不易在体外生长,80年代以来国外采用两步胶原酶灌注法分离肝细胞[1],并以双层鼠尾胶原凝胶培养[2]或肝细胞-非实质细胞混合培养[3],成功地进行了肝细胞的原代培养。但这些方法操作复杂,价格昂贵。我们采用胰酶消化、组织块培养的方法进行肝细胞原代培养成功,现将结果报告如下。 1　材料与方法 1.1　试剂 1.1.1　0.1%的胰酶　胰蛋白酶1g,加D2 H ank s液100m l溶解,4℃过夜,滤纸过滤除菌,调pH值至7.2冷冻保存,临用前用D2 H ank s液稀释。 1.1.2　基础培养液　DM E M培养基(低糖) 10g,N a2CO33.7g,三蒸水1000m l溶解,调pH值至7.2～7.4,玻沙滤器过滤除菌,临用前100m l加入小牛血清10m l,青霉素1万单位,链霉素10m g,氢化可的松、灭菌1M H EPES 0.4%牛胰岛素各0.25m l。 1.2　动物 3～6日龄昆明小鼠,由本校实验动物部提供。 1.3　肝细胞的分离和培养 处死小鼠,无菌分离肝脏,置D2H ank s液中,冲洗肝脏至灰白色,将肝脏剪成1mm×1mm×1mm的组织块,用D2H ank s液洗3次,去掉血细胞,37℃下用0.1%的胰蛋白酶消化10m in,倒掉消化液后用D2H ank s液洗2次,培养液洗2次,将肝组织块贴壁于组织培养瓶中,每个培养瓶放组织块30～35块,加少许培养液,将培养瓶倒转置于培养箱中,在37℃、5%CO2条件下培养,3h后补充4m l培养液,并翻转培养基继续培养。第1周每3天换液1次,以后每2天换液1次。 1.4　白蛋白分泌的检测 换液时收集培养液,离心去除浮游单个细胞及碎片,以溴甲酚绿法检测上清液中白蛋白含量。 2　结 果 2.1　细胞形态及生长动态 培养1周后组织块周围有少数细胞长出, 10天后细胞生长速度较快,大部分组织块周围 ①省教委资助课题 ②　病毒基因工程研究室

干细胞分离及培养

1.1实验材料 1.1.1 实验标本与分组 1）实验标本:12例骨科外伤手术健康志愿者（排除血液系统疾病、结核及肿瘤浸润性疾病）,其中女性5名，男性7名，16岁～65岁。在手术室行髂骨取骨术时无菌状态下抽取髂骨骨髓2～3ml/人。 2）分组:12例标本，按年龄分组如下 ①A组：16岁～25岁，n＝6； ②B组：50岁～65岁，n＝6。 1.2 实验方法 1.2.1 人骨髓的获得与hBMSCs的分离 无菌环境下从我院12名骨外科手术志愿患者（排除血液系统疾病，结核及肿瘤浸润疾病）中采用20ml一次性注射器，肝素化后抽取骨髓2～3ml，放入已消毒好的盛有5ml L-DMEM的试管（先肝素化）内，无菌容器盛装试管送回实验室。将骨髓与L-DMEM混匀，1500rpm×5min去除上层脂肪滴及上清，以D-Hank’s 液重新悬浮细胞后将其悬液平铺于淋巴细胞分离液上（Percoll 1.073g/ml，Sigma），1500rpm×10min，吸取中间层的白膜层（单核细胞层），D-Hank，s液洗涤2次，1500rpm×5min，弃去上清，L-DMEM重新打匀。灭菌的0.17mol/L的饱和NH4CL溶液按1：5的体积比加入已重新打匀的悬液中，4℃下保存10min,取出后1000rpm×5min，弃去上清，D-Hank，s液洗涤2次，L-DMEM重悬后，按2.0×106/ml浓度接种。 1.2.2 hBMSCs的原代培养 将经上述分离步骤所获得的有核骨髓细胞加入含有10％NBCs的L-DMEM中，按2.0×106/ml的细胞浓度接种于50ml的一次性塑料培养瓶内。静置于37℃，5％CO2的CO2培养箱内培养。接种后的第48hr进行第1次半换液，换液前轻轻摇晃，使未贴壁细胞悬浮，弃倒掉一半培养液，可将未贴壁的细胞部分弃掉（避免不能贴壁的细胞占用培养瓶空间，使能贴壁细胞不能贴壁），重新换入含有10％NBCs的L-DMEM；间隔2d后再次半换液1次以清除未贴壁细胞。两次半换液后，细胞隔日洗涤、全换液，使细胞逐渐纯化。 1.2.3 hBMSCs的传代培养 当原代细胞铺满培养瓶的底面80%～90%时，倒净原培养液，用0.01M PBS（PH7.2）洗涤2次。加入37℃，0.5ml的0.25％Trypsin溶液，轻轻旋转，使瓶底细胞全部浸入该溶液中。倒置显微镜下观察细胞变化。随着时间的推移，原贴壁的呈纤维状的细胞逐渐趋于圆形，在细胞还未漂起时将溶液弃去，立即加入10ml 含10％NBCs的L-DMEM终止消化。也可以用肉眼观察消化，当见到培养瓶底发白，出现细针孔样空隙时即可终止消化。在室温下，消化时间约为1～2min。用吸管将贴壁的细胞轻柔吹打成悬液，调整细胞浓度为1.0×105/ml后，按1∶3的比例传代,分到3个50ml的培养瓶中，置37℃,5%CO2的CO2培养箱内继续培养。观察细胞贴壁生长情况。每2d换液1次,培养液为含10%NBCs的L-DMEM,观察细胞的生长情况,待细胞基本融合,再用0.25％Trypsin溶液消化,以上述方法进行传代扩增培养。

一种易操作的小鼠肝细胞的分离及培养方法

一种易操作的小鼠肝细胞的分离及培养方法 鵬臟臟。永玲郑江 第三军医大学第一附属医院中心实验室 摘要： 目的在传统肝细胞提取方法的棊础上，优化一种易操作、快速实用获取小鼠肝细胞的方法，为从事肝脏功能相关研宂人员提供改良的实验方法参考。方法以肝脏分离液逆向灌注小鼠肝脏后，剪碎，肝脏酶消化后密度梯度离心分离肝细胞，转入培养基培养。采用台盼蓝染色计算细胞活力，流式细胞检测技术计算纯度，倒置显微镜观察细胞形态。结果获得较高纯度和活力的肝细胞，具备肝细胞的典型形态特征。结论通过逆向灌注，降低/灌注的难度，同时获得较高纯度、较高活力的肝细胞，经多次实验证明该方法确实是一种易操作、高效适用的肝细胞提取方法。 关键词： C57BL/6J小鼠;肝细胞;逆向灌注;活力;纯度; 作者简介：范仕郡（1983-）,男，助理研究员，研究方向:脓毒症的发病机制与拮抗措施研宄。E-mail:574472439@qq. com 作者简介：郑江（1961-）,男，研究员，研究方向:脓毒症的发病机制与拮抗措施研究。E-mail:https://www.wendangku.net/doc/eb9817246.html, 收稿日期：2017-03-20 基金：国家自然科学基金项FI （编号:81372089）

A simplified method for isolation and culture of primary mouse hepatocytes FAN Shi-jun LIU Xin YANG Dong ZHU Yuan-feng LU Yong-ling ZHENG Jiang Medical Research Center, First Affiliated Hospital， Third Military Medical University; Abstract： Objective To simplify and optimize the method for isolation and culture of primary mouse hepatocytes on the basis of conventional extraction method, and to provide a reference for related research. Methods Mouse liver was reversely perfused with the isolation solution ( i. e., through the vena cava inferior in, and portal vein out)，cut into small pieces and digested with enzymes. Then the hepatocytes were isolated by density gradient centrifugation and transferred into culture medium. The cell viability was detected by trypan blue staining. The purity of the hepatocytes was analyzed by flow cytometry and the cell morphology was observed with an inverted microscope. Results The hepatocytes obtained by this improved method showed high viability and purity, with typical characteristics of cell morphology. Conclusions The liver perfusion is facilitated by reversed perfusion, and the isolated hepatocytes are with high viability and purity confirmed by many times of experiments. This optimized procedure is an easy and efficient method for isolation of primary mouse hepatocytes. Keyword： C57BL/6J mice; Hepatocytes; Reversed perfusion; Viability; Purity; Received： 2017-03-20 肝脏是人体最大的实质器官和重要的排毒器官。在人体中担负着去氧化、存储肝糖、合成分泌性蛋白质等重要作用。同时也是消化系统屮重要的消化腺。它可以制造胆汁来帮助食物的消化，也是尿素合成的主要脏器，更是新陈代谢的重要器官U1。因此，肝脏对于人体的重耍作用不言而喻。肝脏细胞主耍由肝细胞(hepatocytes, HC)、枯否细胞(Kupffer cells, KC) > 肝星形细胞(liver stellate cells, HSC)和肝血

细菌鉴定学习

现有一株细菌宽度明显大于大肠杆菌的粗壮杆菌,请你鉴定其革兰氏染色反应.你 怎样运 传统的细菌革兰氏染色法操作繁琐，初学者不易掌握，寻找一种简便方法。方法：玻璃片上将细菌与碱液混合，用接种环或接种针往上挑，观察有无丝状物出现，我们把它叫作“细菌拉丝实验”。结果：用本法鉴别细菌革兰氏染色性质，G＾－菌有丝状物出现，即拉丝实验阳性，G＾＋菌无丝状物，拉丝实验阴性经过对照使用，本法具有快速，准确，简便，结果易判断，成本低廉等优点，值得推广应用。 由于细菌细胞壁的结构不同，革兰氏染色法可使有的细菌染上初染的的紫色，为革兰氏阳性细菌，有的细菌染上复染的的红色，为革兰氏阴性细菌。大肠杆菌是革兰氏阴性菌，染色后为红色，细菌形态为短小的杆状，单个存在。枯草杆菌是革兰氏阳性菌，染色后为紫色，细菌形态为杆状，比大肠杆菌大，可排成链状的，有的菌体里有椭圆芽孢（无色）或在视野中有散在的芽孢。 实验十肠杆菌科 肠杆菌科(Enterobacteriaceae)是一大群寄居于人和动物肠道中、生物学性状相似的革兰阴性杆菌。多数为肠道的正常菌群，但在机体免疫力低下或寄居部位发生改变时可引起感染。根据其生化反应、血清学试验、DNA同源性等可将肠杆菌科分为120多个菌种，其中与医学密切相关的有埃希菌属、志贺菌属、沙门菌属等。 一、大肠埃希菌 大肠埃希菌(E. coli)俗称大肠杆菌，是寄居于人和动物肠道的正常菌群。当机体抵抗力下降、该菌侵入肠外组织或器官，可引起急性炎症或继发感染；有些血清型可引起腹泻。从水和食品中检出较多大肠杆菌时，可判断它们已被粪便污染。因此，大肠杆菌常被作为饮水、牛乳及食品的卫生学检测指标。 （一）形态与培养特性 【材料与方法】 1．大肠杆菌革兰染色标本片。 2．大肠杆菌普通琼脂平板、SS平板、中国蓝平板、伊红美蓝(EMB)平板培养物。 【结果】 1．大肠杆菌为革兰阴性、中等大小杆菌，两端钝圆或稍弯曲，呈分散排列。 2．菌落特征(表10-1)。 表10-1 大肠杆菌在普通琼脂平板及选择鉴别培养基上的菌落特征 培养基菌落特征 普通琼脂平板圆形，中等大小，灰白，整齐，光滑菌落 SS平板呈红色 中国蓝平板呈蓝色 伊红美蓝平板呈紫黑色，有金属光泽 （二）生化反应 【材料与方法】 1．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于葡萄糖、乳糖、麦芽糖、甘露醇、蔗糖发酵管，37℃培养24h，观察结果。 2．取大肠杆菌、产气杆菌分别接种于双糖铁培养基，37℃培养24h，观察结果。 3．靛基质产生、甲基红、VP、枸橼酸盐利用试验(IMViC试验)，见实验四。 【结果】